CN103492852B - 生物材料的透明化方法、及其利用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明的生物材料的透明化方法包括：第一浸润步骤，使以规定的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到生物材料中；第二浸润步骤，继而使以比第一浸润步骤中用的所述溶液高的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到所述生物材料中。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料的透明化方法、及其利用。
背景技术
在使用光学显微镜观察不透明的组织内部时，将会使用透明化试剂来进行预处理(透明化处理)。
关于透明化试剂及预处理方法，具代表性的例如已有专利文献1及非专利文献1中揭示的由Ann-Shyn Chiang提出的Focus Clear(商品名)溶液、或非专利文献2中揭示的由Hans-Ulrich Dodt等人提出的组织透明法(tissue clearingmethod)。这些技术均用以使组织透明化，目的在于观察存在于组织中的荧光物质。
[现有技术文献]
专利文献1：美国专利第6472216号公报；授权日2002年10月29日。
非专利文献1：Ann-Shyn Chiang et al.：Insect NMDA receptors mediate juvenilehormone biosynthesis.PNAS99(1)，37-42(2002).
非专利文献2：Hans-Ulrich Dodt et al.：Ultramicroscopy：three-dimensionalvisualization of neuronal networks in the whole mouse brain.Nature Methods4(4)，331-336(2007).
发明内容
[本发明要解决的问题]
由于上述方法均需要将有机溶剂用作透明化处理的有效成分等，因此有难以适用于活组织，适用对象一味地限于固定化样品的问题。另外，还有导致作为透明化处理的对象的生物材料引起收缩的问题。
在本发明以前，本发明的发明者们发现如果使用尿素，便能使生物材料透明化。由于尿素是生物亲和性优异的成分，因此如果将尿素或尿素衍生物用作透明化处理的有效成分，就能解决上述的问题。
本发明的发明者们还着手于开发用尿素或尿素衍生物来实现更有效的生物材料透明化处理的方法。
本发明正是为了解决上述课题而完成的，其目的在于提供一种使用生物亲和性优异的成分来使生物材料透明化的更有效率的方法、及其利用。
[用以解决问题的技术方案]
为了解决上述问题，本发明的发明者们进行了锐意研究。结果新发现了通过对有效成分为尿素等的不同浓度的溶液进行组合，便既能抑制不要的体积变化，又能更有效率地进行透明化处理，从而完成了本发明。
即，本发明的生物材料的透明化方法的特征在于包括：第一浸润步骤，使以规定的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到生物材料中；第二浸润步骤，继而使以比第一浸润步骤中用的所述溶液高的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到所述生物材料中。
本发明的透明化方法也可以在第二浸润步骤之后还包括第三浸润步骤，即：使以比第二浸润步骤中用的所述溶液低的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到所述生物材料中。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤中所用的溶液和所述第三浸润步骤中所用的溶液以实质上相同的浓度含有所述化合物。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤中所用的溶液与所述第三浸润步骤中所用的溶液为相同的溶液。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤、第二浸润步骤、以及视需要而进行的第三浸润步骤中所用的溶液均含有尿素来作为所述化合物。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤、第二浸润步骤、以及视需要而进行的第三浸润步骤中所用的溶液的至少一方为水溶液。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤、第二浸润步骤、以及视需要而进行的第三浸润步骤中所用的溶液的至少一方含有表面活性剂。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述表面活性剂为非离子性表面活性剂。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述非离子性表面活性剂为选自由TritonX(注册商标)、Tween(注册商标)、及NP-40(商品名)所组成的群中的至少一种。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述水溶液还含有水溶性的高分子化合物。
在本发明的透明化方法中，作为优选，水溶性的所述高分子化合物为选自由Percoll(注册商标)、Ficoll(注册商标)、聚乙二醇、及聚乙烯吡咯烷酮所组成的群中的至少一种。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤、第二浸润步骤、以及视需要而进行的第三浸润步骤中所用的溶液的至少一方还含有选自由甘油、羧基乙烯基聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、及聚乙二醇(macrogol)所组成的群中的至少一种。
