RO105533B1

RO105533B1 - Procedeu de obtinere a unui vector de transfer de dna continand o secventa de codificare a hormonului de precrestere sau crestere bovin

Info

Publication number: RO105533B1
Application number: RO105165A
Authority: RO
Inventors: Walter L Miller; Joseph A Martial; John D Baxter
Original assignee: Univ California
Priority date: 1980-08-26
Filing date: 1981-08-25
Publication date: 1995-10-01
Also published as: FI812614L; ES8305828A1; ES504968A0; PL232797A1; IE811822L; IL63628A; CA1225948A; DD212403A5; EP0047600B1; EP0047600A3; JPH09135691A; JP2763024B2; DD212267A5; PT73569A; GR74350B; AU544453B2; CZ280596B6; DK372881A; DE3177273D1; FI812614A7

Description

Invenția se referă la un procedeu de obținere a unui vector de transfer DNA, conținând o secvență de codificare a hormonului de precreștere sau creștere bovin, utilizabil pentru accelerarea 5 ritmului de creștere a tineretului taurin.

Se cunoaște că hormonul de creștere este un hormon de tip polipeptidă, sintetizat în și secretat dc adenohipofiză (lobul anterior al glandei pituitare). Hor- 10 monul este sintetizat ca o proteină precursoare (hormon de precreștere), conținând o peptidă semnal N-terminală și secvența hormonului de creștere. Secvența de aminoacizi a hormonului de 15 creștere bovin a fost determinară [Dayhoff, M.D. și colab Atlas of Protein Secvence arul Structure, vol.5, Supp., 3, pag.245-352, Național Biomedical Researeh Foundation, Washington, D.C. 20 (1978)].

Hormonul de creștere este produs în mod normal în tot timpul vieții, dar în cantitățile cele mai mari în timpul perioadei preadulte. Hormonul este ne- 25 cesar pentru creșterea preadulților. Cu toate că mecanismul sau de acțiune nu este cunoscut în detaliu, hormonul de creștere favorizează creșterea scheletului, retenția azotului, sinteza proteică 30 și efectuează metabolismul glucozei și lipidelor. Hormonul de creștere este un agent general anabolic.

Folosirea hormonului de creștere se bazează pe activitatea sa biologică. 35 Acest hormon se poate administra la tineretul taurin pentru accelerarea ritmului de creștere și sporirea în greutate, prin aceasta reducându-se timpul necesar de la naștere până la corner- 40 cializarea vitelor. Creșterea producției de carne în acest fel este importantă.

Hormonul de creștere bovin se deosebește de hormonul de creștere ovin numai prin câțiva aminoacizi. Astfel, 45 hormonul de creștere bovin se poate administra la oi în același scop ca și la taurine, adică pentru accelerarea ritmului de creștere și sporirea în greutate, obținându-se în acest fel mărirea 50

Se cunosc, de asemenea, metodele de bază pentru donarea secvențelor DNA De exemplu, Seaburg, P.H. și colatx, Nature, ΉΟ, 486 (1977) descrie donarea genei de hormon de creștere la șobolan; Shine, J. și colab., Nature 270, 494 (1977) descrie donarea genei somatomammotropinei clorionice umane; Deiynck R. și colab., Nature 285, 542 (1980) descrie donarea genei interferonului de fibroplast uman.

Se mai cunosc, de asemenea, metode pentru expresia DNA heterolog într-un microorganism. în general, secvența de codificare a DNA heterolog este inserată într-un vector de transfer DNA, într-un punct situat într-un operon de expresie. Pentru producerea unei proteine hibride, secvența inserată trebuie să fie în fază de citire cu secvența de codificare a operonului și orientată în aceeași direcție de translație. în condiții adecvate, translația operonului se realizează prin decodificarea acestuia fața de secvența de codificare inserată, astfel că proteina produsa este o proteină de fuziune cuprinzând o secvență de aminoacizi Nterminală codificată de operonul de expresie, urmată de o secvența de aminoacizi codificată de insert [Polisky B. și colab., Ptoc. Nat Acad. Sci USA73,3900 (1976); Itakura K, Sdence, 198, 1056 (1979)]. S-au folosit câțiva operoni expresibili cuprinzând: beta-galactosidaza, beta- lactamaza și triptofanul.

Prescurtările folosite în această descriere sunt cele acceptate și folosite în mod curent în lucrările de specialitate (de exemplu: Z Biol. Chem).

Scopul prezentei invenții este obținerea unui vector de transfer DNA, conținând o secvență de codificare a hormonului de precreștere sau creștere bovin, utilizabil pentru obținerea unfei cantități mai mari a unui astfel de hormon.

Problema pe care o rezolvă invenția este stabilirea etapelor de procedeu, a succesiunii acestora și a condițiilor de lucru pentru realizarea scopului propus.

Procedeul conform invenției înlătură dezavantajele menționate mai sus, prin aceea că se construiește un vector de transfer conținând o secvență dc deoxinudeotide, care codifică hormonul de precreștere sau creștere bovin în capătul său C-terminal și o porțiune dintr-o proteină procariotă în capătul său N-terminal, prin reacția unei secvențe de deorinudeotide care codifică aminoacizii

1...191 ai hormonului de precreștere sau creștere bovin, preparată prin scindarea CDN A, care codifică acest hormon cu enzime de restricție Hae II. incubarea produsului scindat cu o enzimă, aleasă dintre fragmentul Klenow al DNA polimerazei I, DNA polimerază T4 și 3’...5* cxonuclcază în prezență de dATP, dGTP, dCTP sau dTTP și digerarea produsului incubat. cu Si nucleară, cu o moleculă de DNA, preparată prin scindarea plasmidci pBR 322 în regiunea de control, exprimabilă cu enzima de restricție PsT I, se transformă un microorganism cu ajutorul vectorului obținut, se cultivă microorganismul transformat în condiții adecvate pentru exprimarea secvenței care codifică hormonul de precreștere sau creștere bovin și se purifică produsul obținut prin metode în sine cunoscute.

într-o primă variantă a procedeului, secvența dc deoxinucleotide care codifică hormonul de creștere bovin este:

5’ - ATC ATC GCT CtCA GGC CCC CGG ACC TCC CTC CTC CTG GCT TTC

GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TIC CCA GCC ATG TCC TTC TCC GGC CTG ΊΤΓ GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTC GCT GCT GAC ACC TIC AAA CAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT

GCC ITC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CIT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTC GTC TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATC AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TCT GCC TTC TAG 3’ într-o a doua varianta a procedeului, secvența de deoxinucleotide care codifică hormonul de creștere bovin este:

5’ - TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTC

CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCC GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AATGAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTC TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTC GCC CTC ATC CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCC CTC CTC AAG AAC TAC GCT CTC CTG TCC TCC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC

CTG AGC GTC ATG AAG IGC CGC CGC TIC GGG GAC GCC AGC TOT GCC TTC TAG - 3’ într-o a treia varianta a procedeului, secvența de deoxinucleotide care codifică hormonul de creștere bovin este:

- GCC TTC CCA GCC ATG TCG TTG TOC GGC CTG TTT GCC AAC GCT

GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TOC TTC TCC G AA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCAGAC TTG GAG CTG CTT CGC A'IC TCA C1U CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TOC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TOT GCC TTC AAG-3’

Se dau în continuare exemple de realizare a procedeului conform invenției, cu referire la fig. 1 și 2, care reprezintă*.

- fig.1, secvențe CDNA și secvența corespunzătoare dc aminoacizi, codificată;

- fig.2, benzile de electroforeză pe gel, rezultate din experiența cu Escherichia coti x 1776.

