SU1471949A3 - Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста - Google Patents
Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста Download PDFInfo
- Publication number
- SU1471949A3 SU1471949A3 SU813345603A SU3345603A SU1471949A3 SU 1471949 A3 SU1471949 A3 SU 1471949A3 SU 813345603 A SU813345603 A SU 813345603A SU 3345603 A SU3345603 A SU 3345603A SU 1471949 A3 SU1471949 A3 SU 1471949A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- growth hormone
- cdna
- dna
- pbr
- fragment
- Prior art date
Links
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title claims description 27
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 244000309464 bull Species 0.000 title claims description 13
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 claims description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims description 13
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 2
- 102100029812 Protein S100-A12 Human genes 0.000 claims 1
- 101710110949 Protein S100-A12 Proteins 0.000 claims 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims 1
- 108010049708 endonuclease S Proteins 0.000 claims 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 2
- 108010057578 pregrowth hormone Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 7
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102100034112 Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100490447 Homo sapiens AGPS gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101001075376 Bos taurus Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 101100278839 Drosophila melanogaster sw gene Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101000868138 Ovis aries Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к области генной инженерии и касаетс способа получени рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста. Рекомбинантна плазмидна ДНК, кодирующа гормон роста быка, получена путем выделени мРНК из гипофизарных желез быков с последующим получением кДНК и клонированием полученной кДНК в PBR 322. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.
Description
31
Полиаденилировэнную РНК траскри- бируют в одноцепочечную с ДНК с использованием обратной транскриптазы. РНК удал ют путем щелочного гидролиза . Одноцепочечную с ДНК экстрагируют фенолом, подвергают хроматографи- ческому разделению при пропускании над G-50 Sephadex и осаждают этанолом . Одноцепочечную ДНК используют как основу дл синтеза второй цепи кДНК с применением обратной транскриптазы . Одноцепочечную гепариновую петлю у З -концевой части первой молекул рной цепи кДНК удал ют путем обработки нуклеазой 5д. Двух- цепочечную с ДНК очищают экстракци- ей фенолом, подвергают хроматографи- ческому разделению при пропускании над G5.0 Sephadex и осаждают в этано- ле. Двухцепочечнук кДНК снабжают концевым звеном,dCMP с использованием dCTP и концевой трасферазы.
Плазмиду pBR 322 расщепл ют эндо- нуклеазой Pst I и снабжают концевым звеном dGMP с тем исключением, что вместо dCTP используют dGTP. 50 нг расщепленной Pst I плазмиды pBR.322 с dG-концевой частью и 20 нг двуцепо чечной кДНК с dG-концевой частью от- жигшот в 50 мкл реакционной смеси.
Трансформацию Е. coli X, 1776 плаз - мидой осуществл ют как описано ниже, Штамм Е. coli X 1776 становитс проницаемым дп ДНК.в результате вьздерж- ки в термостате в 75 мкМ СаС, 5 MKMMgCl, 10 мкМ Трис, рН 7,5 в течение 20 мин при 4 с, Плазмиду и бактерии выдерживают в течение 60 мин при и затем в течение 2 мин при . Преобразованные колонии отбирают по стойкости к тетрациклину. Присутствие размноженной ДНК определ ют путем гибридизации колоний кДНК зондом, меченным 32Р и кодируюпа1М гормон роста быков. Плазмиду ДНК выдел ют из отобранных колоний, расщепл ют Pst I, подвергают электрофорезу на 1%-ной агарозе, обрабатьгоают этидийбромидом, фотографируют и, наконец , перенос т на нитроцеллюлозные фильтры. Наличие последовательностей гормона роста определ ют путем гибридизации с полной цепью кДИК гормона крысы, меченной nick-трансл цией. Получакп один клон, которьш гибриди- зировалс с nick-транслированной DMA и обозначенной как рВР 348. Введенна
Q 5 0
5 о
5
0
5
0
5
последовательность включала 8831 пар оснований.
Пример 2. Плазмиду рВР 348 расщепл ют Pst 1, фосфат у 5 -концевых звеньев фрагментов ДНК удал ют путем обработки щелочной фосфатазой и замен ют меченным Р фосфатом с использованием полинуклеотидной киназы. Затем плазмиду рВР 348 расщепл ют Pst I, Pvu II или Sau ЗА, меченными , и полинуклеотидной киназой, а после этого расщепл ют другими ферментами с образованием фрагментов ДНК, меченых в одиночной концевой части. Эти фрагменты получают путем элюировани из поли- акриламидного гел и устанавливают последовательность.
Аминокислотные положени нумеруют, начина с аминокислоты с аминовым концом гормона роста быков в направлении к карбоксильному концу и в направлении к первому AU.G кодону, который , как предполагаетс , вл етс точкой начала трансл ции. Данна последовательность кодирует синтез . гормона роста, включающий поелетрансл ционную обработку. Трансл ци гормона роста mRNA приводит к предшественнику гормона роста, включающему сигнальный пептид.