本发明的透明化方法优选用以使作为所述生物材料的源自多细胞动物的组织或器官、或除人类以外的多细胞动物得以透明化。
在本发明的透明化方法中，作为优选，所述第一浸润步骤中所用的溶液中的所述化合物的浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内，并且所述第二浸润步骤中所用的溶液中的所述化合物的浓度落在6M以上8.5M以下的范围内。
本发明的用于生物材料的透明化处理试剂盒的特征在于，包含：第一溶液，其以规定的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物；第二溶液，其以比所述第一溶液高的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物。
在本发明的用于生物材料的透明化处理试剂盒中，作为优选，所述第一溶液含有浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内的尿素、以及浓度落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内的表面活性剂。
在本发明的用于生物材料的透明化处理试剂盒中，作为优选，所述第二溶液含有浓度落在5.5M以上8.5M以下的范围内的尿素、以及浓度落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内的表面活性剂。
在本发明的用于生物材料的透明化处理试剂盒中，作为优选，所述第一溶液含有选自由甘油、羧基乙烯基聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、及聚乙二醇(macrogol)所组成的群中的至少一种。
[发明的效果]
本发明的效果在于能提供一种运用生物亲和性优异的成分而实现的更为有效的生物材料透明化法、及其利用。
附图说明
图1涉及本发明的一个参考例，是用生物材料用透明化试剂处理小鼠的海马区后的结果图。
图2涉及本发明的其他参考例，是用生物材料用透明化试剂处理小鼠的海马区后的结果图。
图3涉及本发明另一参考例，是用生物材料用透明化试剂处理小鼠的整个大脑后的结果图。
图4涉及本发明另一参考例，是表示生物材料用透明化试剂、与被处理的生物材料的膨润情况的相关性的图表。
图5涉及本发明另一参考例，是用生物材料用透明化试剂处理小鼠的整个大脑后的结果图。
图6涉及本发明另一参考例，是用生物材料用透明化试剂处理小鼠的脑切片，然后测定该脑切片的透光率而得的结果图表。
图7涉及本发明另一参考例，是用生物材料用透明化试剂处理胎鼠后的结果图。
图8涉及本发明另一参考例，是用生物材料用透明化试剂处理小鼠的海马区并观察神经干细胞后的结果图。
图9是，用以尿素为有效成分的生物材料用透明化试剂处理小鼠大脑的结果、与用先前技术(BABB法)处理小鼠大脑的结果的比较图。
图10是，用以尿素为有效成分的生物材料用透明化试剂来对表达了各种荧光蛋白质的HeLa细胞进行处理后的结果、与用先前技术(BABB法)来对表达了各种荧光蛋白质的HeLa细胞进行处理后的结果的比较图。
图11涉及本发明另一参考例，是用生物材料用透明化试剂对经神经干细胞移植的大脑皮质进行处理并观察的结果图。
图12涉及本发明另一参考例，是对尚未用生物材料用透明化试剂进行透明化处理前的生物材料、以及经透明化处理之后又恢复成处理前状态的生物材料进行免疫染色的结果图。
图13涉及本发明的一实施例，是对小鼠的海马区进行透明化处理，然后观察该海马区的透光情况的结果图。
图14涉及本发明的其他实施例，是对小鼠的脑切片进行透明化处理，然后测定该脑切片的透光率而得的结果图表。
图15涉及本发明另一参考例，是表示透明化处理对尿素浓度的依赖性的图。具体实施方式
以下对本发明的实施形态进行详细说明。
〔1.使用生物材料用透明化试剂的透明化处理方法〕
(透明化处理方法的概要)
本发明的透明化处理法是使生物材料透明化的方法，其依次包括以下所示的第一浸润步骤和第二浸润步骤。本发明的透明化处理法中，优选在第二浸润步骤后还包括第三浸润步骤。
1)第一浸润步骤：使以规定的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物(有时也统称为尿素系化合物)的溶液(“第一生物材料用透明化试剂”)，浸润到生物材料中；
2)第二浸润步骤：使以比第一浸润步骤中所用的所述溶液的浓度高的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液(“第二生物材料用透明化试剂”)，浸润到所述生物材料中；
3)第三浸润步骤：使以比第二浸润步骤所用的所述溶液的浓度低的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液(“第三生物材料用透明化试剂”)，浸润到所述生物材料中。
另外，在以下的说明中，当对第一生物材料用透明化试剂、第二生物材料用透明化试剂、及第三生物材料透明化试剂进行统称时，则单称为“生物材料用透明化试剂”。因此，说明书中单用“生物材料用透明化试剂”一词所做的说明，是指第一～第三生物材料透明化试剂的共通说明。
本发明的生物材料的透明化处理方法为：使作为透明化处理有效成分的尿素系化合物的浓度不同的“生物材料用透明化试剂”，以规定的顺序浸润到“生物材料”中。该流程的利点之一在于：既能抑制生物材料的不要的体积变化，又能大幅缩短透明化处理的所需时间。
即，通过按照上述顺序进行所述第一浸润步骤及第二浸润步骤，便既能抑制生物材料的不要的体积变化，又能大幅缩短透明化处理的所需时间。并且，视需要进而进行所述第三浸润步骤，便能更确实地抑制生物材料的不要的体积变化，且即使周边温度下降时(寒冷时)，也能更确实地抑制因发生尿素系化合物的结晶析出等而导致生物材料损伤的忧患。
