JP2619036B2 - ブタ成長ホルモンアナログ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一種の新規ブタ成長ホルモンアナログに係
る。

特に本発明は、天然に産生するブタ成長ホルモンのアミ
ノ酸配列中の32〜38位の残基に対応する残基が１個以上
欠失している、組換により作製されたブタ成長ホルモン
のアナログに係る。本発明は更に、このようなアナログ
を含む組成物、並びに哺乳動物の成長を増進するための
このようなアナログ及び組成物の使用に係る。

正常な哺乳動物を下垂体は成長ホルモン（GH）と呼称
される物質を産生し、血流中に分泌する。ヒト（hG
H）、ウシ（bGH）及びブタ（pGH）成長ホルモンのアミ
ノ酸配列は類似している。これについては、Dayhoff,Dt
las of Protein Sequence and Structure,Volmume 5,Su
pplement 6,National Biomedical Research Foundatio
n,Washington,120−121（1976）；及びSeeburg他，DN
A，２,37−45（1983）を参照されたい。サケ成長ホルモ
ン（sGH）のアミノ酸及びヌクレオチド配列も知られて
いる（Seine他，Proc.Nat′l.Acad.Sci.（USA），82,43
06−4310（1985））。これらの成長ホルモン間の相同度
が最も高いbGH,hGH,oGH,pGH及びsGHの配列のアライメン
トに基づいて、安定性が高い領域を同定することができ
る（前出のDayhoff及び前出のSekine他の文献を参
照）。

in vivoにおいて成長ホルモンは、アミノ酸からのタ
ンパク質の構築、投与後の血漿グルコースの初期低下、
初期低下後の血漿グルコースの漸増、及び脂質から脂肪
酸への分解を促進する。成長ホルモンに関連する効果は
夫々成長促進（即ち体重増加）、インシュリン節約作
用、糖尿病誘発及び脂質分解効果と呼称される。抗脂質
分解効果も報告されているが、これはホルモンのインシ
ュリン類似作用の一面であると思われる（Goodman,Meta
bolism，19,849−855（1970））。

更に、成長ホルモンは催乳ホルモンと構造が類似して
おり、同様の効果を誘導することが可能である。例え
ば、bGHは残基の約15％がヒト胎盤性催乳ホルモンと異
なる（Wallis他，Growth Hormone and Related Peptide
s,Pecile他編,Excerpta Medica,Amsterdam,1−13（197
6））。ヒト成長ホルモンは残基の約25％がヒトプロラ
クチンと異なる（前出のWallis他の文献）。gGH又は組
換bGH（rbGH）を皮下注射すると、ウシ、ヤギ及びヒツ
ジの乳汁の生産量が増加する（Eppaird他，J.Dairy Sc
i．68,1109−1115（1985）;Bauman他，J.Dairy Sci.,6
8,1352−1362（1985）;Hart,Proc.Nutr.Soc.,42,181−1
94（1983）；及びHart他，Biochem.J.,218,573−581（1
984））。

下垂体から成長ホルモンを単離するには、ホルモンの
産生に関連する下垂体細胞を溶解させなければならな
い。しかしながら、細胞の溶解によってタンパク質加水
分解酵素（プロテアーゼ）が放出され、天然に産生する
下垂体成長ホルモン（nGH）の少なくとも一部をフラグ
メントに分割しかねない。更に、nGHは血流中に一旦分
泌されると、nGHを同一又は異るフラグメントに分割し
得るプロテアーゼの作用を受ける。成長ホルモンフラグ
メント研究の最大の研究対象は、既に抽出されている成
長ホルモン又は血流中を循環している成長ホルモンに関
連する作用を生じるのがnGHであるのか又はそのフラグ
メントであるのか又はその両方であるのかを決定するこ
とに向けられている。この点に関して、リジン又はアル
ギニン残基を化学的に修飾することにより、hGHのアナ
ログをプロテアーゼトリプシンによる消化に対して耐性
にすると、はっきりとはわかるが弱い成長促進、糖尿病
誘発及びインシュリン類似作用を生じることに着目する
ことができる（Cameron他，Biochim.Biopys.Acta,254−
260（1985））。一方、nGH分子の個々の部分（領域）は
nGHの効果のいずれかに関与すると考えられている。nGH
の作用への関与がこのように局限され得る程度までは、
タンパク質合成、インシュリン節約、糖尿病誘発及び脂
質分解効果を選択的に変化させたフラグメント及びアナ
ログを作製することができる。

以下の文中において、成長ホルモンのフラグメント又
はアナログ中に存在するアミノ酸残基の位置は下付き文
字で示し、数字は対応するnGHの同一の位置に見いださ
れる残基の存在を示し、欠失はコンマで表す。例えば、
天然に産生するブタ成長ホルモンはpGH_1-190で表す。

下垂体から単離され得、且つhGH_1-31,_47-191に対応す
るhGH（22000ダルトン）の20000ダルトン変異体（20K）
は、下垂体を切除したラットの成長を促進し、イヌでは
高血漿症又は高インシュリン血症を誘発せず、in vivo
又はin vitroでインシュリン節約作用も脂質分解作用も
生じず、hGHのラジオイムノアッセイによるとhGH自体よ
りも低反応性である（Lewis他，J.Biol.Chem.,253,2679
−2687（1978）;Frigeri他，Biochem.Biophys.Res.Comm
un.,91,778−782（1979）;Lewis他，Biochem.Biophy.Re
s.Commun.,92,511−516（1980）；及びLewis他，Endoc
r.Res.Commun.,８155−164（1981））。hGHの20K変異体
は転写後修飾産物である（前出のLewis他，Biochem.Bio
phys.Res.Commun．）。hGHの20K変異体は、その二量化
傾向、即ち腎機能低下を免れる傾向により、in vitro生
物活性から予測される以上に重要な成長促進物質である
（Baumann他，Endocrinology，117,1309−1313（198
5））。

