JPS59113890A - プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロティンＡ様物質のヌクレオチド配列（遺伝
子）、該遺伝子を含む微生物及び該微生物によるプロテ
ィンＡ様物質の製造に関するものである。

プロティンＡはｒｆｌｕＡｑスタフィロコッカス・アウ
レウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｖｂ
ｓ）の細胞壁の構成成分である。その一つの型につき４
２，０００の分子量カＳ＠ス告されており、細胞壁の生
成分である（全細胞蛋白自゛の１．７％を占める）〔ビ
ョルク（Ｉｌｉｏｒｋ　）著、ユーロ、ンエイ、バイオ
ヶム。

（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、）、２９：５７９（
１９７２年）を参照〕。プロティンＡの摩擦比（Ｊ’ｒ
ｉｃｔｉｏｎｒａｔｉｏ）および固有粘度を最も球状の
蛋白質と比較測定すると、比較的細長い形状であるらし
い。その分子を調節的にトリプシン分解すると４つの相
同性（ｈｏｒｎｏｌｏｇｏｕｓ　）　被ブチド領域（Ｎ
末端のものから順にｎ、、４．　ＢおよびＣと温合する
）を生じ、その各々はＩ９Ｇ　１分子を該Ｉ？ＧのＦＣ
部分で結合することができる〔ショダール、ジェイ。

（５ｊｏｄａｈｌ、Ｊ、）著、ユーロ、ジエイ、バイオ
ヶム、、７８：３４８（１９７７年）およびショダール
、シエイ、著、ユーロ、ジェイ、バイオヶム、。

７８：４７１（１９７７年）参照〕。プロティンＡの相
対結合効率は、ｐＨ、菌柚、Ｉ、Ｇのクラスおよびザブ
クラス等を含む多くの因子に依存する。

プロティンＡは免疫り゛ロブリンＣｈｙＧ、）の抗体に
対する親和力（αｆｆ１ｎｉｔｙ）を大きく損なうこと
なくＩｙＧに結合する能力を有するため、種々の診断お
よび基礎研究の試験系に゛おける免疫吸着体として広く
使用されている（米国特許ｇ　４．３’２２，２７４号
明細書参照）。最近におけるプロティンＡの応用の興味
は、抗癌治療における臨床用途の可能性に束中しつつあ
る。通常、１ル瘍ｊ洲胞に対して細胞毒性作用を有する
感作末稍皿リンパ球は、特異抗原、抗体、抗クロプリン
および免疫複合体よりなると推定される血清阻止因子に
よって上記作用が阻止されると堆３句されている〔バー
ンズ、ビー。

シー、（Ｂａｒｎｅｓ、Ｂ、Ｃ１）、キャンサー・プル
（Ｃａｎｃｅｒｌｋｌｌ、）、８３：２７８（１９８１
年）参照〕。これらの「阻止因子」はプロティンＡを含
有するスタフィロコッカス・アウレウス、コワンＩ菌体
（５ｔａｐｈｙ１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｃｏ
ｗａｎ　ｌ　ｃｅｌｌｓ　）に吸着させて腫瘍患者の血
清から分離し、かくしてリンパ球細胞の介在する１！東
瘍訓胞毒性を試験管実験系（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｅｓ
ｔ　ｓｙｓｔｅｍ　）で進行させることができる〔スチ
＝し、ジー、（５ｔｅｅｌｅ。

Ｇ、）、アンカースト、ジエイ（Ａｎ、；ｒ、ｃｒｓｔ
　、Ｊ、　）、およヒシオグｖ７．ｘイチ、（Ｓｊｏｇ
ｒｅｎ、Ｈ，）著、インド、ジエイ、キャンサー（Ｉｎ
ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）、１４：８３（１９７４年）参
照〕。プロティンＡはＩｙＧ結合活性とは独立に多クロ
ーン抗体合成を活性化する働きも有する〔ショダール、
ジエイ（＝Ｓｊｏｄａｈｌ、Ｊ、）およびモラー、　′
）−、（１ｖｌｏｌｌｅｒ。

Ｇ）著、スカンド、ジエイ、イムツル、　Ｃ８ｃαｎｄ
。

Ｊ　、　Ｉｗｍｂｎｏ　ｌ　）、１０　：５９３（１９
７９年）参照〕。

プロティンＡの制癌剤としての大規模な試験は、材料の
高価なことおよびあるプロティンＡ＃品中の不純物存在
のために不可能であった。プロティンＡ製品の価格が十
分低下し、純度も向上するならば、プロティン６今の制
癌剤としての用途に関する一層の臨床試験は益々急速に
進展すると期待される。

本発明は、プロティンＡ様物質のアミノ酸配列をコード
する新規ヌクレオチド配列および公知のプラスミドベク
ターｐ、ＢＲ８２２を含む組み変えプラスミドを開示す
るものである。この新規オリゴヌクレオチドの配列は下
記に示す。全配列はプラスミドｐＡｃＢＴ中に含１れで
いる。プラスミドｐＡｃ８Ｔ−６も最後の２０９ヌクレ
オチド塩基を除く同一の全配列を含有する。ｐＡＣ３７
−６の最後の６ヌクレオチド塩基はｐｓｔｌ認識配列、
即ちＣ１’ＧＣＡＧをコードする。

下記に示す配列は、櫂〈べきことに、プロティンＡ様物
質のアミン末端近傍の領域Ｅと命名されたさらに別のＩ
ｆＧ結合領域を新たに開示するものでもある。このよう
な領域の存在は、従来開示も示唆もされていなかったも
のである。さらに、多クローン抗体合成の活性化に関与
する領域を形成していると考えられる予期に反する大き
なカルボキシ末端コード配列も発見された。

本発明により提供されたヌクレオチド配列およびそのサ
ブフラグメントは、遺伝子工学分野に携わる者に対して
、初めてプロティンＡ様物質およびプロティンＡ・凍物
質のサブフラグメントラコードするクローニングされた
ヌクレオチド配列を得ることを可能ならしめたものであ
る。

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により、遺伝子工学分野の技術者にとって、実質的に同
じプロティンＡ様生物活性を有する分子をコードする他
の同等ヌクレオチド配列の存在を認識することは容易で
ある。

従って、本発明の範囲には上記特定のヌクレオチド配列
のみならず、実質的にプロティンＡ様生物活性を有する
分子をコードする全てのヌクレオチド配列も包含される
。ここで「同等」の語は特許用語として通常用いられる
意味であり、実質的に同種の宿主中において、上記ヌク
レオチド配列と実質上同様に、実質的に同じプロティン
Ａ様生物活性を有する分子を製造するヌクレオチド配列
を意味するものである。同等ヌクレオチド配列の定義の
中には、Ｉ、ＧのＦＣ部分に結合する能力を有するプロ
ティンＡ様物質に相当するサブフラグメント、あるいは
多クローン性Ｂ−細胞活性化作用を有するものに相当す
るサブフラグメントも言まれる。本発明に係るプロティ
ンＡ様物質およびそのサブフラグメントは前記プロティ
ンＡと同様の目的に使用可能である。

プロティンＡ様物質をコードするＤＮＡ配列のクローニ
ングは、ＳＡＣゲノム（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ。

ＣｏｗａｎＬ、ＳＡＣ，ＡＴＣＣ１２５９８）のＤ’Ｎ
Ａ配列を含む遺伝子の蓄積調製から開始した。この調製
は、基質としてＩＩａｅ　Ｉ［ｌ　＋　Ａｌ１ｕ　Ｉ部
分制限分解により生じた平滑末端（ｂｅｕｎｔ　ｅｎｃ
ｌ）の５ＡＣＤＮＡフラグメントを使用して、Ｇ−Ｃチ
ーリンダにより行なった。５０４　）’Ｉスス−酸；ｐ
Ｈ７，５：　５　ｍ、Ｍ　ＭｙＣｌｌ：　１　ｍＭジチ
オスレイトールＣＤＴＴ）　４００　／ＩＡ中でのＨａ
ｇｌＩ１１５０単位およびＡｌｕ、　１２００単位によ
るＳＡＣＤＮＡ２５０μｇの分解（３７℃、１２分間）
によって、広範な寸法範囲のフラグメント１−１０キロ
ベース・被アーズＩ＆ｂ１）が得られた。報告されてい
る分子量値４２，０００から、プロティンＡのコード配
列は１．１−１．２　ｋｂ　のＤＮＡよりなると推定さ
れた。

プロティンＡをコードする配列および隣接する調節配列
の両者を含む組み変え挿入片（ｒｅｃｏｍｂｉｎｔｚｎ
ｔｉｎｓｅｒｔ）を得る可能性を最高に高めるため、Ｓ
ＡＣ遺伝子蓄積６調製には８−６ｋｂ　の大きいフラグ
メントを使用した。このＤＮＡは副を用アガロースゲル
から抽出し、ターミナルトランスフェラーゼで１５−２
０Ｃ残基のテールを形成しそしてＧ−テール金形成した
ｐｓｔｌ−分解ｐＢＲ８２２にアニールした。得られた
組み変えＤＮＡ、Ｇ−テールを形成したプラスミドＤＮ
Ａのみまたは未切断ｐＢＲ８２２による大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）ＭＳ　８７１菌の形質転換により、夫々ブジス
ミドＤＮＡのμＩ当り２．０Ｘ１０’、５．ＯＸ　１０
２および２．ＯＸ　１０’の形質転換効率を与えた。約
７．０Ｘ１０３個の形質転換菌を新鮮テトラサイクリン
プレート上に採取してスクリーニングした。