(第一浸润步骤)
第一浸润步骤是，使所述第一生物材料用透明化试剂浸润到生物材料中的步骤。更具体而言，例如在供进行透明化处理的容器内，使“第一生物材料用透明化试剂”浸润到所述“生物材料”中。
进行所述第一浸润步骤时的处理温度并无特别限定，优选落在15℃以上45℃以下的范围内。另外，进行第一浸润步骤的处理时间并无特别限定，优选落在2小时以上1个月以内的范围内，更优选落在12小时以上3日以内的范围内。另外，进行透明化处理时的压力并无特别限定。
所述第一生物材料用透明化试剂中所含的所述尿素系化合物的浓度只要低于所述第二生物材料用透明化试剂中所含的所述尿素系化合物的浓度，则无特别限定。该第一生物材料用透明化试剂中的尿素系化合物浓度优选落在1M以上5.5M以下的范围内，更优选落在2.5M以上5.5M以下的范围内，更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，特别优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。另外，本发明中，生物材料用透明化试剂中若含有多种作为透明化上所需的有效成分的尿素系化合物，则“尿素系化合物的浓度”是指多种尿素系化合物的合计浓度。
(第二浸润步骤)
第二浸润步骤是，使所述第二生物材料用透明化试剂浸润到生物材料中的步骤。更具体而言，例如在供进行透明化处理的容器内，使“第二生物材料用透明化试剂”浸润到所述“生物材料”中。通过使第二生物材料透明化试剂中的所述尿素系化合物的浓度高于第一生物材料透明化试剂、及视需要而用的第三生物材料透明化试剂中的所述尿素系化合物的浓度，便可促进尿素系化合物渗入生物材料。
进行所述第二浸润步骤时的处理温度并无特别限定，优选落在15℃以上45℃以下的范围内。另外，进行第二浸润步骤的处理时间并无特别限定，优选落在2小时以上1个月以内的范围内，更优选落在12小时以上3日以内的范围内。另外，进行透明化处理时的压力并无特别限定。
所述第二生物材料用透明化试剂中所含的所述尿素系化合物的浓度只要满足高于所述第一生物材料用透明化试剂中所含的所述尿素系化合物的浓度的这一前提条件，则无特别限定。其中，在满足该前提条件的基础上，优选落在5.5M以上8.5M以下的范围内，更优选落在6M以上8.5M以下的范围内，更优选落在6.5M以上8.5M以下的范围内，特别优选落在7.7M以上8.2M以下的范围内。另外，就与第一生物材料用透明化试剂的浓度差的观点而言，第二生物材料用透明化试剂优选以2M以上的高浓度方式含有所述尿素系化合物，更优选以3M以上的高浓度方式含有所述尿素系化合物，更优选以3.5M以上的高浓度方式含有所述尿素系化合物。
(第三浸润步骤)
视需要而进行的第三浸润步骤是，使所述第三生物材料用透明化试剂浸润到生物材料中的步骤。更具体而言，例如在供进行透明化处理的容器内，使“第三生物材料用透明化试剂”浸润到所述“生物材料”中。
进行所述第三浸润步骤时的处理温度并无特别限定，优选落在15℃以上45℃以下的范围内。另外，进行第三浸润步骤的处理时间并无特别限定，优选落在2小时以上1个月以内的范围内，更优选落在12小时以上3日以内的范围内。另外，进行透明化处理时的压力并无特别限定。
所述第三生物材料用透明化试剂中所含的所述尿素系化合物的浓度只要低于所述第二生物材料用透明化试剂中所含的所述尿素系化合物的浓度，则无特别限定。该第三生物材料用透明化试剂中的尿素系化合物浓度优选落在1M以上、5.5M以下的范围内，更优选落在2.5M以上5.5M以下的范围内，更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，特别优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。
另外，作为特别优选的方案，更优选第一生物材料用透明化试剂与第三生物材料用透明化试剂以实质上相同的浓度含有所述尿素系化合物。在此，所谓实质上相同的浓度，优选指浓度差为0.5M以内，更优选为0.3M以内，进而优选为0.1M以内。在其他方案中，第一生物材料用透明化试剂与第三生物材料用透明化试剂是同一溶液。
所述第一浸润步骤～第三浸润步骤中，将“生物材料用透明化试剂”与“生物材料”装入透明化处理用容器内时的顺序并无特别限定。例如当在同一容器内连续进行第一浸润步骤～第三浸润步骤时，可以首先将“第一生物材料用透明化试剂”装入容器，然后装入“生物材料”，接着依序进行如下处理：倒去第一生物材料用透明化试剂，将第二生物材料用透明化试剂装入容器；倒去第二生物材料用透明化试剂，将第三生物材料用透明化试剂装入容器。另外，也可以视需要而在各浸润步骤之间设置对容器及生物材料进行清洗处理等的步骤。
可以在例如室温或低温环境下保存所述各浸润步骤中所用的装有经透明化处理的生物材料的处理容器，直到该处理容器被提供给后述观察步骤为止(透明化试样保存步骤)。
(生物材料用透明化试剂的有效成分)
本发明中使用含有“尿素”的溶液，该“尿素”是进行生物材料的透明化时所必须的有效成分。在本发明的其他方案中，使用含有“尿素衍生物”的溶液，该“尿素衍生物”是进行生物材料的透明化时所必须的有效成分。这些溶液相当于所述“生物材料用透明化试剂”。
所述尿素衍生物的种类并无特别限定，具体例如有各种烷基脲、或下述通式(1)所示的化合物。另外，通式(1)所示的化合物包括一部分烷基脲。本发明中所用的生物材料用透明化试剂只要含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少1种化合物来作为有效成分即可，其中更优选含有尿素。
通式(1)所示的尿素衍生物中，R1、R2、R3、R4各自独立地为氢原子(但R1～R4全部为氢原子时，则就是尿素，因此该情况除外)、卤素原子或烃基；构成烃基的碳原子有多个时，这些碳原子的一部分也可被氮原子、氧原子、硫原子等杂原子所取代。烃基包括链状烃基及环状烃基。
