JPS63313586A - ＴＧＦ−α - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なＤＮＡ配列、より詳しくはＴＧＦ−α
〔トランスフォーミング　グロース　ファクター　タイ
プａ　（Ｔｒａｎｓｆｏｒ＋＋＋ｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ　ｔｙｐｅ　　α）　）をコードするＤＮ
Ａ配列、これを含むベクター、該ベクターを保有する宿
主細胞及びその培養によるＴＧＦ−αの製造法に関する
。

従来の技術及びその問題点 ＴＧＦ−αは、最初、サルコーマウィルスにより形質転
換されたラット細胞の培養上澄中に存在することが報告
された細胞生長因子であり（Ｇ。

Ｊ、Ｔｏｄａｒｏら、　　Ｎａｔｕｒｏ　、　　２６４
　、２６〜３１（１９７６））　、上皮細胞生長因子（
Ｅ　Ｇ　Ｆ）とは密接な関連を有する。

ＴＧＦ−αは、ＥＧＦリセプターに対して、ＥＧＦと競
合して結合することが知られており、またＤＮＡ合成促
進、軟寒天中でのコロニー形成促進、新生仔マウスにお
ける眼瞼開裂の促進等、ＥＧＦと共通の生物活性を有す
る（Ｇ、　　Ｊ。

ＴＯｄａｒＯら、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７７．５２５８〜５２６２　（１９８０）　、Ｍ、Ａ。

Ａ　ｎＺａｎｏら、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８０．６２６４〜６２６８　（１９８３）　、Ｊ、Ｐ。

Ｔａｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．６７３〜６７５
（１９８５）等参照）。一方、ＴＧＦ−αは、ＥＧＦよ
りも強い骨吸収活性、脈管形成活性等を有する点で、Ｅ
ＧＦとは区別される（Ｋ、　　Ｊ。

Ｉ　ｂｂｏｔｓｏｎ　ら、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２
２８．　１００７〜１００９　　（１９８５）　、Ａ、
Ｂ、５ｃｈｒｅｉｂｅｒら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３２．　１２５０〜１２５３（
１９８６））。

ＴＧＦ−αの構造としては、最初、サルコーマウィルス
により形質転換されたラット繊維芽細胞の培養上澄から
ラットＴＧＦ−αが精製単離され、その−次構造が決定
された（Ｈ，Ｍａｒｑｕａｒｄｔら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２３．　１０７９〜１０８２（
１９８４））。

次いで、ヒト遺伝子ライブラリーより、ヒトＴＧＦ−α
の前駆体の遺伝子が単離され、同時にそのｃＤＮＡもク
ローニングされたことにより、下記式〔１〕で表わされ
るアミノ酸配列から成るヒトＴＧＦ−αの一次構造がは
じめて明らかにされた（　Ｒ、Ｄ　ｅｒｙｎｃｋら、Ｃ
ｅ１ｌ　、３８，２８７〜２９７　（１９８４））。

Ｖａｔ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｃｕ　−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｃｙｓ　−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ　−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
（１）なおヒトＴＧＦ−αとラットＴＧＦ−αとは、各
々５０アミノ酸残基の内、わずか４残基が異なるのみで
あった。即ち、式〔１〕のヒトＴＧＦ−αに対して、ラ
ットＴＧＦ−αでは、７位Ａｓｐがｔｙｓに、１５位Ｐ
ｈｅがＴｙｒに、２８位ＡｓｐがＧｌｕに、４１位Ａｌ
ａがＶａｌに、それぞれ置換している。

ＴＧＦ−αは、特定の腫瘍細胞により産生される生長因
子ではあるが、本来その遺伝子は正常細胞に含まれてお
り、何らかの生理的な機能を有するものと考えられてい
る。事実、ヒト胎盤（Ｋ。

Ｓ　ｔｒｏｍｂｅｒｇら、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　
Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍ＋ｉｕｎ、、１０６，３５４〜３６１　　（１９
８２））、ラット胚（Ｌ０Ｍ９ＭａｔｒｉＳｉａｎら＊
　　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｉ＋ｉｕｎ、、　　
１０７．　７６１〜７６９　（１９８２））　、ヒトミ
ルク（Ｊ、Ａ。

Ｚ　ｗｉｅｂｅｌら、　　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、
　　４６．　９３３〜９３９　（１９８６）　）等から
ＴＧＦ−αが見出されたという報告があり、真の機能は
、未だ不明であるが、少くとも発生過程において、何ら
かの重要な役割をになっているものと推測される。

従って、ＴＧＦ−αはＥＧＦと同様に医薬として有用と
考えられ、またＴＧＦ−αの機能を明らかにすることは
、それ自体極めて有意義であり、更にその知見に基づい
ての医薬品等への応用開発が待望されている。

天然のＴＧＦ−αは極めて微量成分であるため、従来そ
の大量生産は不可能であった。試みとして、例えば化学
合成法（Ｊ、Ｐ、Ｔａｇら、Ｎａｔｕｒｅ　。

３０９．３７６〜３７８　（１９８４））　、及び遺伝
子組換え法として、ｃＤＮＡにｔｒｐプロモーター／オ
ペレーター及びｔｒｐΔＬＥ１４１３タンパクのアミノ
末端配列をコードするＤＮＡ配列を連結したものを組込
んだベクターを用いて大腸菌菌体内に融合タンパクとし
て産生させる方法〔ＲｏＤ　ｅｒｙｎｃｋら、Ｃｅ１ｌ
　、３８，２８７〜２９７（１９８４）、及びＭ、　Ｅ
、　Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１．１３８３８〜１３８４
３（１９８６））が提案されている。

しかしながら、ＴＧＦ−αは、ＥＧＦと同様、分子内に
３個のジスルフィド結合を有するポリペプチドであるた
め、通常の製造方法では分子内、分子間にランダムにジ
スルフィド結合が形成され、生物活性のある天然型分子
を得ることは難しい。

上記のいずれの方法においても、その障害は克服されて
おらず、複雑な工程を経て、天然型分子を得ることは不
可能ではないにしても、非常に困難であった。例えば、
上記のＲ、Ｄ　ｅｒｙｎｃｋら及びＭ。

Ｅ、Ｗｉｎｋｌｅｒらの一連の遺伝子工学的手法による
場合、菌体内から抽出したＴＧＦ−αは分子内及び分子
間にランダムなジスルフィド結合を有しており、−互譲
結合を還元的に開裂し次いでグルタチオンレドックスバ
ッファー中で再度分子内ジスルフィド結合を生成させ、
これをブロムシアン処理してｔｒｐΔＬＥタンパク部分
を除去し、更に精製するという極めて煩雑な工程を必要
とし、しかもその結果得られる天然型のＴＧＦ−αは、
わずかにその生成を確認できる程度の微量に過ぎない。

問題点を解決するための手段 本発明者は、上記従来技術の問題点を解消し、ＴＧＦ−
αを容易に、高純度で且つ大量に製造することのできる
遺伝子組換え技術を利用した製造方法を開発すべく鋭意
研究した。その結果、該製造方法のためのＴＧＦ−αを
コードする遺伝子として合成ＤＮＡ配列を用いるときに
は宿主細胞に応じた発現に好適なＤＮＡ配列にすること
ができること、ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列と、該アミノ酸配列のアミノ末端相当側にシ
グナルペプチドのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列とが連結されている組換えＤＮＡ
配列を用い、これをベクターに組み込み、形質転換し、
発現させるときには目的のＴＧＦ−αが分泌発現される
のみならず、得られるＴＧＦ−αが生物活性のある天然
型の分子となること、従って従来方法に比して著しく簡
易な工程で高純度且つ大量の天然型ＴＧＦ−αを収得し
得ることを見い出し、これに基づき本発明を完成するに
至った。

即ち本発明は、 ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列
、 ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と、
該アミノ酸配列のアミノ末端相当側にシグナルペプチド
のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ配列とが連結されていることを特徴とする組換えＤＮ
Ａ配列、 該組換えＤＮＡ配列を含むベクター、 該ベクターを保有する宿主細胞、並びに、該宿主細胞を
培養してＴＧＦ−αを製造、採取することを特徴とする
ＴＧＦ−αの製造法に係る。

本発明において目的とするＴＧＦ−αは、好ましくは前
記式［１〕のアミノ酸配列で表わされるヒトＴＧＦ−α
であるが、これに限定されるものではなく、ラットＴＧ
Ｆ−α等も包含する。

前記式〔１〕及び以下の本明細書におけるアミノ酸配列
及び各アミノ酸の略号による表示並びにＤＮＡ配列及び
核酸塩基、その他の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢの規定乃至当該分野における慣用記号に従うもので
あり、その例を次に挙げる。

Ａｌａ・・・アラニン　　　Ａｒｇ・・・アルギニンＡ
ｓｎ・・・アスパラギン　Ａｓｐ・・・アスパラギン酸
Ｃｙｓ・・・システィン　　Ｇｉｎ・・・グルタミンＧ
ｌｕ・・・グルタミン酸　Ｇｌｙ・・・グリシンＨｉｓ
・・・ヒスチジン　　Ｉｌｅ・・・イソロイシンＬｅｕ
・・・ロイシン　　　Ｌｙｓ・・・リジンＭｅｔ・・・
メチオニン　　Ｐｈｅ・・・フェニルアラニンＰｒｏ・
・・プロリン　　　Ｓｅｔ・・・セリンＴｈｒ・・・ス
レオニン　　Ｔｒｐ・・・トリプトファンＴｙｒ・・・
チロシン　　　Ｖａｌ・・・バリンＡ・・・・・・アデ
ニン　　　Ｔ・・・・・・チミンＧ・・・・・・グアニ
ン　　　Ｃ・・・・・・シトシンまた、本明細書に記載
のポリペプチドにおけるアミノ酸番号は、前記式〔１〕
に示す通り、ＴＧＦ−αのアミノ末端（Ｎ末端）のＶａ
ｔを１として表示するものである。