Exemplul 1. Sinteză deprehormon de bovină de creștere DNA

Se colectează glanda pituitară de la bovine femele, la scurt timp după sacriGcaiea acestora, și se congelează imediat în azot lichid. RNA total se prepară prin omogenizarea glandelor pituitare în soluție de tiodanat de guanidină [Chirginwin J.M., și colab., Biochem. 18, 5294 (1979)]. RNA se centrifughează cu 5,7 M CaCl, așa cum este descris de către Ullrich Â., și colab., Sâence, 196, 1313 (1977). Apoi, RNA se extrage cu fenol și se precipită cu etanol. RNA poliadenilat se purifică folosind cromatografia de afinitate pe oligo-dT-celuloză, așa cum este descris de Miller, W.L și McCarthy [BJ., LBioL Chem., 254, 742 (1979)] și Aviv H.; Leder T [ProcNat. Acad-ScLUSA, 69,1408 (1972)].

RNA poliadenilat se supune translației într-un sistem liber de celule, folosind reticulocite de iepure, așa cum este descris de către Miller și McCarthy (citați anterior) și Marțial J.A și colab. \Proc.NaLAcad.Sd USA, 74, 1816 (1977)]. Prehormonul de creștere bovin sintetizat în acest sistem se precipita folosind un antiser heterolog de hormon de creștere de antiovină și se prepară prin adsorbție pe o tulpină I Staphylococcus aureus Cowan, fixată în formalină, așa cum este descris de către Marțial

J.A și colab. (citat anterior). Proteinele 35s se supun electroforezei pe geluri de poliacrilamidă 12,5% SDS, așa cum este descris de către Laemmli U.K. (Naiure, 221, 680 (1970)]. Această analiză arată că RNA poliadenilat care codifică prehormonul de creștere bovin reprezintă circa 12,6% din total RNA poliadenilat din glandă pituitară.

RNA poliadenilat se supune transcripției inverse în cDNA monocatenar, folosind transcriptaza prin metoda descrisă dc Miller și McCarthy (citați anterior) și Monahan JJ. și colab. (Biochem., 15, 223 (1976)].

RNA se îndepărtează prin hidroliza alcalină. cDNA monocatenar se extrage cu fenol, se cupune cromatografiei pe G-50 Sephdex (marca comercială Pharmacia, Inc., Uppsala, Suedia) și se precipită cu etanol. cDNA monocatenar se folosește pentru sinteza celei de-a doua catene de cDNA, utilizând trans105533 criptaza inversă, așa cum este descris mai sus. Bucla monocatenară de la capătul 3’ al primei catene de cDNA se îndepărtează prin digestie cu nuclează SI, așa cum este descris de către Leong, JA., și colab. [J.Virol, 9, 891 (1972)], după Ullrich A. și colab. (citat anterior). cDNA dublu catenar se purifica prin extracție cu fenol, cromatografie pe G-50 Sephadex și precipitare cu etanol. La cDNA catenar se adaugă 3’ dCMP, utilizând și transferază terminală, după cum este descris de către Rcychoudhuiy, R și colab. [Nucleic Acids Res., 3, 863 (1976)].

Plasmida pBR322 se clivează cu endonucleaza Pst I; la plasmida clivată se adaugă dGMP, prin procedeul descris anterior, numai că se utilizează dGTP în locdedCTP. 50 ng din plasmida pBR322, având coada dG clivată cu Pst I și 20 ngdin cDNA dublu catenar, având coada dC, sc renaturează în reacție, așa cum este descris de către Cooke, N.E., și colab. [J.Biol.Chem., 255, 6502 (1980)].

Transformarea bacteriei Escherichia coli ynt> cu preparatul de plasmida se execută după cum urmează: Escherichia coli lT76ae face permeabilă la DNA prin incubare în 75 mM CaC12» 10 mM tris, la/?H7,5, timp de 20 min, la temperatura de 4ⁿC. Plasmida și bacteriile se iucubează timp de 60 min la 4°C și apoi timp de 2 min la 41°C. Se selecționează coloniile transformate pentru rezistența la tetraciclină. Prezența de DNA donat se determină prin hibridarea coloniei cu cDNA din glanda pituitară de bovină proaspăt preparat, marcat cu 32p, așa cum este descris de către Grunstclu, Nî. și Hogness, S.D. [Proc.NatAcad.Sd. USA, 72, 3961 (1975)]. Plasmida DNA se prepară din coloniile alese, se fracționează cu Pst 1, se supune electroforezei pe agaroză 1%, se colorează cu bromura de etidiu și se fotografiază, iar la sfârșit se transferă pe filtre de nitroceluloză prin metoda lui Southern, EM [J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)]. Prezența secvențelor de hormon de creștere în DNA transferat se stabilește prin hibridare cu cDNA de hormon de șobolan, cu lungime completă [Seeburg P.H. și colab., Nature, 270,486, (1977)], marcat, prin translație încrucișată [Maniatis, R și colab. Proc. NatAcad.Sci USA, 72,1184 (1975)]. Se obține un clon care e hibridat cu DNA translat și care se notează pBR348. Insetul conține 831 perechi de baze.

Exemplul 2. Analiza secvenței cDNA Plasmida pBR 348 se fracționează cu Pst I, iar fosfatul de la capetele 5’ ale fragmentelor DNA se îndepărtează cu fosfatază alcalină și se înlocuiesc cu (32p) conținând fosfat, folosind polinucleotid-kinaza. Fracționarea următoare cu o varietate de alte endonudeaze de restricție, electroforeze pe gel de poliacrilamidă, colorarea și autoradiografîa benzilor de DNA conduc la o hartă de restricție a DNA-ului donat Apoi, se prepara pBR384 și se fracționează cu Pst I, Pvu lisau Sau 3A, se marchează cu ATP (Y³²P) și polinucleotikinoză și se fracționează cu alte enzime, dând fragmente de DNA marcate la un singur capăt Aceste fragmente se prepară prin eluție din gelul de poliacrilamidă și se separa după cum este descris de către Cooke și colab. (citat anterior) și Maxam A.M. și Gilbert W. [ZVoc. Nat. AcadScL USA, 74,1560 (1977)]. Secvența CDNA inserat este redată în figura 1, împreună cu secvența corespunzătoare de aminoacizi, codificată de catenă, adică, cate na corespunzând tn secvență cu mRNA respectiv. Cadrul de citire corect este recunoscut prin lipsa unor codoni terminatori pe o porțiune importantă a acestor inserții Pozițiile aminoadzilor sunt numerotate începând cu aminoacidul aminoterminal al hormonului de creștere bovin și înaintând în direcția pozitivă la capătul carboxi-terminal și în direcția negativă la primul codon AVG presupus a fi punctul de inițiere a translației. Secvențele sugerează că, la fel ca și în cazul altor hormoni, sinteza hormonului de creștere necesita procese posttranslaționale. Translația mRNA a hormonului de creștere produce un precursor, prehormon de creștere, conținând o peptidă semnal, care poate fi pusa în libertate în timpul trecerii în reticulul endoplasmic.

Exemplul 3. Se repetă exemplul 1, utilizând piasmida pBR315 în loc de plasmida pBR322. Toate condițiile, incluzând soluția clomcrilor recombinate, sunt cele descrise mai sus. Insertul este îndepărtat și analizat după cum este descris în exemplul 1, rezultând un DNA cu circa 831 perechi de baze și cu secvența din figura 1.