作为所述链状烃基，例如可例示链状烷基、链状烯基及链状炔基等。构成链状烃基的碳的数量并无特别限定，例如可列举碳数为6以下的直链状或支链状的烃基，优选碳数为1～3的烷基。链状烃基也可以含有例如卤素原子等取代基。作为链状烷基的例子，可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、己基、辛基等。
作为所述环状烃基，例如可例示环烷基及环烯基等。环状烃基也可含有例如卤素原子等取代基。作为环烷基的例子，可列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基等碳数为3以上的环烷基，优选碳数为3以上6以下的环烷基。作为环烯基的例子，可列举环己烯基等碳数为3以上的环烯基，优选碳数为3以上6以下的环烯基。
作为所述卤素原子，可列举氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
另外，关于通式(1)所示尿素衍生物的更优选的具体例，有满足以下条件1)～2)的尿素衍生物。
条件1)：选自R1～R4的任意3个基为氢原子，剩余的1个基是卤素原子或碳数1～6的链状烃基；作为优选，剩余的1个基为碳数1～3或碳数1～2的烷基。
条件2)：选自R1～R4的任意2个基为氢原子，剩余的2个基各自独立地是卤素原子或碳数1～6的链状烃基；作为优选，剩余的2个基均是碳数1～3或碳数1～2的烷基；更优选的，为氢原子的2个基的其中一方是R1或R2，另一方是R3或R4。
(使用尿素等作为有效成分时的优点)
尿素是来源于毒性极低的活体的成分。因此，本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”具有如下优点：1)不仅能用来对经固定化的生物材料进行透明化，还能用来对未经固定化的(活的)生物材料进行透明化；2)另外，相对而言，尿素所导致的荧光蛋白质损害情况、及该荧光蛋白质的荧光消失情况较少，因此适合于用荧光蛋白质来观察生物材料；3)尿素非常廉价，也容易获取，且操作性优异，因此能以非常低的成本及简单的程序来进行透明化处理。
另外，除上述的优点以外，还具有如下优点：4)与现有技术中的生物材料用透明化试剂相比，可明显提高因光散射性高而不透明的生物材料的透明性，从而能观察处于超深部组织中的各种荧光蛋白质及荧光物质；5)尤其是就脑组织而言，能使目前还是深部观察中的一个屏障的白质层得以透明化，从而能观察比白质层更位于深部的区域(例如胼胝体)；6)本发明的透明化处理是可逆的，具体而言，仅通过将透明化处理后的生物材料浸渍到平衡盐类溶液中，便可恢复成透明化处理前的状态，且透明化处理前后的蛋白质等的抗原性也保持不变，所以能运用通常的组织染色法及免疫染色法来进行分析。
另外，用所述尿素衍生物代替尿素时，也能获得相同的优点。
(表面活性剂)
本发明中使用的所述“生物材料用透明化试剂”也可以视需要而含有表面活性剂。表面活性剂优选是非离子性的表面活性剂，其理由在于能缓慢地提升本试剂向生物组织的渗入。作为非离子性的表面活性剂，可列举：聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯等脂肪酸系表面活性剂；聚乙烯醇等高级醇系表面活性剂；聚氧乙烯辛基苯基醚等烷酚系表面活性剂。具体而言，例如可列举选自由下述产品所组成的群中的至少一种：TritonX-100、及TritonX-140等TritonX(注册商标)系列；Tween-20、Tween-40、Tween-60、及Tween-80等Tween(注册商标)系列；NP-40(商品名)。表面活性剂也可以视需要而混合两种以上来使用。
这些表面活性剂可提高尿素向生物材料的渗透性，提高透明化处理的效率。特别是若需要对脑组织白质层等这类透明化处理相对较困难的生物材料进行透明化，则“生物材料用透明化试剂”中优选含有表面活性剂。
另外，与采用尿素的方案同样，所述表面活性剂也能提高尿素衍生物向生物材料的渗透性。
“生物材料用透明化试剂”若要含有表面活性剂，则第一生物材料用透明化试剂、第二生物材料用透明化试剂、及视需要而用的第三生物材料用透明化试剂的至少一方含有表面活性剂即可。其中，优选第一～第二生物材料用透明化试剂(或第一～第三生物材料用透明化试剂)均含有相同的表面活性剂，更优选以实质上相同的浓度含有相同的表面活性剂。在此，所谓实质上相同的浓度，是指浓度差在0.01(w/v)％以内。
(水溶性的高分子化合物)
本发明中所用的所述“生物材料用透明化试剂”也可视需要而进而含有水溶性的高分子化合物。在此，所谓高分子化合物是指，分子量例如高达5万～6万以上，从而实质上不会渗入细胞内的化合物。另外，高分子化合物优选是不会引起生物材料的改性等的化合物。作为水溶性的高分子化合物，具体例如可列举交联型蔗糖高分子物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Percoll(商品名；以聚乙烯吡咯烷酮皮膜来包覆胶体状二氧化硅而得的高分子物)等。作为交联型蔗糖高分子物，具体例如可列举Ficoll PM70(商品名))等。Ficoll PM70是，用表氯醇使蔗糖进行交联(共聚)而获得的重量平均分子量约7万的高分子物。
与尿素及尿素衍生物不同的是，这些水溶性的高分子化合物实质上不会浸入细胞内，且为水溶性，因此有助于调整细胞内外的渗透压差。因此，有助于维持作为透明化处理对象的生物材料的原型，特别是有助于防止生物材料的膨胀。虽无特别限定，但本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”的渗透压若相对较高，则优选该试剂含有这些水溶性的高分子化合物。