以下、本発明のＴＧＦ−αの製造技術につき、ＴＧＦ−
αアミノ酸配列をコードする遺伝子たる合成ＤＮＡ配列
及びＴＧＦ−αアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とが連結され
たＤＮＡ配列の設計、造成、これらのＤＮＡ配列を保有
させたベクターの構築、該ベクターによる宿主細胞の形
質転換及び該形質転換細胞の培養を順次説明する。

本発明の第１のＤＮＡ配列であるＴＧＦ−αのアミノ酸
配列をコードする合成ＤＮＡ配列について述べる。合成
ＤＮＡ配列を用いることにより、使用する宿主細胞に応
じて、該細胞により実際に発現でき、しかも高い効率で
発現できるＤＮＡ配列を任意に設計できるという大きな
利点が得られる。

上記合成ＤＮＡ配列であるＴＧＦ−αのアミノ酸配列を
コードする遺伝子としては、例えば前記式〔１〕で表わ
されるヒトＴＧＦ−αのアミノ酸配列に基づいて種々の
ＤＮＡ配列を設定することができる。即ち、ヒトＴＧＦ
−αを構成する前記式〔１〕で表わされる５０個の各ア
ミノ酸に対応する２乃至６通りのコドンの中から任意の
コドンを選択し、之等を組合せることにより設計できる
。

但し、この設計される配列中には、例えば転写終結信号
等の不都合な配列が生じることがあってはならない。　
上記ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードする遺伝子の好
ましい一見体例を、下記式％式％ 上記式〔２〕のＤＮＡ配列を、そのアミノ酸配列と対応
させ、相補二本鎖ＤＮＡ配列として下記式〔３〕に示す
。

Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＡＧ
Ｔ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＡＣＧＡＴ　ＴＧＴ　ＣＣＧ　Ｇ
ＡＴ−ＣＡＣＣＡＣＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　
ＣＴＡ　ＡＣＡ　ＧＧＣＣＴＡ−８ｅｒ−Ｈｉ　５−Ｔ
ｈｒ−Ｇ　１　ｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉ　ｓ
−Ｇ　１　ｙ−Ｔｈｒ−ＡＧＣＣＡＴ　ＡＣＣＣＡＧ　
ＴＴＴ　ＴＧＣＴＴＴ　ＣＡＣＧＧＣＡＣＣ−ＴＣＧ　
ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＴＣＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＡＡ　ＧＴ
Ｇ　ＣＣＧ　ＴＧＧ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
ＴＧＣＣＧＣＴＴｒ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ
　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣＧ−ＡＣＧ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　
ＧＡＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴｒＴ　ＧＧＣ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＧＣＴ　ＴＧＣＧＴＧ
　ＴＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＧＴ
−ＣＧＡ　ＡＣＧ　ＣＡＣＡＣＧ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　Ｃ
ＣＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣＣＣＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ
−Ｇｌｕ−Ｈｌｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
ＡｌａＧＣＣＣＧＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　
ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＧＣＧＧ　ＧＣＧ　ＡＣ
Ａ　ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＧＡＣＣ
ＧＣ〔３〕 上記式〔２〕又は〔３〕で表わされるＤＮＡ配列は、遺
伝子工学的手法によりＴＧＦ−αを発現させるのに好適
なものとして、本発明者が多くの実験の末に見出したも
のであり、全く新規なＤＮＡ配列である。

また、上記式〔２〕又は〔３〕のＤＮＡ配列は、宿主細
胞として大腸菌を利用することを考慮して、大腸菌によ
る使用頻度の高いコドンを優先的に選択、組合せて設計
された具体例であるが、大腸菌を利用する場合でも該大
腸菌による使用頻度の高い他のコドンを利用することも
でき、かくして得られる配列もまた本発明の合成ＤＮＡ
配列に包含される。

更に、本発明に利用される宿主細胞は、後述するように
大腸菌に限定されるものではなく、従って利用する宿主
細胞に応じて、該細胞による使用頻度の高い他のコドン
を選択、組合せることによっても、本発明の合成ＤＮＡ
配列であるＴＧＦ−αアミノ酸配列をコードする遺伝子
を構築することができる。

上記の如き本発明の合成ＤＮＡ配列であるＴＧＦ−αア
ミノ酸配列をコードする遺伝子は、その設計された配列
に従って、例えば市販のＤＮＡ合成機等を利用して、通
常の方法に従い、容易に化学合成することができる。該
方法としては、例えば固相リン酸トリエステル法［Ｎａ
ｔｕｒｅ　、　　３１０゜１０５　（１９８４））等を
例示できる。また、得られるＤＮＡ配列は、例えば高速
液体クロマトグラフィー等の常法により単離精製でき、
精製されたＤＮＡ配列の確認は、例えばホモクロマトグ
ラフィーによる二次展開法［Ｅ、　　Ｊａｙ、　Ｒ，Ａ
。

Ｂａｍｂａｒａ、　Ｒ，Ｐａｄａ＋ａｎｂｈａｎ　ａｎ
ｄ　Ｒ，Ｗｕ　。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、１．　３
３１　（１９７４）〕や〕マキサムーギルバート法Ａ、
　Ｍ、　Ｍａｘａ■ａｎｄ　　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、ヱ迭、５６０　（１９７７）；Ａ、Ｍ。

Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙａ＋ｏ１．、Ｖｏｌ、６５．
　ｐｐ４９９．　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ（１９８０））
等により、それぞれ行なうことができる。

上記化学合成に当たっては、設計されたＤＮＡ配列及び
これと相補的なＤＮＡ配列を、それぞれ数本の一本鎖Ｄ
ＮＡ断片として別々に合成した後、之等を連結させて所
望の二本鎖ＤＮＡを製造するのが有利である。更に上記
二本鎖ＤＮＡの合成においては、得られるＤＮＡ鎖の両
末端部がそれぞれ適当な制限酵素により切断された結果
生じる配列（制限酵素認識部位）を有するものとするの
が好ましい。

かかる適当な制限酵素認識部位を有するＴＧＦ−αアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子の一具体例としては、下記
式〔４〕に示す配列を例示できる。

ＣＡＣＣＡＣＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＣＴＡ
　ＡＣＡ　ＧＧＣＣＴＡ−ＡＧＣＣＡＴ　ＡＣＣＣＡＧ
　ＴＴＴ　ＴＧＣＴＴｒ　ＣＡＣＧＧＣＡＣＣ−ＴＣＧ
　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＴＣＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＡＡ　Ｇ
ＴＧ　ＣＣＧ　ＴＧＧ−ＴＧＣＣＧＣＴＴＴ　ＣＴＧ　
ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣＧ−Ａ
ＣＧ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＧＡＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴ　Ｃ
ＴＡ　ＴＴＴ　ＧＧＣ−ＧＣＴ　ＴＧＣＧＴＧ　ＴＧＣ
ＣＡＣＡＧＣＧＧＴ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＧＴ−ＣＧＡ
　ＡＣＧ　ＣＡＣＡＣＧ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＣＣＡ　Ａ
ＴＡ　ＣＡＣＣＣＡ−ＧＣＣＣＧＣＴＧＴ　ＧＡＡ　Ｃ
ＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＧ−ＣＧ
Ｇ　ＧＣＧ　ＡＣＡ　ＣＴｒ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＡ
　ＧＡＣＧＡＣＣＧＣ−尚、上記式〔４〕では、制限酵
素認識部位としてＥｃｏＲＩ及び５ａｌＩ認識部位が示
されているが、本発明におけるＴＧＦ−αアミノ酸配列
をコードする遺伝子に付与されるべき制限酵素認識部位
は之等に限定されるものではな（、従来公知の各種のも
のを適宜選択使用することができる。

上記式〔４〕の二本鎖ＤＮＡ配列は、例えば下記第１表
に示す各一本鎖ＤＮＡ断片をまず合成し、次いで之等を
適当に連結させることにより製造できる。

第　　１　　表 上記式〔４〕で示される如きＴＧＦ−αの遺伝子を含む
二本鎖ＤＮＡ配列の製造は、通常の方法、例えば特開昭
６１−１５６９１号公報に記載の方法に従って行なうこ
とができる。その具体例としての上記式〔４〕のＤＮＡ
配列の製造の概略を第１図に示し、またその詳細を後記
実施例に示す。

ＴＧＦ−αの遺伝子を含む、ベクターの具体例としては
、後記実施例に詳述する方法により得られるｐＴＧＦＡ
ｌを例示できる。該ベクターｐＴＧＦＡＩは、大きさ約
３．９キロベースペアーズ（ｋｂ）のプラスミドであり
、前記式〔４〕に示した本発明のＴＧＦ−α遺伝子と共
にアンピシリン耐性遺伝子を保有している。該ベクター
ｐＴＧＦＡ１を保有する大腸菌ＨＢ　１０１株は、微工
研に「微工研条寄第１３５４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−Ｉ
３５４）Ｊとして寄託されている。