Exemplul 4. Se repetă exemplul 1, utilizând plasmida pBR316 în loc de plasmida pBR322. Toate condițiile de lucru sunt identice cu cele descrise în exemplul 1. îndepărtarea și analiza insertului descris în exemplul 2 conduc la un DNA având secvența redată în fig.l·

Exemplul 5. cDNA care codifică hormonul de precreștere bovin se prepară după cum este descris în exemplul

1. Toți linkerii de situ de restricție utilizați în acest exemplu, ca și cei care se redau în cele ce urmează, se prepară după cum este descris de către Scheller R.H. și colab., [Sdence 196, 177 (1977)]. Endonucleazele de restricție folosite în acest procedeu sunt cele de la New England Biolabs., Beverly, Massachusetts și se folosesc condițiile optice recomandate. Transformarea bacteriei Escherichia coli 1776 se face după cum este descris în exemplul 1. Linkerii Hind III, având secvența 5’ - CCAAGCTTGC - 3’, se leagă de cDNA preparat în exemplul 1, la capătul drept al DNA, folosind DNA iigaza T4 după cum este descris de către Valenzuela P. și colab. [Nature 280,815 (1979)]. După ligare, produsul se digeră cu Hind III sau Hsu I, după metoda descrisă de către Ullrich A. și colab. [Sdence 196, 1313 (1977)]. Plasmida pBR322se scindează în situ 1 de restricție Hind III, fie cu Hind III, fie/sau cu Hsu I și se tratează cu fosfatază alcalină, cum este descris de către Ullrich A. și colab. (citat anterior). După precipitare cu etanol, pBR322 scindat, tratată cu fosfatază, se leagă de cDNA conținând capete coesive Hind III, după cum este descris de către Ullrich A. și colab. (citat anterior). Escherichia coli 1776 se transformă cu amestecul de ligare și coloniile transformate, se selecționează pentru sensibilitatea față de tetraciclină. Prezența de DNA donat este determinată cum este descris în exemplul 1. Se obține o colonie ce conține un insert care hibridează cu DNA translat încrucișat Insertul se îndepărtează prin digestie cu Hind ΠΙ sau Ileu I și se analizează după cum este descris în exemplul 2 Insertul conține circa 830 perechi de baze și are secvența din fig.1.

Exemplul 6. Se repetă exemplul 5, în care, în loc de pBR322, se folosesc mai mulți vectori. In acest exemplu, în loc de pBR322 se folosesc plasmidele pSClOl, pM89, pBR313, pBR315 și pBR316. Toate condițiile cuprinzând alegerea unor clonuri recombinate sunt cele descrise în (A). Pentru toate plasmidele se obțin rezultate identice, adică se obține o plasmida recombinată, conținând un insert cu secvența din fig.1.

Exemplul 7. Se repeta exemplul 5, în care se folosesc alți linkeri de loc de restricție și alte endonudeaze de restricție în acest exemplu, linkerii Sal 1 și Bam HI se folosesc în linkeri pentru Hind III. Secvența acestor linkeri este 5’GGTCGACC-3’ ȘI 5’-CCGGATCCG G-3’. Când se folosesc linkerii Sal I, cDNA tratat, aceștia și pBR322 se scindează cu endonucleaza de restricție Sal I, iar când se folosesc linkerii Bam HI, endonucleaza de restricție este Bam HL Toate condițiile cuprinzând alegerea unor donuri recombinate sunt cele descrise în exemplul 4 (A). Atât pentru linkeri, cât și pentru endonudeazele de restricție se obțin rezultate identice.

Exemplul 8. Se repetă exemplul 7, în care, în loc de pBR322, se folosesc plasmidele pSClOl, pM89, pBR312, pBR315, pBR316. Toate condițiile sunt cele descrise în exemplul 6 și se obțin rezultate identice, adică în fiecare caz un insert având secvența din fig.1.

Exemplul 9. Se repeta exemplul 5, în care, în loc de linkerul Hind IIL se folosește un linker de restricție Eco RI cu secvența 5’-CCXtAATTCXjG-3’ și în loc de Hind ΙΠ (Hsul) se folosește un EcoRL Toate condițiile sunt cele descrise, cu excepția faptului că coloniile transformate nu se selecționează în funcție de sensibilitatea față de tetraciclină. Prezența de DNA clonat se stabilește după cum este descris în exemplul 1. Se obține un clon recombinant, care conține un insert cu secvența din fig.l.

Exemplul 10. Se repetă exemplul 9, în care, în loc de pBR322, se folosesc plasmidele pSClOl, pMB9, pBR313 și pBR315. Se folosesc aceleași condiții descrise în exemplul 4(E) și pentru fiecare plasmidă se obțin rezultate identice.

Exemplul 11. Sc repetă exemplul 5, în care în loc de linkerul Hind ΠΙ și, respectiv, Hind ΠΙ (Hsu Ϊ), se folosește un linker de restricție Pst I cu secvența 5 -GCTGCAOC-3’ și Pst I. Se folosesc condiții identice, cu excepția faptului ca selecția unor donări recombinate se face după cum este descris în exemplul 1. Se obține un clon recombinant cu secvența din fig.l.

Exemplul 12. Se repetă exemplul 11, în care, în loc de pBR322, se folosesc plasmidele pBR315 și pBR316. Se folosesc aceleași condiții ca în exemplul 11 și se obțin rezultate identice.

Exemplul 13. Se repetă exemplele 1, 3, 4 și 5-12, folosind Escherichia coli RRI sau Escherichia coli ΗΒΙΟΙ,ΐη loc de Escherichia coli 1776. Se aplică toate condițiile descrise și se obțin rezultate identice.

Exenplul 14. în acest exemplu, cDNA care codifică hormonul de precreștere bovin se prepară cum este descris în exemplul 1. Linkerii de situ de restricție Eco RI se leagă la capătul drept al cDNA, după cum este descris de către Valenzuale P. și colab. (citat anterior) și se sdn10 dează cu Eco RI, cum este descris de către Ullrich A și colab. (citat anterior). mDNA de fag Charon 16A, preparat după cum este descris de către Blattner și colab. [Science, 196, 161 (1977)], se folosește ca vector de transfer. Capetele coezive se rematurează prin incubare, timp de 60 min, la 42°C, în 0,1 M&is-HCl, pH=8,0 și 10 mMi MgClz. Vectorul se scindează în situl de restricție Eco RI cu endonudează Eco RI și se tratează apoi cu fosfatază alcalina, după cum este descris de către Ullrich și colab. (citat anterior). După precipitare cu etanol, vectorul DNA tratat cu fosfatază se adaugă la cDNA conținând capete coesive Eco RI, într-un raport molar de 2 moli vector la 1 mol cDNA Amestecul este ligat cu DNA ligază T4, după cum este descris de către Ullrich A și colab. (citat anterior). Amestecul ligat se adaugă direct la o suspensie de celule de Escherichia coli 1776, preparată pentru transformare după cum este descris în exemplul 1, transformarea acesteia se face, de asemenea, după cum este descris în exemplul 1. Fagii recombinați se recuperează și se plachează pe plăci conținând bacterii Lac și 5-clor-4-brom-3- indolil-freta-Dglactoeid (X6), (80 g/ml) fagi recombinanți conținând cDNA inserat în situl Eco RI al fagului Charon 16A se aleg, se soluționează pentru producerea de plăci incolore. Recombinanții soluționați se izolează și se digeră cu un exces de endonudează Eco RI, iar digestul se analizează după cum este descris în exemplul 2. Se recuperează un DNA cu circa 830 perechi de bază în lungime, având secvența din fig.1 în mod alternativ, amestecul de legătură se utilizează pentru a forma fagi recombinanți prin aglomerare invitro cum este descris de către Stemberg prin folosirea metodei de hibridare pe placă in situ a lui Benton W.D. și Davis R.W. [Science, 196, 180, (1977)].

Ekempiui 15. DNA de fag Charon 3A sau 4A preparat după cum este descris

N. și colab., Gene 1, 255 (1977). Fagii reoombinanți se pot separa, de asemenea, de Blattner și colab. (citat anterior), se folosește ca vector de transfer în locul DNA de fag Charon 16A, folosit mai sus. Toate condițiile sunt identice cu cele descrise în cazul DNA-ului de fag Charon 16A. Selectarea fagilor recombinanți se face prin (a) plasarea fagilor pe plăci conținând bacterii I,ac și X6 și izolarea plăcilor incolore, după care urmează hibridarea cu o probă potrivită sau digestie cu o endonuclează de restricție, după cum este descris de Blattner și colab. (citat anterior). Insertul se îndepărtează după cum este descris mai sus, dând un DNA cu circa 830 perechi de bază în lungime și având secvența din fig.l.