“生物材料用透明化试剂”若要含有所述水溶性高分子，则第一生物材料用透明化试剂、第二生物材料用透明化试剂、及视需要而用的第三生物材料用透明化试剂的至少一方含有该高分子即可。但由于第二生物材料用透明化试剂所含的所述尿素系化合物的浓度高于第一及第三生物材料用透明化试剂所含的所述尿素系化合物的浓度，因此从更确实地抑制生物材料的膨润的观点看，有时也优选至少是第二生物材料用透明化试剂含有所述水溶性高分子化合物。另外，若第一～第二生物材料用透明化试剂(或第一～第三生物材料用透明化试剂)均需要含有所述高分子，则优选均含相同的高分子，更优选均以实质上相同的浓度含有相同的高分子。在此，所谓实质上相同的浓度，是指浓度差在0.01M以内。
(其他成分)
本发明中所用的所述“生物材料用透明化试剂”，也可视需要而含有选自于甘油、羧基乙烯基聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、以及聚乙二醇(macrogol)中的至少一种化合物来作为“干燥抑制成分”。干燥抑制成分可防止作为透明化处理对象的生物材料发生干燥。特别是自完成透明化处理时起，至提供给光学显微镜做观察时为止的时间相对较长时，或提供给光学显微镜做观察的时间较长时，优选本发明的试剂含有所述干燥抑制成分。另外，上述列举的干燥抑制成分还表现出如下效果：可调节生物材料透明化试剂的渗透压，从而在某种程度上抑制生物材料的膨润。
“生物材料用透明化试剂”若要含有上述列举的干燥抑制成分，则第一生物材料用透明化试剂、第二生物材料用透明化试剂、及视需要而用的第三生物材料用透明化试剂的至少一方含有该干燥抑制成分即可。另外，从不但实现干燥抑制效果还抑制生物材料的轻微膨润的观点而言，有时也会仅在第一生物材料用透明化试剂、及视需要而用的第三生物材料用透明化试剂中添加所述干燥抑制成分。另外，若第一～第二生物材料用透明化试剂(或第一～第三生物材料用透明化试剂)均要含有所述干燥抑制成分，则优选均含有相同的干燥抑制成分，更优选以实质上相同的浓度含有干燥抑制成分。
另外，本发明中所用的所述“生物材料用透明化试剂”除了含有所述“尿素及/或尿素衍生物”、“表面活性剂”及“水溶性高分子化合物”以外，也可以视需要而例如含有pH值调整剂、渗透压调整剂等添加剂。
(溶剂)
本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”是含有可供溶解尿素的溶剂的溶液。溶剂只要可以供溶解尿素，则其种类无特别限定，优选使用水作为主溶剂，特别优选仅使用水作为溶剂。另外，本发明中，所谓“使用水作为主溶剂”，是指水在所使用的全部溶剂中的体积比例相比于其他溶剂为最多。水在所使用的全部溶剂的合计体积中的用量优选大于50％且100％以下。另外，把以水为主溶剂而制备的“生物材料用透明化试剂”，称为使用水溶液的“生物材料用透明化试剂”。
另外，在使用水作为主溶剂时，例如可将二甲基亚砜(DMSO)与水混合，并用到得以固定了的标本中。例如若将DMSO与水混合并用到得以固定了的标本中，就可期待提高试剂向生物材料的渗透性、及促进具有角质表面的组织的透明化处理等这些效果。
使用水作为溶剂时的主要优点如以下。1)本发明中所用的所述“生物材料用透明化试剂”的有效成分即尿素在水中的溶解性优异，因此生物材料用透明化试剂的制备较容易且成本低。2)与使用有机溶剂作为主溶剂的方案相比，作为处理对象的生物材料不会在透明化处理的过程中发生脱水，因此可抑制生物材料收缩的问题。3)与使用有机溶剂作为主溶剂的方案相比，对荧光蛋白质造成损伤的可能性有显著的降低，因此能利用荧光蛋白质来观察经过了透明化处理的生物材料。4)并不仅限于是经固定了的材料，也能适于活体材料的透明化处理。5)如后文所述的，能实现透明化处理的可逆性，因此能视需要而使透明化处理后的活体试样恢复成透明化处理前的状态。6)与使用有机溶剂作为主溶剂的方案相比，操作的安全性更高。
另外，本发明中所用的所述“生物材料用透明化试剂”也可以是，能对作为透明化处理对象的生物材料的理想pH值进行维持的缓冲液。此外，可以对本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”的渗透压的程度加以调整，以抑制成为透明化处理对象的生物材料发生变形，且使尿素充分渗透到该生物材料内。
另外，对于尿素衍生物，也可以与使用尿素的方案同样，使用上述溶剂。
“生物材料用透明化试剂”若为水溶液，则第一生物材料用透明化试剂、第二生物材料用透明化试剂、及第三生物材料用透明化试剂的至少一方是水溶液即可。其中，优选第一～第二生物材料用透明化试剂(或第一～第三生物材料用透明化试剂)均为水溶液。
(组分的量关系)
只要生物材料的透明化处理有所发展，则本发明中所用的所述“生物材料用透明化试剂”中的“尿素”的含量无特别限定。另外，“尿素”的含量的上限、即第二生物材料用透明化试剂中的尿素含量的上限，取决于尿素在所使用的溶剂中的溶解度。虽然处理时间取决于成为对象的生物材料的种类，但例如可以在“生物材料用透明化试剂”中尿素的含量相对较少时延长处理时间，在尿素的含量相对较多时缩短处理时间。由此来进行所需的透明化处理。
另外，若要使用“表面活性剂”，则其含量无特别限定。表面活性剂的含量浓度优选落在0.025(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围内，更优选落在0.05(w/v)％以上0.5(w/v)％以下的范围内，特别优选落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内。这里的单位(w/v)％指：所用的表面活性剂的重量(w(克))相对于“生物材料用透明化试剂”的体积(v(毫升))的百分率。
另外，若要使用“水溶性高分子化合物”，则其含量无特别限定。水溶性高分子化合物的含量浓度优选落在2.5(w/v)％以上40(w/v)％以下的范围内。就生物材料的膨胀抑制效果、与透明化处理后的折射率之间的平衡性而言，所述含量浓度更优选落在5(w/v)％以上25(w/v)％以下的范围内，进而优选落在10(w/v)％以上20(w/v)％以下的范围内，特别优选落在10(w/v)％以上15(w/v)％以下的范围内。这里的单位(w/v)％指：所用的“水溶性高分子化合物”的重量(w(克))相对于“生物材料用透明化试剂”的体积(v(毫升))的百分率。