20K hGHに欠けている残基を含むhGHのフラグメントも
文献中に開示されている。これらのフラグメントのうち
で成長を促進することが報告されているものはないが、
フラグメントによっては成長ホルモンの糖尿病誘発及び
脂質分解特性に関係の深い特性を有するものもある。

hGHの31〜44位の残基に対応する合成フラグメントは
絶食させた動物におけるin vivo及びin vitorで脂質分
解性である［Yudaev他，Biokhimiya，41,843−846（197
6）］が、非生理的状態でGHの不在下にin vitroでプレ
インキュベーションした後に限りグルコースの取り込み
を刺激する（即ちインシュリン節約作用を示した）（Yu
daev他，Biochem.Biophys.Res.Commun.,110,866−872
（1983））。hGHのペプチドアナログには糖尿病誘発性
のものもあるが、hGH_52-77のアナログはそうではない
（Lostroh他，Diabetes，27,597−598（1978）。hGH
_20-41から構成されるペプチドは活性を欠いてりる（Rea
gan,Diabetes，27,883−888（1978））。hGH_1-36から構
成されるペプチドは血液グルコース又は成長に対して効
果がない（Chillemi他，Growth Hormone and Related P
eptides,Pecile他編,Excerpta Medica,Amsterdam,50−6
3（1976））。

一方、hGH_32-46に対応するペプチドは血清遊離脂肪酸
を減少させ、in vitro［Frigeri他，Proceedings,64th
Annual Meeting of the Endocrine Socitey,San Franci
sco,101（Abstract 88）（1982）］及びin vivo［Rudma
n,U.S.Patent No.4,558,033及びStevenson他，Diabete
s，33,149A（Abstract No.572）（1984）］においてイ
ンシュリンと同時に投与するとインシュリン節約作用を
示す。hGH_32-46のフラグメント及びアナログ（異種アミ
ノ酸又は立体異性体の置換を含む）も同様に、in vivo
でインシュリンと同時に投与するとインシュリン節約性
である（Jones他の同時係属中及び同時譲渡の米国特許
出願第501,024号）。

発明の要約 本発明は、天然に産生するブタ成長ホルモンの生産活
性及び特性を維持しながら成長速度、飼料効果、脂肪分
解又は乳汁生産量を増加するような一種のブタ成長ホル
モンアナログの類に係る。

特に本発明は、アミノ酸の１個以上が欠失しているア
ミノ酸配列 Ｚ−pGH_1-31−（Ｘ）_ｎ−pGH_39-190 （ｎは０又は１であり、Ｚは水素、MET、ALA又はMET−A
LA−であり、Ｘは−GLU−ARG−ALA−TYR−ILE−PRO−GL
Uを含むアミノ酸残基のペプチドである） を含む組換ブタ成長ホルモンアナログ、及びその対立遺
伝子型に係る。

本発明は更に、上記配列を有するブタ成長ホルモンア
ナログをコードする合成遺伝子にも係る。本発明はま
た、DNA配列を含む各種の複製可能なクローニングベク
ター、並びに形質転換細胞又はトランスフェクトした細
胞系でブタ成長ホルモンアナログを作製するのに有用な
DNA配列を含む発現ベクターの構築方法にも係る。更
に、本発明は上記アミノ酸配列を有するブタ成長ホルモ
ンのアナログをコードする遺伝子も提供する。本発明は
更に、各種の複製可能なクローニングベクター、発現ベ
クター及び形質転換細胞又は細菌培養物も包含し、これ
らはいずれも本発明のブタ成長ホルモンアナログを作製
するのに必要な改変遺伝子情報を含む。

本発明のブタ成長ホルモンアナログは実質的に純粋な
形態で作製され、従って、ブタに由来する他のタンパク
質を本質的に含まない。ブタ成長ホルモンアナログは、
宿主動物への有効な運搬を助長できるように許容可能な
組成物を構成するべく、他のタンパク質、例えば血清ア
ルブミンを含む従来の好適なキャリア及びアジュバント
と調合され得る。

本発明は更に、有効量の本発明のブタ成長ホルモンア
ナログを動物に投与する段階を含む動物の成長を促進す
るための方法も提供する。

図面の簡単な説明 第１図はpBR 322−Trp−pGHプラスミド構築の概略
図、第２図はpCFM 414−Trp−pGHプラスミド構築の概略
図、第３図はpGH及びpGH−７の構築に使用されるXba I
〜Apa I pGH DNAフラグメントを作成するために使用さ
れるオリゴヌクレオチドアセンブリの図解、及び第４図
はpCFM 846−pGHプラスミドの構築に使用される成分の
図解である。

詳細な説明 上述のように、成長ホルモンの生理的活性は完全なポ
リペプチドの各領域に起因し得る。このような活性は、
完全なポリペプチドの特定の折り畳み又は修飾、仲介因
子の放出、又は例えばそれ自体が脂質分解に関与し得る
α−及びβ−リポトロンのような他の下垂体ペプチドに
よる「汚染」にも起因し得る［Kuhn他，J.Clin.Endocri
nol.Metab.,56,1338−1340（1983）;Frigeri他，Hormon
e Res.,17,197−201（1983）］。

