DK174341B1 - Porcin væksthormonanalog, DNA-sekvens kodende for denne, ekspressionsvehikel for sekvensen samt komposition omfattende vækstanalogen - Google Patents

Description

i DK 174341 B1

Opfindelsen angår en gruppe hidtil ukendte analoge til porcint væksthormon. Især angår opfindelsen rekombi-nant frenstillede analoge til porcint væksthormon, hvori en eller flere rester svarende til aminosyreresterne 32-5 38 i aminosyresekvensen for naturligt forekommende por cint væksthormon er slettet, samt DNA-sekvenser og ekspressionsvehikler til disse rekombinant fremstillede analoge. Endelig angår opfindelsen kompositioner, der indeholder sådanne analoge.

10 Hypofysen hos normale pattedyr fremstiller og udskiller i blodstrømmen en forbindelse, der kaldes væksthormon ("GH"). Aminosyresekvenserne for human ("hGH"), bovine ("bGH") og porcine ("pGH") væksthormoner minder om hinanden. Se Dayhoff, Atlas of Protein 15 Sequence and Structure, Volume 5, Supplement 6, National Biomedical Research Foundation, Washington, 120-121 (1976); og Seeburg et al., DNA, 2, 37-45 (1983). Man kender også aminosyresekvensen og nukleo-tidsekvensen for laksevæksthormon ("sGH"), Sekine et 20 al., Proc. Nat'l, Acad, Sci. (USA), 82, 4306-4310 (1985). Baseret på en parallelføring af sekvenserne for bGH, hGH, oGH, pGH og sGH til opnåelse af den højeste grad af homolog! mellem disse væksthormoner kan man identificere visse i høj grad bevarede regioner. Der 25 refereres f.eks. til Dayhoff, se ovenfor, og Sekine et al., se ovenfor.

In vivo fremmer væksthormondannelse af proteiner ud fra aminosyrer. Der forekommer i begyndelsen efter indgivelsen et fald i plasmaglucose og derefter en 30 langsom vækst i plasmaglukose, og der forekommer en nedbrydning af fedtstoffer til fedtsyrer. Man betegner de virkninger, der har forbindelse med væksthormon henholdsvis som fremme af vækst (dvs. forøget vægt), insulinbesparelse, diabetogene og lipolytiske virkninger.

3 5 Man har også meddelt en antilipolytisk virkning, men denne synes at stå i forindelse med hormonets insulin- 2 DK 174341 B1 agtige aktivitet. Goodman, Metabolism, 19, 849-855 (1970).

Derudover minder væksthormoner strukturmæssigt om lactogene hormoner og kan fremkalde lignende virk-5 ninger. For eksempel afviger hGH fra human placental lactogen i ca. 15% af aminsyreresterne. Wallis et al., i Growth Hormone and Related Peptides, Pecile et al., eds., Excerpta Medica, Amsterdam, 1-13 (1976). Human væksthormon afviger fra human prolactin ved ca. 25% af 10 aminosyreresterne. Wallis et al., se ovenfor. Subkutan injektion af bGH eller rekombinant bGH ("rbGH") forøger mælkeproduktionen hos køer, geder og får.

Eppaird et al., J. Dairy Sci. 68, 1109-1115 (1985),

Bauman et al., J. Dairy Sci., 68, 1352-1362 (1985), 15 Hart, Proc. Nutr. Soc., 42, 181-194 (1983), og se Hart et al., Biochem. J., 218, 573-581 (1984).

Isolering af væksthormon fra hypofyser involverer , at man lyserer hypofyseceller, der står i forbindelse med produktion af hormonet. Imidlertid vil lysis 20 af cellerne frigive proteolytiske enzymer (proteaser), der kan spalte i det mindste en del af det naturligt forekommende hypofysevæksthormon ("nGH") til fragmenter. Ydermere vil nGH, når det først findes i blodstrømmen, være udsat for proteaser, der kan spalte nGH 25 i samme eller i andre fragmenter. En stor del af forskningen, hvad angår vækst af væksthormoner, angår bestemmelse af, om nGH eller fragmenter deraf eller begge fører til de virkninger, der står i forbindelse med væksthormoner, der er blevet ekstraheret eller som cir-30 kulerer i blodstrømmen. Man kan i denne forbindelse bemærke, at analoge af hGH, der modstår fordøjelse af proteasen trypsin, idet lysin eller argininrester er blevet kemisk modificeret, har en tydelig, men forsinket vækstfremmende diabetogen og insulinagtig aktivi-35 tet. Cameron et al., Biochem. Biophys. Acta, 265-260 (1985). Ikke desto mindre mener man, at bestemte af- 3 DK 174341 B1 snit("domæner") af nGH molekylet er ansvarlige for en eller flere af virkningerne af nGH. Afhængig af, i hvor høj grad man kan lokalisere centrene for virkningerne af nGH på denne måde kan man fremsitlle fragmen-5 ter og analoge, hvor de proteinsyntetiske, insulinsparende diabetogene og lipolytiske virkninger kan ændres selektivt.

I denne forbindelse vil positionerne af aminosy-rerester, der findes i fragmenter eller analoge af 10 væksthormonet, blive identificeret ved en nedre mærkning, hvori tal angiver tilstedeværelse af rester, som man finder samme sted i det tilsvarende nGH, og hvori sletninger angives med et komma. Por eksempel vil naturligt forekommende porcin væksthormon på denne måde 15 blive betegnet med pGH-^gQ.

En 20.000 Dalton variant ("20K") af hGH (22.000 Dalton), der kan isoleres fra hypofyser, og som svarer til hGH1_31 47-191' fremmer vækst hos rotter, hvor hy pofysen er fjernet, er ikke hyperglykæmisk eller hype-20 rinsulinæmisk hos hunde, er hverken insulinsparende eller lipolytisk in vivo eller in vitro, og er mindre reaktiv ved radioimmunassays for hGH end selve hGH.

Lewis et al., J. Biol. Chem. 253, 2679-2687 (1978);

Frigeri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 91, 25 778-782 (1979); Lewis et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun., 92, 511-516 (1980); og Lewis et al., Endocr.

Res. Commun., 8, 155-164 (1981). Denne 20K variant af hGH er et produkt af modificering efter transkription.

Lewis et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., se oven-30 for. Det er muligt, at 20K varianten af hGH er en mere vigtig fremmer af vækst, end man ville tro ud fra dens bioaktivitet in vitro, på grund af dens tendens til at dimerisere og således undslippe nedbrydning i nyrerne.

Baumann et al., Endocrinology, 117, 1309-1313 (1985).

35 Der findes også referencer til fragmenter af

hGH, der inkluderer aminosyrerester, slettet fra 20K

4 DK 174341 B1 hGH. Selv om det ikke meddeles, at disse fragmenter fremmer vækst, udviser nogle af disse egenskaber, der kan være relevante i forbindelse med de diabetogene og lipolytiske egenskaber af væksthormon.

5 Et syntetisk fragment, der svarer til resterne 31-44 i hGH, er lipolytisk in vivo hos forsultne dyr og in vitro [Yudaev et al., Biokhimiya, 41, 843-846 (1976)], men stimulerede kun glukoseoptag (dvs. var insulinsparende) efter in vitro præinkubering ved fravær 10 af GH, dvs. en ikke-fysiologisk tilstand. Yudaev, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 110, 866-872 (1983). Visse peptider, der er analoge til hGH, er diabetogene, men en analog til hGH52_77 er det ikke.

Lostroh, et al., Diabetes, 27, 597-598 (1978). Et pep-15 tid, der består af hGH20_4-|_, har ingen aktivitet.

Reagan, Diabetes, 27, 883-888 (1978). Et peptid, der består af hGH-L_36, har ingen virkning på glukose i blodet eller på vækst. Chillemi, et al., i Growth Hormone and Related Peptides, Pecile, et al., eds. Excerpta 20 Medica, Amsterdam, 50-63, (1976).