另外，若要使用甘油等“干燥抑制成分”，则其含量无特别限定。干燥抑制成分的含量浓度优选落在2.5(w/v)％以上20(w/v)％以下的范围内，更优选落在5(w/v)％以上15(w/v)％以下的范围内，特别优选落在8(w/v)％以上12(w/v)％以下的范围内。这里的单位(w/v)％指：所用的“干燥抑制成分”的重量(w(克))相对于“生物材料用透明化试剂”的体积(v(毫升))的百分率。
(成为处理对象的生物材料)
在用所述“生物材料用透明化试剂”来进行的透明化处理中，成为处理对象的生物材料的种类并无特别限定，优选源自植物的材料或源自动物的材料，更优选源自鱼类、两栖类、爬虫类、鸟类或哺乳类(哺乳动物)等动物的材料，特别优选源自哺乳动物的材料。另外，哺乳动物的种类并无特别限定，可列举：小鼠、大鼠、兔、土拨鼠、除人类以外的灵长类等实验动物；狗、猫等玩赏动物(宠物)；牛、马等家畜；人类。
另外，生物材料可以是生物个体本身(活着的人类个体除外)，也可以是从多细胞生物的个体中获取的器官、组织、或细胞。由于本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”具有优异的透明化处理能力，因此即使生物材料是源自多细胞动物的组织或器官(例如整个脑或其一部分)、或除人类以外的多细胞动物的个体(例如胚胎等)本身，透明化处理也能适用于其。
另外，所述生物材料可以是供进行显微镜观察的经固定(fixed)处理的材料，也可以是未经固定化的材料。另外，若需使用经固定了的材料，则优选进行如下处理：在固定化处理后，例如在20(v/w)％蔗糖-PBS(phosphate bufferedsaline，磷酸盐缓冲盐水)溶液中进行充分(例如24小时以上)浸渍。优选进而进行如下处理：将该材料埋于OCT组合物(Optimum Cutting Temperaturecompound)中并且用液态氮冷冻后，在PBS中解冻，用4(v/w)％PFA(Paraformaldehyde，多聚甲醛)-PBS液再次固定。
所述生物材料具体例如可以是：被注入了荧光性化学物质的活体组织、经荧光性化学物质染色的活体组织、被移植有表达了荧光蛋白质的细胞的活体组织、或表达了荧光蛋白质的转基因动物活体组织等。
(生物材料用透明化试剂的制备)
本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”的制备方法为：将“尿素及/或尿素衍生物”、以及视需要而用的“表面活性剂”、“水溶性高分子化合物”、“干燥抑制成分”等溶解到溶剂中，由此制备生物材料用透明化试剂。溶剂中的溶解或混合的顺序并无特别限定。
(经透明化处理的生物材料的观察步骤)
继而将经透明化处理的生物材料提供至例如用光学显微镜进行观察的观察步骤。可以视需要而在所述透明化处理步骤前，或在透明化处理步骤后且观察步骤前，对提供至观察步骤的生物材料实施染色或做标记等可视化处理步骤。
例如，可视化处理步骤中若需要利用荧光蛋白质，则可以在透明化处理步骤之前，通过对活的生物材料导入荧光蛋白质基因，来使该生物材料表达荧光蛋白质。
另外，若需要将荧光性化学物质(荧光蛋白质除外)注入生物材料，或需要用荧光性化学物质来对生物材料进行染色，则优选在所述透明化处理步骤前进行可视化处理步骤。但也可以在所述透明化处理步骤后进行可视化处理步骤。此外，作为可视化处理步骤，也可以用荧光性化学物质以外的化学物质来进行染色。
观察步骤，可使用各种光学显微镜来进行。例如，可以运用三维超分辨率显微镜技术(例如STED(stimulated emission depletion，受激发射损耗显微技术)、3D PALM(3D photoactivated localization microscopy，3D光激活定位显微技术)、FPALM(Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy，荧光光激活定位显微技术)、3D STORM(3D stochastic optical reconstruction microscopy，3D随机光学重构显微技术)、及SIM(structure illumination microscopy，结构照明显微技术))来实施观察步骤。另外，优选应用多光子激发型(通常为双光子激发型)光学显微镜技术来进行观察步骤。
(其他应用)
用所述“生物材料用透明化试剂”来进行的透明化处理是可逆的。因此，对于经透明化处理的生物材料，例如可以将其浸渍到平衡盐溶液中来除去生物材料透明化试剂的成分，使其恢复成透明化处理前的状态。在此，所谓平衡盐溶液，具体例如可列举：PBS、HBSS等通过磷酸盐而成为缓冲液的平衡盐溶液；通过三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐而成为缓冲液的平衡盐溶液(TBS)；人工脑脊液(ACSF，artificial cerebrospinal fluid)；MEM(Minimum Essential Medium，最小限必需培养基)、DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，杜氏改良培养基)、及Ham′s F-12等用于培养细胞的基础培养基等。
使用了所述“生物材料用透明化试剂”时，则不会在透明化处理的前后阶段、也不会在完成透明化处理而恢复到透明化处理前的状态时，引起生物材料中的蛋白质等的改性等。因此，生物材料中所含的蛋白质等的抗原性也能保持不变。因此，例如可以对生物材料进行透明化处理并利用光学显微镜进行观察，然后将该生物材料恢复成透明化处理前的状态，并运用通用的组织染色方法、或免疫染色方法来进行详细分析等。