精製したホルモンの効果から汚染物の効果を分離する
ためには、他の下垂体成分、例えば組換pGH（rpGH）か
ら単離することにより作製される成長ホルモンの活性を
試験する方法がある。pGHの遺伝子は既に配列決定され
ており、種々の形態で原核及び真核細胞中に発現されて
いる［Keshet他，Nucleic Acids Res.,９,19−30（198
1）;Woychik他．Nucleic Acids Res.,10,7197−7210（1
982）;Seeburg他，DNA，２37−45（1983）;Kupchick
他，DNA，４,23−31（1985）及びGerge他，DNA，４,273
−281（1985）］。

本発明は、天然に産生するpGHの生物学的特性（例え
ば免疫特性及びin vitroの生物学的活性）及び物理的特
性（例えば分子量）の１つ以上を有するポリペプチド精
製物及び単離物を提供する。これらのポリペプチドは、
ゲノムcDNAクローニング又は遺伝子合成により得られる
外因性DNA配列の化学的合成方法による又は原核もしく
は真核宿主発現（例えば培養基中の細菌、酵母、高等植
物、昆虫及び哺乳動物細胞による）産物であることも特
徴とする。典型的な酵母（例えばSaccharomyces cerev
isiae）又は原核生物（例えば大腸菌Escherichia col
i：E.Coli）宿主細胞の発現産物は、哺乳動物のタンパ
ク質と会合しない。脊椎動物（たとえばヒト以外の哺乳
動物及び鳥類）細胞の微生物発現産物はヒトタンパク質
と会合しない。使用される宿主に依存して、本発明のポ
リペプチドは哺乳動物又は他の真核炭水化物でグリコシ
ル化してもよいし、しなくてもよい。本発明のポリペプ
チドはイニシャルメチオニンアミノ酸残基（−１位）を
含み得る。

本文中において、アミノ酸残基の「ペプチド」なる用
語は１個以上のアミノ酸が欠失しているアミノ酸GLU−A
RG−ALA−TYR−ILE−PRO−GLUを含むペプチドを意味す
る。本発明の目的で、該ペプチド中のアミノ酸の欠失は
逐次的でもランダムでもよい。

DNA配列又は遺伝子に適用される場合の「人造（manuf
actured）」なる用語はヌクレオチド塩基のアセンブリ
により完全に化学的に合成された生成物又は合成された
誘導体を意味する。従ってこの用語は、もともと生物に
由来する材料を出発物質とするゲノムcDNAクローニング
法により「合成された」生成物は除外する。

本文中において、「対立遺伝子型」なる用語はアナロ
グの生物活性を改変することなしに本発明のブタ成長ホ
ルモンアナログの配列中で１個以上のアミノ酸が修飾さ
れていることを意味する。このような対立遺伝子型は当
業者により容易に予想されよう。

ＺがMET−ALAの場合、好ましくはMET残基はＺがALAで
あるようなアナログを得るように処理されることに留意
すべきである。本発明の好適なブタ成長ホルモンアナロ
グは、ｎが０であり且つＺがALAであるような式（Ｉ）
のブタ成長ホルモンアナログを含む。別の好適なブタ成
長ホルモンアナログは、ｎが１であり、ＺがALAであ
り、Ｘが−GLU−ARG−ALA−GLU−の配列を有する残基で
あるような式（Ｉ）のブタ成長ホルモンアナログ（ALA
−pGH_1-34,_38-190）を含む。

本発明の更に好適なブタ成長ホルモンアナログは、ｎ
が１であり、ＺがALAであり、ＸがGLU−ARG−ALA−TYR
−ILE−GLUの配列を有する残基であるような式（Ｉ）の
アナログ（ALA−pGH_1-36,_38-190）を含む。本発明の別
の好適なブタ成長ホルモンアナログは、ｎが１であり、
ＺがALAであり、ＸがGLU−ALA−TYR−ILE−PRO−GLUの
配列を有する残基であるような式（Ｉ）のアナログ（AL
A−pGH_1-32,_1-190）を含む。

第１表は天然に産生するpGHのアミノ酸配列を示す。

本発明の組成物及び方法は、有効量の本発明のブタ成
長ホルモンアナログを使用する。本文中においてブタ成
長ホルモンの「有効量」なる用語は、成長又は関連する
特性、即ち飼料効果、赤み肉の多い組成、乳汁生産量等
を増加させるための動物に投与すべきブタ成長ホルモン
アナログの量を意味する。このような有効量は当業者に
より容易に予想されよう。

以下の実施例は本発明の態様を更に詳細に説明するも
のである。

実施例１ 60μｇのポリアデニル化RNAを1gのブタ下垂体から単
離した。Okayama他，Mol.Cell.Biol.,２,161（1982）に
記載の方法に従ってポリ（Ａ）RNAからcDNAを形成し、
コンピテント大腸菌（HB101株）に形質転換させた。³²P
で標識し、ニック翻訳した493bp Pvu II cDNA bGHプロ
ーブを使用して5000個のコロニーをスクリーニングし
た。ハイブリダイズした200個のコロニーに、二次スク
リーニング、DNA単離及び制限酵素マッピングを実施
し、５個のコロニーを選別した２個の単離体は約900bp
のpGH cDNA配列（1,4）を含んでおり、３個の単離体は
約700bp（2,3,5）を含んでいた。