Пример ,3. (А) Осуществл ют процедуру таким же образом, как описано в примере 1, использу плазмиду pBR 315 вместо плазмиды pBR 322.. Все услови , включа отбор рекомбинант- ных клонов, описаны ранее.
Введенную последовательность уда л ют и анализируют аналогично примеру 2, в результате чего получают ДНК, содержащую примерно 831.п.о.
(В) Осуществл ют процедуру таким же образом, как описано в примере 1, с использованием плазмиды pBR 316 вместо плазмиды pBR 322-. Все услови идентичны описанным в примере 1-.
Пример 4. В данном примере сДНА, кодирующую предЩественник гормона роста быков, получают по примеру 1 .
(А) Линкеры Hind III,,имеющие последовательность 5 -CCAAGCTTGG-3 , соедин ют с кДНК, полученной по примеру 1, за счет св зьшани обрезанных концов с использованием Т4 DNA лигазы. После св зьшани продукт об- рабатьшают посредством Hind III или Hsu I. Плазмиду pBR 322 расщепл ют
Hind III или Hsu I и подвергают обработке щелочной фосфатазой. После оса)ени из этанола обработанную фосфатазой расщепленную pBR 322 соедин ют с кДНК, содержащей линкер Hind III. Е. coli X 1776 трансформируют рекомбинантной плазмидой и отбирают по чувствительности к тетрациклину . Получают колонию, включающую введенную последовательность, котора гибридизируетс с nick-транслированной ДНК. Введенную последовательность удал ют путем расщеплени с Hind III или Hsu I и анализируют, как описано в примере 2. Введенна молекула содержала примерно 830 пар оснований , (в) Осуществл ют процедуру аналогично примеру 4, в котором использовалось несколько векторов вместо pBR 322, однако вместо плазмиды pBR 322 используют плазмиды pSC lOlj рМВ9, pBR 315 и pBR 316. Все услови , включа отбор рекомбинантных клонов, аналогичны описанным. Дл всех плазмид получают идентичные результаты, т.е. в каждом случае получают рекомбинан- тную плазмйду, содержащую кДНК, кодирующую гормон роста быка.
(С) Осуществл ют процедуру таким же образом, как описано в примере 4 (А), но используют несколько других сайтов рестрикции и эндонуклеаз рестрикции . В данном примере используют линкеры Sal I и Ват Н I вместо линкеров Hind III. Последовательности линкеров представл ют собой 5 -GGTCCACC-3 и З -CCGGATCCGG-з . При использовании линкеров Sal I кДНК и pBR 322 расщепл ют эндонукле- азой Sal I, а при использовании линкеров Ват Н I эндонуклеаза ограничени представл ет собой Ват HI. Все услови , включа отбор рекомбина- нтных клонов, описаны в примере 4 (А-).
(D)Осуществл ют процедуру аналогично примеру 4 (С), в котором вместо плазмиды pBR 322 используют плазмиды pSC 101, рМВ9, pBR 313, pBR 315 и pBR 316; Все услови такие же, как в примере 4 (С) и получают идентичные результаты.
(E)Осуществл ют процедуру аналогично примеру 4 (А) с использованием линкера Есо RI, имеющего последовательность 5 -CCGAATT6G-3 , вместо линкера -Hind III и с использованием эндонуклеа ы Есо RI вместо Hind III
(Hsu I). Транформирование колонии не отбирают по чувствительности к тетрациклину .
(F)Осуществл ют процедуру аналогично примеру 4 (Е), но с использованием плазмид pSC 101, рМВ 9, pBR 313 и pBR 315 вместо pBR 322. Используют те же услови , что описаны в
10 примере 4 (Е), и дл каждой плазмиды получают идентичные результаты.
(G)Осуществл ют процедуру аналогично примеру 4 (А) с использованием линкера Pst I, имеющего последова15 тельность 5 -GCTGCAGC-3 , и с использованием Pst I эндонуклеазы вместо сайта Hind III и вместо Hind III (Hsu I) соответственно. Используют идентичные услови с той разницей,
Q что отбор рекомбинантных клонов осуществл ют , как описано в примере 1 Получают рекомбинантньй клон.
(Н) Осуществл ют процедуру аналогично примеру 4 (G), но используют
5 плазмиды pBR 315 и вместо плазмцды pBR 322. Используют те же услови , что описаны в примере 4 (G), и получают идентичные результаты. Q) Осуществл ют процедуры таким
0 же образом, как описано в примерах 1 3 (А), 3 (В) и 4 (А) - (И), с использованием Е. coli RRJ или Е. coli НВ 101 вместо Е. cali X 1776. Все услови и результаты идентичны описанным.
j ПримерЗ. В данном примере получают cDNA, кодирующую i предщественник гормона роста быков , как описано в призере 1. Линкеры Есо RI соедин ют с кДНК и рас-
Q щепл ют посредством Есо RJ.