[2.生物材料用透明化处理试剂盒、及处理系统]
(生物材料用透明化处理试剂盒)
本发明的“生物材料用透明化处理试剂盒”具备：第一溶液，其以规定的浓度而含有所述尿素系化合物；第二溶液，其以比所述第一溶液高的浓度而含有所述尿素系化合物。在此，第一溶液相当于所述第一及第三生物材料用透明化试剂，第二溶液相当于所述第二生物材料用透明化试剂。另外，使用不同的溶液来作为第一、第三生物材料用透明化试剂时，那么“生物材料用透明化处理试剂盒”也可以具备：组分不同于第一溶液的第三溶液，其以比第二溶液低的浓度而含有所述尿素系化合物。
“生物材料用透明化处理试剂盒”也可以进而具备以下至少一方：所述透明化处理步骤中使用的”处理容器”、“生物材料夹持器具(镊子等)”、用以将透明化处理后的生物材料恢复成透明化处理前的状态的“平衡盐溶液”、以及“试剂盒的操作说明书”。另外，试剂盒的操作说明书中例如记载有：上述“(透明化处理方法的概要)”栏中所述的、运用第一～第二生物材料用透明化试剂、优选使第一～第三生物材料用透明化试剂来进行的透明化处理方法的顺序等。
以下例示第一溶液～第三溶液的更具体的组分例。这些透明化试剂极其适于对小鼠等哺乳动物的整个脑、脑的一部分(例如海马区、整个大脑或大脑的一部分)、及胚胎进行透明化处理。
·第一溶液(1)、或第三溶液(1)例如是：
将尿素以浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内的方式溶解在水中而获得的水溶液。尿素的浓度更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，进而优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。
·第一溶液(2)、或第三溶液(2)例如是：
使水中含有浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)、以及浓度落在8(w/v)％以上12(w/v)％以下的范围内的“干燥抑制成分(例如甘油)”，从而获得的水溶液。尿素的浓度更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，进而优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。
·第一溶液(3)、或第三溶液(3)例如是：
使水中含有浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)、浓度落在8(w/v)％以上12(w/v)％以下的范围内的“干燥抑制成分(例如甘油)”、以及浓度落在5(w/v)％以上25(w/v)％以下的范围内的“水溶性高分子化合物(例如Ficoll)”，从而获得的水溶液。尿素的浓度更优选落在3.5M以上4.5M以下的范围内，进而优选落在3.7M以上4.3M以下的范围内。
·第一溶液(4)、或第三溶液(4)例如是：
使水中含有浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)、浓度落在8(w/v)％以上12(w/v)％以下的范围内的二甲基亚砜(DMSO)，从而获得的水溶液。尿素的浓度更优选落在3.SM以上4.5M以下的范围内，进而优选落在3.7M以上、4.3M以下的范围内。
·第二溶液(1)例如是：
将尿素以浓度落在5.5M以上8.5M以下的范围内的方式溶解在水中而获得的水溶液。尿素的浓度更优选落在6M以上8.5M以下的范围内，进而优选落在7.7M以上8.2M以下的范围内。
·第二溶液(2)：
使水中含有浓度落在5.5M以上8.5M以下的范围内的尿素、浓度落在0.05(w/v)％以上0.2(w/v)％以下的范围内的非离子性表面活性剂(例如TritonX-100)，从而获得的水溶液。尿素的浓度更优选落在6M以上8.5M以下的范围内，进而优选落在7.7M以上8.2M以下的范围内。
另外，若使用尿素衍生物(或尿素与尿素衍生物的混合物)来代替尿素，则只需采用与所述尿素浓度相同的浓度的尿素衍生物等来制备所述第一溶液(1)～(4)、第三溶液(1)～(4)、以及第二溶液(1)～(2)即可。
(生物材料透明化处理系统)
在本发明的生物材料透明化处理系统中，包含本发明中所用的“生物材料用透明化试剂”以及经单离的所述“生物材料”，且为了使该“生物材料”得以透明化而使“生物材料用透明化试剂”浸润到了该“生物材料”的内部。即，该处理系统的定义中例如包括：含有处在透明化处理过程中的生物材料的处理系统、含有已完成了透明化处理的生物材料的处理系统。
[实施例]
根据以下的参考例、实施例、及比较例等对本发明进行更具体说明，但本发明并不限定于此。另外，各参考例中例示的含有尿素来作为有效成分的生物材料用透明化试剂，适于用作本发明的第一～第三生物材料用透明化试剂。
[参考例1：海马区的观察]
(全身固定步骤)
使用在神经系统的神经元上表达了荧光蛋白质YFP(Yellow FluorescentProtein，黄色荧光蛋白)的出生后7～8周龄的转基因小鼠(YFP-H line：由美国Harvard大学Josh Sanes教授提供。[参考文献]Feng et al.Neuron，28：41-51，2000)，使用蠕动泵(peristaltic pump)自左心室灌注冰冷PBS，然后灌注冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH值为7.4)来将小鼠的全身完全固定。
(生物材料的摘出及固定步骤)
然后，除去小鼠的头盖骨，十分小心地摘出海马区。然后，在4℃的环境下使摘出的海马区在冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH值为7.4)中浸渍一晚。其后，将该海马区转移到20％蔗糖-PBS溶液中，并在4℃的环境下缓慢振荡24小时。