クローン番号１にM13 DNA配列決定を実施し、pBR322
−Trp発現ベクターに転写した。この構築を得るため
に、クローン１からのプラスミドDNAをインサートの
５′末端の近傍のHae II部位及びクローン１のpBR322領
域のcDNAインサートの３′末端の外側Hae II部位で切断
し、1100bpフラグメントを形成した。この1100bpセグメ
ントをSIヌクレアーゼで処理し、Xba Iブラントリンカ
ーを両端に連結した。次に、Xba IではさんだDNAセグメ
ントを、先にXBa Iで切断したpBR322−Trp発現プラスミ
ドに連結した（第１図）。

Xba Iブラントリンカーは、５′Xba I部位及び３′ブ
ラント末端、並びにATG開始コドンを形成した。

XBa I ５′CATGAGAATGGC ３′ ３′ TCTTACCG ５′ 上記発現プラスミドをPvu II及びEcoR Iで消化するこ
とにより３′末端のポリ（Ａ）エーテルを除去し、Trp/
pGH 355 bpフラグメントを分離した。このために、Pvu
II−BamH IリンカーをPvu IIで切断した３′末端に連結
させ、次にこれを制限酵素EcoR I及びBamH Iで切断した
pCFM 414発現プラスミドに連結した（第２図）。

Pvu II−BamHIリンカーはPvu II部位の半分、終始コド
ン（TAA）及びBamH I部位を含んでいた。

Pvu II BamH I ５′CTGCGC ATTC TAA G ３′ ３′GACGCG TAAG ATT CCTAG ５′ 配列決定データに基づいて２つの異なる二重鎖（ds）
のオリゴヌクレオチド配列（PGHwt,PGH−７）を上述の
ように化学的に合成した。３つのDNAの各々が５′末端
にXba I制限部位を有し且つ３′末端にApa I制限部位を
有するように割り当てた。Apa I部位のすぐ下流にHind
III制限部位を加え、mp19バクテリオファージへのクロ
ーニングを助長するようにした。

要約すると、人造遺伝子を構築するために以下の実施
例で使用されるプロトコロールは、参考資料として本発
明の一部に加えるAlton他名義のPCT公開WO83/04053に一
般論として開示されている通りである。遺伝子の構築
は、成分オリゴヌクレオチドをまず多数の二重型にアセ
ンブリし、次いでこの二重型を個々のセクションにアセ
ンブリするようにした。これらのセクションは容易に増
幅できるようにし、増幅システムから除去後、逐次又は
多重フラグメント連結を介して適当な発現ベクターにア
センブリした。

実施例２ ブタ成長ホルモンの２つの遺伝子フラグメントを同様
に構築した。一方の遺伝子フラグメント（フラグメント
１−pGHwt）は、cDNA配列決定により推測されるように2
2Kブタ成長ホルモン遺伝子配列を含んでいた。第２の遺
伝子フラグメント（フラグメント２−pGH−７）は、
「欠失ペプチド」（DP）領域中の７個のアミノ酸を欠失
する22Kブタ成長ホルモン配列（以下、21Kブタ成長ホル
モンと呼称する）をコードした。オリゴマー15、16、17
及び18はpGH−７のDPコード領域の始めと終わりの間に
ギャップを形成し、この遺伝子型に加えられるアミノ酸
をコードする。両方の遺伝子型に共通のオリゴヌクレオ
チドセグメントは１、２、３、５、６、７、８、９、1
0、12、13、14、16及び18であった（第３図）。

２つの遺伝子フラグメントの構築に必要な20個のオリ
ゴヌクレオチドをAB I DNAシンセサイザーで合成し、標
準方法を使用してゲル電気泳動により精製し、第２表に
リストした。各精製オリゴヌクレオチド（オリゴ）を1m
lのTE（10mM Tris HCl,pH7.2,0.1mM EDTA）に溶解さ
せ、260nmの吸光度を記録した。吸光度をオリゴの吸光
係数計算値と比較し、濃度を計算した。次にピコモル／
μで表した濃度を使用して遺伝子構築用の夫々のオリ
ゴを測定した。例えば13個のアデノシン、８個のシトシ
ン、９個のグアニン及び９個のチミジンを含む39量体で
あるオリゴ＃１の場合、260nmで計算した吸光係数は444
700である。260nmにおける吸光度は0.379であり、濃度
（pm/μ）は0.852である。オリゴは、Eppendorfチュ
ーブへEppendorf pipetmanを使用して量り取った。使用
量は、構築すべき各遺伝子フラグメントに100ピコモル
の各オリゴが割り当てられるようにした。即ち、オリゴ
＃１、２、３、３、５、６、７、８、９、10、12、13、
14、16及び18は２つの遺伝子構造の各々に共通であるた
め、200ピコモルを使用した。15、17、19及び20は遺伝
子構造の一方にしか見いだされないので100モルを使用
した。量り取ったオリゴを高速真空乾燥し、80％エタノ
ール、20％水あわせて15μを使用して再乾燥した。