Imidlertid frembringer et peptid, der svarer til hGH32_ .46, en nedgang i frie fedtsyrer i serum og er insulinsparende, når det indgives sammen med insulin in vitro [Frigeri et al., i Proceedings, 64th Annual 25 Meeting of the Endocrine Society, San Francisco, 101 (Abstract 88) (1982)], og in vivo [Rudman, US patent skrift nr. 4 558 033 , og Stevenson et al., Diabetes, 33, 149A (Abstract No. 572) [1984)]. Fragmenter og analoge (deriblandt med substituering af heterologe 30 aminosyrer eller stereoisomere) af hGH32_4g er også insulinsparende, når de indgives sammen med insulin in vivo. Jones et al., vor samtidige US patentansøgning SN nr. 501 024.

Opfindelsen angår en gruppe porcine væksthormon-35 analoge, der opretholder den biologiske aktivitet og de biologiske egenskaber af naturligt forekommende porcin 5 DK 174341 B1 væksthormon, idet de forøger væksthastigheden, fodereffektiviteten og lypolysen eller mælkeudbyttet.

Især angår opfindelsen en rekombinant porcin væksthormonanalog, der omfatter aminosyresekvensen: 5 Z-pGH1_31-(X)n_PGH39-igo hvori: 10 hvori n er 0 eller 1; Z er hydrogen, MET, ALA eller MET-ALA; og X er et peptid af aminosyreester omfattende 15 -GLU-ARG-ALA-TYR-ILE-PRO-GLU- idet én eller flere af disse rester er slettet, og al-leliske versioner deraf.

Opfindelsen angår endvidere et syntetisk gen, 20 der koder for porcine væksthormonanaloge med den ovenfor givne sekvens. Opfindelsen angår endvidere fremgangsmåder til fremstilling af forskellige replicerbare kloningsvehikler, der indeholder DNA sekvenserne, såvel som ekspressionsvehikler, der indeholder DNA sekvenser-25 ne, der er nyttige til at styre produktionen af de porcine væksthormonanaloge i transformerede bakterier eller transficerede cellelinier. Derudover tilvejebringer opfindelsen et gen, der koder for de analoge af porcin væksthormon med den ovenfor beskrevne aminosyre-30 sekvens. Opfindelsen omfatter også de forskellige replicerbare kloningsvehikler, ekspressionsvehikler og transformerede bakteriekulturer eller cellekulturer, alle med indhold af den ændrede genetiske information, der er nødvendig til produktionen af de porcine vækst-35 hormonanaloge ifølge opfindelsen.

De porcine væksthormonanaloge ifølge opfindelsen 6 DK 174341 B1 frembringes på i det væsentlige ren form og eksisterer i det væsentlige fri for andre proteiner af porcin oprindelse .

Man kan formulere de porcine væksthormonanaloge 5 med passende egnede bærere og adjuvanter, deriblandt andre proteiner, f.eks. serumalbumin, til opnåelse af acceptable kompositioner, som på effektiv måde indgives til værtsdyret.

På tegningen viser 10 fig. 1 en skematisk illustration af konstruk tion af plasmidet pBR 322-Trp-gGH; fig. 2 en skematisk illustration af konstruktion af plasmid pCFM-414-Trp-pGH plasmid ; 15 fig. 3 en diagrammatisk beskrivelse af den samling af oligonukleotider, der benyttes til fremstilling af xbal Apal pGH DNA fragmenter, der benyttes ved konstruktionen af pGH og pGH-7; og 20 fig. 4 en diagrammatisk illustration af de kom ponenter, der benyttes ved konstruktionen af plasmidet pCFM 846-pGH.

Som tidligere nævnt kan man henføre de fysiologiske aktiviteter af væksthormoner til forskellige do-25 mæner i det fuldstændige polypeptid. sådanne aktiviteter kan også skyldes en bestemt foldning eller modifikation af det fuldstændige polypeptid, frigivelse af medierende faktorer, eller "forurening" med andre hypofyse-peptider, f.eks. a- og β-lipotropien, der selv kan 30 have en lipolytisk aktivitet [Kuhn et al., J. Clin. Endocrinol, Metab., 56, 1338-1340 (1983)]. Frigeri et al., Hormone Res., 17, 197-201 (1983).

7 DK 174341 B1

En måde at skille virkningen af forurenende stoffer fra virkningen af rensede hormoner på, er at undersøge aktiviteten af et væksthormon, der er fremstillet uden tilstedeværelse af andre hypofysekomponen-5 ter, f.eks. rekombinant pGH ("pGH"). Man har sekvensopdelt genet for pGH og har eksprimeret det i proka-ryotiske og eukaryotiske celler i en række former.

Keshet et al., Nucleic Acids Res., 9, 19-30 (1981), woychik et al., Nucleic Acids Res., 10, 7197-7210 10 [1982), Seeburg et al., DNA, 2, 37-56 (1983), Kopchick et al., DNA, 4, 23-31 (1985), og George et al., DNA, 4, 273-281 (1985).

Opfindelsen tilvejebringer rensede og isolerede polypeptidprodukter med en eller flere af de biologiske 15 egenskaber (f.eks. immunologiske egenskaber og in vitro biologisk aktivitet) og fysiske egenskaber (f.eks. molekylvægt) af naturligt forekommende pGH. Disse poly-peptider er også ejendommelige ved at være produktet af kemisk syntese eller af eksprimering i prokaryotiske 20 eller eukaryotiske værtsorganismer (f.eks. af bakterier, gærarter, højere planter, insektceller og pattedyrsceller i kultur) af exogene DNA sekvenser, opnået ved genomisk cDNA kloning eller ved gensyntese. Produktet fra typiske gærceller (f.eks. Saccharomyces 25 cerevisiae) eller prokaryoter (f.eks. Escherichia coli (E. coli)) værtsceller er ikke associeret med nogen som helst pattedyrsproteiner. Produkterne fra mikrobiel eksprimering i vertebralceller (f.eks. ikke humane pattedyr og fugle) er ikke associeret med nogen som helst 30 form for humane proteiner. Afhængigt af den anvendte værtsorganisme kan man glykosylere polypeptiderne ifølge opfindelsen med pattedyrs eller andre eukaryotiske carbonhydrater, eller de kan forekomme ikke-glykosyle-rede. Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan også in-35 kludere en begyndelses methionin aminosyrerest (ved stilling -1).

8 DK 174341 B1 I denne forbindelse vil betegnelsen "peptid af aminosyrerester" referere til et peptid, der omfatter aminosyrerne -GLU-ARG-ALA-TYR-ILE-PRO-GLU-, hvori en eller flere aminosyrer er blevet slettet. I opfindel-5 sens sammenhæng kan sletningen af aminosyrerne i dette peptid være foregået i rækkefølge eller tilfældigt.

Betegnelsen "fremstillet" vil med henblik på en DNA sekvens eller et gen betegne et produkt, der enten er fuldstændig syntetiseret ved en samling af nukleo-10 tidbaser eller afledt syntetisk. Betegnelsen vil således ikke omfatte produkter, der er "syntetiseret" ved cDNA metoder, der omfatter fremgangsmåder med genomisk kloning, og hvor man benytter udgangsmaterialer, der oprindelig er af biologisk oprindelse.

15 I denne forbindelse vil betegnelsen "alleliske versioner" angå modifikationer af en eller flere aminosyrer i sekvensen for de porcine væksthormonanaloge ifølge opfindelsen, der ikke medfører ændring af den biologiske aktivitet af den analoge. Sådanne alleliske 20 versioner kan uden videre bestemmes af en almindelig fagmand.