本発明の第２のＤＮＡ配列であるＴＧＦ−αのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列とシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列とが連結されたＤＮＡ配列について、
以下に述べる。

本発明の第２のＤＮＡ配列は、ＴＧＦ−αのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列と、該アミノ酸配列のアミノ
末端相当側にシグナルペプチドのアミノ酸配列を有する
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とが連結されてい
る組換えＤＮＡ配列である。

本発明の第２のＤＮＡ配列におけるＴＧＦ−αのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列としては、特に限定はな
く１、例えばｃＤＮＡを用いることもできるが、本発明
の第１のＤＮＡ配列である合成ＤＮＡ配列を用いるのが
好適である。

即ち、本発明の第２のＤＮＡ配列の好ましいものとして
、前記式〔３〕で代表される合成ＤＮＡ配列と、シグナ
ルペプチドのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列とが連結されたものを挙げることがで
きる。

ここでシグナルペプチドとは、各種の分泌性蛋白等の前
駆体のアミノ末端に存在する士数個乃至数十個の疎水性
に富んだアミノ酸配列である。これは上記前駆体を細胞
の細胞質内から膜外に導き出す作用を奏し、またそれ自
体は前駆体より切離され、かくして該シグナルペプチド
の作用によって分泌性蛋白等が分泌発現される。

特に、本願発明においては、シグナルペプチドを利用す
ることにより、従来の遺伝子組換え法或いは化学合成法
による製造が極めて困難であった多数のジスルフィド結
合がすべて正しく形成された生物活性のある天然型ＴＧ
Ｆ−αを得ることができるという大きな利点が得られる
。β−ウロガストロンについて、同様の利点が見出ださ
れているが〔大貝秀雄、バイオインダストリー、３゜８
７５〜８８３　（１９８６））　、ＴＧＦ−αについて
実際にかかる利点が見出だされたのは今回が始めてであ
る。

本発明に利用されるシグナルペプチドは、上記バイオイ
ンダストリーや特開昭６１− １４９０８９号に記載のものと同一であってもよく、ま
た之等と異なるものであってもよい。その具体例として
は、例えば大腸菌β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、リン酸
結合蛋白（ｐｓｔＳ又はｐｈｏＳ）、アルカリフォスフ
ァターゼ（ｐｈｏＡ）　、動物のＩＬ−２、成長ホルモ
ン、プロインシュリン等の前駆体蛋白のそれぞれのシグ
ナルペプチドを例示できる。

２等シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、化学
合成することもできるし、天然のＤＮＡ配列を利用する
こともできる。上記シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含むベクターの具体例としては、ｐＫＴＮを例
示できる。

ｐＫＴＮは、ｂｌａシグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含むベクターであり、その詳細は後記実施例２
に示しである。また該ｐＫＴＮを保有する大腸菌７Ｍ１
０３株は、ｒ　Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　、
ＪＭ−１０３，ｐＫＴＮ−２−２Ｊ　なる表示で、微工
研菌寄第９１４６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１４６）とし
て寄託されている。

本発明の第２のＤＮＡ配列としては、ＴＧＦ−αアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列とシグナルペプチドのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とが直接連結されて
いることが、目的のＴＧＦ−α自体が分泌発現される点
から好ましい。かかる本発明ＤＮＡ配列の具体例として
は、下記式〔５〕で表わされるものを例示できる。該式
〔５〕のアミノ酸配列は、ｂｌａシグナルペプチドとＴ
ＧＦ−αとが直結された融合ポリペプチド配列であり、
同ＤＮＡ配列は該融合ポリペプチドをコードする配列の
一例である。尚、式中には、シグナルペプチドとＴＧＦ
−αとの連結位置を矢印で示した。

Ｍｅｔ−８ｅｒ−１１ｅ−Ｇ　１　ｎ−Ｈｌ　ｓ−Ｐｈ
ｅ−Ａｒｇ−Ｖａ　Ｉ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌｅｕ−ＡＴＧ　
ＡＧＴ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＴＣＣＧＴ　ＧＴ
ＣＧＣＣＣＴＴ−ＴＡＣＴＣＡ　ＴＡＡ　ＧＴＴ　ＧＴ
Ａ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＧＡＡ−１１ｅ
−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａ　１　ａ−Ａ　ｌ　ａ−
Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ＡＴＴ　ＣＣＣＴＴ
Ｔ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣＴＴＴ　ＴＧＣＣＴＴ　Ｃ
ＣＴ−ＴＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＣＧＣＣＧＧ
　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧＡ−ＧＴＣＴＴＣＧＣ
ＣＧＴＧ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＡＣＧＡ
Ｔ−ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＧＧ　ＣＡＣＣＡＣＴＣＡ　Ｇ
ＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＣＴＡ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｐ−３ｅｒ−１１ｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙ
ｓ−Ｐｈｅ−ＴＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＡＧＣＣＡＴ　
ＡＣＣＣＡＧ　ＴＴＴ　ＴＧＣＴＴＴ−ＡＣＡ　ＧＧＣ
ＣＴＡ　ＴＣＧ　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＴＣＡＡＡ　ＡＣ
Ｇ　ＡＡＡ−１１ｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ｐｈｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−ＣＡＣ
ＧＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　Ｃ
ＡＧ　ＧＡＡ−ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＧＣ
Ｇ　ＡＡＡ　ＧＡＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ
−８ｅｒ−Ｇｌｙ−ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　
ＴＧＣＧＴＧ　ＴＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＴ−ＣＴＡ　ｍ
　ＧＧＣＣＧＡ　ＡＣＧ　ＣＡＣＡＣＧ　ＧＴＧ　ＴＣ
Ｇ　ＣＣＡ−ＧＡＣＧＡＣＣＧＣＡＴｒ　　　　　　　
　　　（５）本発明ＤＮＡ配列は、これを遺伝子組換え
技術に利用するためには、その５′末端に開始コドン（
ＡＴＧ等）を、また３′末端に終止コドン（ＴＡＡ、Ｔ
ＡＧまたはＴＧＡ）を有している必要があり、かかる開
始コドン及び終止コドンを有するＤＮＡ配列（以下これ
を「構造遺伝子」という）もまた、本発明に包含される
。本発明の構造遺伝子には、開始コドンに始まり、上述
したＴＧＦ−αとシグナルペプチドとの融合ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を経て、終止コドンで終わる
一本鎖ＤＮＡ配列、これと相補的な一本鎖ＤＮＡ配列及
び之等からなる二本鎖ＤＮＡ配列が含まれる。

上記式〔５〕に示したＤＮＡ配列は、シグナルペプチド
のアミノ末端Ｍｅｔに対応する開始コドン（ＡＴＧ）及
びＴＧＦ−αのカルボキシ末端Ａｌａのコドンの直後に
終止コドン（ＴＡＡ）を有しており、本発明構造遺伝子
の好ましい具体例である。

かかる本発明構造遺伝子は、その全配列を前記した化学
合成により製造することもでき、一部のＤＮＡ配列とし
て天然のＤＮＡ断片を利用し、これと合成ＤＮＡ断片と
を連結させて製造することもできる。この連結操作は常
法、例えば各種制限酵素による切断処理、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ処理等によることができる。

本発明構造遺伝子は、これを適当なベクターに挿入させ
て、本発明ベクターを構築される。

上記ベクターの構築は、この種遺伝子組換え技術におけ
る通常の方法に従うことができる。これには各種制限酵
素による切断処理、上記Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いた
上記連結処理、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法等による単離、精製、フェノー
ル抽出法による回収、精製等が包含される。また得られ
るベクターの確認も常法に従い、例えばそのＤＮＡ配列
を直接マキサム−ギルバート法（Ａ０Ｍ０Ｍａｘａｍａ
ｎｄ　　Ｗ、　　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４，５６０　（１９７７））で解析するか、
ミニプレバレージョンやマツピング法により遺伝子の挿
入やその方向を確認する方法［ＨｏＣ。

Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、７゜１５１３〜１５２３　
（１９７９））等によることができる。

上記本発明ベクターの構築のために利用される起源ベク
ターは、特に制限がなく、従来公知の種々のものでよく
、これには例えばバクテリオファージ及び動植物ウィル
スを含む各種ウィルスベクター、各種プラスミド、コス
ミド等が包含される。

之等のうちでは、ｐＢＲ３２２又はこれに由来する各種
のプラスミドベクターが好適である。更に本発明構造遺
伝子は、これに対応するＲＮＡ配列として、ＲＮＡ遺伝
子からなる適当なベクターに保有させることもできる。

本発明構造遺伝子を保有するベクターの具体例としては
、後記実施例に詳述する方法により得られるｐＴＧＦＡ
２を例示できる。該ベクターｐＴＧＦＡ２は、大きさ約
４．２キロベースペアーズ（ｋｂ）のプラスミドであり
、前記式〔５〕に示した本発明の構造遺伝子と共にテト
ラサイクリン耐性遺伝子を保有している。該ベクターｐ
ＴＧＦＡ２を保有する大腸菌ＪＭ１０３株は、微工研に
「微工研条寄第１３５５号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１３５
５）Ｊとして寄託されている。また同じく、該ベクター
ｐＴＧＦＡ２を保有する大腸菌Ｈ８１０１株は、微工研
に「微工研条寄第１３８７号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１３
８７）Ｊとして寄託されている。