無作為に選別した１０の形質転換菌のミニーライゼー）
　（Ｍｉｎｉ　−１ｙｓａｔｅ）プラスミドＤＮＡ標品
をＰｓｔｌで消化し、得られたＤＮＡフラダメントの大
きさをアガロースゲル電気泳動で分析した。

その結果、（１）形質転換菌１０個中７個は組み変えＤ
ＮＡプラスミドを有すること、（２）９つの組み変えプ
ラスミド中７つはＧ−Ｃテーリング操作で再生した両Ｐ
ｓｔＩ制限部位を有すること、そして（３）挿入された
ＤＮＡの平均は長さは約８ｋｂであることが判明した。

本発明のクローニング・ベヒクルは、形質転換宿主のレ
ブリケーションによりプロティンＡ様生物活性を有する
分子をコードする遺伝子を、最初に入手可能としそして
該遺伝子の供給を増大するために有用である。このよう
に所望遺伝子を大量に供給することによって、プロティ
ンＡ様物質をより低価格で入手しつるに十分なプロティ
ンＡ発現レベルに達しつると期待される。

次に最良の態様を含めて本発明を実施するための実施例
を記載する。しかしながら、本発明は実施例の範囲に限
定されるものではない。実施例中、特に記載しない限り
、パーセントは全て重量％で示し、溶媒混合物の混合比
率は容量で示す。

実　施　例　１　　菌株の保存および増殖スタフィロコ
ッカス・アウレウス、コワンＩ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＣｏｗａｎｌＣ８ＡＣ。

ＡＴＣＣ１２５９８）およびＷｏｏｄｓ　４６　（ＳＡ
Ｗ　。

ＡＴＣＣ１０８３２）株は、メリーランド州、ロツクビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（
Ａｒｎｅｒｉｃａｎ　Ｔ’ｌｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ）から入手した。菌株ともペンア
ッセイ（Ｐｅｎａｓｓａｙ）メディウム（５ｍ９７ＦＩ
ＬＥカシトン（Ｃａ５ｉｔｏｎｅ）、２．５ｍＦｌ／ｍ
ｌイーストエキストラクト、２．５　ｎ１９／　ｒｕｔ
！β−ダリセロホスフエート、４ｍｇ／ｍｌニアシン、
２　ｒｎｇ　／　ｒｕｌ　ｆアミン−塩酸〕中で標準条
件下に液体培地または１．５％寒天プレート上で増殖さ
せた。

大腸菌ＭＳ３’１１はＬ−グロス（５ｇ／βＮａＣＬ　
　１０　ｇ　／　、ｅ　ハクトドリプトン、５ｆＪ／Ｅ
イーストエキストラクト）中で培養した。プラスミドＤ
ＮＡの調製のために、所望プラスミドを有する細胞をＭ
−９培地（４９ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ＜、１　７　　ｍＭ
’　　ＫＨ２Ｐ　Ｏ４、８，６ｍＡｆ　　ＮａＣ９，１
８，，７ｒｎＡｆＮＨ４Ｃｆ　０．１　ｍｌＷ’　Ｃａ
Ｃ８２，１ｒａＭ　Ｍｆ　Ｓ　Ｏ＋　・’Ｉ＆Ｏ。

０４％グルコース、０．４％カザミノ酸、２〜／Ｕチア
ミン）中で培養した。

実　施　例　２　８ＡＣからのＤＮＡの抽出ＳＡＣの一
夜培養物を被ンアツセイブロスで１：１００に希釈し、
次いで０Ｚ）ｓｏｏ　＝　０．６　　まで増殖させた。

この菌体を遠心分離（ベックマンＪＡ１０ローターにて
、２℃において５．００　Ｏｒｐｍ。

１０分）してベレット化し、２０倍のＤ’ＮＡ抽出バッ
ファー（０，ＬＭ　ＮａＣｅ：５０ｍＭ　ＥＤＴＡ：１
０　ｍＭ　）リス−塩酸、ｐＨｓ、ｏ）に再懸濁させ、
そしてドライアイス−アセトン浴中で凍結した。

凍結細胞懸濁物を３７℃で解凍し、リゾスタフィン（１
ｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ：ミズリー州、セントルイスのシ
グマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）より
入手〕を５０〃１ｇ／ｌｄに添加し、そしてこの懸濁液
を３７℃で１５分インキュベートした。プロテアーゼＫ
（４０１，７９／酎）およびＳＤ、Ｓ’（０，５％）を
添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

この溶解菌体を次いでＤＮＡ抽出バッファーで飽和Ｌｉ
フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。この
ＳＡＣＤ−ＮＡ浴溶液（０，９５ｇ／Ｍ）ＣｓＣｅに調
節し、遠心分離（ベックマンＴｉ６０ローターを用い２
３℃で４４００　Ｏｒｐｍ、　４８時間）により層別し
た。次いでＤＮＡをシリンジおよび２１ｇ針を用いて側
部穿刺して採取した。

このＤＮＡをＴＥバッファー（１０ｒｎＭ　）リス−塩
酸、１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　ｐＨ８，０）で透析
し、前記同様フェノール／クロロホルムで抽出し、２倍
量のエタノールで２回沈殿させた。Ｓ　ＡＣＤＮＡの収
量は、菌体湿重量１ｇ当り７００　＝８０（１１ｇＤＮ
Ａの範囲にあった。

実　施　例　８　制限酵素による消化 全ての制限エンドヌクレアーゼは、メリーランド州、ベ
セスダのベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）互りはマサチュセツツ州、ベバリーのニュー・イ
ングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ）から入手した。特に記載しない限り、本
明ｍ’ｓ中の制限分解は、ＤＮＡ濃度１０〇−４００ｐ
９１ｒｎｌ、　ＤＮＡ　ｐｇ当り２−４単位の酵素、２
−３時間、３７℃の条件で、各市販会社が各酵素に対し
て推奨するバッファー系中にて行なった。

実　施　例　４　　ＤＮＡフラグメントの電気泳動およ
び抽出 アガロースゲル電気泳動は、ゲル中には２Ｘトリス−ア
セテートゲルバッファー（８０ｍＭ　）リス−塩酸、ｐ
Ｈ８，０；　４０　ｒｎＭ　ＮａＣＪＩ３Ｃｈ　：　８
６ｍＭ　ＮａＣＡ　：　２　ｒｎＭ　Ｎａ２Ｅ　ＤＴ　
Ａ　）そして、泳動にはＩＸバッファーを用いて行なっ
た。分析用ゲルは通常、水平ゲルボックス中にて［サブ
マリン・ゲル（ｓｕｂｍａｒｉｎｅ　ｇｅｌ）Ｊの状態
で泳動した。調製用ゲルは通常、ＥＣモデル４７０ゲル
ボツクス中にて泳動した。ＤＮＡバンドの検出はエチジ
ウム・ブロマイドＣＥｔＢｒ）による後染色法（ＩＸゲ
ルバッファー中Ｏ０５ｍＱ／ｍｌ）およびカリフォルニ
ア州、サンカプリエルのウルトラバイオレット・プロダ
クツ社（Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
、Ｉｎｃ、）製モデルＴＭ　−８６Ｕ、Ｖ、　）ランス
イルミネーターを用いて行なった。

調製用アガロースゲルからのＤＮＡの抽出は、先ず、一
本のゲルレーンのＥｔＢｒ染色バンドの位置の検出から
始めた。目的ＤＮＡフラグメントを含有するゲルのスラ
イスを手でさいの目）Ｃ切り出し、１．５−２倍量のＤ
ＮＡゲル抽出バソファー（０，５Ａｉ　ｎＨ＜Ｃ２Ｈ５
Ｏ２，１０ｍｕ　ＥＤＴ　Ａ、　　１０　ｍＭＭｆ　（
Ｃ２Ｈ５０２）　２．１０％５ＤＳ）とともに２０ｇ針
を通過させた。１　ｍＭ　ＮＨ＜Ｃ２１１ｓＯ□および
１０　ｍＭＥＤＴＡで飽和したフェノールを等量加え、
エツインドルフチューブ中でロータリーシェーカーによ
る抽出を２３℃で一夜行なった。次いでチューブを３０
分間氷上に置き、次いでマイクロ遠心によって水層を除
いた。飽和フェノール溶液による水層の抽出を３−４回
繰返し、その後クロロホルム抽出およびエタノール沈殿
を行なった。１５　ｋｂより小さいり、ＮＡフラグメン
トの日常回収率は約４０％であった。

実　施　例　５　プラスミドおよび挿入用ＤＮＡのテイ
ル形成およびアニーリン グ（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ） 組み変えプラスミドの製造は、Ｇ−Ｃティリング法〔シ
ュタイン、アイ、（５ｔｅｉｎ、’１．）、カテラル、
ジエイ、　（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、Ｊ、）、ウー、ニス
。