(А) В качестве вектора используют Charon 16А. Когезионно св ,занные концевые части обрабатьтают путем - жки в течение 60 мин при 42°С в 0,1 М
g Трис-НС1, рН 8,0 и 10 мМ MgCljj. Данньй вектор расщепл ют в сайте ;ЕСО RI эндонуклеазой Есо RJ и затем подвергают обработке щелочной фосфа- тазой. Шсле осаждени из этанола в обработанный фосфатазой вектор ЬЕсо RI сайт ввод т кДНК при мол рном соотношении 2 моль вектора на I моль.
0
+
Эту смесь сшивают лигазой фага Т Полученной смесью трансформируют суспензию клеток Е. coli X 1776, приготовленную дл преобразовани , как описано в примере 1. Рекомбинантные фаги извлекают и нанос т на .Lac бактерии в чашках, содержащих 5-хлор-4-бром-3-индолип- ()-В-глактозид (Х6) , дл продуцировани бесцветных негативных колоний отбирают рекомбинант- ные фаги (80 мкг/мл), содержащие
сДНК в Е. coRJ сайте вектора 16А. Отобранный рекомбинант изолирую и обрабатьшают избытком эндонуклеа- зы Есо RJ и продукт обработки анализируют , как описано в примере 2. Из- влекают ДНК с длинной цепью, включающей примерно 830 пар оснований. Полученные фаги упаковьшают in vitro.
(Б) ДНК фагов Charon ЗА или 4А используют в качестве векто-ра вместо ДНК Charon 16А. Все услови были идентичны тем, что описаны дл ДНК Charon 16А. Выбор рекомбинантных фагов осуществл ют путем нанесени фагов на Lac бактерии в чашках, со- держащих Хб, и изолировани бесцветных негативных колоний с последующими либо гибридизацией с соответствующей пробой, или обработкой эндо- нуклеазой. Эту введенную последова- тельность удал ют, как описано ранее в результате чего п олучают ДНК с длинной цепью примерно 830 пар осно- ваний.
(C)ДНК фaгa gt WE8 ЛВ используют в качестве вектора вместо Charon 16А Все услови идентичны описанным дл Charon 16А. Отбор рекомбинантных фагов осуществл ют по способу гибридизации .
Введенный фрагмент удал ют, как описано ранее, в результате чего получалась ДНК, включающа примерно 830 пар оснований (длина цепи).
(D)Осуществл ют процедуру таким же образом, как описано в примерах
5(А) - (С), в которых использовались Е. coli RPJ, Е. coli ИВ 101, Е. coli DP 50 или Е. coli DPS иф F, вместо Е. coli, X 1776, Все услови тедентич- ны и получают идентичные результаты.
Пример 6. Дл осуществлени данного примера получают сДНК, кодирующую предшественник гармона роста, как описано в примере 1 . Вво- д т линкеры Hind III и кДНК обраба- тьшают посредством Hind III или Hsu I, как описано в примере 4(А).
Ппазмиду рС 194, изолированную из S. aureus, используют в качестве вектора, рС 194 расщепл ют в зоне Hind Hi посредством Hind III или Hsu I и затем подвергают обработке щелочной фосфатазой.
Полученную кДНК соедин ют с расщепленной рС-194, Осуществл ют трансформацию В, subtil is RuB, Клеточную суспензию нанос т непосредственно на L чашки, содержащие 3 мкг хлор- амфеникола. Отобранньй рекомбинант изолируют и обрабатывают посредством Hind III и продукт расщеплени анализируют, как описано в примере 2 Извлекают ДНК длиной цепи примерно 830 пар оснований.
Пример 7, (А) Плазмиду pBR 348 обрабатывают эндонуклеазой Нае II с образованием фрагмента, включающего 1600 п.о. Однако зона Нае II находитс в пределах введенной кДНК, кодирукнцей предшественник гормона роста, а втора зона - в пределах фрагмента плазмиды pBR322. В результате расщеплени получают
,...3 - З -GCGGAA5
Бычий GH (гормон роста) начинаетс либо с 4-1 ala, либо с -+2 phe остататочного звена в концевом по-: ложении NHj,. Удаление ко дона ala . осуществл ют путем вьщержки в термостате ДНК вместе с dATP и фрагментом Кленова DNA полимеразы I. В результате этой реакции получают.
5 ТТС .,.,3
З - AAG5 .