Man bør bemærke, at i tilfælde af, at Z er ΜΕΤ-ALA, fjerner man fortrinsvis MET resten til opnåelse af en analog, hvori Z er ALA. En foretrukket porcin 25 væksthormonanalog ifølge opfindelsen omfatter en porcin væksthormonanalog med formel (I), hvori n er 0 og Z er ALA. En anden foretrukket porcin væksthormonanalog omfatter en porcin væksthormonanalog med formel (I), hvori n er l, Z er ALA og X er en rest med sekvensen: 30 -GLU-ARG-ALA-GLU- ("ALA-pGH1_34# 38_190").

En yderligere foretrukket porcin væksthormonanalog ifølge opfindelsen omfatter en analog med formel (I), hvori n er 1, Z er ALA og X er en rest med sekvensen: 35 GLU-ARG-ALA-TYR-ILE-GLU ("ALA-pGH-^g 38_190")·

En yderligere foretrukket porcin væksthormonanalog 9 DK 174341 B1 ifølge opfindelsen omfatter en analog med formel (I), hvori n er 1, Z er ALA og X er en rest med sekvensen: -GLU-ALA-TYR-ILE-PRO-GLU-("ALA-pGH1_32/ 34_190") · I Tabel 1 vises aminosyresekvensen for naturligt 5 forekommende pGH.

I de nævnte kompositioner ifølge opfindelsen benyttes en effektiv mængde eller dosis af de porcine væksthormonanaloge ifølge opfindelsen. I denne forbindelse vil betegnelsen "effektiv mængde el-10 ler dosis" af porcine væksthormonanaloge referere til en mængde porcin væksthormon, der skal indgives til et dyr til opnåelse af forøget vækst eller lignende egenskaber, dvs. bedre fodereffektivitet, mindre fedt i kødet, bedre mælkeproduktion osv. Sådanne effektive mæng-15 der eller doser fastlægges let af fagmanden.

De følgende Eksempler skal yderligere illustrere udførelsesformerne af opfindelsen.

Eksempel 1 20

Man isolerede 6 0 pg polyadenyleret RNA fra 1 g grisehypofyser. Man opnåede cDNA ud fra polyA RNA ved fremgangsmåden, beskrevet af Okayama et al., Mol. Cell.

Biol., 2, 161 (1982) og transformerede det i en forbe-25 redt E. coli (stamme HB101). Man gennemsøgte 5000 kolonier under anvendelse af en 32P-mærket haktranslate-ret 493 bp PvuII cDNA bGH sonde. Heraf hybridiserede 200 kolonier, hvoraf man benyttede 5 til en anden gennemsøgning, en isolering af DNA, og en kortlægning ved 30 hjælp af restriktionsenzymer. To isolater indeholdt ca. 900 bp af pGH cDNA sekvens (1,4), og tre indeholdt ca. 700 bp (2,3,5).

35 1 o DK 174341 B1 —< <-> «3 L·) <0 OU TJ 03 003 03 O»— l- 03

i <—> — θ'— ιΛυ- >— O O )- Φ <— o O ►“O

O O O *3 O ^ O'— '—«O'— O C7i — < w"i O — 3>> >— )-¾ 03 ou o o 3"> ou *— O r— O —* r- Oj Oo> ou o u <>> o CD 0¾ 0¾ o— < ιΛ U fl 0¾ ►— -*-) O'— 03 OC 03 OC ow 03 < L· y— fO >— 4> <— < '— cC IS\ h— <D >— O) O^ o> o *— οσν o cn <« <E i— 03 < C 0*0 O'— O i- 03 OC 03 <*— < ·— O — O -C ►- 4» < /« <f— 03> OO' 0¾ 0> <Co O'— < 1¾ Οσ' OC O 1/1 OC O Q. O0> 0¾ < L· L·- <T3 ¢¢,- <·,- < v> >— x; o — o jz o — O O' OÆ <ίΌ 0¾ ►— D, o «3 < -J 0¾ )— i- 003 OC OOW. O'— OOC O Q. O O ^ O -C CSih-OJ <*— rv. o O )— fO <sj < *— < i/i ^ <£ >i <C*J O *— o 0*1 h-trt 0> h (j Dl O« « o Cd θν> ΟΦ < C7» O CD 04) >— Oj Ocrt 3 U < ·- >— — OL· OL· I— — I— JS < *—

t— w 0£ < — <n3 < <0 <M- )— Q. O -C

OO O C OL· OC OL· O >t < ν' 03 OL· <£**“ 04) <£— 04) O'— < >i H-0) o Cl o σν i— <✓> οσν ·< </» οσ» <c *— θ'- os 0¾ OL· OC 03 03 OO. O Q.

►— 4) O'— <>) <— >— 4) <«✓> < W

o — 0¾ r— -*-j oo> o*— οσ> o« 0¾ OOtrt ocn o cn 0¾ ΟΦ 03 OL· O^ ·"* O >1 OL· OL· o— >— .C <— <>% <>) i)— U O fO c eO 0¾ >— Q. O 3> ^ <C —

1 I

O 3 (_) 3' O O C 0 3 Q O C 03 O O S- Ovn O O C

p- c p- c cr < — < — cn < — >— c <r o -c < >, cn >— £ J o — O — O ση O σι o cn o — — if -J < r- ™ I— Cl 03 o— <>> oa. o<— oa < c o c o« m — c t— o o— <£ vn i— ns «t vn <— i— .c o·—

" O— O > O On O Ό 0> O (O U O' S— a O nS

CQ O Ό Οβ 03 Ovn OO Ovn Ovn o vn >— vn O ·— O *- < — <>n OS. < >, <>, 0>> 0>, ^ O ns O'« ocn <— oa <— < — >— U )— t_> O (Li OC OO O 5-, O >i 03 03 OS- OS.

O >— ~ <vn OU O — O— I— Cl i— C OC OC

h- a <ns oa οσι ocn o— o— i— m < vn (— "O O ns OC O s. 03 Ovn OC 03 OS.

o<— o— y— — o -c i— c =C>n s— — >— c oc O« ons <t ·— «£—> o I— «£ — <— O— c vn 03 OH- C OS. OOO oa 003 OC 003 O 3 I— C " f— J= <>1 vOOS- OS- —«f,— < — vOh— C < — O— t— a h— —> oa "031 ocn·—IO·— ocn 03 <C3 010 O ns o S- 01. <>1 C3>1 O'— 1— C S— C O'— O'— OC «ί>η O — O— ►— 1¾ O — o i— ø a ΟΌ 1— vn »— _i Οση ocn 0> o — os- o σ' oo oc o ·— < ns os. oc S— ns oc OS. OU <— >— (C O— <>n O > <vn ons oa OOS o> ΟΌ t— o i— a

OS- OS- 03 OC OC OCT Oon OC OCT

oc OC <— »— ·— >— <— OS- os. <vn o S- »-•1/1 ^-vs Οση «ί— <C— oc O« c ιβ Οιβ os. 03 >— c os- 03 oa 00 ovn o cn o.c s— c v— .c o j= s— C et vi os- <>n o S- <v t— ·— y~ a c —i o·— om oa «ti— o<e OO 003 03 003 < S- oos. *— 3 O·— vn os. on <c — -t — 00 (— c oc moc o-C ooo>n

oa ocn όση Οι— (— in —< vn O— —I h U

O *v Ovn o s. 03 OS. 0>| 03 Ovn »—C <>n OC 1— C O JZ o— v- C «5>n < ε < 1— s— vn o— <—1 ocn O I— <t —

0(0 o u oc 01- O >, v-a o ns 0*J

O'— <>n ►— -C OC O— <vn O'- ^-C

O O (— vJ 1— a s— vn O Cn Ons o Ό «tE

<tO OS. Ovn OC I— C <3 Oa θ'- OS. O J= 0>n i— Æ S-JC 3— <vn t— ιβ oa i— u >— a — a ocn οό o > oc oa oc οση o — 03 s— a ocn >— .C <vn — £1 OS- ν-Ό 1— c <vn OS.