（Ｗｏｏ、Ｓ、）、ミーンズ、エイ、　（１ｖｌｅａｎ
ｓ　、Ａ、　）、オマリー、ビー、（０’Ｍａｌ　ｌｅ
’／、ｆｌ、）著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、１ｓｔｒ’／）　１７　：　５７６８（１９７８年
）参照〕により行なった。Ｐｓｔｌで消化し、アガロー
スゲルで精製したｐＢＲ：３２２ＤＮＡは、下記の条件
下に１００μｇの反応で約１４Ｇ残基のテイルを形成さ
せた＝１００μｇ／ｍｌ　ＤＮＡ、２０　ＰＭ　ｄＧＴ
Ｐ、２００　ｍＭ　Ｋｌカコジレート、１　ｍＭ　Ｃｏ
Ｃ（３２，１ｒＩＬＭβ−メルカプトエタノール（β−
８Ｈ）、１５単位ターミナルデオキシヌクレオチジル・
トランスフェラーゼ〔ウィスコンシン州、ミルウオーキ
ーのピー。エル、バイオケミカルス社（Ｐ、Ｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｉｎｃ　、　）　３、３７℃、３０分。２μβの１００
７１ＬＭＥＤＴＡ、　２　ｐ（１（Ｄ５Ｍ　ＮａＣ１；
３．２ｐ、ｅ　（７）２０　％ＳＤＳを加えて反応を停
止させ、そしてフェノール：クロロホルム（１：１）で
抽出した。得られたＧ−テイル形成プラスミドＤＮＡを
セファデックスＧ−５０カラムに通過させ、エタノール
で沈殿させた。

平均８−５ｋｂ　の長さを有する標的５ＡＣＤＮＡフラ
グメントは、下記の条件下に８０　ａｌｌの反応で１５
−２０℃残基のティルを形成させた：４−５μｊＪ　Ｓ
ＡＣＤＮＡ、２０μＭ　ｄＣＴＰ。

２００　ｍｕ　Ｋ　／カコジレート、１　ｒｎＭ　Ｃｏ
Ｃ（３２，１ｍｕβ−８Ｈ，４，５単位ターミナル・デ
オキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ、３７℃、
１２分。Ｃ−テイルを形成したＳＡＣＮＤＡの反応停止
およびその後の処理は上記同様に行なった。

プラスミドと標的ＳＡＣＤＮＡとのアニーリングは、２
−５μｇのプラスミドおよび４．０μＩの標的ＳＡＣＤ
ＮＡを８００　ｐにｌの１０　ｍｋｌ　）リス−塩酸、
ｐＨ８，０；　ｌ　ｍ、Ａｉ　ＥＤ’ｌ’Ａ　：　１０
０ｒｎＭ　ＮａＣ１１中で混合し、そして６８℃で１０
分間加熱することにより開始した。このアニーリング溶
液を次いで５５℃で１時間、２３０℃で１時間インキュ
ベートし、必要時１で４℃に貯蔵した。

実　施　例　６　　ＤＮＡフラグメントの結合（ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ、） 互いの末端を重ねた二つのＤＮＡフラグメントの結合は
、１０．０−２ｏｏ単位／ＦＩＬ７！（７）Ｔ４　ＤＮ
Ａリガーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）；
６６１Ｍ　ＡＴＰ：　６６ｍＭ　）リス−塩酸、ｐＨ７
、６；　６．６　ｍｕ　ＭｙＣ，ｅ２；　Ｉ　Ｑ　ｍｕ
ジチオスレイトール；１２℃、１２−１６時間の粂件で
行なった。

実　施　例　７　大腸菌ＭＳ８’１１の形質転換新鮮な
一夜培養菌液をＬ−グロスで１：１００に希釈し、３７
℃で振とう培養してＯＤｓｏｏ　＝　０．１−０．１５
１で増殖させた。菌体を４レツト状に集め（ペックマン
Ｊ２−２０遠心機のＪＡ２０ローグーにより５℃で５分
間５０００　ｒｐｍの遠心による）、もとの中容量の氷
冷５０　ｍＭ　ＭｎＣ１ｈ　；　１０ｍＭ　ＮａＣ２１
１３０２、ｐＨ５，６中に再懸濁させ、そして０℃にて
２０分間静置した。前記同様にベレット状に集め、氷冷
１００　ｒｎＭ　ＭｎＣ（！ｚ　：　７５　ｒｎＭＣａ
Ｃｌ　ｚ；１０　ｍＡＩ　　ＮａＣ２Ｈ５０２、ｐＨ５
，６に再懸濁させた。この菌Ｑ、１ｍＡ分を１０μｅの
ＤＮＡ形質転換溶液と混合し、４０分間氷上罠直参た。

次いで菌に熱衝撃（２５−８０℃、２．５分〕を与え、
そして菌Ｑ、ｌ＃Ｉ１分当り１．５μβの２．０Ｍ）リ
ス−塩酸、７）Ｈ７，４および０．５！ｄのＬ−グロス
を加えた。次いで菌を１５−２５μβづつ１０μｇ／ｒ
ｎｌテトラサイクリン〔シグマ（Ｓｉｇ＋ｎａ）製Ｊを
カ１えた１、５％寒天Ｌしプロスプレート上に接種し、
３７℃で一夜インキユペートした。１．ＯＸ　１０’コ
ロニー／μ、！ｉ’　ｐＢＲ８２２ＤＮＡの形質転換効
率が恒常的に観療された。

実　施　例　８　ミニライゼー）　（Ｍｉｎｉ　−Ｌｙ
ｓａｔｅ）したプラスミドＤＮＡ ミニライゼートしたプラスミドの調製は、新鮮−夜培養
菌液１　ｍｌを１％グルコースを添加したＬ−プロス９
ｒｎｌ中に加え、８７℃で振とうしてＯＤｓｓ。

が１．０になる壕で増殖させることから始めた。次いで
クロラムフェニコールを１５０μｇ／ｍｌになるよう加
え、培養物を３７℃で１’２−１６時間インキュベート
した。次いで菌を遠心分離してペレット状に回収しく　
、ＲＣ−８遠心機で２３℃、ａｏｏ。

ｒｐｒｎ、　５分）、氷冷ＴＥバッファーに再懸濁させ
、そして１．５１エツペンドルフチユーブに移して再度
遠心分離でベレット状に回収した。得られた菌イレット
を渦巻撹拌して５０　ｒｎＭ　）リス−塩酸、ｐＨ，８
，Ｏ；　５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　；　１５　％蔗糖（ｗ
／Ｖ）に再懸濁させた。この菌懸濁液に１０％５ＤＳ１
０μｇを加え、７０℃で１０分間インキュベートした。

得られたライゼート物に水冷４Ｍ酢酸力＋Ｉ　ラム６２
゜５μｅを〃口え、ライゼート物を氷上で　　　　□少
なくとも２時間静置した。遠心分離の後、上澄液の容量
を水でＱ、、５ａに調整し、ＤＮＡを二倍量の無水エタ
ノールで沈殿させた。次いでＤＮＡを１００μｌのＴＥ
に再懸濁させ、ＮａＣＩＪで塩濃度を０．ＩＭに調整し
、そして二倍量のエタノールで再沈殿させ、て制限酵素
分析に付した。

実　施　例　９　プラスミドＤＮＡの大量調製２５ｍ１
の培養をテトラサイクリンを１０μｇ／ｍＡ添加したＬ
−グロス中で一夜行なった。この−夜培養菌液５ｒｎｌ
をＭ７９培地ＩＥに〃口え、ロータリーインキュベータ
ー（２００μｌｍ）により３７℃で、０Ｄ６００が０．
６に達するまで増殖させた。次いでクロラムフェニコー
ル（シグマｔｌ［）ｅ２５０ａｙ　／　ｍ添加し、培養
液を８７℃で１２−１６時間振とつした。次いで菌を遠
心分離して収穫しく　６０００　ｒｐｎＬ、　２０分、
２℃、ベックマンＪＡ−１０ローター）、−！レットを
氷冷１’Ｅバツフアーで一度洗った。洗浄した被レッド
は一６０℃で凍結するかまたは直ちに抽出した。純化ラ
イゼート物の調製は、菌体４レツトを最初の培養菌液１
１当り、５０　ｎＬｕ　）リス−塩酸、ｐＨ８，０中の
２５％蔗糖６．２５ｒｎＡに懸濁し、次いで新たに作成
したＩＱＩｎ９／＋πｌのラインシーム（シグマ社製）
溶液１．５ｍｌをカロえることから始めた。この懸濁液
を氷上で５分間連続的に旋回撹拌し、０．５Ｍ　−Ｎα
２ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０を１．２５　ｒｎｉ　７Ｊ＋］
えそして、氷上の旋回撹拌を５分間続けた。もとの培養
１Ｈ１ｅ当り１０ｍ１の１０Ｘトリドア　（１０ｍｌの
１０％トリ）７．￥−１００：　１２５ａｌｌ（Ｄｏ　
５Ａ（’　　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，、Ｏ；　５０−の１．０　Ｍ　）リス−塩酸、
ｐＨ８，０；および８００ＩｎＡのＨ２Ｏ）を加え、懸
濁液を氷上で１５分間旋回撹拌した。次いでこのう・ｆ
ゼート物を遠心分離しくＪＡ−２０ローター中、１９０
００ｒｐｙｘ、４℃、３０分）、上澄をメスシリング−
に移した。上澄にＣｓＣｅを０．９５　、！９７ｒｎｌ
に溶解し、ＴＥバッファー中に１０■／ｒｒＬｌに溶か
しｆｌｇｔＢｒを鴇容量〃口えた。プラスミドとクロモ
シームＤＮＡとの分離はペックマンＴｉ５０．２０−タ
ーによる遠心分離（２３℃、４４０００　ｒｐｍ。