ДНК экстрагируют фенолом и осаждают . Избыток dATP и .дигерированные основани удал ют путем хроматографии на G50 Sephadex. Оставшеес 5 звено удал ют нуклеазой S.. В результате такого расщеплени получают
5- ТТС ,.,,3
з - AAG- ....5
(В) Осуществл ют процедуру таким же образом, как описано в примере 7(А), в котором дезоксинуклеотидную последовательность, кодирующую предшественника гормона роста быка, удал ют путем обработки рекомбинантных ДНК, полученньис в примерах 3, 4, 5 И 6 эндонуклеазой Нае II.
Используемые векторы и эндонуклеа зы показаны в таблице.
После обработки ферментом рестрикции изолируют последовательность предшественника гормона роста быка посредством гельэлектрофореза и за914
тем ее подвергают обработке, как описано в Примере 7(А), при этом получают идентичные результаты.
(С) Осуществл ют процедуры таким же образом как описано в примерах 7(А) и 7(В), с использованием полимеразы или З - 5 экзонуклеазы вместо фрагмента Кпенова ДНК полимеразы I.
Все другие услови идентичны и в каждом случае получают идентичные последовательности фрагмента гормона роста быков.
П р и м е р 8. {А) фрагмент гормона роста быков ,
5 - С ТТС....3
з - GCCGAAG з
получают путем обработки Нае II,- как описано в примере 7(А) или 7(В). Затупление осуществл ют следующим об- . ДНК, вьщерживают в термостате- с dATP, dCTP, dCTP, dTTP и фрагменто Кпенова ДНК полимеразы I. В результате этой реакции получают 5 - GG
З - GCGGAAG ...,
ДНК экстрагируют фенолом и осаждают. Данную последовательность затем выдерживают в термостате с фрагментом Кленова ДНК полимеразы I в присутствии dCTP. Эту последовательность за тем обрабатьюают S| нуклеазой, в результате чего получают последовательность
5 - GCC ТТСз
3 - CGG AAG5
(в) Осуществл ют процедуру таким же образом, как описано в примере 8(А), с использованием Т4 ДНК полимеразы или 3 - 5, т.е. в присутствии dCTP.
Пример 9. Дезоксинуклеотид- ную последовательность, кодирующую гормон роста быков, ввод т в векторы переноса, как описано дл предшественника гормона роста быков.
(А) Осуществл ют процедуры таким же образом, как описано в примерах , 3(А), 3(В), 4(А) - (J), 5(А) - ,() и 6, о использованием ДНК, приготовленной аналогично примерам 7(А), 7(В) или 7(С). Все другие услови идентичны. ДНК расщепл ют соответствующими эндонуклеазами, как показано в таблице, и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае по9 О
лучают ДНК с последовательностью, начинающуюс с Phe в положении 2.
(В) Осуществл ют процедуры таким же образом, как описано в примерах I, 3(А), 3(В), 4 (А) - (СГ), 5СА) - (D) и 6, с использованием ДНК, приготовленной согласно примеру 8(А) или 8(В). Все другие услови идентичны.
ДНК расщепл ют соответствующей эндо-. нуклеазой (как показано в таблице) и анализируют, как описано в примере 2. В каждом случае получают ДНК., имеющую последовательность, начинающуюс с Ala кодона.
Пример 10. (А) Экспрессию предшественника гормона роста быка как белка сли ни демонстрируют с помощью радиоиммунного анализа и
миникпеточного эксперимента. В эксперименте с радиоиммунным анализом Е. coli X 1776, содержащие pBR 348, или Е. coli, содержащие pBR 322, как контроль, выращивают в питательном
бульоне и извлекают посредством центрифугировани . Клетки повторно суспендируют и лизирутот, и в гормон роста ввод т радиомеченый гормон роста овец и антитело овец (или быков).
Иммунный комплекс осаждают и измер ют радиоактивность. Эксперимент показал , что белок сли ни сохран ет некоторую 1муноактивность гормона роста быков. Дп более подробной иллюстрации продуцировани белка сли ни осуществл ют мкниклеточньй эксперимент . Данньй эксперимент показывает , что pBR 348 образует белок сли ни , состо щий из 183 аминокислот
| Лактамазы, 217 аминокислот предгор- мона роста быка и несколько св зывающих аминокислот, кодированных обычно, нетранслированной 5 зоной. Общий молекул рный вес, составл ющий примерно 45000, соответствует предсказанному молекул рному весу гибридного белка.