Exemplul 16. DNA de fag gt WES, B, preparat după cum este descris de Tremeier și colab. [Nature, 263, 526 (1976)], se folosește ca vector de transfer în locul lui DNA de fag Charon 16A, folosit mai sus. Toate condițiile sunt identice cu cele descrise pentru DNA de fag Charon 16A. Selectarea fagilor recombinanți se face prin metoda de hibridare a lui Bcnton și Davis (citați mai sus). Insertul se îndepărtează după cum este descris mai sus, dând un DNA cu circa 830 perechi de bază în lungime și având secvența din fig.l.

Exemplu! 17. Se repetă exemplele 14...16, în care, în loc de Escherichia coli 1776 se folosesc Escherichia coli RPI, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DP50 sau Escherichia coli DP50 SupF. Toate condițiile sunt identice și se obțin rezultate identice.

EXemplul 18. cDNA care codifică hormonul de precreștere bovin se prepară după cum este descris în exemplul 1. Se adaugă linkeri de sit de restricție Hind III și cDNA se digeră cu Hind III sau Hsu I, după cum se descrie în exemplul 5.

Plasmida pC194, izolată din Streptococcus aureus după cum este descris de către Erlich S.D. [Proc.NatLAcacLScL USA, 74, 1680 (1977)], se utilizează ca vector de transfer. pC194 se scindează în locul Hind III cu Hind III sau Hsu I și apoi se tratează cu fosfatazâ alcalină, după cum este descris de către Ullrich A. și colab. (citat mai sus). cDNA având capete coesive Hind III se leagă de pC194 scindat, după cum este descris de Ullrich A. și colab. (citat mai sus). Inducția de competență a microorganismului BaciUus subtilis RUB331 se execută după cum este descris de către Sgaramella V. și colab. [LMoLBioL, 105, 587 (1976)] și Borenstein S. și Ephrati- Elizue E. [J.MoLBiol„ 45,137 (1969)]. Transformarea Bacillus subtilis RUB331 se face folosind amestecul de ligare, după cum este descris de către Sgaramella și colab. și Borenstein și colab. (citați anterior). Suspensia de celule se plachează direct pe plăci I, conținând 3 g cloramfenicoL Un recombinant ales se izolează și se digerează cu Hind III și fragmentul digerat se analizează după cum este descris în exemplul 2. Se recuperează un DNA cu circa 830 perechi de bază în lungime și având secvența din fig.l.

Exemplul 19. Sinteza cDNA care codifică hormonul de creștere bovin

Plasmida pBR348 se digerează cu endonucleaza Hae II, generând un fragment de 1600 perechi de baze. Un sit Hae II se află în interiorul fragmentului cDNA, care codifică prehormonul de creștere și al doilea sit se găsește în interiorul porțiunii plasmidei pBR.322. Digestia conduce la:

+ 1 +2

5’ - C TTC...3’

31G GGG AAG...5’ GH bovin poate începe fie cu reziduul de +1 ala, fie cu +2 phe, la capătul NH2 terminal [Dayhoff și colab. (citat anterior)], se poate astfel încerca completarea codonului ala sau se poate îndepărta.

încercarea de deleție se face prin incubarea DNA cu dAAP și fragmentul Klenow al DNA polimerazei I, întrucât prima bază a codonului +2 phe (pe lanțul 3’ 5*) este A. Această reacție dă următoarele:

+ 1 5’ -C 3’ + 2

TTC...3’

AAG...5’

DNA se extrage cu fenol și se precipită. Excesul de dATP și bazele digerate se îndepărtează prin cromatografîe pe G-50 Sephadex C rămas la 5’al codonului +1 ala se îndepărtează cu SI nuclează după cum este descris de Shine și colab. [Nature 285,456 (1980)]. Această digestie dă:

+ 2

5’ - TTC...3’

3’ - AAG...5’

Exemplul 20. Se repetă exemplul 19, în care secvența de deoxinucleotid care codifică hormonul de precreștere bovin se îndepărtează prin digerarea vectorilor de transfer preparați în exemplele 3...18, prin enzima de restricție corespunzătoare înaintea digerării cu Hae II. Vectorii de transfer și enzimele de restricție utilizate sunt date în tabelul de mai jos:

Enzima de restricție PstI

1lind III

Sall

Bam HI

EcoRI

Vectorul de transfer (exemplu)

3A, 3B, 4G, 4H

4A, 4B, 6

4C, 4D

4E, 4F, 5A, 5B, 5C

După digestia cu enzima de restricție corespunzătoare, secvența de hormon de precreștere bovin se izolează prin elcctroforeză pe gel și se tratează după cum este descris în exemplul 7 A, obținându-se rezultate identice.

Exemplul 21. Se repetă exemplele 19 și 20, în care T4 DNA polimeraza sau 3’ - 5’ exonucleaza se folosește în loc de fragmentul Klenow de DNA polimerază L Toate celelalte condiții sunt identice și în fiecare caz se obține secvența identică de fragment de hormon de creștere bovin.

Exemplul 22. Fragnentuî de hormon de creștere bovin + 1 +2

5’ - C 3’ - G CGG

TTC...3’

AAG...5’ se prepara prin digestie Hac II, cum este descris in exemplele 19 sau 20. încercarea de completare se face după cum urmează: DNA se incubează cu dATP, dGTP, dCTP, dTIT și fragmentul Klenow de DNA polimeraza I. Această reacție dă.

+ 1 +2

5’ - C GCC

TCC..3’

3’ - G CGG AAG...5’ DNA se extrage cu fenol și se precipită. Apoi, secvența se incubează cu fragmentul Klenow de DNA polimeraza I, în prezență de dCTP. Secvența se digeră 15 apoi cu SI nuclează, cum este descris de Shine și colab. Nature 285, 456 (1980), dând secvența:

5’ - GCC TTC...3’ 3’ - CGG AAG...5’

Exemplu] 23. Se repeta exemplul 22, în care, în a doua fază de incubare, în loc de fragmentul Klenow se folosește T4 DNA polimeraza sau 3’-5’ exonucleaza, adică în prezență de dCIP. Celelalte condiții sunt identice și în fiecare caz se obține secvența de hormon de creștere bovin identică.

Exemplul 24. Secvența de deoxinu cleotide care codifică hormonul de creș30 fere bovin se insera în vectorii de transfer, după cum este descris mai sus, care codifică secvența pentru hormonul de precreștere bovin.

Se repetă exemplele 1,3,18, în care 35 DNA preparat în exemplele 19-21 sau 18, se utilizează în loc de DNA care codifică hormonul de precreștere bovin. Toate celelalte condiții sunt identice. DNA se îndepărtează prin digestie cu 40 enzima de restricție corespunzătoare (tabelul de la exemplul 20) și se analizează după cum este descris în exemplul 2 în fiecare caz, se obține un DNA având o secvență care începe cu codonul Phe în poziția 2 și continuă până la capătul secvenței din fig.l.

Exemplul 25. Se repetă exemplele 1,

3-18, în care, în loc de DNA, care codifică hormonul de precreștere bovin, se folosește DNA preparat în exemplele 22 sau 23. Toate celelalte condiții sunt identice. DNA se îndepărtează prin digestie cu enzima de restricție corespunzătoare (tabelul de la exemplul 20) și se analizează cum este descris în exemplul 2 în fiecare caz se obține un DNA având o secvență care începe cu codonul ala în poziția 1 și continuă până la capătul secvenței din fig.l.