２４時間及びひき続き８８０００　ｒｐｍ８６時間）に
より行なった。

グラジェント上のプラスミドＤＮＡバンドｋｌ。

Ｖ、ランプで肉眼識別し、シリンジを用いて側穿刺によ
って２１ｇ針で採取した。ＥｔＢｒの除去はイソブチル
アルコールで繰返し抽出して行なった。

このプラスミド溶液を次いでＴＥバッファーで一夜透析
し、塩濃度を０．ＩＡＩ　ＮａＣｅに調節し、二倍量の
無水エタノールでＤＮＡの沈殿を行なった。

実　施　例　１０　　”５１−１１Ｇ−プロティンＡバ
インディングアッセイ バクテリアコロニーにおけるプロティンＡ様活性の発現
は、ニトロセルロースフィルター上に固定したコロニー
の溶菌菌体への１２″Ｉ　−１９Ｇの結’、ｔｓ−によ
り検出した。組み変えプラスミドを有する大腸菌並びに
５ＡＣＣ陽性コントロール）および５ＡＷ（陰性コント
ロール）菌を取り、栄養寒天プレートに線上に塗り、−
夜増殖させた。このプレート上ニニトロセルロースフィ
ルターディスクＣＢＡ８５．８７ｍｍ５　シュライヒヤ
ー・アンド・シュエル、ケーネ、　、ｒ−ヌ、　バー　
、　（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅ　ｌ　
ｌ　、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ、ｌ−１）Ｊ　　を注意深く恵ね
て下面のコロニーを吸着させ、このフィルターを持ち上
げてワットマン８　ＭＭＩＰ紙に押しあてて乾燥した。

フィルターに結合した菌の溶菌は、フィルターｒコロニ
ー側を上にして、０．５　ＭＮｃＬＯＩＩで飽和させた
ワットフッ８ＭＭＰ紙上に■ね、２８℃で１０分間溶菌
させることにより行った。溶菌終了後、フィルターをｐ
紙で乾燥させ、１．０＆）リス−塩酸、ｐＨ７，０で飽
和させたｐ紙で中和した。このフィルターを再度ｐ紙で
乾燥させ、プロティン・パインディング溶液（１０ｒｎ
Ｍトリスー塩酸、ｐＨ７，０；　１００　ｒｎＡＩ　Ｎ
ａＣ８：　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．１３％ＮＰ４０　
；　０．１％ＳＤＳ：０．１％デオキシコール酸ナトリ
ウム；　０．’２％フィコール４００；０．８％ゼラチ
ン）で２８℃、４−６時間ロータリープラットフォーム
シェーカー上で前処理した。

この前処理後、フィルターをフィルター当り４．５ｄの
プロティン・パインディング溶液を入れた１４ビーカー
に移した。”ｌ−１ｆＧＣ抗家兎羊血清、メイン州、ボ
ストン、ニュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ１ｂｃｌｅｃＬｒ）製〕のパイ
ンディングは、前記ビーカーに５　Ｘ　１０’　ｃｐｒ
ｎ／　ｍｌの＋２５Ｉｌ、（：；を加え、定常回転振と
うを４℃で一夜行なうことによってパインディングをひ
き起すことにより実施した。フィルターの洗浄はプロテ
ィン・パインディング溶液５００　ｎｒｌでの繰返し洗
浄により行ない、その際第一回の洗浄は４℃で、そして
２−３回の追卵洗浄は２３℃で行なった。洗浄したフィ
ルターを次いでｐ紙で乾かし、生じた＋２６ＩＪ、Ｇバ
インディングの検出は、コダックＸＡＲ−５フィルムお
よび二つのデュポン・クロネツ、クス・ライトニング−
プラス増巾スクリーン（１）ｌＬＰａｎｔ　Ｃｒｏｎｅ
ｚ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　−ＰｌｕｓＣ訣ａｎｃｅｍｅ
ｎｔ　５ｃｒｅｅｎ　）を用し）るう・ジオオートグラ
フィーで実施した。

実　施　例　１１　　　ＤＮＡ配列の決定ＤＮＡ配列の
決定はマキサムＣ１Ｃ１１ａｘａおよびシルバード（ｇ
ｉｌｂｅｒｔ）および／％イデツカ；−（ｌｌｅｉｄｅ
ｃｋｅｒ）らの報告した方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４：５６０（１９７７）およびＧｅｎｅ、１
０：６９（１９８０）参照〕を僅かに変形して行なった
。

実　施　例　１２　　　形質転換大腸菌中でのプロティ
ンＡ様物質の発現、のスクリ ーニング 組み変えＳＡＣ遺伝子の蓄積中のプロティンＡ様物質を
コードする配列の発現をテストするため、谷々５２コロ
ニーの５０プレートカラのコロニー（２，６００）ｔ−
ニトロセルロースディスクに乗せ、１２５ＩＪ、Ｇバイ
ンデインダアツセイを行すった。

陽性コントロールおよび陰性コントロールとして夫々Ｓ
ＡＣおよびＳＡＷコロニーを含むフィルターについても
同様に行なった。アッセイの感度を評価するため、精製
プロティンＡ〔ニューシャーシー州、ビスカタウエイ、
ファルマシア（Ｐｈａｒ　−ｍａ、ｃ　ｉα）製〕の連
続希釈もニトロセルロースディスクにスポットし、試験
フィルターと並行してアッセイした。このアッセイの日
常的感度は精製プロティンＡについ？１．Ｏｒ、Ｃいし
０．０１　ｎｉの範囲で変動することが見出された。Ｓ
ＡＣおよびＳＡＷ菌を言むフィルターは、それぞれ陽性
および陰性のオートラジオグラフィーシグナルを与えた
。このアッセイおよびひき続くアッセイにおいて、一つ
の形質転換コロニーが相当量の１２′５Ｊ　　Ｊ、Ｑを
結合した。このコロニーをひき続く分析のために採取し
た。このコロニーに含１れるプラスミドをｐＡα３７と
命名する。

実　踊　例　１８　　　ｐＡｃ８７の挿入フラグメント
のプロティンＡ様物質に相当 する遺伝子領域の決定 ｐＡｃ８１プラスミドＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
分析において、３．１．２．３．１．９およびＱ３５．
ｋｂ　の長さのＰｓｔｌ挿入フラグメントの存在が明ら
かになった。ｐＡｃ８７プラスミドＤＮＡを２８口で消
化し、７’４１１ガーゼで再結合し、そして大腸菌ＭＳ
８７１の形質転換に使用した。得られた形質転換菌を実
施例１２に記載した＋２５１−ＩｆＧ−パインディング
アッセイでスクリーニングした。

３２２の形質転換菌中、１２５１　１２Ｇ−ノ（インデ
ィング陽性のコロニーが１０個得られ、１．９ｋｂＰｓ
ｔ１挿入フラグメントを含む組み変えプラスミドを有す
ることが見出された。＋２ｊＩＪ、Ｇ−・ζインディン
グ能の無い形質転換コロニーを任意に１２個選びその組
み変えプラスミドＤＮＡを分析したところ、それらはｐ
Ａｃ８ＴのＰｓｔｌフラグメントを１個−ｆたはそれ以
上言むがｌ’、９ｔｃｂ　　フラグメントは含１７了い
ことが判った。従ってプロティンＡ様コード配列の少な
くとも一部はｐＡＣ３７の１．９　ｋｂ　　Ｐｓｔ　ｌ
フラグメント中に存在すると結論された。１，９　ｋｂ
　挿入フラグメントを１個有する組み変えヤ°ラスミド
を有する一つの陽性コロニ（ｐ、Ａｃ８７−６と命名す
る）紮採取してさらに分析した。

冥　施　例　１４　　ｐＡｃ８７−６ＤＮＡのプロティ
ンＡ様コード配列の同定 ｐＡｃ８７−６ＤＮＡのＰａｔ　Ｉ　１．９　ｋｂ　　
フラグメント中のプロティンＡ様コード配列の存在の最
終決定は、ＤＮＡ配列決定により行なった。ｐＡＢ８７
−６ＤＮＡをＨｉｎｄ　［［Ｉで消化し、γ３２ｐ−Ａ
ＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベルし次いで
Ｐｓｔｌで消化した。０．６　ｋｂ　Ｈｉルｄ！［／ｐ
ｓｔｌフラダメントの部分を配列決定したところ、プロ
ティンＡ分子のＢ−Ｃ結合（ｊｕｎｃｔｉｏｒＬ）の公
昶アミノ酸と配列的一致を示した。挿入フラグメント中
のプロティンＡｍ物質のＢ−Ｃ結合の配列コードの位置
は、ｐＡｃ８７−６プラスミドＤＮＡの１．９　ｋｂ挿
入片がプロティンＡ遺伝子の配列コードの大部分（（ノ
ボシーム結合ナイトおよび５′調節配列も含めて）を有
することを示唆した。

実　施　例　１５　　大腸菌ＭＳ　８７１　（ｐＡａＢ
’１−６）、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１８１ からのプロティンＡ様物質の 精製 大腸菌ＭＳ　Ｂ　７１　（ｐＡｃ８７−６　）を０．１
ＮＩＶａＯＨで溶菌して遠心分離した。上澄を除き、リ
ン酸−ナトリウムを２５　ｍＭ加え、そしてこの溶液を
ＩＨＨＣｌｌでｐＨ’７．０に調整した。この蛋白質液
を２５　ｍＡＩリン酸ナトナトリウムｐＨ７にて透析し
、次いで遠心分離して澄明にした。