オリゴは、完成した遺伝子構造の末端に最終的に位置
し得るオリゴマーが自己連結し得ないように選択的にホ
スホリル化した。即ちオリゴ１及び14はホスホリル化し
なかった。他の全オリゴはホスホリル化した。キナーゼ
化（kination）及び連結の全操作は50mM HEPES,pH7.6,1
0mM塩化マグネシウム及び10mMジチオトレイトールから
構成される連結用緩衝液LB中で実施した（LBは10倍濃縮
溶液、10×LBとして保存し、必要に応じて希釈した）。
オリゴ１及び14を夫々60μのLBに溶解させ、必要が生
じるまで氷上に置いた。

92μの10×LB、20μのポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer−Mannheim,10単位／μ）、１μの10m
M ATPのTE溶液、80,000,000カウント／分の放射活性を
含む³²Pγリン酸ATPの1/4μ、810μの水を含有する
キナーゼ混合物を調製した。

キナーゼ混合物の総量は920μであった。ホスホリ
ル化すべき乾燥オリゴ100pmoleにつき20μの混合物を
加えた。オリゴ２、３、５、６、７、８、９、10、12、
13、16及び18（各200pmole）を40μのキナーゼ混合物
に溶解させた。オリゴ15、17、19及び20（各100pmole）
は20μのキナーゼ混合物に溶解させた。次に、キナー
ゼ混合物中に溶解させたオリゴを収容する全チューブを
37℃で45分間インキュベートした。1/4μのアリコー
トを各チューブから取り出し、DE−81紙ストリップに別
々にスポットした。次に、溶媒の前端が下向きのストリ
ップの底部に達するまでDE−81ストリップをクロマトグ
ラフィーチャンバ内で0.35Mの蟻酸アンモニウム緩衝液
で溶出された。次にストリップをチャンバから取り出
し、100℃の乾燥オーブンで乾燥し、液体シンチレーシ
ョンカウンター（Beckman LS 6800）で分析できるよう
に細断した。ストリップを、原料のみを含む第１の断片
と、DE−81ストリップの残部を含む第２の断片とに切断
した。次にDE−81ストリップからのフラグメントをプラ
スチック製計数バイアル内に設置し、LS−6800で乾燥計
数した。カウンターは、各ストリップの原料物質に取り
込まれた放射活性を示したので、大過剰量の低温ATPで
ホスホリル化反応を追跡した。各ホスホリル化反応物に
１μの10mM ATPを加え、チューブを37℃で更に45分間
インキュベートした後、DE−81分析を実施した。次に、
オリゴを収容する全チューブ（ホスホリル化しなかった
１及び14を含む）を５分間煮沸し、迅速に冷却した。こ
の工程によりキナーゼ酵素を破壊した。

1＋ 8 2＋ 9 3＋10 5＋12 6＋13 7＋14 15＋17 16＋18 19＋20 各二重型は対の最初のほうのオリゴの番号で呼称する
ことにした。チューブ１、２、３、５、６、７、15、16
及び19を混合し、５分間煮沸した後、室温まで徐冷し
た。

次に、これらのアニールした二重型を結合して四量
体： 3＋ 2 5＋ 6 を形成した。

これらの四量体は、対の最初のほうのチューブの番
号、即ち夫々３及び５として呼称することにした。四量
体３及び５を収容するチューブの各々に５μの10mM A
TPを加えた（ATP濃度を約200マイクロモルにした）。四
量体を37℃で10分間アニールした。５μのリガーゼ
（Boehringer−Mannheim,1単位／μ）を各チューブに
加えた。連結物を37℃で５分間インキュベートした後、
氷上に１時間置いた。

二重型16の２分の１を二重型15と結合し、残りの1/2
は二重型19と結合した。これらの四量体の各々に２μ
の10mM ATPを加えた。四量体を37℃で10分間アニールし
た後、２μのリガーゼを各チューブに加えた。混合物
を37℃で５分間インキュベートし、氷上に１時間置い
た。

別の二重型を加えてより長い二重型とし、即ち二重型
７を四量体５に加えて六量体＃５とし、二重型１を四量
体３に加えて六量体＃３とし、2.5μ10mM ATP及び2.5
μのリガーゼをこれらの六量体に加えた。次に２本の
チューブを混合し、37℃で10分間インキュベートし、氷
上に１時間置いた。

夫々pGH−７及びpGHの中心オリゴを収容するチューブ
15及び19の各々に六量体＃５の３分の１を加えた。チュ
ーブ15及び19を37℃で10分間インキュベートし、氷上に
２時間置いた。次に六量体＃３を1/2ずつチューブ15及
び19の各々に加えた。10mM ATP及び５μのリガーゼの
構築に必要な全オリゴをチューブの各々に加えた。連結
物混合物を含むチューブを37℃で10分間及び４℃で５日
間インキュベートした。

３つの連結物の各々からの５μを取り出し、7M尿素
を含む厚さ0.75mmの分析用５％ポリアクリルアミドゲル
で検査した。³²Pで標識しHpa IIで切断したpBR322を標
準として隣接するレーンに展開させた。各連結物からの
アリコート及びHPa II標準を、0.1％キシレンシアノー
ル及びブロムフェノールブルー染料（80％ホルムアミド
＋染料）を含む80％ホルムアミドと20％水との溶液20μ
に希釈した。サンプルを５分間煮沸後、氷上で５分間
迅速に冷却し、ゲルに充填した。ゲルを（ブロムフェノ
ールブルーがゲルスラブの底部に達するまで）400ボル
トで45分間泳動させた後、ガラスプレートから取り出
し、サランラップに包み、Dupon Cronex X線フィルムシ
ートと共にフィルムパトローネに容れた。−70℃で露光
し、フィルムを現像した処理、連結したDNAがオートラ
ジオグラム上に現れた。レーン15には272塩基対二重型
に対応するバンドが現れた。レーン19には293塩基対二
重型に対応するバンドが現れた。これは、各連結による
夫々pGH−７及びpGHに必要なDNA構築物の一部が得られ
たことを意味する。