Exemplul 26. Expresia hormonului de creștere bovin

Hormonul de creștere bovin se poate exprima prin oricare din metodele descrise mai sus.

Expresia prehormonului de creștere bovin ca o proteină de fuziune s-a demonstrat printr-o experiență dc radioimunotestare și printr-o experiență.

în experiența radioimnnotestare, Escherichia coli 1776 care conține pBR348 sau Escherichia coli care conține pBR322 ca control se lasă să crească în soluție nutritivă și se colectează prin centrifugare. Celulele se resuspendă și se lizează și la hormonul de creștere se adaugă hormon de creștere ovin radiomarcat anticorp ovin sau bovin. Complexul imun se precipită și sc determină radioacti vitatea. Această experiență arată că proteina de fuziune reține hormon de creștere bovin imunoactiv. Pentru a ilustra mai departe producția unei proteine de fuziune, se face o experiență aplicând metoda descrisă de Meagber R.B. și colab. [Cell. 10, 521, (1977)]. în fig,2 se redau benzile de electroforeză pe gel care rezultă din minicelulele de Escherichia coti 1776. Banda a) se obține din 1776 transformat cu pBR348. Banda b) se obține din 1776 transformat cu pBR322 Banda c) este reper pentru greutatea moleculara. A) indică produsul de fuziune de beta-lactamază și hormonul de precreștere bovin. B) indică prelactamaza și C) indică heto-lactamaza. Această experiență arată că pBR348 produce o proteină de fuziune constând din 183 aminoacizi de beta- lactamaza, 217 aminoacizi de prehormon de creștere bovin și câțiva aminoacizi de legătură codificați de regiunea 5’ normal netransformată; greutatea moleculară totală de circa 45000 corespunde cu greutatea moleculara presupusă proteinei hibride.

Exemplul 27. Pentru expresia directă a prehormonului de creștere bovin, insertul DNA se separă mai întâi din pBR348, prin digestie parțială cu endonucleaza Pst I, și se purifică prin electroforeză pe gel. Apoi, o probă de 15 g deinsert DNA purificat, se modifică prin suspendarea de DNA în apă, la care se adaugă o soluție concentrata de săruri, astfel încât compoziția finala cuprinde 70 mM Tris, pH=8,8, 70 mM MgC12,10 mM ditiotreitol și 13,75 unități T4 DNA polimeraza, într-un volum total de 250 L Amestecul de reacție se incubează la 37°C, timp de câteva minute și apoi se adaugă dATP în concentrație de 50 mM, pentru a termina digestia endonudeolitică la următorul reziduu de adenină. După 20 s de incubare suplimentară, enzima se inactivează prin tratament termic la 65°C, timp de 5 min. Acest proces se repetă de 2 ori, o dată când dCTP se folosește în loc de dATP și apoi când dTTP se folosește din nou. DNA tratat se recuperează prin precipitare cu etanol. Digestia cu SI nuclează pentru a da capete inactive se face cum este descris de Ullrich A. și colab. (citat anterior). Această metodă este desemnata sa producă o moleculă de DNA terminată la codonul inițial la numărul de poziție 26. Aceste molecule se transfera când sunt inserate într-un vector de expresie având un sit de inserție de circa

3...11 nucleotide de la secvența sitului de legătură ribozomal a unei unități de expresie.

Un vector pentru expresie directa este alcătuit prin modificarea plasmidei ptrpE30, prin îndepărtarea de 23...29 nudeotide, folosind T4 DNA polimerază și SI nucleoză, în modul descris mai sus. cDNA modificat și vectorul de expresie modificat sunt prevăzuți cu un linker specific, având secvența 5’CCGGATCCGG-3’ pe o catenă și secvența sa complimentară pe cealaltă catenă, printr-o legătură inactivă folosind DNA ligază, după cum este descris de Valenzuela (citat anterior). Linkerii crează situri de restricție sensibile la endonudeaza Bam HI, care se folosesc pentru ușurarea inserției Inserția se face prin aplicarea metodei lui Ullrich A și colab. (citat anterior). Bacteriile gazdă Escherichia coli HB101, RRI sau 1776 se transformă prin vectorii recombinanți în care este inserat prehonnonul de creștere modificat și transformanții sunt selectați pentru rezistența la ampidlină. Se selectează un singur transformant, denumit ptrpE30/bGH, pentru a fi analizat mai departe.

Celule bacteriene transformate prin ptrpE30/bGII se lasă să crească într-un mediu minim standard (M9), suplimentat cu Leu, Pro, vitamina Bl și ampicilina, la 37°C. în prima fază log, operonul trp se induce prin adaugare de acid beta indolilacrilic (30 g'ml mediu). Culturile de control se iasă neinduse. După mai mult de 3 h de creștere, 1,5 ml celule se marchează radioactiv prin adăugare de 20 Ci 35 S-L-Met și se incubează timp de 10 min. Celulele se colectează prin centrifugare, se spală și se resuspendă în 250 1 tampon, conținând 10% (vol/vol), 5% vol/vol heta-mercaptoetanol și 2,3% (greut/vol) SDS în 0,0625 moli tris, pH=6,8. Suspensia se fierbe timp de 5 min, după care se aplica pe 10% greut/vd SDS - gel de poliacrilamidă și se fracționează prin electroforeză. Benzile de proteine se vizualizează prin auloradiogrâfie. Rezultatele arată existența unei noi benzi de proteină de circa

24000 daltoni, neobservată în culturile neinduse sau netransformate.

Prehonnonul de creștere bovin se purifică prin metode obișnuite cuprinzând, de pildă, filtrare prin gel, cromatografie pe schimbătoare de ioni, cromatografie de afinitate și metode de solubilitate diferențială. Prehormonul de creștere este convertit la hormon de creștere aplicând metoda descrisă de Jackson R.C. și Blobel G. [Proc.Nat. AcadSci USA, 74, 5598, (1977)].

Exemplul 2& Un linker specific, având secvența 5’-CCGGATCCGGATG - 3’ pe o catenă și secvența sa complimentară pe cealaltă catenă, este ligat inactiv de DNA, care codifică hormonul de creștere bovin preparat în exemplele

19...23. Acest DNA modificat este apoi inserat în plasmida modificată ptrpE30, după cum este descris în exemplul 27. Bacteria gazdă se transformă și se cultiva și hormonul de creștere bovin rezultat se purifică după cum este descris în exemplul 27.

în general, procedeul conform invenției cuprinde donarea unui DNA, care codifică hormonul de precreștere bovin sau hormonul de creștere bovin și expresa DNA donat îa microorganisme.

mRNA care codifică hormonul de precreștere bovin, se izolează din glanda pituitarâ bovină. Cu ajutorul mRNA prin transcripție inversă, se prepară cDNA care se insera într-un vector de transfer. O secvența de deoxinudeotide, care modifică hormonul de creștere bovin, se prepară prin hidroliza secvenței care codifică presecvența din cDNA de hormon de precreștere bovin. Vectorul de transfer este folosit pentru transformarea bacteriilor care exprima cDNA donat Metodele de bază pentru cDNAse cunoec [Seeburg, P.H. și colab., Nature, 270, 486, (1977) și Derynck R. și colab., Nature, 285, 542, (1980)].