本発明の構造遺伝子を保有させたベクターは、これが宿
主細胞内に導入されて目的とするＴＧＦ−αを発現する
ためには、本発明構造遺伝子の他に、その発現に必要な
各種の遺伝情報、例えばプロモーター、転写終結信号、
ポリＡ鎖付加信号（真核細胞を宿主細胞とする場合）等
の転写のための情報やりボゾーム結合部位（シャイン・
ダルガルノー配列、ＳＤ配列）等の翻訳のための情報等
が必要である。かかる遺伝情報は宿主細胞に応じてそれ
ぞれよく知られており、例えばプロモーターとしては、
大腸菌に対するｔｒｐプロモーター、ｌａｅプロモータ
ー、ｒｙｅプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｉｐｐ
プロモーター、ｔａｃプロモーター等、枯草菌に対する
５ＰＯＩプロモーター、５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎ
プロモーター等、酵母その他の真核細胞に対するＰＨ０
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、５ｖ４０由来プロモーター
等を例示できる。之等の遺伝情報は、本発明ベクターの
構築に当たって、之等を含むプラスミドを選択して起源
ベクターとすることにより、又は之等を含むプラスミド
から常法に従い単離するか、化学合成した後、適当なベ
クターに組込むことにより、それぞれ本発明ベクターに
存在させることができ、かくして所望のＴＧＦ−α発現
ベクターを得ることができる。

か（して得られるＴＧＦ−α発現ベクターは、本発明の
構造遺伝子の上流にプロモーター及びリボゾーム結合部
位を、また下流に転写終結信号を各々連結されてなるＴ
ＧＦ−α発現情報単位の少なくともひとつを保有するも
のであり、適当な宿主細胞内に導入して該細胞を形質転
換させることによって、該細胞に目的とするＴＧＦ−α
を生産、蓄積させることができる。本発明は、かかるＴ
ＧＦ−α発現ベクターをも提供するものである。

上記ＴＧＦ−α発現情報単位の一個を有する本発明発現
ベクターの具体例としては、前記のｐＴＧＦＡ２を例示
できるＪ ｐＴＧＦＡ２は、前記式〔５〕で表わされる本発明構造
遺伝子の上流に、ｔａｃプロモーター及びＩａｅ　Ｚ遺
伝子のりボゾーム結合部位を有する。また該構造遺伝子
の下流にｂｌａ遺伝子の転写終結信号を有する。更にこ
れはテトラサイクリン耐性遺伝子をも有している。

また、本発明のＴＧＦ−α発現ベクターは、該ベクター
内は、上記ＴＧＦ−α発現情報単位の複数個を有するも
のであってもよく、かかる複数個のＴＧＦ−α発現情報
単位を保持させたベクターによれば、ＴＧＦ−αの生産
性を高め得る場合がある。

上記の如くして得られる本発明のＴＧＦ−α発現ベクタ
ーは、これを適当な宿主細胞に導入（形質転換）させる
ことにより、該宿主細胞に本発明のＴＧＦ−α産生能を
付与することができる。ここで用いられる宿主細胞とし
ては、特に限定はなく、公知の各種のもの、例えば大腸
菌等のダラム陰性細菌、枯草菌等のグラム陽性細菌、放
線菌、酵母、動植物細胞等のいずれでもよいが、特に大
腸菌に１２株由来のＨ８１０１株（Ｈ，Ｗ。

Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　　Ｄ、　　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄ
ｕｓｓｏｉｘ、、Ｊ、　　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　４１．４５９〜４７２　（１９６９）　
）及びＪＭ１０３株（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａ
ｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、９．３
０９　（１９８１））は好ましい。

上記宿主細胞への本発明ベクター乃至本発明ＴＧＦ−α
発現ベクターの導入及びこれによる形質転換の方法とし
ては、一般に用いられている方法、例えば宿主細胞を低
温で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理し、該溶液中
にベクターを添加する方法（Ｅ、　　Ｌｅｄｅｒｂｅｒ
ｇ　　ａｎｄ　Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１１９．１０７２　（１９７４
）　）等を例示できる。

上記のようにして、本発明ベクター乃至本発明発現ベク
ターの導入により形質転換した細胞を収得することがで
き、本発明は、かかる形質転換された宿主細胞をも提供
するものである。

本発明のＴＧＦ−α発現ベクターにより形質転換された
細胞は、通常の細胞を培養するために用いられる適当な
培地を用いて培養することができ、該培養により所望の
ＴＧＦ−αが生産、蓄積される。上記培養に利用できる
培地としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地、Ｍ６
３培地等の各種の培地を好ましく例示することができる
。また之等の培地には、更に通常知られている各種の炭
素源、窒素源、無機塩、ビタミン類、天然物抽出物、生
理活性物質等を添加することもでき、かかる培地も好ま
しく利用できる。培養は、前記宿主細胞の生育に適した
ｐＨ，温度、通気、攪拌等の条件を採用した各種の方法
により実施できる。例えば大腸菌の場合には、ｐＨ約５
〜８の範囲、特にｐＨ７が適当であり、約２０〜４３℃
の温度で、通気攪拌条件で培養するのが望ましく、培養
のスケールには特に限定はない。更に目的とするＴＧＦ
−αの発現量乃至分泌量を高めるため、また菌体外への
目的蛋白の排出を促進乃至抑制する目的等に応じて、上
記培地組成や培養条件等は適宜変更設定することもでき
る。

上記培養により、シグナルペプチドとＴＧＦ−αとの融
合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有させた本
発明の発現ベクターで形質転換した細胞では、細胞質内
で融合ポリペプチドが生産され、続いて細胞外又はペリ
プラズムに目的のＴＧＦ−αが成熟ポリペプチドの形で
分泌蓄積される。即ち、まずベクター中の融合ポリペプ
チドをコードする遺伝子から、ベクター中の転写調節因
子並びに宿主細胞中の諸刃子の作用でｍＲＮＡが生産さ
れる。次いで、該ｍＲＮＡから翻訳調節因子並びに宿主
細胞中の諸々因子の作用で融合ポリペプチドが生産され
る。更にここで生産されるポリペプチドは、シグナルペ
プチドの作用により、細胞外又はペリプラズムに分泌さ
れ、同時にシグナルペプチダーゼの作用により、該ポリ
ペプチドからシグナルペプチドが切り離されるのである
。

その結果、シグナルペプチドも、また他の如何なる不要
なアミノ酸配列をも含まないＴＧＦ−αが細胞外又はペ
リプラズムに分泌、蓄積される。しかも、このＴＧＦ−
αは、実施例に示されるように天然型と同様の生物活性
を有しており、従って天然型の正しいアミノ酸配列及び
正しいジスルフィド結合を有するものである。

かくして、宿主細胞のペリプラズム等の内部又は培養上
澄等に蓄積されたＴＧＦ−αは、これを常法に従い分離
することができ、また精製することができる。この分離
、精製操作は、例えば培養上澄、浸透圧ショック法によ
り調製したペリプラズム画分等につき、ゲル濾過、吸着
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー等を適宜組合せる方法によ
り実施することができる。

かくして、本発明によれば、遺伝子組換え技術により、
天然型ＴＧＦ−αを好適に製造できる。

得られるＴＧＦ−αの確認は、例えば各種の細胞表面に
存在するＥＧＦリセプターに、ＴＧＦ−αが結合するこ
とを利用したラジオリセプターアツセイ（ＲＲＡ）等の
手法によることができる。

また、本発明方法によって得られるＴＧＦ−αが高純度
に精製されていることは、例えば、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）により単一ピークになること、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で単一バ
ンドになること等を指標として容易に確認することがで
きる。該高純度精製ＴＧＦ−αの同定は、また通常のポ
リペプチド乃至蛋白質の構造解析手段と同様の手段、例
えば５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量分析、等電点電気泳
動による等電点測定、アミノ酸分析機によるアミノ酸組
成の測定、アミノ酸シークエンサーによるアミノ酸配列
の解析等により、実施することができる。

更に、得られたＴＧＦ−αの生物活性は、例えば以下の
方法により確認することができる。

■　細胞増殖促進活性 ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３等の培養細胞又は成熟ラット肝細胞
等の初代培養細胞等を、低血清条件下にＴＧＦ−α又は
対照としてのβ−ウロガストロン等を添加して培養し、
培養液中に標識されたチミジン−５′−三リン酸等を加
えることにより、新たに合成されたＤＮＡ中に取込まれ
るラジオアイソトープの量を測定する。このラジオアイ
ソトープ量に比例して、新たなＤＮＡ合成が行なわれた
こと、即ち細胞の増殖が促進されたことが判る。

■　軟寒天上コロニー形成活性 ＮＲＫ４９Ｆ　（ラット腎繊維芽細胞）等の細胞は軟寒
天培地中では、殆んど増殖しないが、ＴＧＦ−β（トラ
ンスフォーミングクロースファクタータイプβ）の存在
下に、ＴＧＦ−α又はＥＧＦが共存すると増殖してコロ
ニーを形成する（Ｊ、Ｅ、Ｄｅ　Ｌａｒｃｏ　ａｎｄＧ
、　　Ｊ。

Ｔａｄａｒｏ　、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ。

７５．４００１〜４００５　　（１９７８）　、Ａ。

Ｂ　、　　Ｒｏｂｅｒｔｓら、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、７７．３４９４〜３
４９８　（１９８０））。