得られた溶液をＩｆＧ−セファロースカラム（蛋白質１
．８Ｌ’１ｇ当りベッドボリューム８０ｒｎｌ）に導入
し、カラムをＡ　２８０　でｉＭＩＩ定したときカラム
からもはや蛋白質が流出しγＳくなる１で０．１Ｍリン
酸ナトリウムｐＨ７，０で洗浄した。

プロティンＡ様物質は０．１Ｍグリシン−塩酸ヲ使用し
て溶出した。精製された蛋白質は８０％飽和（ＮＨ４）
２　Ｓ　Ｏｈで沈殿濃縮し、１０　ｒｎＭリン酸ナトリ
ウムｐＨ’？、０で透析し、凍結貯蔵した。

大腸菌ＭＳ　８７１　（ｐＡｃ８７　）、ＮＲＲＬ　　
Ｂ−１５１２７７１）らのプロティンＡ様物質の精、ｚ
Ｊも上記同様に行ないつる。

実　施　例　１６　大腸菌ＭＳ３７１　（ｐＡｃ８’７
−６）、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１１１ からの、プロティンＡ様物質 に当るアミノ酸配列のサブ７ ラグメントをコードするヌク レオチド配列の分離 プロティン、４に類似する生物活性を有するアミノ酸配
列をコードしうるコード領域の実質的に純粋なサブフラ
グメントを分離するためにプロティンＡ様物質をコード
するヌクレオチド配列を開裂するためには制限１孝素を
使用することができる。

例えば、Ｒｓα１制限エンドヌクレアーゼによる７）Ａ
Ｑ８７−６ＤＮＡの開裂により、１１９９ヌクレオチド
長さの領域Ｅ、Ｄ’、Ａ、ＥおよびＣを含むポリにプチ
ドをコードする一つのオリゴヌクレオチドが得られる。

他の制限酵素、例えばｌ１ｉｎｆｌによる消化または例
えばＨｉｎｄ　ｉＩｌおよび３ａｕ８Ａの混合酵素によ
る消化の使用によって、プロティンＡの生物活性に類似
の活性を有するアミノ酸配列をコードする実質的に純粋
な十分特定されたオリゴヌクレオチドフラグメントを生
じさせることができる。

これら所望のオリゴヌクレオチドのサブフラグメントは
、（欠のようにして’＝８　ｔＱ用アガロースゲル電気
泳動により実質的に純粋な形で単離可能である：アガロ
ースを２ｘＥバツフアー（０，０８Ｍ）リス−塩酸、ｐ
Ｈ７，８：　０．０１　ｈｆ　　ＮａＣＪｓＯ２：１）
、０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ）に１％に溶かし、バイオラン
ド社（Ｂｉｏ　−Ｒａｔｉ　：リッチモンド、Ｃａ）の
スラプゲ“装置（′５ｌａｂ　ｇｅｌ　ａｐｐａｒａｔ
ｕｓ）に注入する。サンプルを１０　ｒｎＭ　）リス−
塩酸、ｐＨ８，０：０．１ｍＭＥＤＴＡに溶解し、２ｘ
Ｅ泳動バツフアーを用いて定電力で泳動する。

電気泳動後、一つのレーン（ｔαルｅ）をゲルから切り
取り、エチジウム・プロマイ）”　（０，５μｊｊ／ｍ
ｌ）で染色し、ＤＮＡバンドを紫外線下に肉眼で確認す
る。レーンを切り取った残りのゲルから目的のバンドを
切り取り、軟化させてから２ｏゲージ針を通過させる。

次いで等量の抽出バッファー（１０ｍ、Ｍトリス−塩酸
、ｐＨ８，０；　２　ｒｎＭ　ＥＤＴＡ　；　ＩＡｉ　
ＮａＣｅ）を加えてゲルと混合する。混合物を４７℃で
１６時間インキュベートし、１００．０００ｇで１時間
かけてアガロースをイレット状に沈殿させる。上澄を次
いでｔＲＮＡが８０　ｐｇ／ｒｕｔ；になるようにし、
そして界面にアガロースが認められηｆるまでフェノー
ルで抽出する。次いでＤＮＡをエーテルで抽出し、エタ
ノールで沈殿させる。ゲルバッファーおよび抽出工程は
、当業者により所望ＤＮＡフラグメントを回収するため
に変化されることができる。

実　施　例　１７　　プロティンＡ様物質の領域Ｅ１Ｄ
、Ａ、Ｂ、およびＣのアミ ノ酸配列をコードするヌクレ オチド配列の合成 例えば前記実施例に示したようにクローニングおよび配
列解析によって特定アミノ酸配列をコートスルヌクレオ
チド配列が決定さｔＬれば、このアベノ酸配列をコード
するオリゴヌクレオチトヲ化学的手法で合成することが
できる〔例えばエツジ。

エム、ディー、　（Ｅｄｇｅ　、Ｍ、Ｄ、　）ら、ネイ
チャーＣＮａｔｕｒｅ）、２９２ニア５６−７６２（１
９８１年）参照３゜すなわち、プロティンＡ４９分子の
ためのコード領域のサブフラグメントまたは全コード領
域を合成し、実質的に純粋な形で単離することができ、
これには領域ＥＸＤ、Ａ、ＢおよびＣをブー上゛するコ
ード配列の領域も含む。

領域Ｅ、ＤＸＡ、ＢおよびＣの各々または種々の組合せ
はプロティンＡと同様に１前記のように診断テストシス
テムにおいてＩｆＧを結合するために有用である。

実　施　例　１８　プロティンＡ様物質の領域Ｅ１ＤＸ
Ａ、Ｂ、およびＣのアミ ノ酸自己タリをコードするヌクレ オチド配列のクローニングお よび形質発現 夫々実施例１６および１７で単離および合成された。プ
ロティンＡ様物質またはその生物活性サブフラグメント
をコードする実質的に純粋なヌクレオチド配列は、発現
クローニングベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　ｖ’ｅｃｔｏｒ）中の適当な制限酵素部位へ
結合（ｌｉｇａｔｅ）することができる。

必要に応じ、リンカ−分子を用いてヌクレオチド配列に
結合サイトを付加することもできる〔例えばノリス、ケ
ー、イー、’（Ｎｏｒｒｉｓ、に、Ｅ、）ら、ジーンＣ
Ｇｅｎｅ）、７　：　８’５５−８６２　（１９７９年
）参照〕。こうして結合したＤＮＡは、つづいて宿主微
生物の形質転換に使用できる。他の研究者らによる従来
の研究により、クローニングしたヌクレオチド配列によ
る形質発現が期待しうろことが示されている〔例えば、
ドエル、エム、ティー。

（Ｄｏｅｌ　、Ｍ、Ｔ、　）ら、ヌク、アシッズ・レス
、０Ｊｔｂｃ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、８　：　４５７５−４５９２
（１９８０年）：ロバーツ、ティー、　（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ　７’、）ら、プロス、ナト、アカド、サイ、　ＣＰ
ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）、７６’ニア６Ｏ−７６４（１９７９年）；
ガレンテ、　エル、　（Ｃｒｒ）、ａｒｅｎｔｅ、Ｌ、
）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、２０：５４８−５５８（１９
８０年〕参照〕。こうして発現された生物活性物質は、
次いで実施例１５に記載したように１．て精製できる。

プラスミドｐＡｃ’ａ’ｌおよびｐＡｃ８Ｔ−６は、永
久寄託物として大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を宿主として、
米１因イリノイ州、被オリア（Ｐｅｏｒｉα）の米国農
務省（Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｒｎｅｎ、ｔ　ｏｆ　Ａｇ
ｒｉｃｗｌｔｑｂｒｅ）、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　　Ｉｌｅｇ
ｉｏｒＬａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ：ＮＲＲＬ）に寄託されている。その寄託番号は
次のとおりである： Ｅ、ｃｏｌｉＭ：Ｅ８’１１（ｐＡｃ８？）・・・−Ｎ
ｉｌＲＬ　　Ｂ　−１５１２７（１９８２年８月１８日
寄託）Ｅ、　　ｃｏｌｉ　ＭＳ８Ｔ　１　（ｐＡｃ・８
’ｌ　−６）　・−ＮＲＲＬＢ−１５１８１（１９８２
年８月１８日寄託）Ｅ、ｃｏｌｉＭｓ３７１＝−ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１５１２９（１９８２年−８月１８日寄託） プラスミドｐＢＲ８２２は公知かつ容易に入手し得るプ
ラスミドである。このプラスミドはＥ。

ｃａｄｉ宿主中でＡＴＣＣ８７０１７として維持されて
いる。純化ｐＥＲ８２２，ＤＮＡは、ポリバー。

エフ、ロドリゲス、アール、エル０．グリーン、ピー、
シエイ、、ベトラツハ、エム、シー０．ハイネツカー、
エイチ、エル８．ボイヤー、エイチ、ダブリュ１．クロ
サ、ジエイ、エイチ、およびファルコウ、ニス、（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ、Ｆ、、Ｒｏｄｒｉｑｗｅｚ、Ｒ，Ｌ、。