RNA se izolează din glandele pituitare de bovina, folosind metode obișnuite. RNA poliadenilat se izolează prin cromatografie de afinitate. Integritatea

RNA poliadenilat se apreciază prin executarea translației libere de celule a RNA poliadenilat, așa cum este descris de către Miller W.L și McCarlhy BJ. [J.BioLChem., 254,742, (1979) și Marțial 5 JA. și colab. (ProcNatAcxicLScL USA, 74,1816 (1977)] și analizarea proteinelor produse prin electroforeza pe gel SDS de acrilamida, așa cum este descris de către Laemmli U.K. \Nature, 22Ί, 680 10 (1970)]. Hormonul de creștere bovin se mai identifică printr- o reacție de precipitare imună, așa cum este descris de către Marțial JA și colab [Proc. Nat AcadSci USA, 74, 1816 (1977)]. 15

RNA poliadenilat este folosit ca modelul pentru prepararea unei copii de cDNA dublu catenar, prin metoda în sine cunoscută. Prima catenă de cDNA este sintetizată folosind transcriptaza in - 20 versă, un oligo dT amorsor și RNA poliadenilat, conform procedeului descris de către Miller și Mc.Carty (citat anterior) și Monahan J.J. și colab. [Biochem.

15, 223 (1976)]. Z5

RNA este îndepărtat prin digestie alcalină și cDNA monocatenar este folosit pentru amorsarea sintezei celei de-a doua catene cu ajutorul transcriptazei inverse. Bucla în ac de păr monocatenară este îndepărtata prin digestie cu SI nuclează [Leong J.A, și colab. J. Virol, 9, 891, (1972)], prin procedeul descris de către Ullrich A și colab. [Science, 196: 1313 (1977)].

cDNA astfel preparat se poate insera într-un vector de transfer corespunzător. Vectori de transfer potriviți sunt cei capabili să transforme bacterii ca Escherichia coli și BadUus subtilis, drojdie (Seccharomyces cerevisiae\ tulpini de mutant ini, esp și esp de Neurospora crassa și celule animale în cultură tisulară.

Vectori de transfer potriviți pentru invenția de față, capabili de transformarea bacteriei Escherichia coli, sunt plasmidele: pSClOl, pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 și pBR322 și vectorii derivați din bacteriofagii Charon 3A, Charon 4A, Charon 16A și gtWES B. Referințele bibliografice în care se descriu prepararea și caracteristicile acestor vectori de transfer sunt date în tabelul 1.

Tabelul 1

Vector de transfer	Referințe bibliografice
pSClOl	Cohen și colab., Proc. NatL Acad. Soi USA 70, 1293 și 3240
	(1977) Boyer și colab., Recombinării Molecules, Beers și colab., Eds., Ravan Press, ΝΎ, p. 13 (1977) Cohen și colab., Recombinam Molecules, p.91
pMB9	Rodriguez și colab. Molecular Mechanisms in Control of Gene Expression (IGN-UCLA Șymposium on MoL & CelL BioL voL 5) Nieslich șî colab., Eds., Academic Press, NY, p.471 (1976) Bolivar și colab., Gene 2, (1977)
pBR313	Bolivar și colab. (citat mai sus)
pBR315	Rodriguez și colab. (citat mai sus)
pBR316 pBR322	Rodriguez și colab. (citat mai sus) Bolivar și colab. (citat mai sus) Bolivar și colab., Gene, 4, 121 (1978) Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. on Quant, Biol., 43, 77 (1978)

Charon 3A	Blattner și colab., Science 196, 161 (1977)
Charon 4A	Blattner și colab. (citat mai sus)
Charon 16A	Blattner și colab. (citat mai sus)
gtWES. B	Tremeier și colab., Nature 263, 526 (1976) Leder și colab., Science 196, 175 (1977)

Alți vectori potriviți pentru transformarea bacteriei Escherichia coli sunt descriși de Sinaheimer R.L.[Ann,Rev^iocZî<2m. 46,415 (1977)]. Vectorii de transfer pentru transformarea Bacillus subtiUs au fost descriși de către Iordănescu S. [J.Bacteriol. 124, 597 (1964)] și Ehriich S.B. [Proc.NaL4cad.Sci. USA74,1680(1977)]. Un astfel de vector a fost identificat ca piasmidă pC194. Plasmidele hibride conținând DNA de drojdie plasmidic și/sau cromosomic și DNA bacterian, de exemplu plasmidic, se folosesc pentru transformarea drojdiei. Astfel de plasmide au fost descrise de către Beggș J.D. [Nature ZJ5, 104 (1978), Asiav C.L. și Carbon (JJ*roc.NatAcad.Sci. USA 76, 3829 (1979)] și Kingșman, A.K. și colab. [Gene 7, 141 (1979)]. Vectorii de transfer care se pot utiliza pentru transformarea celulelor animale în cultură tisulara sunt virusurile Adeno SV-40 și virusul poliomielitei.

cDNA este inserat într-un vector de transfer, folosind metode în sine cunoscute. cDNA se insera, de obicei, într-un sit de restricție care este unic în vectorul 10 de transfer. Charon 3A și 4A și gt WES B nu conțin situri unice și pentru acești vectori se folosesc situri de restricție în număr limitat Siturile unice de restricție din diferiți vectori de transfer 15 și situnle de restricție utile din vectorii Charon 3A și 4A și gt WES B sunt date în tabelul 2.

Tabelul 2

Vectori de transfer	Situri unice de restricție
pSClOl pMB9 pBR313 pBR315, pBR322 _PBR316 pC194 Charon 16A Charon 3A Charon 4A gt WES B	Eco RI, Hind III, Sal I, Bam HI, Hpa I, Sma I Eco RI, Hind III, Sal I, Bam HI Eco RI, Hind ΠΙ, Sal I, Bam HI, Hpa I, Smal, Xma I Eco RI, Hind III, Sal I, Bam HI, Pst I Hind ΙΠ, Sal I, Bam HI, Pst I Hind III EcoRI, Sat I EcoRI EcoRI EcoRI

în general, cDNA se inseră î ntr-un sit 20 de restricție aflat într- un traseu fenotipic, pentru ușurința selecției. De exemplu, Hind ΙΠ, Sal I și Bam HI în pSClOl, pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 și pBR322 se găsesc în gena pentru rezis- 25 tența la tetraciclină sau în regiunea sa de control. Inserarea în acest ioc are ca rezultat pierderea rezistenței la tetraciclină. cDNA se poate insera în vectorul de transfer, prin folosirea unor linkeri de 30 restricție sau a unor deorinucleotide de prelungire. în primul caz, o nudeotidă sintetică conținând un sit de recunoaștere pentru o endonudează de restricție specială, de tipul celor mai de sus, se 35 poate lega inactiv de cDNA. cDNA și vectorul de transfer se incubează separat cu endonucleaza de restricție și se rcnaturcazăapoi, pentru a forma vectorul de transfer care conține cDNA. în cel de-al doilea caz, cDNA se poate prelungi folosind o dcoxinucleotidă și transforeza terminală, prin procedeul descris de către Roychoudhuiy R. și colab. [NucLAcids Res 3, 863 (1976)]. După digestia cu o endonudează de restricție, vectorul de transfer se poate prelungi folosind deoxinucleotida complementara. Vectorul de transfer și cDNA prelungite se renaturează pentru a forma vectorul de transfer care conține cDNA. De exemplu, cDNA se poate prelungi și vectorul de transfer se poate deschide în situl Pst I și prelungire dG.