(В) Дп пр мой экспрессии предшественника гормона роста быка введен ™ сначала отдел ют от pBR 348 путем частичного расщеплени эндону- клеазной Pst I и очищают посредством препаративного гель-электрофореза. 15 мкг образца очищенной введенной
Н затем модиАицируют путем суспен- зировани ДНК в воде, в которую вво т раствор солей так, чтобы конеча композици содержала: 70 мМ Трис, Н 8,8; 70 мМ MgCl2 ; Ю Ь дитио1
треитола и 13,75 молекул рных звеньев полимеразы ДНК в общем объеме 250 мкл Реакционную смесь вьщерживают в термостате при 37 С в течение нескольких минут, затем ввод т dATP до концентрации 50 M}J. После, дополнительной выдержки в термостате в течение 30 мин фермент инактивируют путем термообра ботки при 65°С в течение 5 мин. Этот процесс повтор ют еще два раза, один раз с использованием dCTP и dATP, а затем снова с использованием dTTP. Обработанную DNA извлека1от путем осаждени этанолом. Обрабатывают S, нук- леазой. Данный процесс обеспечивает получение молекулы ДНК, заканчивающейс в начальном кодоне в положении за номером 26. Такие молекулы транс- лирзгютс при вводе в вектор экспрессии , имеющий зону ввода, соответствующую примерно 3-11 нуклеотидам от последовательности рибрсомного св зы- ,вани .
Вектор пр мой экспрессии конструируют путем модификации плазмиды ptrp ЕЗО, путем удалени 23-29 нуклеоти- дов с использованием полимерат зы и S нуклеазы, как описано ранее.
Модифицированную кДНК и модифицированный вектор экспрессии снабжают линкером, имеющим последовательнйсть 5 -CCGGATCCGG-3 у одной цепи, и гомологичную ей, последовательность у другой цепи посредством св зьюани с использованием лигазы. Эти линкеры обеспечивают наличие Ват Е+ сайтов. Бактерии-хоз ева Е. coli НВ 101, RR5 или X 1776 трансформируют посредством рекомбинантных ДНК, несущих фрагмент , кодирующий предшественник гормона роста, и трансформаты отбирают по стойкости к ампициллину. Единственный трансформант, обозначенный как ptr рЕЗО/bGH отбирают дл дополнительного анализа.
Бактериальные клетки, трансформированные плазмщ ой ptr рЕЗО/bGH, выращивают в стандартной.минимальной среде (М9), содержащей LeU PrO, витамин В1 и ампициллин, при 37°С. На ранней логарифмической фазе trp опе- рон индуцируют путем ввода й-индолил- акриловой кислоты (30 мкг/мл среды). Контрольные культуры оставались не- индуцированньми. По прошествии 3 ч роста 1,5 мл клеток .подвергают радиоактивному мечению путем ввода 20 1К S-L-Met и выдерживают в тер моста47
ев л. ой ин а т н . а- и - ы-
rp т ,i .
ь ы 5 г а - л- . ота1949J2
те в течение 10 мин. Клетки извлекают путем центрифугировани , промывают и снова суспенди руют в 250 мкл буферного раствора, содержащего 10% гликол , 5% р -меркаптоэтанола и 2,3% SDS в 0,0525 М Трис, рН 6,8. Суспензию кип т т в течение 5 мин, затем ввод т в 10%-ный гель SDS полиакрилами10 да и фракционируют посредством электрофореза . Полосы, соответствующие белковым зонам, визуально наблюдают посредством ауторадиографии. Результаты показали наличие новой белковой
15 полосы, составл ющей примерно 2АООО дальтон, котора отсутствует в неиндуцированных или непреобразованных культурах.
Предшественник гормона роста бы20 ков очищают обычными способами,
включающими, например, гель-фильтрацию , ионообменную хроматографию, адсорбционную хроматографию и методы, основанные на различии растворимос25 тей. Предшественник гормона роста Превращают в гормон роста.
(С) Линкеры с последовательностью S -CCGGATCCGGATG-3 у одной цепи и гомологичной ей последовательностью
30 У другой.цепи соедин ют фрагментом ДНК, кодирующим гормон роста.быка, полученным аналогично примерам 7(А) - (С) и 8(А) - (В). Эту модифицированную DNA затем ввод т в вектор ptr
-g рЕ 30, как описано в примере 10(В). Бактерию-хоз ина трансформируют и культивируют, и получаемый в результате гормон роста быков очищают, как описано в примере 10(В).