■　新生仔マウス眼瞼開裂及び切歯萌出促進活性新生仔
マウスに、ＴＧＦ−α又はβ−ウロガストロン等を２４
時間毎に皮下注射し、各被検動物の眼瞼が開裂する日及
び切歯の出現する日を記録する。ＴＧＦ−α、β−ウロ
ガストロン等は、之等に要する日数を短縮できることが
知られている（Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏ
ｌ　、　Ｃｈｅｗ、。

２３７．１５５５〜１５６２　（１９６２）　、Ｊ。

Ｐ、　Ｔａｌ１．５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９．６７３〜
６７５（１９８５））。

以上に述べたＴＧＦ−αの製造方法は、式〔１〕のアミ
ノ酸配列のヒトＴＧＦ−αを例として述べたものである
が、同様にして、他種動物のＴＧＦ−αの製造のために
も適用することができる。何故なら各種動物由来のＴＧ
Ｆ−αの構造は極めて相同性が高く、生物学的活性のみ
ならず、物理化学的性質も殆んど同様であるとみなし得
るからである。例えば前述の通り、ラットＴＧＦ−αと
ヒトＴＧＦ−αとは、僅かに４個のアミノ酸残基が異な
るのみである。

発明の効果 本発明により、次の様な格別顕著な効果が得られる。

（１）遺伝子組換え技術を用いたＴＧＦ−αの製造方法
のためのＴＧＦ−αをコードする遺伝子として合成ＤＮ
Ａ配列を用いることにより、宿主細胞に応じた発現に好
適なＤＮＡ配列にすることができる。

（２）ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列と、該アミノ酸配列のアミノ末端相当側にシグナルペ
プチドのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ配列とが連結されている組換えＤＮＡ配列を用
い、これをベクターに組み込み、形質転換し、発現させ
ることにより、目的のＴＧＦ−αが分泌発現されるのみ
ならず得られるＴＧＦ−αが生物活性のある天然型の分
子となる。

（３）従って、従来方法に比して著しく簡易な工程で高
純変且つ大量の天然型ＴＧＦ−αを収得し得る。

実　　施　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実・施例を挙げ
る。尚、各側において用いられる各方法及び操作は、特
に明記しない限り、以下の通り行なわれたものとする。

１、制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡの水溶液（又は緩衝液溶液）或いは粉末に、下記
第２表に示す各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次いで
制限酵素を加え、３７℃の水浴中で３時間静置して反応
させる。制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡＩμｇに対
して１ユニツトであり、最終液量は１０μＱ以上となる
ようにする。

第　　２　　表 ２、フェノール抽出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なった。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フェノール（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液をフェ
ノールに飽和させたもの）を加えて充分混和した後、同
じく半量のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで遠
心分離してＤＮＡの含まれる緩衝液層を取る。更に０．
１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）と２
倍量の冷エタノールとを加えて混和して、−２０℃で１
時間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収することによ
りフェノールを完全に除去する。

３、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ断片の結合（環状
化）操作 ６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，５）　、６．６ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイト−ル及び１ｍＭ
　　ＡＴＰに０．０１％の牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　
Ａ）を添加した水溶液中で、ＤＮＡ断片と、その１μｇ
当り３ユニツトとなる量のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
社製）とを、１２℃で５時間以上反応させることにより
ＤＮＡを結合（環状化）させる。

４、ＤＮＡ修飾酵素の使用方法 （１）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるＤＮＡ５’
端のリン酸化 １〜１０μｇのＤＮＡを、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）５０μＱに溶かし、
これにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５ユニットを加え
、３７℃で３０分間反応させ、次いで加熱処理により酵
素を失活させる。

（２）ＳｌヌクレアーゼによるＤＮＡのプラントエンド
化 ＤＮＡ１μｇにつき、６ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｍＭ
塩化ナトリウ及び１ｍＭ硫酸亜鉛を含む緩衝液（ｐＨ４
，５）１００μ２を用いて、上記ＤＮＡの緩衝液溶液を
作成し、これに２０００ユニツトの８１ヌクレアーゼ（
ＢＲＬ社製）を加えて２０℃で３０分間反応させ、反応
終了後、フェノール抽出を行ない酵素を完全に失活させ
る。

５、形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株
又はＪＭ１０３株を用いる。

宿主細胞株を、ＬＢ培地（１％バクトドリプトン、０．
５％バクトイ−ストエキス、０．５％塩化ナトリウム）
で、３７℃下、６１０ｎｍの吸光度が０．２５になるま
で増殖させる。この培養液４０１１Ｑを遠心分離（６０
００回転／分×１０分）して菌体を回収し、次いで水冷
する。これを０．１Ｍ塩化マグネシウム２０或で洗浄し
、続いて水冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５
Ｍ塩化マグネシウム溶液２０＋１１Ｑに懸濁させ、１時
間氷冷する。遠心分離（６０００回転／分Ｘ１０分）後
、菌体を氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５
Ｍ塩化マグネシウム溶液２＋１１Ｑに再懸濁させる。こ
の懸濁液０．　２１１ｉ２に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させたＤＮＡ断片の反応組成液０．０１ｍ２を
加え、１時間氷冷する。次いで４２．５℃の水浴で９０
秒間加温し、ＬＢ培地２、８１１Ｑを加え、これを３７
℃の水浴中で１時間静置する。

次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選択
する。即ち、１．５％寒天を含むＬＢ培地にアンピシリ
ン５０μｇ／威又はテトラサイクリン２０μｇ／ｍ１２
を添加して調製した平板培地に、上記で得た反応組成液
の溶液各０．３或ずつを拡げ、これを３７℃で一晩培養
し、生育する大腸菌コロニーを分離する。

６、プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５０μｇ／
ＷＱ又はテトラサイクリン２０μｇ／ｍＱを添加したＬ
Ｂ培地５００ｍＱで、６１０止での吸光度が約０．６に
なるまで３７℃で振盪培養する。

次いでクロラムフェニコール８０ｍｇを加え、３７℃で
１２〜１６時間振盪培養する。これを遠心分離（６００
０回転／分ＸＩＯ分）して菌体を集め、０．８５％塩化
ナトリウム水溶液で洗浄する。菌体を２０％蔗糖を含む
５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液２．　５１１
９に懸濁させ、次に１％リゾチームを含む０．２５Ｍ）
リス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液０．５１１Ｑを加え、１
０分間氷冷する。更に０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ
８，０）１或を加え、１０分間水冷する。次に６　ｍ　
Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ８，０）　、６０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ及び０．１％トリトンＸ−１００の溶液４＋１１１２
を加える。

これを超遠心（２５０００回転／分Ｘ９０分）して上清
を採取する。この上清８．　２１Ｔｌ１２に塩化セシラ
ム９．０ｇを加えて溶かし、次いで１％エチジウムブロ
マイド溶液０．８１１１１２を加える。これを遠心分離
（２０００回転／分Ｘ１０分）して浮遊物を除き、溶液
を超遠心（５００００回転／分Ｘ１５時間）する。次い
で紫外線照射により螢光を発するプラスミド部分を分離
する。これを５Ｍ塩化ナトリウム溶液で飽和したイソプ
ロパツールで５〜６回抽出してこれからエチジウムブロ
マイドを除去する。最後に１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１
０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，０）緩衝液に対して透析し
て塩化セシウムを除去する。

７、アガロースゲル電気泳動 シュライフ（Ｓ　ｃｈｌｅｉｆ）とウエンシンク（Ｗｃ
ｎｓｉｎｋ）の手引書〔“Ｐ　ｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂ　ｉｏ
ｌｏｇｙ”　（１９８１）。

Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖ　ｅｒｌａｇ社、ｐｐＨ４〜
１２５）に記載の方法に従って、アガロースゲル電気泳
動及び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう。

泳動用電源としては、アトー社製コンスターパワー５Ｊ
１０６５型を、泳動槽としては１２Ｘ１５ｅｌのプラス
チック製水槽（白金型極付）を、アガロースとしてはア
ガロースＩ（同口化学研究所製）を、また泳動用緩衝液
としては４０ｍＭ）リス塩酸（５ｍＭ酢酸ナトリウム及
び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有、ｐＨ７，９）をそれぞれ用
いる。

８、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 上記手引書の第７８〜８７頁及び第１１４〜１２５頁に
記載の方法に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう。泳動
用電源としては、アトー社製コンスターパワー５Ｊ１０
６５型を、泳動槽としてはアト−社製５Ｊ１０６０ＳＤ
型を用いる。

アクリルアミド溶液として、アクリルアミドとＮ。

Ｎ′　−メチレンビスアクリルアミド（２９：　１）と
の水溶液を、重合促進剤としてＮ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重合触媒と
して過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。

また泳動用緩衝液として２．５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含有
する９０ｔｎＭ）リスホウ酸緩衝液（ｐＨ８，３）を用
いる。

実施例　Ｉ ＴＧＦ−αをコードするＤＮＡ配列の造成この造成の概
略図は、第１図に示す通りであり、まず第１表に示す各
ＤＮＡ断片を合成し、之等を連結し、次いでクローニン
グすることにより実施した。その詳細を次に示す。

■　一本鎖ＤＮＡ断片の合成 第１表に示したＴＧＦ−１〜ＴＧＦ−１０の１０種の一
本鎖ＤＮＡ配列を、それぞれＤＮＡ合成機　３８１Ａ型
〔アプライドバイオシステムズ社製〕を用いて合成した
。