ί— a o ό p— a o ό o> o— oo oo

OOOOOOOQO

Q-aa a aaaaa 11 DK 174341 B1

Man benyttede klon nr. 1 til Ml3 DNA sekvensopdeling og overførte den til en pBR322-Trp ekspressionsvektor. Til opnåelse af denne konstruktion gennemskår man plasmid DNA fra klon 1 ved et Haell sted 5 tæt ved 5'-enden af indsætningsstykket og ved et Haell sted uden for 3'-enden af cDNA indsætningsstykket i pBR322 regionen i klon 1 til opnåelse af et 1100 bp fragment. Dette 1100 bp segment blev behandlet med SI nuklease, og man bandt en Xbal-stumplinker til begge 10 ender. Derefter ligerede mn DNA segmentet, der var indrammet af Xbal i et pBR322-Trp ekspressionsplasmid, der var gennemskåret med Xbal (fig. 1).

Xbal-stumplinkeren tilvejebragte et 5'-xbal sted og en 3' -stump ende, såvel som et ATG initieringsko-15 don.

Xbal 5'CTAGAGAATGGC 3' 3' TCTTACCG 5'

Man fjernede polyA halen ved 3'-enden ved at un-20 derkaste det ovennævnte ekspressionsplasmid en Pvull og EcoRI fordøjelse til frigivelse af Trp/pGH 355 bp fragmentet. Til dette ligerede man en Pvu-BamHI linker ved den Pvull gennemskårne 3'ende, og dette produkt ligerede man derefter i et pCFM 414 ekspressionsplasmid, der 25 var blevet gennemskåret med restriktionsenzymerne EcoRI og BamHl (fig. 2).

PvuII-Baml linkeren indeholdt halvdelen af Pvull stedet, termineringskodoner (TAA) og en BamHl sted.

Pvull BamHl 30 5'CTGCGC ATTC TAA G 3' 31GACGCG TAAG ATT CCTAG 5' På basis af sekvensopdelingsdata syntetiserede man kemisk to forskellige dobbeltstrengede (ds) oligo-35 nukleotidsekvenser, som beskrevet ovenfor (PGHwt, PGH-7). Hver af de tre DN'er blev tilkendt et Xbal- 12 DK 174341 B1 gennemskæringssted ved 5'-enden og et Apal gennemskæringssted ved 3'-enden. Lige nedstrøms for Apal-stedet indsatte man et Hindlll gennemskæringssted til lettelse af kloning i mpl9 bakteriophagen.

5 Kort fortalt er den serie af fremgangsmåder, der benyttes i de følgende Eksempler til fremstilling af kunstig gen, i det store og hele som nævnt i vor Alton, et al., PCT publikation nr. W083/04053, til hvis hele Indhold vi herved refererer. Man konstruerede generne, 10 så man først samlede oligonukleotidkomponenterne til adskillige duplekser, som derefter blev samlet til forskellige sektioner. Disse sektioner blev konstrueret, så de kunne mangfoldiggøres, og når de blev udtaget fra et sådant system, kunne de samles i rækkefølge 15 eller ved ligering af mange fragmenter i en passende ekspressionsvektor.

Eksempel 2 20 Man konstruerede parallelt to genfragmenter til porcint væksthorman. Et genfragment (fragment 1-pGHwt) indeholdt en 22K porcin væksthormon gensekvens, som bestemt ved cDNA sekvensopdeling. Et andet genfragment (fragment 2-pGH-7) kodede for 22K porcin væksthormon-25 sekvensen minus -7 aminosyrer i "sletningspeptidregionen" (DP), (herefter benævnt 21K porcin væksthormon).

De oligomere 15, 16, 17 og 18 førte over gabet mellem begyndelsen og slutningen af den DP kodende region i pGH-7 og kodede for de aminosyrer, man tilføjede i den-30 ne genversion. Oligonukleotidsegmenter, der var fælles for begge genversioner, var nr. 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16 og 18 (fig. 3).

Man syntetiserede de 20 oligonukleotider, der var nødvendig til konstruktionen af de to genfrakmenter 35 på ABI DNA synthesizer og rensede dem ved gelelektrofo-rese under anvendelse af standardfremgangsmåder; de an- 13 DK 174341 B1 gives i Tabel 2.

5 14 DK 174341 B1 TABEL 2 5 1 5' - CTAGAAGGAGGAATAACATATGGCTTTTCCAGCAATGCC - 3'' 2 5' - TCTCTCGAGCCTGTTCGCTAACGCTGTACTGCGTGCTCAG - 3' 3 5' - CACCTGCATCAACTGGCTGCAGACACTTACAAAGA - 3' 5 5' - TCCCGGCGCCAACTGGTAAAGACGAAGCTCAACA - 3' 10 6 5' - CAGATCTGATGTTGAACTGCTGCGTTTCTCT - 3' 7 5' - CTGCTGCTGATTCAATCTTGGCTGGGGCCCTTCA - 3' 8 5' - GAGAGGCATTGCTGGAAAAGCCATATGTTATTCCTCCTT - 3' 9 5' - AGGTGCTGAGCACGCAGTACAGCGTTAGCGAACAGGCTCGA - 3' 10 5’ - GAATTCTTTGTAAGTGTCTGCAGCCAGTTGATGC - 3' 15 12 5' - TCTCTGTTGAGCTTCGTCTTTACCAGTTGGCGCC - 3' 13 5' - GCAGAGAGAAACGCAGCAGTTCAACATCAGA - 3' 14 5' - AGCTTGAAGGGCCCCAGCCAAGATTGAATCAGCA - 3' 15 5' - ATTCGGTCAGCGTTACTCTATC -*3' 16 5' CAGAACGCTCAGGCTGCATTTTGCTTCTCTGAAACCA - 3' 20 17 5' TTCTGGATAGAGTAACGCTGACC - 3' 18 5' GGGATGGTTTCAGAGAAGCAAAATGCAGCCTGAGCG ** 3' « 19 5' ATTCGAACGTGCTTACATCCCGGAAGGTCAGCGTTACTCTATC - 3' 20 S'TTCTGGATAGAGTAACGCTGACCTTCCGGGATGTAAGCACGTTC - 3' 25 30 35 15 DK 174341 B1

Hvert renset oligonukleotid (oligo) blev opløst i 1 ml TE (10 mM Tris HC1, pH 7,2 0,1 mM EDTA), og man målte absorbansen ved 260 nm. Absorbansen blev sammenlignet med den beregnede extinktionskoefficient for 5 oligo, og man beregnede koncentrationen. Derefter benyttede man koncentrationen i pmol/μΐ som et mål for de enkelte oligo'er til genkonstruktionerne. For eksempel, for oligo nr. l, var det en 39-mer med indhold af 13 adenin, 8 cytosin, 9 guanin og 9 thymidin, og den 10 beregnede extinktionskoefficient var ved 260 nm 444 700. Man målte absorbansen ved 260 nm som 0,379, og den deraf følgende koncentration i pmol/μΐ er 0,852.

Man målte oligo'erne under anvendelse af et Eppendorf pipettesystem i Eppendorfrør. Mængderne var sådanne, 15 at der blev tildelt 100 pmol af hvert oligo til hvert genfragment under konstruktion. Således benyttede man 200 pmol af oligo nr. 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 0, 10, 12, 14, 16 og 18, da disse er fælles for de to genkonstruktioner. Man benyttede 100 pmol af oligo nr. 15, 20 17, 19 og 20, da de kun findes i en af genkonstruktio nerne. De målte oligo'er blev lynvakuumtørret og derefter tørret igen under anvendelse af 150 μΐ af 80% ...

ethanol og 20% vand.