Ｇｒｅ　ｅｎｅ　、　Ｐ、Ｊ、　、Ｂｅ　ｔ　ｌ　ａｃ
’ｈ　、Ｍ、Ｃ，、Ｈｅ　ｙｎｅｋｅｒ　、Ｈ，Ｌ、。

Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、　、Ｃｒｏｓａ、Ｊ、ｇ、　、ａ
ｎｄ　Ｆａｌｋｏｗ、Ｓ、　）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、
２：９５−１１３（１９７７年）およびストクリフ、ジ
エイ、ジー、　（５ｕｔｃｌｉｆｆｅ。

Ｊ、Ｇ、　）、ヌクレイツク・アシソズ・レス（Ｎｗ　
ｃ　ｌ　ｅ　１ｃＡｃｉｒｌｓ　Ｒｅ５）、５　：２７
２１−２７２８（１９′７８）に記載された方法で得ら
れる。

ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１２７、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１
８１およびＮｌンＲＬＢ−１５１２９は、本明細書に記
載された発明とともにこれらの寄託番号を開示した特許
の付与と同時に一般に入手可能となる。これらの寄託物
の入手可能性は、行政処分として付与された特許権を制
限して本発明の実施権を許諾するものでないことに留意
され、たい。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＥ　８７１の代りに、例えば枯草菌（
Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレフ０トミセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｎｒｎｙｃｅｓ）属、およびイーストなどが使用しつ
る宿主として公知である。

さらに、菌の増殖、ＤＮＡの抽出、制限酵素によｌ化の
実施、ＤＮＡフラグメントの電気泳動、プラスミドのテ
ール形成およびアニールならびにＤＮＡ挿入、ＤＮＡの
結合、Ｅ、ｃｏｌｉ閑の形質転換、プラスミドＤＮＡの
調Ｗ、ＩｙＧ−バインディングアッセイの実施、蛋白溶
解物（ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｓαｔｅｓ）の調製、蛋白質
の電気泳動およびＤＮＡの配列決定等に要求される条件
を変化させることは当業者の慣用手段の範囲である。