■　ＤＮＡ断片の連結 ＴＧＦ−２〜ＴＧＦ−５及びＴＧＦ−７〜ＴＧＦ−１０
の各約１μｇをそれぞれγ−３２Ｐ−ＡＴＰの２０μＣ
ｉの存在下に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
社製）を用いてリン酸化した。次いで、ＴＧＦ−１と上
記リン酸化されたＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−８
、ＴＧＦ−９及びＴＧＦ−１０の各々約０．２μｇとを
混合しくこれを（Ｉ）とする）、別に、ＴＧＦ−６と上
記リン酸化されたＴＧＦ−４、ＴＧＦ−５及びＴＧＦ−
７の各約０．２μｇとを混合しくこれを＜ＩＩ＞とする
）、それぞれをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用
いて連結させた。

上記各連結物を、８％ポリアクリルアミドゲルを用いて
電気泳動させ、オートラジオグラフィーを行なった。現
像したＸ線フィルム上の３２Ｐによる感光位置を参考に
して、（Ｉ）の連結物より約１１０ベースペアーズ（ｂ
ｐ）に相当するＤＮＡ断片を、（ＩＩ）の連結物より約
７６ｂｐに相当するＤＮＡ断片をそれぞれポリアクリル
アミドゲルから分離した。　以上で得られる２種のＤＮ
Ａ断片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させ、５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、再度オー
トラジオグラフィーを行なって確認しつつ、前記式〔４
〕の二本鎖ＤＮＡ配列に相当する約１８６ｂｐのＤＮＡ
断片を、ポリアクリルアミドゲルから分離した。

■　クローニング ｐＢＲ３２２の１μｇを５ａｌＩ緩衝液中で、制限酵素
５ａｌＩ（全酒造社製）にて切断し、次いで、高塩濃度
緩衝液中にて、制限酵素ＥｃｏＲＩ（全酒造社製）を用
いて切断した後、０．９％アガロースゲル電気泳動を行
なって、約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。

このＤＮＡ断片と前記的１８６ｂｐのＤＮＡ断片とを混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、得られた
連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。その結
果、アンピシリン耐性を示す形質転換体が得られ、之等
はすべてテトラサイクリン感受性であった。

上記形質転換体より１株を選び、これからプラスミドｐ
ＴＧＦＡ１を単離した。

得られたｐＴＧＦＡｌを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、５ａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌｌＩ及びＡｃｃｍ（
以上全酒造社製）を用いて、それぞれ単独で又は組合せ
て切断させ、生じるＤＮＡ断片の大きさを、電気泳動で
調べた。その結果、該ｐＴＧＦＡ１は、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉサイト間に、前記式〔４〕の
二本鎖ＤＮＡ配列が挿入されたものであることが確認さ
れた。更に、ｐＴＧＦＡｌが上記式〔４〕のＤＮＡ配列
を有することは、マキサム−ギルバート法による分析の
結果からも確認された。

上記のベクターｐＴＧＦＡ１を保有する大腸菌Ｈ８１０
１株は、微工研に「微工研条寄第１３５４号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１３５４Ｊとして寄託されている。

実施例　２ プラスミドｐＫＴＮの構築 このプラスミドの構築の概略図は、第２図に示す通りで
あり、ｐＢＲ３２２とｐＵＧＴ１５０とから下記■〜■
に従い構築された。

■　ｐＵＧＴ１５０ このプラスミドｐＵＧＴ１５０は、本発明者らがβ−ウ
ロガストロンの分泌発現ベクターとして先に構築した大
きさ約３．８７ｋｂのプラスミドであり、β−ウロガス
トロンの化学合成遺伝子の５′末端にｂｌａシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡ配列が連結されており、その
上流には、１ａｃＺ遺伝子のりボゾーム結合部位を、更
にその上流にはｔａｃプロモーターを有している。また
上記ｂｌａシグナルペプチドとβ−ウロガストロンとの
ポリペプチド連結部位のＤＮＡ配列には、Ｎ　ｒｕ　Ｉ
サイトが含まれており、その切断点は連結点の２塩基上
流（シグナルペプチド側）に位置している〔特願昭６１
− １５３７８３号参照〕。このプラスミドｐＵＧＴ１５０
を保有する大腸菌ＪＭ１０３株はｒＪＭ１０３　［ｐＵ
ＧＴ１５０］　Ｊなる表示で、微工研条寄第９７４号（
Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｂ　Ｐ　−９７４）として寄託されて
いる。

■　上記ｐＵＧＴ１５０の１０μｇを、ＮｒｕＩ緩衝液
中で、制限酵素ＮｒｕＩ（日本ジーン社製）を用いて切
断し、次いで高塩濃度緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩを
用いて切断した後、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行なって、約０．４６ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ＞を得
た。

別に、ｐＢＲ３２２の１μｇを、中塩濃度緩衝液中で制
限酵素ＤｒａＩ（日本ジーン社製）を用いて切断し、次
いで高塩濃度緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて切
断した後、０．９％アガロースゲル電気泳動を行なって
、約３．２３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ）を得た。

また、パリンドローム構造であるオリゴヌクレオチド（
Ｘ　ｍａ）　　（５°−ＣＣＧＧＣＣＧＧ−３’）を合
成した。

■　上記■で得た各ＤＮＡ断片＜Ａ＞及び（Ｂ）と、（
Ｘ　ｍａ）の約０．１μｇとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて之等を連結させ、得られた連結物で大腸菌
ＨＢ　１０１株を形質転換させ、テトラサイクリン耐性
の形質転換株を得た。

その中より１株を選んで、目的のプラスミドｐＫＴＮを
単離した。

かくして得られたｐＫＴＮは、ｐＵＧＴ１５０と同様に
テトラサイクリン耐性遺伝子を持つと共に、ｔａｃプロ
モーターを有し、該ｔａｃプロモーターの下流に１ａｅ
Ｚリボゾ一ム結合部位を、更にその下流にｂｌａシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ配列を有している。しか
しｐＵＧＴ１５０とは異なって、該ＤＮＡ配列の３′末
端が丁度制限酵素ＮａｅＩにより切断されるようになっ
ており、またβ−ウロガストロン遺伝子は含んでいない
。

実施例　３ ＴＧＦ−α発現ベクターｐＴＧＦＡ２の構築このベクタ
ーの構築の概略図は、第３図に示す通りであり、これは
以下の通り前記実施例１で得たｐＴＧＦＡｌ、実施例２
で得たｐＫＴＮ及びｐＢＲ３２２より構築された。

■　ｐＴＧＦＡｌの１０μｇを生塩濃度緩衝液中で、制
限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で切断し、次いでＳ１ヌ
クレアーゼ（ＢＲＬ社製）を用いて切断末端の突出塩基
を除去した後、５ａｌＩ緩衝液中で、制限酵素５ａｌＩ
を用いて切断した。

その後、２．０％アガロース°ゲル電気泳動を行なって
、約１５６ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ）を得た。

また、ｐＫＴＮの１０μｇを生塩濃度緩衝液中で制限酵
素ＮａｅＩ　（ＮＥＢ社製）を用いて切断し、次いで高
塩濃度緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて切断した
。その後、２．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、
約０．４６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ＞を得た。

別に、ｐＢＲ３２２からプラスミドｐＢＲ３２２ＰＳを
作製して用いた。

即ち、ｐＢＲ３２２の１μｇを高塩濃度緩衝液中で制限
酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）を用いて切断した後、合成
オリゴヌクレオチド（ＰＳ）の約０．　１μｇを加え、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結して得たプラスミドで
ある。ｐＢＲ３２２ＰＳでは、下記式〔６〕に示すよう
に、新たに一つの５ａｌＩサイトが形成され、その両側
にＰｓｔＩサイトが並んでいる。

ｐＢＲ３２２Ｐｓの４μｇを生塩濃度緩衝液中で制限酵
素ＡｖａＩ　（宝酒造社製）を用いて切断し、次いで高
塩濃度緩衝液中で制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。次に
、０．９％アガロースゲル電気泳動を行なって、約１．
４３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ）を得た。

また、ｐＢＲ３２２Ｐｓの４μｇを生塩濃度緩衝液中で
制限酵素ＡｖａＩで切断し、次いで５ａｌＩ緩衝液中で
制限酵素５ａｌＩで切断し、続いて０．９％アガロース
ゲル電気泳動を行なって、約２．１９ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｆ）を得た。

■　上記■で得られた各ＤＮＡ断片（Ｃ）、＜Ｄ＞、（
Ｅ）及び（Ｆ）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結させ、得られた連結物で大腸菌ＪＭ１０３株を形質
転換させ、テトラサイクリン耐性の形質転換株を得た。

その中から１株を選んで、目的のｐＴＧＦＡ２を単離し
た。

得られたｐＴＧＦＡ２は大きさ約４．２３ｋｂのプラス
ミドであり、テトラサイクリン耐性遺伝子を有している
。ｐＴＧＦＡ２がｐＫＴＮ出来のｂｌａシグナルペプチ
ドとｐＴＧＦＡ１由来のＴＧＦ−αとが連結されたアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（式〔５〕）を有して
いることは、ＤＮＡ配列分析の結果、確認された。また
、その上流にはｌａｃ　Ｚ遺伝子のりボゾーム結合部位
を、更にその上流にはｔａｃプロモーターを有している
。

上記のベクターｐＴＧＦＡ２を保有する大腸菌ＪＭ１０
３株は、微工研に「微工研条寄第１３５５号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１３５５）Ｊとして寄託されている。