Man phosphorylerede oligo'erne selektivt til op-25 nåelse af, at de oligomere, der til slut ville befinde sig i enden af de færdige genkonstruktioner, ikke ville binde med sig selv. Således phosphorylerer man ikke oligo'er 1 og 14, men phosphorylerede alle andre oligo-er. Man foretog alle kinationer og ligationer i lige-30 ringspuffer, "LB", der bestod af 50 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM magnesiumchlorid og 10 mM dithiothreitol. (Man oplagrede LB som en ti gange koncentreret opløsning, 10 x LB og fortyndede med vand efter behov). Man opløste både oligo 1 og 14 i 60 μΐ og anbragte dem på is til 35 senere brug.

Man fremstillede en kinaseblanding, der inde- 16 DK 174341 B1 holdt: 92 μΐ 10 x LB, 20 μΐ polynukleotidkinase (Boehringer-Mannheim, 10 enh./μΐ), 1 μΐ 10 mM ATP i TE, 1/4 μΐ 32P-y-phosphat ATP med Indhold af 80 000 000 tællinger/minut radioaktivitet, 810 μΐ vand.

5 Det totale rumfang af kinaseblandingen var 920 μΐ. Man satte blandingen til de tørrede oligo'er, 20 μΐ for hver 100 pmol til phosphorylering. Man opløste hver af oligo'erne 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 16 og 18 (200 pmol af hver) i 40 yl kinaseblanding. 011-10 go'erne 15, 17, 19 og 20 (100 pmol hver) blev hver opløst i 20 μΐ kinaseblanding. Alle de rør, der indeholdt de opløste oligo'er i kinaseblanding, blev inkuberet ved 37°C i 45 minutter. Man fjernede 1/4 μΐ fra hvert rør og anbragte dem hver for sig på en DE-81 pa-15 pirstrimmel. Derefter eluerede man DE-81 strimlerne i et kromatografikammer med 0,35 M ammoniumformiatpuffer, indtil fronten af opløsningsmidlet nåede bunden af den hængende stribe. Man fjernede nu striberne fra kammeret, tørrede i en ovn ved 100°C og skar dem i stykker 20 til analyse i en væske-scintillationstæller (Beckman LS 6800). Striberne blev skåret i stykker på en sådan måde, at der var et stykke, der kun indeholdt den oprindelige plet, og et andet stykke der indeholdt resten af DE-81 striben. Man anbragte fragmenterne fra DE-81 25 striberne i tællebeholdere af plast og talte tørt i LS--6800. Tælleren viste radioaktivitet ved begyndelsen af hver stribe, og af denne grund påvirkede man pho-sphyleringsreaktionerne med et stort overskud af kold ATP. Man satte 1 yl 10 mM ATP til hver phosphoryle-30 ringsreaktion og inkuberede rørene ved 37°C i yderligere 45 minutter efter DE-81 analysen. Alle rør med indhold af oligo (deriblandt nr. 1 og 14, der ikke blev phosphoryleret) blev derefter kogt i fem minutter og hurtigt afkølet. Ved denne fremgangsmåde ødelagde man 35 kinaseenzymet, DK 174341 B1 17 1+8 2 + 9 3 + 10 5 + 12 5 6 + 13 7 + 14 15 + 17 16 + 18 19 + 20 10 Hver duplex blev benævnt efter det første oligo 1 parret. Man blandede indholdet af rørene l, 2, 3, 5, 6, 7, 15, 16 og 19, kogte i fem minutter og afkølede derefter langsomt til stuetemperatur.

Disse sammenføjede duplexer blev derefter kombi-15 neret til dannelse af tetramerr: 3 + 2 5 + 6

Disse tetramere blev benævnt efter det første rør i parret, henholdsvis 3 og 5. Til hver af rørene, 20 der indeholdt de tetramere 3 og 5, satte man 5 yl 10 mM ATP (til opnåelse af ca. 200 ymol ATP koncentration).

Man sammenføjede de tetramere ved 37°C i ti minutter.

Man satte 5 yl ligase (Boehringer-Mannheim, 1 enhed/yl) til hvert rør. Ligeringsblandingerne blev inkuberet i 25 fem minutter ved 37°C og derefter i en time på is.

Den ene halvdel af duplex 16 blev kombineret med duplex 15, og den øvrige halvdel med duplex 19. Til hver af disse tetramere satte man 2 yl ATP. Man sammenføjede de tetramere ved 37°C i ti minutter og satte 30 derefter 2 yl ligase til hvert rør. Blandingerne blev nu inkuberet i fem minutter ved 37°C og i en time på is.

Man tilsatte flere duplexer til opnåelse af længere duplexer: Duplex 7 sat til tetramer 5 gav hexamer 35 nr. 5; duplex 1 sat til tetramer 3 gav hexamer nr. 3; man satte 2,5 yl 10 mM ATP og 2,5 yl ligase til disse 18 DK 174341 B1 hexamere. Man blandede derefter to rør, inkuberede i ti minutter ved 37°C og i en time på is.

Man satte en trediedel af hexamer nr. 5 til hvert af rørene 15 og 19, der indeholdt centrale oligo-5 dele af henholdsvis pGH-7 og pGH. Man inkuberede rørene 15 og 19 i ti minutter ved 37°C i to timer på is.

Derefter tilsatte man hexamer nr. 3, halvdelen til hver af rørene 15 og 19. Man satte alle oligo'er, der var nødvendige til konstruktion med 10 mM ATP og 5 μΐ liga-10 se til hver af rørene Man inkuberede rørene med indhold af ligationsblandingen i ti minutter ved 37°C og ved 4°c i fem dage.

Man kontrollerede 5 μΐ fra hver af de tre ligationer på en 0,75 mm tyk analytisk polyacrylamidgel, 15 5%, 7 M urinstof. Man kørte 32-P mærket Hpall skåret pBR22 i et nabobånd som standard. Man fortyndede prøverne fra hver ligering samt Hpall standarden i 20 μΐ 80% formamid, 20% vand, der indeholdt 0,1% xylencyanol og bromphenolblåt som farvestof (80% formamid plus 20 farvestoffer). Prøverne blev kogt i fem minutter, hvorefter man afkølede hurtigt på is og anbragte på gelerne. Gelen blev kørt ved 400 volt i 45 minutter (indtil farven af bromphenolblåt nåede bunden af gelskiven), fjernede gelerne fra glaspladerne, indpakkede i Saran 25 Wrap og anbragte dem i en filmkassette med et ark Dupont Cronex røntgenfilm. Eksponering ved -70°C og fremkaldelse af filmen gjorde den ligerede DNA synlig på autoradiogrammet. I bane 15 var der bånd, der svarede til et 272 basepar duplex. I bane 19 fandtes et 30 bånd, der svarede til 293 basepar duplex. Dette var et tegn på, at ligeringerne var så fremskredet, at man havde opnået en vis del af den ønskede DNA konstruktion for pGH-7 og pGH.

På basis af de analytiske gelresultater forbe-35 redte man de tre ligeringsblandinger til gelrensning i større skala. Hver ligering blev udfældet med ethanol 19 DK 174341 B1 under anvendelse af 40 yl 3 M natriumacetat og l ml 100% ethanol og afkøling til -70°C natten over. Efter 10 minutters centrifugering ved 10000 g isolerede man DNA bundfaldet, idet man fjernede supernatanten og va-5 skede den med 100 μΐ iskold 80% ethanol. Det rensede centrifugebundfald blev hurtigt tørret under vakuum, hvorefter man opløste dem hver for sig i 80 yl 80% formamid med farvestoffer. Man kogte i fem minutter og afkølede hurtigt på is. Derefter anbragte man 10 halvdelen af hver ligationsblanding på en 3 mm tyk 5% polyacrylamidgel med indhold af 7 M urinstof og kørte gelen ved 250-300 volt i to timer. Derefter anbragte man gelen i en filmkassette og autoradiograferede ved stuetemperatur til påvisning af båndene. Man anbragte 15 derefter den fremkaldte film ved siden af gelen i kassetten, markerede positionen af det bånd i hver bane, der svarede til et fuldstændigt ligeret gelfragment og udskar de ønskede bånd fra gelen med et barberblad. Udskårne gelskiver blev derefter pulveriseret hver for 20 sig ved extrusion gennem en 3 ml sprøjte uden nål i et Eppendorf rør. Hver pulveriseret gelskive blev dækket med 0,7 ml gel elueringspuffer (0,5 M ammoniumacetat, 0,01 M magnesiumacetat, 0,001 M EDTA og 0,1% ammoniu-macetat, 0,01 M magnesiumacetat, 0,001 M EDTA og 0,1% 25 natriumdodecylsulfat og inkuberet natten over ved 37 °C.