Vectorul de transfer, care conține cDNA, se folosește apoi pentru a transforma o gazdă potrivita. Gazdele potrivite pentru diferiții vectori de transfer sunt Escherichia coli, Bacillus suhtilis, drojdia, Ncurospora crassa și celule animale în cultură în tisulară. Vectorii de transfer capabili de a transforma fiecare din aceste gazde au fost descriși mai sus. în mod obișnuit, se folosesc trei tulpini de mutant de Escherichia coli. Acestea sunt 1776, RRI și IIB101. Escherichia coli 1776 a fost descrisă de Curtiz R. țAnn. RevMicrobioL 30, 507 (1976)] și în brevetul SUA nr.4190495. RRI a fost descrisă în Dugaiczyk A. și colab. (Molecular Mecanisms in Control of Gens Expression p543), Escherichia coli HB101 a fost descrisa de Kedez D.H. și Thomas CA. [Proc.NatAcad.Sci. USA, 73, 1537, (1976)]. Gazdele potrivite sunt transformate prin metode obișnuite. De exemplu, Escherichia coli 1776 este transformată cu ajutorul vectorului de transfer care conține cDNA, prin procedeul descris de către Cooke N.E. și colab. [J.Biol.Chem. 255,6502 (1980)]. Coloniile sunt selectate și/sau separate prin metode obișnuite. De exemplu, coloniile se pot selecta pe baza pierderii unei trăsături fenotipice, cum este rezistență la tetraciclină. Coloniile se pot separa prin îndepărtarea cDNA printr-o endonuclează de restricție corespunzătoare și analizarea sa prin electroforeză și hibridare [Southern E.M., J.Mol.Riol.,98, 503 (1975)] sau (2) prin placare repetata prin procedeul descris de către Grunstein

M. și Hogness D.S. J/Vod. NatAcad.Sci USA 72,3961, (1975)] și hibiridarea cu o probă corespunzătoare sau prin examinarea coloniilor cu privire la expresia prin RIA sau alte metode.

DNA care codifică hormonul de creștere bovin se poate prepara din fragmentul care codifica preliormonul de creștere bovin.

DNA care codifica prehormonul se îndepărtează printr-o endonucleaza de restricție corespunzătoare. De exemplu, dacă cDNA este inserat în situl Pst I al plasmidei pBR322, fragmentul cDNA se poate îndepărta prin digestie parțială cu Pst I, întrucât cDNA pentru GH bovin conține 2situri interne Pst L Apoi, cDNA se digera cu Hae II. în mod alternativ, plasmida recombinanta, derivată de la pBR322, se poate digera cu Hae II pentru îndepărtarea unei porțiuni din fragmentul cDNA, Prin digestia cu Hae II, se îndepărtează DNA care codifica peptida semnal N- terminală și două din cele trei baze care codifică ala N- terminală al hormonului de creștere. Aceste baze sunt înlocuite prin incubarea fragmentului cu fragmentul Klenow al DNA polimerazei I și cu deoxinudeotide. în mod alternativ, bazele care codifică ala se pot îndepărta prin incubarea cDNA cu fragment Klenou, DNA polimerază T4 sau 3’-5’ exonudează, în prezență de dATP. Fragmentul Klenow a fost descris de către Klencw H. și Henningsen I {ProaAfatAaui&x USA 65,168 (1970)]. cDNA care codifică hormonul de creștere se inseră apoi într-un vector de transfer corespunzător, prin procedeul descris mai sus.

DNA donat se exprimă în bacterii pentru a produce fie o proteina de fuziune, cuprinzând hormonul de creștere bovin codificat, de secvența inserată, fie hormonul de creștere bovin, ca atare.

Se poate utiliza una din următoarele tehnici: (a) modificarea secvențelor de codificare pentru a rezulta un punct exact de pornire, transiațional, (b) alegerea sau construirea unui vector de expresie optim, (c) prelucrarea poettranelațională, fie prin exploatarea m vivo a activității de prelucrare a gazdei, fie prin mijloace chimice in vitro și (d) expresia dirctă. Când se exprimă o proteină de fuziune, este necesară modificarea secvenței de nucleotide donată, întrucât secvența rezultată pennite translația insertului în cadrul corect de citire și nu oprește intervenția codonilor înaintea codonului ințial al secvenței inserate.

Prehormonul de creștere sau hormonul de creștere este exprimat ca o proteină do fuziune prin inserția cDNA în siturile corespunzătoare din operonii exprimați (vectorii de expresie) cuprinzând, dc exemplu, silul Pst I în gena dc beta- lactamază a pBR322 [WillaKomaroff I„ și colab. Proc.Nat.Acad.Sci. IJSA, 75, 3727 (1978)], Seeburg P. și colab. (Nature Z74,-. 795 (1978)], silul Eco RI din pBR322, care poarta regiunea de control lac și secvența de codificare pentru beta-galactozidază [ltakura J., Sctence, 198,1056 (1979)] sau situl Hind UI al genei trpD a plasmidei ptrpED50 [Marțial J. și colab. Science, 205, 602 (1979)]. Se cunosc modificări ale lungimii secvenței prin una sau două nucleotide, pentru a crea faza de cadru corect de citire. Inserții în situl Pst I al pBR322 cu ajutorul procedeului prelungire apar în faza corectă și cadrul de citire cu o probabilitate de 1/6.

Prehormonul de creștere sau hormonul de creștere se prepara dintr-o proteina de fuziune susceptibila de scindare, specifica in vitro. Secvența de nucleotide donată este modificată pentru a codifica secvențele de aminoacizi, creând specificitate pentru o enzimă proteolitică. O secvență utila este AspAspAspAspLys, scindata, de preferință, de către enzimă enterokinază, prin procedeul descris în brevetul SUA nr.4190495.

Conform acestui procedeu, o secvență de nucleotide de legătură care codifică secvența dc aminoacizi de mai înainte este inserată adiacent ia secvența de nudeotide, care codifică amino-terminus al prehormonului de creștere.

Pentru perhormonul de creștere o astfel de inserție necesită modificarea insertului original cDNA, prin îndepărtarea nndeotîdeior la capătul 5’ al secvenței care codifică prehormonul de creștere. Insertul cDNA pentru hormonul de creștere, descris mai sus, nu este nevoie să fie modificat Modificarea insertului pentru prehormonul de creștere se face fie prin digestia controlată a capătului 3’ al insertului, folosind 3’ exonudeaza sau T4 DNApoIimeraza, fie prin combinarea clivării cu endonudeaza de restricție într-un punct al capătului, cu sinteza chimică, pentru a reface porțiunea îndepărtată a secvenței Pentru alte amănunte ale acestor metode, vezi cererea de brevet SUA (2). Aplicând aceste metode, folosind, de preferință, T4 DNA polimerază și SI sudează, se obține secvența cDNA, care codifică prehormonul de creștere și se îndepărtează regiunea 5’ netranslata.

Secvența de nudeotide a linkerului care codifica secvența de aminoacizi de mai sus este ligată prin capătul drept de cDNA, care codifica fie prehormonul de creștere, fie hormonul de creștere, folosind DNA ligaza, prin procedeul descris de către Valenzuela și colab. Nature, 280,815 (1979). Secvența cDNA modificată este inserată într-un vector de expresie a proteinei de fuziune. Bacteriile gazdă cum sunt Escherichia coli HB101, RRI sau 1776 sau alte bacterii, sunt transformate cu ajutorul vectorilor recombinanți, care poartă regiunea inserată, care codifică prehormonul de creștere.

Transformanții sunt selectați pentru rezistența la ampicilina. Apoi, transformanții se lasă sa crească în condiții potrivite pentru expresia proteinei de fuziune. După expresia proteinei de fuziune, prehormonul de creștere sau hormonul de creștere este scindat prin hidroliza enzimatică folosind enterokinaza.

Prin folosirea unor vectori de transfer corespunzători prehormonului de creștere, este exprimat direct, adică nefuzionat, cu o proteină procariotă. Principiul de bază al expresiei directe constă în aceea că segmentul DNA inserat înlocuiește cu totul segmentul de codificare transcris în mod normal și transferat de către regiunea de control bacterian.