また、上記で得たベクターｐＴＧＦＡ２を用いて、大腸
菌１（Ｂ１０１株を形質転換させ、テトラサイクリン耐
性の形質転換株を得た。このベクターｐＴＧＦＡ２を保
有する大腸菌ＨＢＩＯＩ株は、微工研に「微工研条寄第
１３８７号（ＦＥＲＭＢＰ−１３８７）Ｊとして寄託さ
れている。

実施例　４ 本発明組換え微生物の培養及びこれによるＴＧＦ−αの
製造 ■　菌の培養 実施例３で得られたベクターｐＴＧＦＡ２を保有する大
腸菌ＨＢ　１０１株（「微工研条寄第１３８７号」）を
以下の通り培養した。

培地としては、グルコース、カザミノ酸、ロイシン、プ
ロリン、サイアミン及びテトラサイクリンを添加したＭ
９培地を用いた。その組成は次の通りである。

〈試薬添加Ｍ９培地〉 リン酸二ナトリウム・１２水塩１０．０ｇリン酸−カリ
ウム　　　　　　　　３．０ｇ塩化ナトリウム　　　　
　　　　　０．５ｇ塩化アンモニウム　　　　　　　　
１．０ｇ塩化カルシウム・二水塩　　　　１４．７ｍｇ
硫酸マグネシウム・七水塩　　　　２５０ｍｇグルコー
ス　　　　　　　　　　　　　５０ｇカザミノ酸　　　
　　　　　　　　　　１０ｇＬ−ロイシン　　　　　　
　　　　２００ｍｇＬ−プロリン　　　　　　　　　　
　２００ｍｇサイアミン・塩酸塩　　　　　　　　１０
ｍｇテトラサイクリン・塩酸塩　　　　　２０ｍｇ上記
各成分を、蒸留水に加えて合計ＩＱとする。

上記培地２０Ｑを含む３０Ｑ容ジャーファーメンタ−Ｍ
ＳＪ−Ｕ３型（丸菱バイオエンジニアリング社製）に菌
を接種して３５℃にてｐＨ６，５に制御しつつ培養を行
なった。２２時間培養後に培養液の一定量（１０１ｒｌ
１２）を採取して、６１０ｎｍでの吸光度を測定し、次
いで遠心分離（６０００回転／分ＸＩＯ分間、４℃）に
より、菌体と培養上澄とを分離した。かくして得られた
培養上澄を菌体外画分とする。

また、菌体から浸透圧ショック法［Ｈ，Ｃ。

Ｎｅｕ　　ａｎｄ　　Ｌ、　Ａ、　Ｈｅｐｐｅｌ　、　
　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、２４０．３６８５〜３６９２（１９６５）
）に従い、以下の操作によりペリプラズム画分を抽出し
た。即ち、まず前記菌体を２０％蔗糖を含む３０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５ｍ１２に懸濁させ、０
．２５ＭＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８，０）の０．１戒を加
え、１０分間攪拌した後、遠心分離（９０００回転／分
×１０分間）して菌体を集め、次いでこの菌体を水冷し
た水１０ＷＪＱに再懸濁させ、水中に１０分間静置して
時々攪拌し、遠心分離（９０００回転／分×１０分間）
により菌体と上澄とを分離した。かくして得られた上澄
をペリプラズム画分とする。

更に、菌体を洗浄用緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸及び３
０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐｕｓ、０）で洗浄後、ＰＢＳ
　（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７、０）　ｌ０ＩＩＩＱに懸濁さ
せ、超音波破砕機（太番製作所社製、５２０２型）を用
いて、出力１００Ｗにて、３０秒ずつ３回破砕処理し、
次いで遠心分離（１２０００回転／分Ｘ２０分間、４℃
）して、上澄を得た。かくして得られた上澄を菌体内画
分とする。

■　ラジオリセプターアッセイ（ＲＲＡ）によるＴＧＦ
−αの測定 ＴＧＦ−αの測定を、Ａ４３１細胞を用いたＲＲＡによ
り、以下の通り実施した。

用いたＡ４３１細胞は、ヒト扁平上皮癌由来の細胞株で
あり、細胞表面に多数のＥＧＦリセプターを持つことが
知られている（ＲｌＮ。

Ｆａｂｒｉｃａｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４．５６５〜５６９　（１９７７））。

本ＲＲＡは、上記Ａ４３１細胞表面のＥＧＦリセプター
に対するＴＧＦ−αとβ−ウロガストロン（ヒトＥＧＦ
）の結合の競合反応を利用したものである。

０Ａ４３１細胞の調製 Ａ４３１細胞を下記組成の１０％ＦＣ３添加ＤＭＥ培地
２０１１Ｑ中で、５％ＣＯ２存在下に３７℃の条件で３
日間培養した。

く１０％ＦＣ８添加ＤＭＥ培地〉 ダルベツコ変法イーグル培地　　　９００脱Ｌ−グルタ
ミン　　　　　　　　　０．６ｇ１０％炭酸水素ナトリ
ウム水溶液　　１０脱ストレプトマイシン　　　　　　
　２００ｍｇペニシリン　　　　　　　　　　　２０万
ＵＦＣ３１００１０１２ その後、細胞を懸濁させ、細胞数を計数後、２０＋１１
Ｑの１０％中性ホルマリン液を加え、３０分間、４℃に
放置した。次いで下記組成のＤ−ＰＢＳ−で数回洗浄し
、分注後、凍結乾燥させて保存した。

＜Ｄ−ＰＢＳ′″〉 塩化ナトリウム　　　　　　　　８．０　ｇ塩化カリウ
ム　　　　　　　　　０．２　ｇリン酸ニナトリウム　
　　　　　１．１５ｇリン酸−カリウム　　　　　　　
０．２　ｇ上記各成分を、蒸留水に加えて合計ＩＱとす
る。

Ｏ測定方法 スタンダードとしてβ−ウロガストロンを用いた。また
β−ウロガストロンをクロラミンＴ法によりヨード化し
て１２５Ｉ−β−ウロガスト０ンを調製した。スタンダ
ード、　　　Ｉ−β−ウロガストロン、Ａ４３１細胞及
び測定用検体は、全て０．　１％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢ
Ｓ−の溶液又は懸濁液として利用した。

まず、スタンダード又は測定用検体０．２１１１１２と
約３０万ｃｐ■／威の１２５１−β−ウロガストロン０
．１戒とを混合し、次いで、約１００万細胞／ＩＩＱの
Ａ４３１細胞０．２戒を加え、２５℃で２０時間放置し
た。その後０．１％ＢＳＡ添加Ｄ−ＰＢＳ−１１１Ｑを
加え、４℃にて遠心゛分離（３０００回転／分、３０分
間）を行ない、上澄をすてた。次に沈渣の放射能をγ−
カウンターにて測定し、スタンダードから得られる標準
曲線に基づいて、検体中のＴＧＦ−α量をβ−ウロガス
トロン換算値として求めた。

標準曲線の一例を第４図に示す。図において、横軸はβ
−ウロガストロン量（ｎｇ／アッセイチューブ）、縦軸
はＡ４３１細胞に対する１２５Ｉ−β−ウロガストロン
結合比（％）を各々示す。

各画分についての上記ＲＲＡの結果（ＴＧＦ−α値：単
位：μｇ／Ｑ、β−ウロガストロン換算値）を下記第３
表に示す。

第３表 上記第３表より、本発明のＴＧＦ−α発現ベクター（ｐ
ＴＧＦＡ２）を保有する大腸菌は、ＥＧＦリセプターと
の結合能を有する物質、即ちＴＧＦ−αを、菌体内（ペ
リプラズム）及び菌体外に産生ずることが明らかである
。

実施例　５ ＴＧＦ−αの精製及び同定 ■精製 以下の方法によりＴＧＦ−αの精製を行なった。即ち、
実施例４で得たペリプラズム画分及び菌体外画分中のＥ
ＧＦリセプター結合能を有する物質について、ＲＲＡを
指標として、以下の工程を順次行なった。まず、ブチル
トヨパール６５０Ｃ（東洋曹達社製）を用いた吸着クロ
マトグラフィーを行ない、次いでＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｍ（同上社製）を用いた陰イオン交換クロマトグ
ラフィーを行ない、更にＣＭトヨパール６５０Ｍ（同上
社製）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを行な
った。次いでＴＳＫゲル−０ＤＳ−１２０Ｔカラム（同
上社製）を用いたＨＰＬＣによる分取を行ない、単一ポ
リペプチドを採取し、最後にセファデックスＧ−２５（
、ファルマシア社製）を用いたゲル濾過により脱塩して
、純度９９％以上の精製品を得た。

■　ＨＰＬＣ 得られたＴＧＦ−αの逆相ＨＰＬＣによる溶出パターン
を第５図に示す。

第５図は、ＴＳＫゲル−〇Ｄｓ−１２０Ｔカラム（４，
６ａｖｌＤＸ２５ｃｍ）を用いて、２５％（Ｖ／Ｖ）ア
セトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸を含む水溶
液により、毎分１．０ｍｌの流速で溶出させた結果であ
り、縦軸は２１５ｎｍでの吸光度を、横軸は保持時間（
分）を示す。