Gel-opløsningsblandingen blev filtreret gennem en filterskive af glasfiber i en sprøjte og vasket tre gange med n-butanol. Man udfældede DNA ved tilsætning 3 0 af 2½ rumfang ethanol og lagring ved -70°C i en time. Centrifugering i ti minutter ved 1000 g gav et bundfald, som man isolerede ved at dekantere supernatanten.

Man hurtigtørrede bundfaldene under vakuum i fem minutter, hvorefter man opløste dem i 200 yl TE, centrifuge-35 rede til koncentrering af polyacrylamidrester og udfældede igen med 20 yl 3 M natriumacetat og 550 yl 100% 20 DK 174341 B1 ethanol. Man foretog tælling på det tørrede DNA-cen-trifugebundfald på væskescintillationstælleren og fandt, at de indeholdt ca. 1 pmol af hvert genfragment .

5 Hvert DNA bundfald blev opløst i 20 yl opløs ning med indhold af 2 yl 10 x LB og 1 yl radiomærket ATP (30 000 000 cpm ym). Man udtog portioner på en kvart yl fra hvert rør og satte dem som pletter på DE-81 striber. Nu satte man 1 yl polynucleotidkinase til 10 hvert rør og inkuberede rørene ved 37°C i 30 minutter, hvorefter man udtog portioner på en kvart yl af phos-phoryleringsreaktionerne og anbragte dem som pletter på et andet sæt DE-81 striber. Alle seks striber blev derefter udludet med 0,35 M ammoniumformiat, og man 15 sammenlignede de oprindelige portioner for tilbageholdt radioaktivitet. Sammenligning af "før" og "efter" DE-81 striberne for hver duplex viste, at der var forekommet phosphorylering, hvorfor man fremskyndede reaktionerne med 1 yl 10 mM ATP til afslutning af disse.

20 Efter 45 minutters inkubering ved 37°C kogte man rørene i fem minutter og lod dem langsomt afkøle til stuetemperatur. De sammenføjede phosphorylerede duplexer i ligeringspuffer var nu klar til ligering i passende kloningsvektorer.

25 Efter kloning af hver af de syntetiske pGH kon struktioner i M13mpl9 isolerede man enkeltstrengs (ss) og ds DNA. Man sekvensopdelte de enkeltstrengede DNA'er. Man benyttede ds DNA'er som kilder for et Xbal-Apal ds DNA fragment, der indeholdt 5'-delen af 30 de tre forskellige pGH konstruktioner.

Til konstruktion af pGH ekspressionsvektorer havde man brug for tre slags DNA ligationer (fig. 4). Komponent 1 var Xbal-Apal ds DNA fragmentet, isoleret fra et af de tre pGHmpl9 DNA'er. Komponent 2 blev 35 isoleret fra en pCFM414pGH vektor som et Apal-BamHI ds DNA fragment med indhold af 3'-delen af pGHwt genet.

21 DK 174341 B1

Komponent 3 var et pCFM846 plasmid, gennemskåret med Xbal og BamHl. pCFM846 plasmidet er et derivat af pCFM836 (beskrevet nedenfor), fremstillet ved indsætning af den følgende DNA sekvens mellem de unikke Clal 5 og Kpnl steder i pCFM836: 5' CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTAC 3' 3' TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGC 5' 10 Plasmidet pCFM836 er fremstillet som et derivat af pCFM536 (ATCC nr. 39934), konstrueret så det inkorporerer en resistensmarkør for kanamycin, en syntetisk Pi promotor, en ny kloningsgruppe af restriktionssteder og en række translationsstopsekvenser, så man kan 15 standse translation i alle tre læserammer. Man sletter først §-lactamasegenet ved fordøjelse af pCFM 536 med Sstl og xbal. Herved sletter man ikke blot markørgenet, men også hele "par" eller stabilitetssekvensen, Pi promotoren og en del af gruppen af gennemskæringsste-20 der. Man kan opnå Kanamycin gensekvensen som et Smal-Hindlll fragment fra Tn5 plasmidet ifølge Beck et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 45, side 107-113 (1981). Når fragmentet skal forberedes til indsættelse i den nye vektor, føjer man en Sstl linker 25 til Smal stedet og en Ndel linker til Hindm stedet.

Man ødelagde det naturligt forekommende Ncol gennemskæringssted i Kanamycin resistensgenet ved positionsspecifik mutagenese ved kodonet for en threoninrest 76 aminosyrer opstrøms for det carboxyterminale leucin, 30 bestemt af Kanamycin resistensgenet, og mere nøjagtigt ved at ændre en ACC kodon til en ACT kodon. Man kan opnå "par" sekvensen som et HincII-Aval fordøjelsesfragment fra pSCIOl (ATTCC nr. 37032). Til forberedelse af "par" fragmentet til indsættelse i den nye vektor 3 5 behandler man ført Hindi stedet med en Sall linker og derefter med en Aatll linker. Man behandler Aval ste- DK 174341 B1 22 det med en BamHI linker og derefter med en Ndel linker.

Man tilsatte en DNA sekvens, der indeholdt en syntetisk promotor, opnået ved kemisk syntese fra et ds DNA oligonukleotid med klæbrige ender til indsættelse mel-5 lem et Aatll gennemskæringssted og et xbal gennemskæringssted på følgende måde: 5 5 1 CAGATCCATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATAC-10 3' TGCAGTCTAGGTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATG- -CACTGGCGGTGATAATGAGCACATCGATT 3' -GTGACCGCCACTATTACTCGTGTAGCTAAGATC 5' 15 Til indsættelse af et translationsstop i alle tre rammer gennemskår man plasmidet med BamHI og indsatte følgende ds oligonukleotid: 5'GATCCGCGGATAAATAAGTAAC 3' 20 3' GCGCCTATTTATTCATTGCTAG 5'

Efter ligering transformerede man hver konstruktion i E. coli (stamme FM6). FM6 er et derivat af AM7 (nr. CG608159), der er gjort phag 25 modstandsdygtige overfor adskillige ukendte bakterio-phager, og som indeholder det gen, der koder for tetra-cyklinresistens, og generne for λ bakteriophagrepresso-ren, CI857 og cro, integreret i kromosomet.

Efter transformering udvalgte man repræsentati-30 ve kloner for hver type pGH. Man isolerede kovalent lukket, cirkulært (ccc) plasmid DNA og sekvensopdelte under anvendelse af alkalidenaturerings ccc fremgangsmåden. Sekvensen for den syntetiske del af 21K pGH ses i Tabel 3.