Claims (2)
1. Способ конструировани реком- бинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, заключающийс в
45 том, что вьщел ют полиаденилирован- ную мРНК из гипофиза быка, очищают поли А мРНК адсорбционной хроматографией с применением олиго-ё-ц еллюло- зы, обрабатывают обратной транскрипgQ тазой и получают однкДНК, удваивают полученную однкДНК .с помощью обратной транскриптазы, полученную двунитевую кДНК последовательно обрабатьюают эн- донуклазой Нае II, фрагментом Кленоgg ва, ДНК полимеразой, а затем нуклеа- зой S( и получают кДНК, кодирукнцую бычий гормон роста с 26 по 191 аминокислоту со следующей нуклеотидной последовательностью;
S-ATGATGCCTCCAGGCCCCCGGACCTCCCTGCTCCT GCTTTCGCCCTGCTCTGCCTGCCGTGGAGTCAGGTG GTGGGCGCGTTCCC AGGCATGTGGTTGTCCGGGGTG TTTGCGAACGCTGTGCTCCGGGGTCAGCACCTGCAC
CAGCTGGGTGCTGAGACCTTGAAAGAGTTTGAG CGTAGCTACATCGGGGAGGGAGAGAGATACTGC ;ATCCAGAACACCGAGGTTGCCTTCTGCTTCT€C IGAAACCATGCCGGCGGCCACGGGCAAGAATGAG
GGCCAGCAGAAATGAGACTTGGAGCTGCTTCGC
ATCTCACTGCTCCTGATCCAGTCGTGGCTTGGG
GCCCTGCAGTTTCTCAGGAGAGTCTTCACC
AACAGCTTGGTGTTTGGGAGGTCGGAGCGТ
GTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAA
GGCATGTTGGCCGTGATGGGGGAGCTGGAA
GATGG CAGC GGGCGGGG TGGG CAGATGCTC
AAGCAGACCTATGAGAAATTTGACACAAAC
ATGCGCAGTGACGAGGCGGTGCTCAAG
AACTACGGTqTGGTGTGGTGCTTCCGG
AAGGACCTGGATAAGACGGAGACGTAC
CTGAGGGTGATGAAGTGGCGCGGGTTC
GGGGAGGGCAGGTGTGGCTTGTAG-З ,
5
°
5
0
следующей обработкой эндонуклеазой S, и получением кДНК, кодирук дей гормон роста быка со следующей нуклео- тидной последовательностью
5 -GGGTTGGGAGCGATGTGGTTGTGCGGCCTGTTT GGGAAGGGTGTGCTGGGGGCTCAGCACCTGCAG GAGGTGGGTGCTGACAGGTTGAAAGAGTTl GAG CGTACGTAGATGCCGGAGGGACAGAGATAGTCC ATGGAGAAGAGCCAGGTTGCCTTGTGCTTGTGC.. GAAAGCATCCCGGCCGCCACGGGCAAGAATGAG GCCCAGGAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTGGG ATGTCACTGCTGCTGATCGAGTCGTGGCTTGGGCCCGTG CAGTTTCTCAGCAGAGTCTTGACCAACAGGTTG GTGTT GGAGCTGGGACCGTGTCTATGAGAAG ,GTGAAGGACCTGGAGGAAGGGATCTTGGCCCTG ATGCGGGAGGTGGAAGATGGGACCCCCCGCGTC GGGGAGATCGTCAAGCAGACGTATGAGAAATTT GAGACAAACATGCGCAGTGACGAGGGCGTG CTCAAGAACTACGGTCTGCTGTCCTGGTTCCGGAAG GAGGTGGATAAGAGGGAGACGTAGGTGAGGGTGATG AAGTGGGGGCGGTTGGGGGAGGGGAGGTGTGGCTTGTAG
и клонируют ее в PS t I или EcoRI сайт вектора pBR 322.
2. Gnoco6 no п. 1, отличающийс тем, что двунитевую кДНК расщепл ют Нае II эндонуклеазой полученные фрагменты инкубируют в присутствии с1АТФ, dГTФ, бЦТФ и dTTФ последовательно обрабатывают фрагментом Кленова, ДНК-полимеразой фага Т.