ゲル分析結果に基づいて、３つの連結混合物から大規
模ゲル精製を行った。40μの3M酢酸ナトリウム及び1m
lの100％エタノールを使用し、−70℃で一晩冷却するこ
とにより、各連結物をエタノール沈降させた。10000×
ｇで10分間遠心分離後、上清を除去し、100μの氷冷8
0％エタノールで濯ぐことによりDNAペレットを単離し
た。濯いだペレットを高速真空乾燥した。次に各ペレッ
トを80μの80％ホルムアミド＋染料に溶解させた。５
分間煮沸し、氷上で迅速に冷却した。次に、各連続混合
物の1/2を、7M尿素を含む厚さ3mmの５％ポリアクリルア
ミドゲルに充填した。ゲルを250〜300ボルトで２時間泳
動させた。次にゲルをフィルムパトローネに容れ、室温
でオートラジオグラフィにかけ、バンドを可視化させ
た。次に現像したフイルムをパトローネ中のゲルの近く
に置き、完全に連結した遺伝子フラグメントに対応する
各レーンのバンドの位置をマークし、カミソリの刃を使
用して所望のバンドをゲルから切り取った。3mlの注射
器（針なし）でEppendorfチューブに押し出すことによ
り各ゲルスライスを砕いた。砕いた各ゲルスライスを0.
7mlのゲル溶解緩衝液（0.5M酢酸アンモニウム、0.01M酢
酸マグネシウム、0.001M EDTA及び0.1％酢酸アンモニウ
ム、0.01M酢酸マグネシウム、0.001M EDTA及び0.1％ド
デシル硫酸ナトリウム）で覆い、37℃で一晩インキュベ
ートした。

注射器の筒にガラス繊維フィルターパッドを挿入して
ゲル−溶液混合物を過し、ｎ−ブタノールで３回洗浄
した。２と1/2容量のエタノールを加え、−70℃で１時
間保存することによりDNAを沈降させた。1000×ｇで10
分間遠心分離した処、上清を傾瀉することによりペレッ
トを単離した。ペレットを５分間高速真空乾燥した。ペ
レットを200μのTEに再溶解させ、遠心分離してポリ
アクリルアミド残渣を濃縮した後、20μの3M酢酸ナト
リウム及び550μの100％エタノールで再沈澱させた。
乾燥したDNAペレットを液体シンチレーションカウンタ
ーで計算した処、各遺伝子フラグメントを約１ピコモル
含有していることが認められた。

各DNAペレットを、２μの10×LB及び１μの放射
性標識ATP（30,000,000cpm/μ）を含有する溶液20μ
に再溶解させた。1/4μのアリコートを各チューブ
から取り出し、DE−81ストリップにスポットした。１μ
のポリヌクレオチドキナーゼを各チューブに加え、チ
ューブを37℃で30分間インキュベートした。1/4μの
アリコートをホスホリル化反応物から取り出し、別呑DE
−81ストリップの組にスポットした。次に全部で６個の
ストリップを0.35Mの蟻酸アンモニウムで溶離させ、そ
の由来の放射活性保持能力を比較した。各二重型の前後
のDE−81ストリップを比較した処、ホスホリル化が生じ
ていたので１μの10mM ATPで各反応を追跡し、反応を
完了した。37℃で45分間インキュベーション後、チュー
ブを５分間煮沸し、室温まで徐冷させた。連結緩衝液中
のアニールしたホスホリル化二重型を、適当なクローニ
ングベクターに連結できるようにした。

合成pGH構築物の各々をM13mp19にクローニングした
後、一重鎖（ss）及びdsDNAを単離させた。ss DNAを配
列決定した。３つの異なるpGH構築物の５′部分を含むX
ba I〜Apa I ds DNAフラグメントのソースとしてds DNA
を使用した。