35 23 DK 174341 B1 o o o m2e->< o e- < vocjcj <r U O o U O iflUU <n £- tf

E-tf r- tf E- <— £-· <n c> O

O O O O U O tf E-

E-tf tfE- E-tf tf Ευ O OO E-tf OU

E-tf tfE- CJO E-tf e o uo ou e-tf uo ou ε-tf ou ου E-tf ε-tf e- < m3 E- < tf> U O O E- tf ία < h Ό tf

m tf E- cn O U ιΛ E- tf --- O U r~ O

tfE- OU <—i < E-· (N ri < cnCJ

UO E-tf UO UU E- OU UO OU E-tf tf E-

tfE- tfE- E-tf < E- UO

uo tfE- uo ou e- < UO UO OU tfE- E-tf E-tf E-tf ou ou uo

E-tf tfE- tfE- tf E- UO

Ό h <i vouo O U O U5UO IOUU

<N E- tf oo O U IJ ^ < o tf E- \o O O

uo e- < >-h u o (N<E-> <nou UU uo ou uo ou ou uo uo e-tf ou

El C tfE- tf E- UO E-itf 00 tfE- uo 2 e- ou uo E-tf OU OU tfE- ou

J tfE- tf E- tf E-ι tfE- OU

M UO UO UO OU E-tf w w o tf E- «3 E- tf o U O O U O W3 e-ι tf

CQ tf E- r- u O n £- tf σ\ tf E- iflUO

E-|tf UU -tfE- r— O U cn E- tf tf tfE- E-itf E-itf tf E- tf E- tf E-ι OU UO tfE- tf E-

E- OU UO E- tf tf S- OO

OU OU UU E- < E-tf tfE-· E-tf tfE- OU E-tf OU UO E-tf OU tf E-

OU tfE- E-tf E-tf UU

\OtfE- U3 E- tf O O U vO U O OE-tf tfE- ifl O U (NUO 03 tf E- -3·υθ·

O 6-< i-ι O O ή tf E- (N O O

tf UO tfE- UO E-tf

E- UU UO UO UO

U UO E-tf OU UU

tfE- OU UO E-tf

tfE- OU OU UO

E-tf UO OU E-tf

UO E-tf UO UU

VDUU oE-tf OUO us E-tf- in U U r-tfE- r-UO nuo E— tf <“i tf E- i—i E- tf (N E— tf E-tf OU tfE- E-tf OU tfE- UO E-tf

E-tf tf E- UO OU

UO tfE- tfE- UO

UO UO tfe- OU

OU tfE- tfE- E-tf

tfE- E-tf OU UO

DK 174341 B1 24

Eksempel 3

Man kan ydermere konstruere fire pGH analoge 5 ved positionsrettet mutagenese. Først kloner man det lille Xbal-BamHI fragment fra p846pGH22K i M13mpl0 og isolerer enkeltstrenget phag DNA. Man syntetiserer primere på hver af de analoge, kinaserer dem og fæster dem til det enkeltstrengede DNA. Man tilsætter de fire 10 d NTP'er, ATP, T4 DNA ligase og Klenowenzym til syntetisering af den anden streng af DNA, der indeholder de ønskede ændringer. Man transficerer DNA i værtsstammen JM103 og udplatter plakker. Man bestemmer de korrekte kloner ved hybridisering til 32P-mærkede primere af den 15 analoge sekvens. Man bekræfter sekvenserne ved dides-oxysekvensopdeling og kloner Xbal-BamHI fragmentet fra M13mpl0 tilbage i p846. Primeren for klonerne vises nedenfor:

20 Analog 1: (Tyr, Ile, Pro) TCGAACGTGCTGAAGGTCAGCG

Analog 2: (Pro) GTGCTTACATCGAAGGTCAGCG

Analog 3: (Arg) CAAAGAATTCGAAGCTTACATCCC

Den fjerde klon (-Glu, Arg...Glu-) kræver to 25 positionsrettede mutageneser. Den første primer (A) vil fjerne Glu, Arg. Efter denne positionsrettede mutagenese renser man det enkeltstrengede DNA og udfører en anden omgang positionsrettet mutagenese med en anden primer (B), der vil fjerne det andet Glu.

30

Analog 4 primere: A TACAAAGAATTCGCTTACATCCCG B CTTACATCCCGGGTCAGCGTTA 35 DK 174341 B1 25

Eksempel 4

Man udførte en fermentering både med 22K og 21K og nåede celledensiteter op til en optisk tæthed på 65.

5 Mængden af dannet porcin væksthorman eller analoge deraf, varierede fra 50-75 mg/OD L (3-3,9 gm/L).

Man foretog forsøgene under anvendelse af E. coli FM6/pCFM 856 pGH nr. 3 (med 22K pGH) og nr. 8 (med 21K pGH). Hver af de ovenstående besidder et 10 plasmid med uhæmmet replikation og en kanamycinmarkør til plasmidstabilitet.

TABEL 1 15 (Sammensætning af medium)

Komponent Batch (8L) Fødemateriale {3L) 20 Gærekstrakt 40 g 400 g (NH4)2S04 30 g 15 g K2HP04 56 g KH2P04 64 g 25 Dow P-2000 2 ml

Glukose 40 g 1300 g (MgS04,7H20) (1M) 32 ml 103 ml

Opløsning af spormetaller 16 ml 28 ml 30 Vitaminopløsning 16 ml 28 ml

Kanamycin 20 yg/ml

Man foretog fermenteringen batchvis med tilførsel og under carbonbegrænsning, idet man opretholdt en 35 temperatur på 30°C og en pH-værdi på 7,0. Mængden af opløst oxygen blev opretholdt ved 50% mætning med 26 DK 174341 B1 luft. Man udtog prøver med regelmæssige mellemrum og målte vækst og acetatindhold. pGH koncentrationen blev målt under anvendelse af Coomassiefarvet SDS-PAGE. på grund af mangel på tilgængelighed for ren 5 pGH benyttede man ren bGH og IFN- aCon som standard.

Man gennemsøgte gelen under anvendelse af en Shimodzu integrator/scanner og benyttede gennemsnittet for de to standarder til beregning af koncentrationen af pGH og procentisk andel af total protein.

10 Man inducerede cellerne ved at lade temperatu ren stige til 42°C ved en optisk tæthed på ca. 25, og man kontrollerede dem under et mikroskop for inklusionslegemer. Der fandtes et indhold på 1-2 inclu- sionslegemer efter ca. 3-4 timers induktion. Man 15 fandt intet pGH i prøver før Induktionen fra de to analoge forsøg. Resultaterne vises i Tabellerne 4 og 5 for vild type (22K) og analog (21K).

Som illustreret i disse Tabeller kunne man producere en maksimal mængde pGH (70-75 mg/OD 1) ved 20 hjælp af 22K pGH. Med 21K pGH analogen forekom det, at mængden af produceret analog havde et maksimum med OD og begyndte at gå nedad sammen med nedgangen i OD, sandsynligvis på grund af proteolytisk nedbrydning.

Dette viser, at man sandsynligvis bør standse fermen-25 teringen 5-6 timer efter induktionen.

Eksempel 5

Man undersøgte den biologiske aktivitet af re-30 kombinant fremstillede analoge ved et bioassay med måling af vægtforøgelse i 10 dage hos rotter med fjernet hypofyse, idet man benyttede hypofysefremstillet por-cin væksthormon som standard.

Man injicerede 21K pGH analogen ifølge opfin-35 delsen og hypofyse-afledt pGH ("pd-pGH'') præparationer hver i tre doser to gange dagligt, med et rumfang på 27 DK 174341 B1 0,1 ml subkutant til rotter af hunkøn uden hypofyse på dagene 0-9 efter en 12 dages tilvænningsperiode. pd-pGH præparationen blev præpareret fra et frysetørret præparat i pH 9,5 bicarbonatpuffer (30 mM) til 5 fremstilling af en lageropløsning med en koncentration på 1 mg/ml. Man fortyndede lageropløsningen samt alle de rekombinante prøver, i "World Health Organization" ("WHO") puffer (0,2% laktose, 0,2% mannitol, 30 mM NaHC03, pH 8,6) til 300, 100 og 30 yg/ml. Prøverne 10 blev lagret ved 4°C så længe eksperimentet varede. Bestemmelse af protein blev udført på udtagne prøver af testmaterialerne.

15 28 DK 174341 B1

PJ

O

O o o in \ rH C" S3 ill n in o in in o ft co co ιο ι~~ σ> ε

3*3 <N

<N C

<M -H C!