I1-Т
или 3 -5 в присутствии ёТТФ -с по
Фермент ограничени
Вектор переноса (Пример)
0
Pst I Hind III Sal I Bam HI ECO RI
ЗА,ЗБ, 4G, 4H
4A,4B, 6
4G,4D
4G,4D
4E,4F 5A, 5B, 5G
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18134880A | 1980-08-26 | 1980-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1471949A3 true SU1471949A3 (ru) | 1989-04-07 |
Family
ID=22663908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU813345603A SU1471949A3 (ru) | 1980-08-26 | 1981-10-23 | Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0047600B1 (ru) |
| JP (2) | JP2534221B2 (ru) |
| KR (1) | KR830007822A (ru) |
| AT (1) | ATE72833T1 (ru) |
| AU (1) | AU544453B2 (ru) |
| CA (1) | CA1225948A (ru) |
| CZ (1) | CZ280596B6 (ru) |
| DD (4) | DD212403A5 (ru) |
| DE (1) | DE3177273D1 (ru) |
| DK (1) | DK372881A (ru) |
| ES (2) | ES504968A0 (ru) |
| FI (1) | FI812614L (ru) |
| GR (1) | GR74350B (ru) |
| HU (1) | HU195535B (ru) |
| IE (1) | IE52755B1 (ru) |
| IL (1) | IL63628A (ru) |
| NZ (1) | NZ198050A (ru) |
| PH (2) | PH21216A (ru) |
| PL (1) | PL232797A1 (ru) |
| PT (1) | PT73569B (ru) |
| RO (1) | RO105533B1 (ru) |
| SU (1) | SU1471949A3 (ru) |
| YU (1) | YU44962B (ru) |
| ZA (1) | ZA815696B (ru) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| JPS58996A (ja) * | 1981-06-01 | 1983-01-06 | ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− | 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 |
| US5254463A (en) * | 1981-09-18 | 1993-10-19 | Genentech, Inc. | Method for expression of bovine growth hormone |
| EP0278121B1 (en) * | 1981-09-18 | 1995-09-06 | Genentech, Inc. | Microbially produced bovine growth hormone (BGH) and its use |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| GB2121054B (en) * | 1982-05-25 | 1986-02-26 | Lilly Co Eli | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| CA1224432A (en) * | 1982-08-17 | 1987-07-21 | Gary N. Buell | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| WO1984001150A1 (en) * | 1982-09-16 | 1984-03-29 | Amgen | Avian growth hormones |
| CA1341012C (en) | 1982-09-27 | 2000-06-06 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides |
| AU2092983A (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-17 | Genentech Inc. | Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology |
| ZA837173B (en) * | 1982-11-08 | 1984-05-30 | Univ Case Western Reserve | Genomic bovine growth hormone |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| DE3247922A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten |
| AU2704084A (en) * | 1983-04-19 | 1984-10-25 | Genex Corp. | Cloned ovine growth hormone genes |
| US4859600A (en) * | 1983-04-25 | 1989-08-22 | Genentech, Inc. | Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US5198361A (en) * | 1983-07-15 | 1993-03-30 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for production of met-asp-gln bovine growth hormone, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods |
| US4521409A (en) * | 1983-10-03 | 1985-06-04 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of growth hormone to enhance ruminant mammary development |
| US4935370A (en) * | 1983-12-23 | 1990-06-19 | Pfizer Inc. | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria |
| DE3484926D1 (de) * | 1983-12-23 | 1991-09-19 | Pfizer | Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien. |
| US5489529A (en) * | 1984-07-19 | 1996-02-06 | De Boer; Herman A. | DNA for expression of bovine growth hormone |
| US4861868A (en) | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| US5037806A (en) * | 1985-02-22 | 1991-08-06 | Monsanto Company | Biologically active method using somatotropins |
| EP0229110B1 (en) | 1985-06-26 | 1992-05-20 | The Upjohn Company | Solubilization and oxidation of somatotropin from transformed microorganisms |
| US4786501A (en) * | 1985-07-15 | 1988-11-22 | International Minerals & Chemical Corp. | Cylindrical implants for the controlled release of growth hormones |
| US5631227A (en) * | 1985-09-18 | 1997-05-20 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
| WO1987001708A2 (en) * | 1985-09-18 | 1987-03-26 | The Upjohn Company | Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation |
| EP0263206B1 (en) * | 1986-10-08 | 1990-12-12 | The Upjohn Company | Enhanced bioactivity of mammalian somatotropin through selective deamidation |
| US5215896A (en) * | 1987-03-20 | 1993-06-01 | Creative Biomolecules, Inc. | Leader sequences for the production of recombinant proteins |
| US5013653A (en) | 1987-03-20 | 1991-05-07 | Creative Biomolecules, Inc. | Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage |
| US5268284A (en) * | 1988-03-11 | 1993-12-07 | The Upjohn Company | Ribosome binding site |
| JP2787729B2 (ja) * | 1990-08-02 | 1998-08-20 | 株式会社ニッポンジーン | 組換え型ミンク成長ホルモン遺伝子、組換え型ミンクプレ成長ホルモン遺伝子、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換プラスミド、及び、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換大腸菌 |
| WO2002051238A2 (en) | 2000-12-26 | 2002-07-04 | Monsanto Technology Llc | Recombinant dna vectors for expression of somatotropins |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| YU257278A (en) * | 1977-11-08 | 1984-02-29 | Genentech Inc | Process for obtaining a recombinat clone carrier |