該条件でのＴＧＦ−αの保持時間は１０．０分であった
。

■　アミノ酸分析 精製ＴＧＦ−αを、６Ｎ塩酸中で１１０’Ｃにて４８時
間加水分解し日立８３５型アミノ酸分析計を用いて、ニ
ンヒドリン法によりアミノ酸分析を行なった。

結果を下記第４表に示す。

第　　４　　表 上記第４表より、精製ＴＧＦ−αのアミノ酸の実測残基
数は、理論残基数と良好に一致していることが判る。

■　アミノ酸配列 精製ＴＧＦ−αのアミノ酸配列を、気相プロティン・シ
ークエンサー４７０型（アプライドバイオシステムズ社
製）を用いて分析した。即ち、ＴＧＦ−αのアミノ末端
側よりエドマン分解を行なって、アミノ末端より、３８
番目のＴｙｒまでのアミノ酸残基の配列を決定した。

その結果を下式（Ａ）に示す。但し、Ｃｙｓは、還元処
理による誘導体化を行なっていないため同定されなかっ
たので、Ｘとして示した。

Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｐ−（Ｘ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ
−Ｔｈｒ−（Ｘ）−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−（
Ｘ）−Ｖａｌ−（Ｘ）−Ｈｉｓ−８ｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙ
ｒ　　　　　　　　　　　　（Ａ）上式（Ａ）のアミノ
酸配列は、前記式（１〕のＴＧＦ−αアミノ酸配列と正
確に一致した。

実施例　６ ＴＧＦ−αの生物活性の測定 ■　細胞増殖促進活性 ＴＧＦ−αの細胞増殖促進活性を、以下の通り、ＢＡＬ
Ｂ／ｃ３Ｔ３細胞を用いて、標識チミジンのＤＮＡへの
取込みを指標として測定した。

ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　　Ａ３１細胞（フローラボラトリ
ーズ社製）を、７Ｘ１０’細胞／戒／２、　５ｃｍ２と
なるように、１２穴のプラスティック製ディツシュに分
注し、５％ＣＯ２存在下に、３７℃の条件で２４時間培
養した。培地としては、５％ＣＳ添加ＤＭＥ培地を用い
た。

次いで、培地を０．　１％Ｃ８添加ＤＭＥに代えて４８
時間培養し、その後更に種々の濃度のＴＧＦ−α又は対
照としてのβ−ウロガストロンを含む０．１％Ｃ８添加
ＤＭＥに代えて培養を続け、２２時間後に、２．５μＣ
ｉの〔８Ｈ〕−チミジン（０゜３Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌ　）
を加えて更に４時間培養した。

上記培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＴＣＡを加
えて４℃で一夜放置した。次いで１０％ＴＣＡを除き、
０．ＩＮ水酸化ナトリウム５００μ２を加え、３７℃で
１時間放置して細胞を溶かした。

得られた溶液２５０μΩ中の放射能を液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。

その結果を第６図に示す。図において横軸はＴＧＦ−α
又はβ−ウロガストロンの濃度（ｎｇ／ｍ）を、縦軸は
ＤＮＡに取込まれた放射能（ｄｐＩｌｘ１０３／７ｘｌ
Ｏ’細胞／ウェル）を示す。また図において（１）はＴ
ＧＦ−αを、（２）はβ−ウロガストロンをそれぞれ示
す。

上記第６図から、本発明により得られるＴＧＦ−αは、
β−ウロガストロンと同様に、チミジン取込み促進効果
、即ち細胞増殖促進活性を有することが明らかである。

■　軟寒天中コロニー形成活性 まず０．６％寒天（Ａｇａｒ　Ｎｏｂｌｅ、　Ｄｉｆｃ
ｏ社製）及び５％仔牛血清を含むダルベツコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥ）を直径３５ｍｍのシャーレに２ｍ（２
ずつ分注して固まらせた。別に０．３％寒天、５％仔牛
血清、４ｍｇ／ｍＱのＴＧＦ−β（豚ＴＧＦ−β、　Ｒ
＆Ｄ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　　Ｉｎｃ、社製）及び２ｍ
ｇ／ｉｆ４のＴＧＦ−α又はβ−ウロガストロンを含む
ＤＭＥ培地２．　５１１ＩＱｔニア、　　５Ｘ１０’細
胞／脱のＮＲＫ４９Ｆ細胞（フローラボラトリーズ社製
）１００μＱを加え、このもの１或を前記の０．　６％
寒天培地上に注ぎ、３０分間室温に放置して固まらせた
。これを炭酸ガス培養機中で、３７℃で５％ＣＯ２の条
件で１０日間培養した後、３１００μｍ２以上（６０，
ｃｚｍφ）のＮＲＫ４９Ｆ細胞のコロニーを顕微鏡下で
計数した。

その結果を第５表に示す、表中の数値は、軟寒大中に形
成されたコロニー数（個／シャーレ、φ３５ｍｍ）を示
す。

第　　　５　　　表 上記第５表から、本発明により得られるＴＧＦ−αは、
β−ウロガストロンと同様に、ＴＧＦ−βの共存下で、
軟寒天中のコロニー形成活性を有することが明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ベクターｐＢＲ３２２に合成オリゴヌクレオ
チドＴＧＦ−１〜ＴＧＦ−１０を連結、挿入してプラス
ミドｐＴＧＦＡ１を得る工程及び得られるｐＴＧＦＡｌ
の特徴を示す図であり、図中口は合成オリゴヌクレオチ
ド由来ＤＮＡ配列、即ちＴＧＦ−αをコードするＤＮＡ
配列を示し、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を、Ｔｃ
’はテトラサイクリン耐性遺伝子を各々示し、実線で示
される各オリゴヌクレオチドの５′末端のＯ及び・は該
末端がそれぞれリン酸化されていない（０印）及びリン
酸化されている（・印）ことを示す。 之等は以下の図でも同様のことを示す。 第２図は、ｐＢＲ３２２とｐＵＧＴ１５０とからベクタ
ーｐＫＴＮを得る工程及び得られるベクターの特徴を示
す図であり、図中口ヌキの矢印はｔａｅプロモーターを
、閣はｂｌａシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
を、口はβ−ウロガストロンをコードするＤＮＡ配列を
それぞれ示し、以下の図でも同様とする。 第３図は、ｐＴＧＦＡｌ、ｐＫＴＮ及びｐＢＲ３２２か
らＴＧＦ−α発現ベクターｐＴＧＦＡ２を１昇る工程及
び得られるベクターの特徴を示す図である。 第４図は、ＲＲＡの標準曲線を示すグラフである。 第５図は、精製ＴＧＦ−αの逆相ＨＰＬＣによる溶出パ
ターンを示すグラフである。 第６図は、標識チミジンのＤＮＡへの取込みを指標とし
て、精製ＴＧＦ−α及びβ−ウロガストロンの細胞増殖
促進活性を調べた結果を示すグラフである。 （以　上） 手続補正書印幻 昭和６２年７月２２日　　１ １　事件の表示 昭和６２年特許願第１４７４２５号 ２　発明の名称 アース製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル臼　　発 ６　補正の対象 補正の内容 明細書第２６頁第１７〜１８行に「微工研・・・９１４
６）Ｊとあるを「微工研条寄第１３９８号（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−１３９８）Ｊと訂正する。 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードする合成ＤＮ
   Ａ配列。 ［２］ＴＧＦ−αがヒトＴＧＦ−αである特許請求の範
   囲第１項に記載のＤＮＡ配列。 ［３］ＴＧＦ−αをコードする遺伝子が下記配列である
   特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ配列。 （５′）【ＤＮＡ配列があります】（３′） ［４］ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
   列と、該アミノ酸配列のアミノ末端相当側にシグナルペ
   プチドのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードす
   るＤＮＡ配列とが連結されていることを特徴とする組換
   えＤＮＡ配列。 ［５］ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
   列とシグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮ
   Ａ配列とが直接連結されている特許請求の範囲第４項に
   記載のＤＮＡ配列。 ［６］シグナルペプチドが大腸菌β−ラクタマーゼのも
   のである特許請求の範囲第４項又は第５項に記載のＤＮ
   Ａ配列。 ［７］５′末端及び３′末端にそれぞれ開始コドン及び
   終止コドンが付加された特許請求の範囲第４項〜第６項
   のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 ［８］ＴＧＦ−αがヒトＴＧＦ−αである特許請求の範
   囲第４項〜第７項のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 ［９］ＴＧＦ−αのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
   列が合成ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第４項〜第８
   項のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 ［１０］ＴＧＦ−αをコードする遺伝子が下記配列であ
   る特許請求の範囲第４項〜第９項のいずれかに記載のＤ
   ＮＡ配列。 （５′）【ＤＮＡ配列】があります（３′） ［１１］特許請求の範囲第４項〜第１０項のいずれかに
   記載のＤＮＡ配列を含むベクター。 ［１２］上流にプロモーター及びリボゾーム結合部位、
   下流に転写終結信号を含む特許請求の範囲第１１項に記
   載のベクター。 ［１３］プロモーター、リボゾーム結合部位、ＴＧＦ−
   αをコードする遺伝子及び転写終結信号からなるＴＧＦ
   −α発現情報単位の複数個を有する特許請求の範囲第１
   １項に記載のベクター。 ［１４］特許請求の範囲第１１項〜第１３項のいずれか
   に記載のベクターを保有する宿主細胞。 ［１５］特許請求の範囲第１４項に記載の宿主細胞を培
   養してＴＧＦ−αを製造、採取することを特徴とするＴ
   ＧＦ−αの製造法。