pGH発現ベクターを構築するためには３部分のDNA連結
が必要であった（第４図）。成分１は３つのpGHmp19 DN
Aの１つから単離したXba I〜Apa I ds DNAフラグメント
であった。成分２はpGHwt遺伝子の３′を含むApa I〜Ba
mH I ds DNAフラグメントとしてpCFM414pGHベクターか
ら単離した。成分３はXba I及びBamH Iで切り出したpCF
M846プラスミドであった。pCFM846プラスミドはpCFM836
の誘導体（以下に記載）であって、pCFM836の非反復Cla
I及びKpn I部位の間の次のDNA配列： ５′CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTAC ３′ ３′ TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGC ５′ を挿入することにより調製した。プラスミドpCFM836
は、カナマイシン耐性マーカー、合成P1プロモーター、
制限部位の新しいクローニングクラスター、及び全３つ
の読取フレーム中で翻訳を停止させるための一連の翻訳
停止配列を取り込むように構築されたpCFM536の誘導体
（ATCC＃39934）として調製される。まずpCFM536をSst
I及びXba Iで消化することによりβ−ラクタマーゼ遺伝
子を欠失させる。この結果、マーカー遺伝子のみならず
完全なpar又は安定性配列、P1プロモーター、及び制限
部位のクラスターの一部も失う。カナマイシン遺伝子配
列は、Beck他，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol，
45,pp.107−113（1981）のTn5プラスミドからのSma I〜
Hind IIIフラグメントとして得られる。新しいベクター
に挿入するためのフラグメントを調製するには、Sma I
部位にSat Iリンカーを加え、Hind III部位にNde Iリン
カーを加える。カナマイシン耐性遺伝子中に天然に産生
するNco I制限部位は、カナマイシン耐性遺伝子により
特定されるカルボキシ末端ロイシンの上流のスレオニン
残基の76個のアミン酸のコドンに部位特異的突然変異を
誘発することにより、より特定的にはACCコドンをACTコ
ドンに変えることにより破壊した。par遺伝子座配列はp
SC101のHinc II〜Ava I消化フラグメント（ATCC＃3703
2）として得られる。新しいベクターに挿入するためのp
arフラグメントを調製するには、Hinc IIをまずSal Iリ
ンカーで処理し、次にAst IIリンカーで処理する。Ava
I部位をBamH Iリンカーで処理した後、Nde Iリンカーで
処理する。Aat II制限部位とXba I制限部位の間に挿入
するための付着端を有するds DNAオリゴヌクレオチドの
化学的合成により得られる合成P_Lプロモーターを含むDN
A配列を次のように加えた。

５′ CAGATCCATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATAC− ３′TGCAGTCTAGGTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGATTTATG− −CATGGCGGTGATAATGAGCACATCGATT ３′ −GTGACCGCCACTATTACTCGTGTAGCTAAGATC ５′ 全３つのフレームに翻訳停止配列を加えるために、プ
ラスミドをBamH Iで切断し、次のdsオリゴヌクレオチ
ド： ５′ GATCCGCGGATAAATAAGTAAC ３′ ３′ GCGCCTATTTATTCATTGCTAG ５′ を挿入した。

連結後、構築物の各々を大腸菌（FM6株）に形質転換
した。FM6は数種の未知のバクテリオファージに対する
ファァージ耐性を与えられたAM7の誘導体（＃CG60815
9）であり、テトラサイクリン耐性をコードする遺伝
子、並びに染色体に組み込まれるλバクテリオファージ
リプレッサー遺伝子CI857及びcroを含んでいる。

形質転換後、pGHの各型の代表的なクローンを採取し
た。共有結合による閉環状（ccc）プラスミドDNAを単離
し、アルカリ変性ccc法を使用して配列決定した。21K p
GHの合成部分の配列を第３表に示す。

実施例３ 更に、部位特異的突然変異誘発により別の４つのpGH
アナログを構築することができる。まず最初に、p84pGH
22KからのXba I〜BamH Iの小さいフラグメントをM13mp1
0にクローニングし、一重鎖ファージDNAを単離する。ア
ナログの各々のプライマーを合成及びキナーゼ化し、ア
ニールして一重鎖DNAを得る。d NTP、ATP、T₄DNAリガー
ゼ及びクレナー（klenar）酵素の４種を加え、所望の変
異を含むDNAの第２のストランドを合成する。DNAを宿主
株JM103にトランスフェクトし、プラークを溶菌させ
る。正しいクローンはアナログ配列の³²P標識プライマ
ーへのハイブリダイゼーションにより決定される。ジデ
オキシ配列決定により配列を確認し、M13mp10からのXba
I〜BamH Iフラグメントをp846に再びクローニングす
る。クローンのプライマーを以下に列挙する。

アナログ1:（Tyr,Ile,Pro）TCGAACGTGCTGAAGGTCAGCG アナログ2:（Pro）GTGCTTACATCGAAGGTCAGCG アナログ3:（Arg）CAAAGAATTCGAAGCTTACATCCC 第４のクローン（−Glu,Arg…Glu−）は２つの逐次部
位特異的突然変異誘発を必要とする。第１のプライマー
（Ａ）はClu,Argを除去する。この部位特異的突然変異
誘発後、一重鎖DNAは精製され、第２のGluを除去する第
２のプライマー（Ｂ）により部位特異的突然変異誘発の
第２ラウンドが実施される。

アナログ４プライマー： Ａ TACAAAGAATTCGCTTACATCCCG Ｂ CTTACATCCCGGGTCAGCGTTA 実施例４ 22K及び21Kの各々に発酵工程を実施した。細胞密度は
光学密度が65までとなるようにした。ブタ成長ホルモン
又はそのアナログの形成量は50〜75mg/OD L（３〜3.9gm
l/L）であった。

工程は大腸菌FM6/856 pCFM pGH＃３（22K pGH）及び
＃８（21K pGH）を使用して実施した。前記の各々は、
ウォークアウェイ（walkaway）プラスミド及びプラスミ
ド安定生のためのカナマイシン薬物マーカーを有する。第１表 （培地組成）成分（培地組成） バッチ(8L) フィード(3L) 酵母エキス 40g 400g （NH₄）₂SO₄ 30g 15g K₂HPO₄ 56g − KH₂PO₄ 64g − Dow P−2000 2ml − グルコース 40g 1300g （MgSO₄−7H₂O）（1M） 32ml 103ml 微量金属溶液 16ml 28ml ビタミン溶液 16ml 28ml カナマイシン 20μg/ml 発酵工程はパッチ供給式で炭素制限下に実施した。温
度30℃及びpH7.0を維持した。酸素溶解量は50％の空気
飽和に維持した。サンプルを等間隔で取り出し、成長と
酢酸レベルを測定した。クーマシー染色SDS−PAGEを使
用してpGH濃度を測定した。純粋なpGHは入手し難いの
で、純粋bGH及びIFN−α Conを標準として使用した。Sh
imodzu積分器／スキャナーを使用してゲルを走査し、２
つの標準の平均を使用してpGHの濃度及び総タンパク質
の百分率を計算した。