·* 30

Componenta esențială a regiunii de control ce urmează să fie preservată este denumită unitatea dc expresia care cuprinde un promotor și un sil de legare ribosomal, capabil să acționeze în orga- 5 nismul gazdă. Nu este nevoie să se îndepărteze toate nucleotidele care codifică proteina de fuziune. Relația dintre situl de legătură ribosomal și codonul inițial (AUG) este astfel încât codonul 10 inițial poate fi situat oriunde în nucleotidele 3-11 ale sitarilor de legătură ribosomal fShine J. și colab. Proc.NatAcad. ScL USA, 71, 1342 (1974) și Steitz J. Proc.NatAcad.Sci USA, 724734 (1975)]. 15 în regiunea de nucleotide 3-11, primul AUG stabilește cadru! de citire pentru translație. în cazul unui plrpE30, derivat de la ptrpEDSO descris mai sus și conținând operatorul, promotorul, ate- 20 nuatorul și secvențe de legătura ribosomale ale operonului triptofan, împreună cu secvența dc nucleotide care codifică 7 aminoacizi ai proteinei trp E, urmată de un sit Hind ΓΠ, îndepărtarea 25 unui minim 23-29 nucleotide din situl Hind III creează un sit pentru inserția fragmentului cDNA sub controlul operonului triptofan.

Pentru expresia directă a prehormo- 30 nului de creștere, fragmentul original cDNA se modifică, în modul descris mai sus, pentru îndepărtarea regiunii 5’ netranslată. Un vector pentru expresie directă se poate alcătui prin modificarea 35 ptrpE30, prin îndepărtarea nucleotidelor 23 29, folosind T4 DNA polimeraza și SI nucleaza. O secvență de nucleotide delinker conținând secvența de restricție pentru endonucleaza Bam HI este legată 40 prin capătul drept atât de insertul cDNA modifieah cât și de ptrpE30 modificat, prin procedeul descris de Valenzuela și colab. (citat mai sus). Aceasta se face pentru a ușura inserția care se execută 45 în modul descris de către Ullrich A. și colab. \Sdence 196,1313 (1977)]. Gazde potrivite, cum sunt: Escherichia coli HB101, RRI sau 1776 sau alte bacterii, se transformă cu ajutorul vectorilor re- 50 combinanți, care conțin regiunea inserată care codifică prehormonul de creștere. Transformanții se selectează pe baza rezistenței la ampicilină și apoi se cultivă în condiții adecvate pentru expresia prehormonului de creștere.

Hormonul de creștere se poate exprima direct prin metoda descrisa de Goeddel D.V. și colab. [Nature, 281, 544 (1979)]. în mod alternativ, o secvență de nucleotide ale linkerului conținând situl Bam HI și codonul inițial (AUG) se poate liga prin căpătai drept de cDNA, care codifica hormonul de creștere. Acest cDNA modificat este apoi inserat în ptrpE30, modificat și el, în modul arătat mai sus.

Prehormonul de creștere este convertit la hormon de creștere prin îndepărtarea secvenței N-terminale a aminoadzilorhidrofobi, care cuprind peptida semnal. îndepărtarea in vitro a peptidei semnal se poate executa prin tratarea proteinei extrase din celulele induse, transformate cu un preparat de microsomi bruți, în modul descris de către Jackson R.C. și Blobel G. (Proc.NatAcad.ScL USA, 74, 5598 (1977)]. îndepărtarea m vivo a peptidei semnal se poate face în timpul expresiei directe bacteriene a secvenței care codifică prehormonuhde creștere. Peptidele semnal bacteriene și mamifere au secvențe similare. Proteinele având peptide semnal provenite de la mamifere se pot prelucra de către celulele bacteriene; rezultatul îl constituie expresia unui hormon de creștere în spațiul periplasmic sau în mediu.

Prehormonul de creștere și hormonul de creștere se purifică prin metode cunoscute, de exemplu, filtrate pe gel, cromatografie prin schimbători de ioni, cromatografie de afinitate și metode de solubilitate diferențială.

Digestiile cu endonudeaze de restricție se execută în condiții optimizate pentru fiecare enzimă. Endonucleazele de restricție, nomenclatura lor și specificitatea de sit au fost descrise de către Roberts R.Crit (Revjfiochem. 4, 123,

......-...jar· (1976)]. Enziuiele s-au obținut de la New England Biolabs. Cambridge, Massachusetts. Transcriptaza inversă s-a preparat de către drJ.Beard, Life Sciences, Inc., StPetersburg, Florida. Folosirea transcriptazei inverse și condițiile de reacție potrivite au fost descrise de către Seeburg P.H. și colab. [Nature 276, 795 (1978)], Seeburg P.H. și colab. (Nature, 274:795 (1978)] și Shine J. și colab. (citat anterior). T4 DNA polimerază s-a obținut de la New England Biolabs. Folosirea de T4 DNA polimerază și condițiile de reacție potrivite sunt descrise în brevetul SUA menționat mai sus. SI nuclează s-a obținut de la Miles Laboratories, Elkhart. Indiana. Folosirea de SI nuclează și condițiile de reacție potrivite sunt descrise de Ullrich A. (citat mai sus). Transferaza de deoxinucleotidă terminală s-a obținut de la Enzo Biochemicals, New York. Folosirea acestei enzime și reacțiile potrivite sunt descrise de către Roychoudhuiy și colab. (citat mai sus).

Fragmentul Klenow de DNA polimerază I s-a obținut dc la Bochringer Biochemicals, Indianopolis, Indiana.

Avantajele procedeului conform invenției constă în aceea că permite obținerea la scară industrială a hormonului de precreștere și creștere bovin, care sunt utili în medicina veterinară.

Claims

Revendicări

1. Procedeu de obținere a hormonului de precreștere sau creștere bovin cu ajutorul unui vector de transfer DNA, caracterizat prin aceea că, în scopul obținerii unei cantități mai mari dc hormon, se construiește un vector de transfer, conținând o secvență de deoxinucleotide care codifică hormonul de precreștere sau creștere bovin în capătul său C-terminal și o porțiune dintr-o proteină procariotă în capătul său N-terminal, prin reacția unei secvențe de deoxinucleotide, care codifică aminoacizii 1...191 al hormonului de precreștere sau creștere bovin, preparată prin scin32 darea CDNA, care codifică acest hormon, cu enzimă de restricție Hae II, incubarea produsului scindat cu o enzimă, aleasă dintre fragmentul Klenow al DNA polimerazei I, DNA polimeraza T4 și 3’ - 5’ exonuclează, în prezență de dATP, dGTP, dCTP sau d lT P și digerarea produsului incubat cu Si nuclează, cu o moleculă de DNA preparată prin scindarea plasmidei pBR322 în regiunea de control exprimabilă cu enzimă de restricție Pst I, se transformă un microorganism cu ajutorul vectorului obținut, se cultivă microorganismul transformat în condiții adecvate pentru exprimarea secvenței care codifică hormonul de precreștere sau creștere bovin și se purifică produsul obținut, prin metode în sine cunoscute.
2 Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că secvența de deoxinucleotide care codifică hormonul de precreștere bovin este:

5’ - ATG ATG GCT GCA GGC CCC CGG ACC TCC CTG CTC CTG GCT

TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG

CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG C1C IOC 1UC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT 5 GCC TTC TAG - 3’, în care A este deoxiadenil, G deoxiguanil, C - deoxicitasil și T - timidil.
3. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că secvența de deoxinucleotide care codifica hormonul de creștere bovin este:

5’ - TIC CCA GCC ATG TCC TTG TOC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG C1U GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCC GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA 20 ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGG AAG AATGAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG 25 TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG 30 CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCC CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTG TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG PAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC

CGC TTC GGG GAC GCC AGC TGT

GCC TTC TAG - 3’, în care A este deoxiadenil, G deoxiguanil, C - deoxicitoeil și T - timidil.
4. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că secvența de deoxinucleotide care codifică hormonul de creștere bovin este:
5’- GCC TTC CCA GCC ATG TCC
10 TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC

GCT GTG CTC GGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA 15 CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AATGAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GGC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG 35 TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC AAG - 3’, în care A este deoxiadenil, G - deoxiguanil, C - deoxidtosil și T - timidil