特許量ａ人　　レプリゲン・コーポレーション化　　理
　　人　　弁理士　　　湯　　浅　　恭　　竺（外４名
） 一段死

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　プロティンＡ様物質のアミノ酸配列をコード
   するヌクレオチド配列を有する組み変えプラスミドまた
   は実質的に同じプロティン様生物活性を有する分子をコ
   ードする前記ヌクレオチド配列のサブフラグメントを有
   する微生物。 （２）プロティンＡ様物質のアミノ酸配列をコードする
   ヌクレオチド配列または実質的に同じプロティンＡ様生
   物活性を有する分子をコードする同等ヌクレオチド配列
   を含む組み変えプラスミドを有する微生物でろって、前
   記ヌクレオチド配列が次式で衣わされる微生物： ＴＴＧ　ＡＡ４’　ＡＡＧ　、４Ａ４　ＡＡＣＡＴＴ　
   ＴＡＧ’　ｉ’ｃＡ　ＡＴＴ　ＣＧＴＭｅｔ　Ｌｙｓ　
   Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　５ｅｒＩｌ
   ｅ　ＡｒｇルｉＡ　ＣＴＡ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＧＧＴ　
   ＩＴ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＡＣＴＬｙｓ　Ｌｅ−
   ｕＧＬｙ　Ｖａｔ　ＧＬｙ　ＩＬｅ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　
   Ｖａｌ　Ｔｈｒ＊ＴＴＡ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　Ｃ
   ＴＴ　Ｍ’Ａ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＧＴＡＬｅｕ　
   ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｒｅ　Ｓｅｒ　Ｇ
   ｌｙ　Ｇｌｙ　ＶａｌＡＣＡ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡ
   　ＡＡｒ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＡＣＧＡＩ’Ｔ
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   ＣＡＡ　ＡＡＴ　（ＥＣＴ　ＴＴＴ　ＴＡＩ’　ＣＡＡ
   　ＧＴＧＧｌｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａ
   ｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　ＶａｔＥ　　〉 ＴＴＡ　ＡＡ７’　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＡＡＣＴＴＡ　Ａ
   ＡＣＧＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡＬｅｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　
   Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇ
   ｌｎＣＧＴ　ＭＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　Ａｒｃ　ＣＡＡ　
   ＡＧＣＣＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
   　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ
   　ＡｓｐＧＡＴＣＣＡ　ＡＧＣＣＡＡ　ＡＧＴ　ＧＣＴ
   　ＡＡＣＧＴＴ　ＴＴＡ　ＧＧＴＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅ
   ｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　　Ｌｅ
   ｒｂ　ＧｌｙＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴＴ
   　ＡＡｆｆ’　ＧＡＣＴＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴＣＣＡ　
   ＡＡＡＧＣＴ　ＧＡｆ’　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　Ａ
   ＡＩ’　ＡＡＧ　ＴＴＣＰｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓ
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   ｈｅＤ　　　　　　　〉 ＡＡＣＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＧＣＧＣＣ
   ７’ＴＣＴＡＴＧＡＡＡｓｎ　Ｌｙｓ、Ａｓｐ　Ｇｉｎ
   　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　ＧｌｕＡ
   ｆ’ＣＴＴＧ　ＡＡＣＡｆｌ”Ｇ　ＣＣＴ　ＡＡＣＴＴ
   Ａ　ＡＡＣＧＡＧ　ＧＡＧＩｌｅ　　Ｌｅｒｂ　Ａｓｎ
   　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｌａｒｂ　Ａｓｎ　
   Ｇｉｒｔ、ＧｌｕＣＡＡ　ＣＧＣＡＡＩ’　ＧＧＴ　Ｔ
   ＴＣＫＩ’Ｔ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＡＡＡＧｉｎ
   　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　　’Ｉｌｅ　Ｇｉ
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   ＡＧＣＣＡＡ　ＡＧＣＡＣＴ　ＡＡＣＧＴＴ　ＴＴＡＡ
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   ｈ、ｒ、Ａｓｎ　Ｖａｌ　　ＬｅｕＧＧＴ　ＧＡＡ　Ｇ
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   　ＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＴ
   　ＧＣＴ　ＴＴＣＴＡＴ　ＧＡＡ　ＡＴＣＴＴＧＧｌｕ
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   Ｃ，４Ａ４　ＧＡＡ　ＣＡＡＣＡＡ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　
   ＴＴＣＴＸＴ　　ＧＡＡ　ＡＴｃ　ＴＴＡ　ＣＡＴＴＴ
   ＡＧｌｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　
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   　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＧＣＡＡＴ　　
   ＧＧＴＰｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｒｂ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇ
   ｉｒｔ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｔｊ　ＧｌｙＴＴＣＡＴ
   ＣＣＡＡ　ＡＧＣＴＴＡ　Ａ４Ａ　ＧＡＩ’　ＧＡＣＣ
   ＣＡ　ＡＧＣＰｈｅ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ’Ｓｅｒ　Ｌｅ
   ｗ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　５ｅｒＣＡＡ　
   ＡＧＣＧＣＴ　ＡＡＣＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ
   　ＧＣＴ　ＡＡＡＧｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌ
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   　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＧＡＴＧＣＡ　ＣＡｊＬ　ＧＣＡ　
   ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＩ’ＧＡＣＡＡＣＡＡＡ　ＴＴＣ
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   ｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌ
   ｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　ＡｓｎＣ〉 ＧＣＴ　ＴＴＣｌ’ｌ　ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＣＡ
   Ｔ　　ＴＴＡ　ＣＣＴ　ＡＡＣＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ
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   ａｌ　　５ｅｒＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣ
   Ａ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ、ＣＴＡＬｙｓ　
   　Ｇｉｎ、Ｉｌｅ’Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
   Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　ＬｅｕＡＡＣＧＡＴＧＣＴ　ＣＡ
   Ａ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣ
   ＡＡＣ”ＡＡＣＡＡＧ　ＣＣ：Ｔ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　Ｇ
   ＡＡ　ＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡｓｎ　Ａｓｎ　’Ｌｙｓ　
   Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａ
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   Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌ
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   　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｒｂ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ
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   ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣＧｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓ
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   ｎＡＡＡＣＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣＧＧ
   ＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＴＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙ
   ｓ　Ｇｌｖ、　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒ
   。 ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡｆ　（ＥＧＣＡＡＣＡＡ
   Ａ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＡＡ４Ｃ；ｌｙ　Ｌｙｓ　　Ｇｌ
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   　ＬｙｓＧＡＡ　ＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＴ　
   ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＸＴＧｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌ
   ｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　Ｇｌ
   ｕ　ＡｓｐＧＧＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＣＧＴ　ＡＡ
   Ａ　ＧＡＡ　ＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙ
   ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ
   　ＡｓｎＧＧＡ　ＧＴＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＴ　ＡＡ
   Ａ　ＣＣ１’　ＧＣＴ　ＧＡ’ｌ’　ＡＣＡＧｌｙ　Ｖ
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   ７Ａｓｐ　Ｔｈ５ＧＴＡ、ＡＫＩ’　ＧＡＣＡＴＴ　Ｇ
   ＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＡＣＧＧＣＡＣＴＶａＬ　Ａ
   ｓｎ　ＡｓｐＩｉｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ
   　Ｇｌｙ　ＴｈｒＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＡ　ＡＴ
   Ｔ　ＧＣＴ’ＧＣＡ　ＧＡ７’　ＡＡＣＡＡＡＴｈｒ　
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   Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＬｙｓＴＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡｆ　ＡＡ
   Ａ　ＡＡＣＡＴＧ　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＴＬｅ
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   ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＧＡＴＡＡＧ’ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＣＣ
   ＡＧｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ａｓ
   ｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ　Ｐｒ。 ＧＣＡ　ＡＡＣＣＩ　ＧＣＡ　ＧＫＩ’　ＧＣＴ　ＡＡ
   ＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡＡｌａ　Ａｓｎ　１−１ｉｓ
   　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　
   ＧｉｎＧＣＡ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧ
   Ｔ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡ７’　ＣＣＡＡｌａ　Ｌｅｕ
   　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
   Ａｓｎ　Ｐｒ。 ＴＴＣＡＴＣ（ＥＧＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ｉ”
   ＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＴＴＡＬａｗ　Ｉｌｅ　　Ｇｌ
   ｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
   ｙ　ＬｅａＴＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＧ　ＴＴＡ　ＧＧＴ　
   ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴＳｅｒ　Ｌｅ
   ｒｂ　Ａｌａ　Ｌｅｒｂ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ
   ｅｒｂ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧＧＡ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧ
   ＣＧＡＡ　ＣＴＡ　ＴＡＡＧｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａ
   ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　５ｔｏｐ（８１ｉ後の２０９ヌ
   クレオチド塩基を含まぬことを除き特許請求の範囲＄２
   項で規定したヌクレオチド配列と同じ配列を有する、プ
   ロティンＡ様物質のアミノ酸配列をコードするヌクレオ
   チド配列または実質的に同じプロティンＡ、ｌｌ生物活
   性を有する分子をコードする同等ヌクレオチド配列を含
   む組み変えプラスミドを有する微生物。 （４）特許請求の範囲第２項で現定されたヌクレオチド
   配列を有するＤＮＡ運搬ベクター。 （６１％許請求の範囲第３項で規定されたヌクレオチド
   配列金有するＤＮＡ運搬ベクター。 （７ｊ　　微生物中へ移入され、その中で複製された特
   許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ運搬ベクター。 （８１ｐＢＲ８２２の全ゲノムおよび特許請求の範囲第
   ２項で規定されたヌクレオチド配列−ト有するプラスミ
   ドｐＡｃ　８７゜ （９１ｐＢＲ８２２の全ゲノムおよび特許請求の範囲第
   ３項で規定されたヌクレオチド配列を有するプラスミド
   ｐＡｃ８７−６゜ （１０）寄託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１２７の大腸菌
   （Ｅ、ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第２項記載の微
   生物。 （Ｕ）寄託許号ＮＲＲＬ’Ｂ−１５１８１の大腸菌ＣＥ
   、ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第３項記載の微生物
   。 （１２）プロティンＡ様物質の領域りのアミノ酸配列を
   コードするヌクレオチド配列および実質的Ｖ（同じ領域
   りの生物活性ヲ有する分子をコードする同等ヌクレオチ
   ド配列を含む組み変えプラスミドを有する微生・吻であ
   って、前記ヌクレオチド配列が次式で表わさｎる微生物
   。 ＧＣＴ　ＧＸＴ　ＧＣＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡＡＡＡＡＡＧ
   　ＴＴＣＡＡＣＡＣＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｌ＠　Ｇｉｎ　
   Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＬｙｓＧＡ
   Ｉ’　ＣＡＡ　’ＣＡＡ　ＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＡＴ　
   ＧＡＡ　ＡＴＣＴＴＧＡｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　’Ｓｅ
   ｒ　ＡＬａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｉｒｅ　Ｌｅｕ
   ＡＡＣＡＴＧ　、ＣＣＴ　ＡＡＣＴＴＡ　ＡＡＣＧＡＧ
   　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＧＣＡｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａ
   ｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　に１ｕＧｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ
   ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣＡＴＴ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　Ｃ１
   ’Ｔ　ＡＡＡ　ＧＡＣ（ＪＩＸＴＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈ
   ｅ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ＬｅｌＬＬｙｓ　Ａｓｐ
   　ＡｓｐＣＣＡ　ＡＧＣＣＡＡ　ＡＧＣＡＣＴ　ＡＡＣ
   ＧＴＴ　ＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
   ｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
   　ＧｌｕＧＣＴ　ＡＡＡルＩＡＴＴＡ氾ＣωＶ　ＴＣＴ
   　Ｃ氾ＧＣＡ　ＣＣＧＡｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｒｅ
   ｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒ。 ＡＡＡ Ｌｙｓ０ （１３）プロティンＡ様物質の領域Ａのアミノ酸配列を
   コードするヌクレオチド配列および実質的に同じ領域Ａ
   の生物活性を有する分子をコードする同等ヌクレオチド
   配列を含む組み変えプラスミドを有する微生物であって
   、前記ヌクレオチド配列が次式で表わされる微生物： ＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＣｊＬＫｒＴＴＣＡＡＣＡＡＡ　Ｇ
   ＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ’Ａｓｎ
   　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎル
   １７’　ＧＣＴ　ＴＴＣＴＩ　ＧＡＡ　Ａ７″ｃ　ＴＴ
   Ｇ　ＡＡＣＡ７′Ｇ　ＣＣＴＡｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　
   Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅａ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐ
   ｒ。 ＡＡＣＴＴＧ　ＡＡＣＧＡＡ　Ｇ氾ＣＡＡ　ＣＧＣＡＡ
   Ｔ　ＧＧＴ　ＴＴＣＡｓｎ　Ｌｅｒｔ、　Ａｓｎ　Ｇ１
   １ＬＧｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ
   ＡＴＣＣＡＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＹ　ＧＡＣ
   ＣＣＡ　ＡＧＴ　Ｃ氾ｌｉｅ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｒ
   ｂ　Ｌｌｌｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
   ｎＡＧＴ　ＧＣＴ　ＡＡＣＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　Ｇ
   ＡＡ　ＧＣ’ｌ’　ＡＡＡ　ＡＡＧＳｅｒ　Ａｌａ　Ａ
   ｓｎ　Ｌｅｒｂ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌ
   ｙｓ　ＬｙｓＴＴＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　、ＣＡ
   Ａ　ＧＣＡ　ＣＣＧルＭＬｅｒｂ　Ａｓｎ　Ｇｌｒｂ　
   Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ０Ｑ４）プロ
   ティンＡ様物質の領域Ｂのアミノ酸配列をコートスるヌ
   クレオチド配列および実質的に同じ領域Ｂの生物活性を
   有する分子をコードする同等ヌクレオチド配列を含む組
   み変えプラスミドを有する微生物であって、前記ヌクレ
   オチド配列が次式で表わされる微生物： ＧＣＴ　ＧＡＩ’　ＡＡＣＡＡＡ　ＴＴＣＡＡＣＡＡＡ
   　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌ
   ｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌ
   ｎルσＧＣＴ　ＴＴＣＴＡＩ″ＧＡＡ眉’ＣＴＴＡ　Ｃ
   ＡＴ　ＴＴＡ　ＣＣＴＡｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ
   　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌａ１ＬＨｉｓ　Ｌｅｒｂ　Ｐｒ。 ＡＡＣＴＴＡ　Ａｎ’　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＧ
   ＣＡ、り１ＧＧＴＴＴＣＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌ
   ｕ　Ｇｔｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ
   、心’ＣＣＡＡ　ＡＧＣＴＴＡル帆ＧＡＴ　ＧＡＣＣＣ
   Ａ　ＡＧＣＣＡＡｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｗ　Ｌ
   ｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＡＧＣ
   ＧＣＴ　Ａ７１ｃ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　
   ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧＳｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅ
   ｕ　Ｌｅｒｂ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙ
   ｓＣＴＡ　ＡＡＴ　Ｇｌ’　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　
   ＣＣＡルＭＬｅｔｂ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｉｎ
   　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　。 （１５）プロティンＡ様物質の領域Ｃのアミノ酸配列を
   コードするヌクレオチド配列および実質的に同じ領域Ｃ
   の生物活性を有する分子をコードする同等ヌクレオチド
   配列を含む組み変えプラスミドを有する微生物であって
   、前記ヌクレオチド配列が次式で表わされる微生物。 ＧＣＴ　ＧＡＣＡＡＣＡ４Ａ　ＴＴＣＡＡＣＡＡＡ　Ｇ
   ＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡＡｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
   　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　ＧｉｎＡ
   ＡＴ　ＧＣＴ　１’ＴＣＴＡＴ　ＧＡＡ　Ａｆ’Ｔ　Ｔ
   ＴＡ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＣＩ’Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈ
   ｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　１ｉｉｓ　Ｌｔ
   ｔｔｕ　Ｐｒ。 ＡＡＣ、ＴＴＡ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　Ｃ
   ＧＴ　ＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡｓｎ　Ｌｅｗ　７”ＡｒＧ
   ｉｕ　Ｇｌ−ｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐ
   ｈｅＡｒｃ　ＣＡＡ　ＡＧＣＣＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＣＧ
   ＡＴ　ＣＣＴ　ｉ’ｃＡ　Ｇ１’Ｇ１１ｅ　Ｇｌｎ　Ｓ
   ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｅ
   ｒ　ＶａｌＡＧＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＩＩＩＪ’Ｔ　ＴＴ
   Ａ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＧＣＴルＩＡＡＡＧＳｅｒ　Ｌｙ
   ｓ　Ｇｌｕ、　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｌ
   ａ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＣＴＡ　７４Ａｃ　ＧＡＴ　ＧＣＴ
   　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＡＬｅｕ　Ａｓｎ　Ａ
   ｓｐ　Ａｌａ、Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　０（
   １６）プロティンＡ様物質の領域Ｅのアミノ酸配列をコ
   ードするヌクレオチド配列および実質的に同じ領域Ｅの
   生物活性を有する分子をコードする同等ヌクレオチド配
   列を含む組み変えプラスミドを有する微生物であって、
   前記ヌクレオチド配列が次式で表わされる微生物： ＧＣ’ｌ’　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＩ’　ＧＣＴ　ＴＴ
   Ｔ　ＴＡＴ　Ｃ氾ＧＴＧ　ＴＴＡＡｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌ
   ｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ
   　Ｌｅｕんσ眉’Ｇ　ＣＣＴ　ＡＡＣＴｉ’Ａ　ＡＡＣ
   ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＣＧＴＡｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒ
   ｏ’　Ａｓｎ　Ｌｅｒｂ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇ
   ｉｎ　ＡｒｇんσＣ；ＧＴ　ＴＴＴ　Ａｒｃ　ＣＡＡ　
   ＡＧＣＣＴＴ　ＡＡＡ　Ｇ疋’ＧＩＡｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐ
   ｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓ
   ｐ　ＡｓｐＣＣＡ　ＡＧＣＣＡＡ　ＡＧＴ　ＧＣＴ　Ａ
   ＡＣＧ’ｌ’Ｔ　ＴＴＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡＰｒｏ　Ｓｅ
   ｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｒ
   ｂ　Ｇｌｙ　Ｇｌｖ。 ＧＣ１’　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴｉ’ルσＧＡＣＴＣＴ
   　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＣＣＡＡｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌ
   ｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒ
   。 ＡＡＡ Ｌｙｓ。 （１７）プロティンＡ様物質のカルボキシ末端領域のア
   ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および実質的
   に同じカルボキシ末端領域の生物活性を有する分子をコ
   ードする同等ヌクレオチド配列を営む組み変えプラスミ
   ドを有する微生物であって、前記ヌクレオチド配列か次
   式で表わされる微生物：ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣ７１７
   ｉＣＡ４ＣＡＡＧ　ＣＣ’ｌ’　ＧＧＴル１４　ＧＡＡ
   Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐ
   ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＧｌｎＧＡＣＧＧＣＡＡ（、ニ
   ル帆ＣＣＴ弱Ｔル１−４　ＧＡＡ　ＧＡＣＧＧＣＡｓｐ
   　Ｇｌｙ　ＡｓｎＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇ
   ｌｕ−ＡＳ７）ＧｌｙＡＡＣＡＡＡ’ＣＣＴ　ＧＧＴ　
   ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＣＡｓｎ　
   Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｖ、　Ａｓｐ　
   Ａｓｎ　Ｌｒｙｓ　ＡｓｎＣＴＴ　ＧＧＯＡＡＡ　’Ｇ
   ＡＡ　ＧＡＣＧＧＣ７１７１Ｃ７Ｌ４７１ＣＣ’ｌ’　
   ＧＧＴＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌ
   ｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＧｌｙルＩＡ　ＧＡ、４
   　ＧＡＣＭＣルＩＡ　ＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣＡＡＡ　
   ＧＡＡＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　’Ｌ
   ｙｓ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＬｙｓ　、Ｇｌｕの１７”　ＧＧ
   ＣＡＡＣＡＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＴルＶＧ屈ＧＡＣ圓ＣＡ
   ｓｐ　ＧＬｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙ
   ｓ　Ｇ１１ＬＡｓｐ、　Ｇ１１ｔＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＴ
   　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴＧＧＣＡＡＣルＭＡ
   ｓｎ、Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇ１１ＬＡｓ
   ｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＬｙｓＣＣＴ　ＧＧＴ　、４ＡＡ
   　ＧＡＡ　ＧＡｆ　ＧＧＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧ
   ＴＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　
   Ａ８ｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＧｌｙルＩＡ　ＧＡＡ　ＧＫ
   Ｔ　ＧＧＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　Ａ’ＬＡ　
   ＧＡＡＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙ
   ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＧｌｒｂＧＡＣＧＣ；Ｃ
   ＡＡＣＧＧＡ　ＧＴＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣＧＴＴ　ＡＡＡ
   　ＣＣＴＡｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　、
   ｌ１ｉｓ　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　Ｌｙｓ　Ｐｒ。 ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＡＡＴＧＡＣＡ１”
   Ｔ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡＧｌｙ　Ａｓｐ　Ｉ’ｈｒ
   　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ
   　ＡｌａＡＡＣＧＧＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣ
   ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＣＩ’　ＧＣＡＡｓｎ　Ｇｌｙ　ｉ
   ’ｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　
   Ａｌａ　ＡｌａＧＡＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴ
   　ＧＡＰ”　ＡＡＡＡＡＣＡＴＧ　ＡＴＣＡｓｐ　Ａｓ
   ｎＬｙｓ、Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　
   Ｍｅｔ　　ｌ１ｅＡ４Ａ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　Ｇ
   ＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＧＡ７’　ＡＡＧＬｙ
   ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｒｂ　Ｖａ
   ｌ　−Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＬｙｓＡＡＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ
   　ＧＣＡ　ＡＡＣＣＡＴＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡ
   ＣＬｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　
   Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ＡｓｎＡＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡ
   Ａ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ
   　ＧＡＡＬｙｓ　Ａｌａ　Ｇ１１ＬＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｐ
   ｒｏ　Ｇｌｕ　ｉ’ｈｒ　Ｇｌｙ　ＧＬｕＧＡＡ　ＡＸ
   ｒ　ＣＣＡ　ＴＴＣＡＴｃ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＡＣ１’
   　ＧＴＡ　Ｔ’ｌ’ＴＧｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
   　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ
   ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　Ｔ’ｌ’Ａ　ＧＣＧ
   　１’ＴＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＧＣＧＧｌｙ　Ｇｌｙ　
   ＬｅｌＬＳｅｒ　Ｌｅｒｂ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　
   Ａｌａ　Ａｌａ１’ＴＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　Ｃ
   ＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＣＧＡＡ　Ｃ１’Ａ　ＴＡＡＬｅｕ
   　ＬｅｌＬＡｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　
   Ｇｉｎ　Ｌｒｅｕ　５ｔｏｐｏ　　　−（］８）プロテ
   ィンＡ、［生物活性を有するアミノ酸配列をコードする
   領域Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣのヌクレオチド配列の混合
   物二しよび実質的に同じ生物活性をコードする同等ヌク
   レオチド配列を有する組み変えプラスミドを有する微生
   物。 （１９）プロティンＡ様物質のアミノ酸配列を特徴とす
   る特許請求の範囲第２項で規定したヌクレオチド配列で
   ある実質的に純粋なヌクレオチド配列。 （２ω領域Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢもしくはＣまたはそれらの混
   合物であるアミノ酸をコードする実質的に純粋なヌクレ
   オチド配列。 （２１）クローニングしたＤＮ’Ａの発現（ｅｘｐｒｅ
   ｓｓ−ｉｏｎ）、適当な微生物宿主中でのプロティンＡ
   様物質へのコーディングおよび該プロティンＡ庫物質の
   回収よりなる特許請求の範囲第２項で規定したプロティ
   ンＡ様物質の製造方法。 （２２）クロー二／グしだＤＮＡの発現、適当な微生物
   宿主中でのプロティンＡ様物質へのコーディングおよび
   該プロティンＡ様物質の回収よりなる特許請求の範囲第
   ３項で規定したプロティンＡ様物質の製造方法。 Ｃ２３）クローニング゛したＤＮＡの発現、適当な微生
   物宿主中でのプロティンＡ様物質へのコーディングおよ
   び該プロティンＡ様物質の回収よりなる特許請求の範囲
   第１２項で規定したプロティンＡ様物質の製造方法。 （２４）クローニングしたＤＮＡの発現、適当な微生物
   宿主中でのプロティンＡ様物質へのコーデイングおよび
   該プロティンＡ様物質の回収より１よる特許請求の範囲
   第１３項で規定したプロティンＡ様物質の、製造方法。 Ｃ２５）クローニングしたＤＮＡの発現、適当な微生物
   宿主中でのプロティンＡｍ物質へのコーティングおよび
   該プロティンＡ様物質の回収よりなる特許請求の範囲第
   １４項で規定したプロティンＡ様物質の製造方法。 （２６）クローニングしたＤＮＡの発現、適当な微生物
   宿主中でのプロティンＡｍ物質へのコーティングおよび
   該プロティンＡ様物質の回収よりなる！１ｑ許詞求の範
   囲第１５項で規定したプロティンＡｉ宋物實の製造方法
   。 （２７）クローニングしたＤＮＡの発現、適当な微生物
   宿主中でのプロティンＡ様物質へのコーティングおよび
   該プロティンＡ様物質の回収よりなる特許請求の範囲第
   １６項で規定したプロティンＡ様物質の製造方法。 （２８）クローニングしたＤＮＡの発現、適当な微生物
   宿主中でのプロティンＡ様物質へのコーティングおよび
   該プロティンＡ様物質の回収よりなる特許請求の範囲第
   １７項で規定したプロティンＡ　＋’策物質の製造方法
   。