温度を42℃に上げることにより〜25のODで細胞を誘導
し、封入体を顕微鏡で観察した。誘導から約３〜４時間
後の細胞封入体は１〜２個であった。２つのアナログ展
開からの予備誘導サンプルにpGHは見いだされなかっ
た。第４表及び第５表は野生型）22K）及びアナログ（2
1K）の結果を示す。

これらの表に示すように、22K pGHで最大量（70〜75m
g/OD L）のpGHが得られた。21KのpGHアナログでは、ア
ナログの量はODと共にピークに達した後、恐らくタンパ
ク質分解によりODの減少と共に低下し始めることが認め
られる。恐らく誘導から５〜６時間後が発酵を停止する
最適時間であると判断できる。

実施例５ 下垂体から誘導されるブタ成長ホルモンを標準として
使用して、10日間の体重増加バイオアッセイ中に下垂体
切除したラットで、組換により作製されるアナログの生
物活性を測定した。

本発明の21K pGHアナログ及び下垂体から誘導したpGH
（pd−pGH）調製物を夫々３回の投与量に分け、下垂体
切除した雌ラットに12日間の順応期間後の０〜９日目
に、１日に２回0.1mlを皮下注射した。凍結乾燥物からp
H9.5の重炭酸緩衝液（30mM）でpd−pGH調製物を復元
し、1mg/mlの濃度を有するストック溶液を形成した。全
組換サンプルと同様に、世界保健機構（WHO）緩衝液
（0.2％ラクトース、0.2％マンニトール、30mM NaHCO₃,
pH8.6）でストック溶液を300、100及び30μg/mlに希釈
した。サンプルは実験の間４℃で保存した。試験材料の
アリコートについてタンパク質同定を実施した。

化学分析 化学分析によると、pd−pGHはpGH単量体の85％に過ぎ
ないことが判明したので、凍結乾燥材料重量で換算した
投与量の1.18倍を投与した。標準としてBSAのWHO緩衝溶
液を使用するBradfordアッセイにより全注射溶液のタン
パク質含有量を分析した。配合は予想されるタンパク質
濃度に適合するように変化させた（第６表）。pGH注射
液のタンパク質濃度を吸光係数により決定する正確な方
法はないので、全実際値はBradfordの結果により示され
る量とした。

体重増加 体重増加の速度は全調製物の投与量に相関して加速し
た。従って、０日目から10日目の実際の体重変化により
生物応答を測定した。本発明の21K pGHアナログは組換2
2K pGH及びpd−pGHよりも低い２つの投与量でより大き
い体重増加をもたらした。試験投与量のうちで最高の21
K pHGアナログ投与量でも体重増加にそれ以上影響はな
く、これは恐らくより低い投与量で最大速度に達したた
めであると思われる。第７表は実際の体重変化を示す。
第８表は下垂体標準の回帰係数を使用して対数（投与
量）対体重変化の一次回帰分析により決定した各調製物
の相対力価を示す。

以上、本発明の好適態様について説明したが、当業者
はこの開示内容から各種の変形及び改良を想到し得るも
のと思われる。従って、本発明は特許請求の範囲に該当
する限り、このような全変形も包含する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザ，ローレンス・エム アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 91360、サウザンド・オークス、ウイザ ースプーン・ドライブ・1302 (56)参考文献 特開 昭59−173083（ＪＰ，Ａ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の式： Ｚ−pGH_1-31−pGH_39-190 （式中、Ｚは水素、MET、ALA又はMET−ALAである）によ
   って表わされるアミノ酸配列を含み、ブタ由来の他のタ
   ンパク質を本質的に含まない、ブタ成長ホルモンアナロ
   グ。
2. 【請求項２】ＺがALA又はMET−ALAである、請求項１に
   記載のブタ成長ホルモンアナログ。
3. 【請求項３】ＺがALAである、請求項２に記載のブタ成
   長ホルモンアナログ。
4. 【請求項４】請求項１に記載のブタ成長ホルモンアナロ
   グを、適当な担体と組み合わせて含む、哺乳動物の成長
   促進用組成物。
5. 【請求項５】下記の式： Ｚ−pGH_1-31−pGH_39-190 （式中、Ｚは水素、MET、ALA又はMET−ALAである）によ
   って表わされるブタ成長ホルモンアナログをコードする
   DNA。
6. 【請求項６】トランスフェクションされた培養細胞中
   で、請求項５に記載のDNA配列を発現することが可能な
   発現ベクター。
7. 【請求項７】下記の式： Ｚ−pGH_1-31−pGH_39-190 （式中、Ｚは水素、MET、ALA又はMET−ALAである）によ
   って表わされるアミノ酸配列を含み、且つブタ由来の他
   のタンパク質を本質的に含まないブタ成長ホルモンアナ
   ログの有効量をヒトを除く哺乳動物に投与することから
   なる、該動物の成長を促進する方法。
8. 【請求項８】ＺがALA又はMET−ALAである、請求項７に
   記載の方法。