| FI792481A (fi) * | 1978-08-11 | 1980-02-12 | Univ California | Syntes av enkaroytiskt protein genom anvaendning av mikro-organismer |
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
-
1981
- 1981-08-10 IE IE1822/81A patent/IE52755B1/en unknown
- 1981-08-12 CA CA000383687A patent/CA1225948A/en not_active Expired
- 1981-08-14 GR GR65802A patent/GR74350B/el unknown
- 1981-08-14 NZ NZ198050A patent/NZ198050A/en unknown
- 1981-08-18 ZA ZA815696A patent/ZA815696B/xx unknown
- 1981-08-20 IL IL63628A patent/IL63628A/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-08-21 DE DE8181303824T patent/DE3177273D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1981-08-21 AT AT81303824T patent/ATE72833T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-08-21 EP EP81303824A patent/EP0047600B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-08-24 DK DK372881A patent/DK372881A/da unknown
- 1981-08-24 PH PH26092A patent/PH21216A/en unknown
- 1981-08-25 FI FI812614A patent/FI812614L/fi not_active Application Discontinuation
- 1981-08-25 JP JP56133231A patent/JP2534221B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1981-08-25 HU HU812462A patent/HU195535B/hu not_active IP Right Cessation
- 1981-08-25 RO RO105165A patent/RO105533B1/ro unknown
- 1981-08-25 PL PL23279781A patent/PL232797A1/xx unknown
- 1981-08-25 ES ES504968A patent/ES504968A0/es active Granted
- 1981-08-25 YU YU2062/81A patent/YU44962B/xx unknown
- 1981-08-25 AU AU74496/81A patent/AU544453B2/en not_active Expired
- 1981-08-25 PT PT73569A patent/PT73569B/pt not_active IP Right Cessation
- 1981-08-26 KR KR1019810003125A patent/KR830007822A/ko unknown
- 1981-08-26 DD DD81252964A patent/DD212403A5/de unknown
- 1981-08-26 DD DD81252962A patent/DD211581A5/de unknown
- 1981-08-26 DD DD81232811A patent/DD204711A5/de unknown
- 1981-08-26 DD DD81252965A patent/DD212267A5/de unknown
- 1981-08-26 CZ CS816360A patent/CZ280596B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1981-10-23 SU SU813345603A patent/SU1471949A3/ru active
-
1982
- 1982-07-29 ES ES514526A patent/ES8305828A1/es not_active Expired
-
1984
- 1984-03-15 PH PH30403A patent/PH22847A/en unknown
-
1996
- 1996-02-29 JP JP8043645A patent/JP2763024B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Мероу Дж.,Уозит Дк.,Эфетратиадис А. Исследование фибриона шелка.- В кн.: Рекомбинантные молекулы, значение дл науки и практики. Перченод с; ,англ. - M.tj Наука, 1977, К 7, с. 476- 484.. 1 Изобретение относитс к г,еннай инженерии и касаетс способа получени рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста. Рекомбинантна плазмидна ДНК, кодирующа гормон роста быка, получена Путем вьщелеии мРНК , из гипофиз арнык желез быков с последуюпцвч получением кДНК и клонированием полученной кДНК в pBR 3212 Пример 1 Гипофизарии коров извлекают вскоре после умерщвлени коров и сразу же замораживают в жидком азоте. Рибонуклеиновую кислоту (РНК) приготавливают путем гомогенизировани гипофизарйев в растворе тиоцианата гуанидина. Затем РНК экстрагируют фенолом и осаждают в этаноле. Полиаденилированную РНК очищают, использу метод адсорбционной * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1471949A3 (ru) | Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста | |
| CA1340522C (en) | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification | |
| Bedouelle et al. | Mutations which alter the function of the signal sequence of the maltose binding protein of Escherichia coli | |
| FORTKAMP et al. | Cloning and expression in Escherichia coli of a synthetic DNA for hirudin, the blood coagulation inhibitor in the leech | |
| SU1764515A3 (ru) | Способ получени лейкоцитарного интерферона | |
| Franklin et al. | The N protein of bacteriophage lambda, defined by its DNA sequence, is highly basic | |
| Filutowicz et al. | Autorepressor properties of the π-initiation protein encoded by plasmid R6K | |
| EP0316018A2 (en) | Modification of DNA sequences | |
| JPH0432838B2 (ru) | ||
| JPH0648987B2 (ja) | 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法 | |
| IE54267B1 (en) | Stabilization and selction of host cells containing recombinant dna which express a functional polypeptide | |
| Baty et al. | Extracellular release of colicin A is non‐specific. | |
| JP2000060577A (ja) | 成熟ヒトインタ―ロイキン１タンパク質 | |
| US5087564A (en) | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase | |
| AU595805B2 (en) | Releasing desired peptides from fusion polypeptides using endopeptidases | |
| WO1989003886A1 (en) | Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells | |
| Zhang et al. | Escherichia coli RNase D: sequencing of the rnd structural gene and purification of the overexpressed protein | |
| US4675297A (en) | Genes encoding bovine prolactin | |
| EP0046669B1 (en) | Somatostatin or somatostatin precursors | |
| IE53607B1 (en) | Expression vectors | |
| US6194200B1 (en) | Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells | |
| US6692941B1 (en) | Bovine growth hormone | |
| EP0163603B1 (en) | A human t-cell growth factor | |
| EP0113372A1 (en) | Vector | |
| EP0314184B1 (en) | Expression plasmids |