— IH Φ O

10 4J *H

S3 O -P

n +) μ M

ft d ft P

Q) Η Ό ro u ro d ft o -P ή in in m *· >1 P O I rH OJ ro

-P ft -P (Bil I

Ό p O O O O

iJ rH ft rH (M CO ro Ή H > ® p O 'i' o o in c- rtjip Ω vvvvv O in co t- co oo

Eh p N Ί1 H1 in ro

-P

ro -p

rH

P

ro ro a P 0) η tn

<D -H c3 O -H

-P P —

M 0) P

C3-PQ) mooinin PCB - " - » ' ft ro ή corHcoinn- roE-P rHCMnjmm roo p —

-Η O

Eh tp d

O

•H

+o ϊ 3 ro Ό -p d cn -π 29 DK 174341 B1

J

I—i Q tn O 0) o in \ β vo W i il n o in m in o

On ID ID ID

cn ε « o H « CN -P β

—' <4-1 fl) O

<0 -P -P

KO +>

ο -ρ ρ M

Λ β Λ 3 <D Η Ό

tn υ ro C

o o -p -η o in in in H p O I m m ro ro Λ -P ffi iii β ρ o in o o PI (0 CL| CN cn m ro w ρ o W 4-1 OD O O CN ro <! P Q SVSV^ φ O 'S* co ro r- co E-ι +j cn N* id in in ro p 3 m ro Η β cd ro o tn •Ρ β •ri -Ρ P —' m ro p β+ίφ inooinm

3 β H

Pi Φ Ή co rH m m n-

WH-P H « N n M

Ό P ^ h ro

Eh ip β o

•H

-P

-P M

P 3

ro xj •Ρ β CO -P

DK 174341 B1 30

Kemisk analyse

Man fandt ved proteinkemisk analyse, at pd-pGH kun var 85% pGH monomer, hvorefter man indgav den med 5 1,8 x dosisværdien af det udvejede frysetørrede mate riale. Man analyserede alle opløsningerne til indsprøjtning for proteindhold ved Bradford assay under anvendelse af BSA i WHO puffer som standard. Der var variationer i præparationerne med henblik på tilpasning 10 af det ventede proteinindhold (Tabel 6). På grund af mangel på nøjagtige fremgangsmåder til bestemmelse af proteinkoncentrationerne af pGH i indsprøjtningsvæsker-ne ved extinktionskoefficienter har man benyttet Bradford-resultaterne som angivelse af de virkelige do-15 sisværdier.

Væqtqevinst

Ved alle præparationer fik man en dosisafhængig 20 vækst i vægtgevinsten. Derfor benyttede man som mål på biologisk respons den virkelige vægtgevinst mellem dag 0 og dag 10. 21K pGH analogen ifølge opfindelsen med førte større vægtgevinst end rekombinant 22K pGH og pd-pGH ved de laveste to dosisværdier. Den højeste, 25 afprøvede dosis for 21K pGH analog stimulerede ikke yderligere vægtgevinst, sandsynligvis på grund af, at man havde opnået maksimal hastighed ved de lavere doser. Tabel 7 viser de virkelige ændringer af krops vægt. Tabel 8 viser de relative styrker af hvert præ-30 parat, bestemt ved lineær regressionsanaslyse af log(dosis) mod ændring i kropsvægt, idet man benyttede regressionskoefficienter for hypofysestandarderne.

35 31 TABEL 6 DK 174341 B1

Proteinkoncentrationer i somatotropin _injektionsvæsker (yq/ml)_ 5

Prøve Ventet værdi Virkelig værdi (Bradford) pd-pGH 353 360 10 118 118 35 35 pGH (21K analog) 300 342 100 127 15 30 35 pGH (21K analog) 300 396 100 138 30 36 20 hyp-bGH standard 300 329 100 109 30 31 25 pGH (21K analog) 300 314 100 104 30 29 pGH (21K analog) 300 268 30 100 90 30 24

Anslået til kun 85 vægt% pGH monomer.

35 32 TABEL 7 DK 174341 B1

Baseret på Bradford (Protein) 5 Hypofyse og rekombinant procin væksthormon, målt ved vægtgevinst hos rotter uden hypofyse TRL 031-017 (ændringer i kropsvægt, g middelværdi +/-standardafvi-gelse).

10 Dosis Puffer hyp-bGH std. 22K pGH 21k pGH

pg/rotte/dag (hypofyse) 0 1,5±-0,6 15 7,0 14,3±0,7 13,9±1,1 7,2 20,7±1,1 23.6 19,4±0,8 25,4 23,6±1,2 27.6 28,411,2 20 68,4 30,212,2 72,0 30,211,6 79.6 29,613,9 33 TABEL 8 DK 174341 B1

Relativ ækvivalensstyrke af væksthormonpræparater (Gennemsnit ± standardafvigelse på gennemsnittet) 5

Reference Ækvivalens i forhold

Præparat Prøve til reference 10 hyp-bGH "std" hyp-bGH "std" 1,01 ± 0,05 hyp-bGH "std" 22K pGH 1,06 ± 0,01 hyp-gGH Ste" 22K pGH 1,40 ± 0,15

Opfindelsen er ganske vist blevet beskrevet ved 15 hjælp af en foretrukken udførelsesform, men det ventes, at fagmanden kan udføre modifikationer og forbedringer ved gennemlæsning af opfindelsen. I overensstemmelse hermed skal de følgende krav dække alle sådanne ækvivalenter, der falder inden for opfindelsen.

20

Claims (10)

34 DK 174341 B1

1. Porcin væksthormonanalog, kendetegnet ved, at den omfatter aminosyresekvensen

2. Porcin væksthormonanalog ifølge krav 1, k e n -detegnet ved, at n er 0.

3. Porcin væksthormonanalog ifølge krav ^kendetegnet ved, at Z er ALA eller ΜΕΤ-ALA, for- 20 trinsvis ALA.

4. Porcin væksthormonanalog ifølge krav 1, k e n -detegnet ved, at n er 1, og at X er -GLU-ARG-THR-GLU-;

25 -THR-TYR-ILE-PRO-; -GLU-ARG-THR-TYR-ILE-GLU-; eller -GLU-THR-TYR-ILE-PRO-GLU-.

5. Porcin væksthormonanalog ifølge krav 4, k e n -detegnet ved, at Z er ALA eller ΜΕΤ-ALA, for- 30 trinsvis ALA.

5 Z-PGH1-31-«>n-PGH39-190 hvori n er 0 eller 1; Z er hydrogen, MET, ALA eller ΜΕΤ-ALA; og 10 X er et peptid af aminosyrerester omfattende -GLU-ARG-ALA-TYR-ILE-PRO-GLU- idet en eller flere af disse rester er slettet, og 15 alleliske versioner deraf.

6. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den omfatter en sekvens, der koder for en porcin væksthormonanalog ifølge krav 1. 35 DK 174341 B1

7. Ekspressionsvehikel, kendetegnet ved, at den i en transficeret helt kultur kan eks-primere en DNA-sekvens ifølge krav 6.

8. Komposition, kendetegnet ved, at den 5 omfatter en porcin væksthormonanalog med aminosyrese- kvensen z-pGH1_32-(χ)n-pGH40-191 10 hvori n er 0 eller 1,- Z er hydrogen, MET, ALA eller ΜΕΤ-ALA; og X er et peptid af aminosyrerester omfattende

15 -GLU-ARG-ALA-TYR-ILE-PRO-GLU- idet en eller flere af disse rester er slettet, og alleliske versioner deraf, og at den i det væsentlige er fri for andre proteiner af porcin oprindelse.

9. Porcin væksthormonanalog, kendeteg net ved, at den omfatter aminosyresekvensen (MET)m-AIiA-pGH1.19|3 25 hvori m er 0 eller 1, fortrinsvisO, og alleliske variationer deraf.

10. Komposition, kendetegnet ved, at den omfatter en porcin væksthormonanalog ifølge krav 9, og at den i det væsentlige er fri for andre proteiner 30 af porcin oprindelse.