接着，用20％蔗糖-PBS溶液对海马区的组织实施了完全的置换后，将其埋于OCT compound中，并用液态氮进行冷冻。接着，将冷冻后的海马区转移到PBS中，在室温下解冻。将解冻后的海马区再次在4％多聚甲醛-PBS中固定1小时。
(生物材料的透明化处理及观察步骤)
最后，在室温下，将再固定了的海马区在本参考例的生物材料用透明化试剂中浸渍、振荡了3天。该生物材料用透明化试剂是将4M浓度的尿素溶解于纯水中而成的水溶液。在透明化完成的同时(自处理开始起3天后)，将海马区封入琼脂糖凝胶(浓度为0.5％(w/v)以下)中，利用具备920nm波长激光器的正置式双光子显微镜(商品名FV1000MPE，Olympus公司制造)，从海马区的基底侧到表面侧，进行了观察。另外，供进行观察的物镜的工作距离(workingdistance)为2mm。
观察的结果示于图1。如图1所示，通过利用本参考例的生物材料用透明化试剂来进行透明化处理，能对包罗了齿状回(Dentate Gyrus：DG)、CA1以及海马区表面的、深度约为1.9mm(相当于生物材料的厚度)的区域进行清晰的观察。
[参考例2：海马区的观察、及试剂的研究]
使用将4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、10％(w/v)浓度的甘油溶解到纯水中而成的水溶液(以下称为SCALE-A2试剂)，来作为上述“(生物材料的透明化处理步骤)”中所用的生物材料用透明化试剂，并且，从海马区的表面侧到基底侧，进行了观察。除这两方面以外，均按照与所述参考例1相同的方法，对小鼠的海马区进行观察。
观察的结果示于图2。如图2所示，通过利用本参考例的生物材料用透明化试剂来进行透明化处理，能对包罗了海马区表面、CA1、齿状回(DG)、以及海马区基底的、深度约为2mm(相当于生物材料的厚度)的区域进行清晰的观察。
[参考例3：大脑的观察]
除以下处理1)～3)以外，均按照与参考例1相同的方法，对小鼠的大脑进行了观察。
1)在所述“(生物材料的摘出及固定步骤)”中将整个大脑摘出，将该大脑固定而用作生物材料。
2)在所述“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中，使用与参考例2相同的SCALE-A2试剂来作为生物材料用透明化试剂。
3)在所述“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中，使用工作距离为3mm的物镜，从大脑的表面(大脑皮质)侧向海马区侧进行了观察。
观察的结果示于图3。如图3所示，通过利用本参考例的生物材料用透明化试剂来进行透明化处理，不仅能对大脑皮质、V-VI层进行清晰观察，还能对包罗了大脑皮质下部的白质区域(corpus callosum)、海马区的纤维束(fiber tract)、以及构成CA1及齿状回(DG)等的细胞群的、深度约为3mm(物镜的工作极限)的区域进行清晰的观察。
而当运用现有技术中的透明化试剂时，因无法将大脑皮质下部的白质区域透明化，所以未能观察到比白质区域更深的区域。
[参考例4：试剂的研究]
按照以下的条件，对SCALE-A2试剂使生物材料膨润的程度进行了评价，并对并用有Ficoll时的膨润抑制效果进行了评价。
1)首先，将透明化处理的时间设为2天，除此以外，均按照参考例3中记载的方法，使用SCALE-A2试剂对小鼠的大脑进行了透明化处理。然后，测定了透明化处理后的大脑的体积。透明化处理的时间只要确保为2天，就能使小鼠的大脑透明至可观察的程度。
2)使用在SCALE-A2试剂中添加浓度为5％(w/v)、20％(w/v)的Ficoll而得的试剂，来作为透明化试剂。除此以外，均按照与上述条件1)相同的方式对小鼠的大脑进行了透明化处理。然后分别测定了透明化处理后的大脑的体积。
3)作为对照组，测定了刚在PBS中浸渍过(0天)的小鼠大脑的体积。
观察的结果示于图4。如图4所示，与对照组(图中记为“PBS”)相比，经过了上述1)所述处理的大脑(图中记为“SCALE-A2”)发生了膨润，而经过了上述2)所述处理的大脑随着Ficoll的添加量而相应地被抑制了膨润。特别是当使用添加有20％(w/v)浓度的Ficoll的透明化试剂时，膨润被抑制了85％以上(图中，记为“SCALE-A2+20％Ficoll”)。
另外，虽然特别优选未发现有膨润或退化的大脑，但发现有膨润或退化的大脑也能用作光学显微镜观察用的试样。
[参考例5]
除以下处理1)、2)以外，均按照与参考例1相同的方法，对小鼠的大脑进行了观察。
1)在“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中，使用将4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、10％(w/v)浓度的甘油、及10％(w/v)浓度的Ficoll溶解到纯水中而成的水溶液作为生物材料用透明化试剂，进行了3天的透明化处理。
2)在“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中，使用工作距离为2mm的物镜，自大脑的表面(大脑皮质)侧向海马区侧进行了观察。
观察的结果示于图5。如图5所示，通过利用本参考例的生物材料用透明化试剂进行透明化处理，不能可对大脑皮质、V-VI层进行清晰的观察，还能对包罗大脑皮质下部的白质区域(corpus callosum)、海马区的纤维束(fiber tract)、以及构成CA1等的细胞群的、深度约为2.16mm(物镜的工作极限距离)的区域进行清晰观察。
而当运用现有技术中的透明化试剂时，因无法将大脑皮质下部的白质区域透明化，所以未能观察到比白质区域更深的区域。
[参考例6：透光率的评价]
针对分别用水、PBS、8M浓度的尿素水溶液(透明化试剂)、4M浓度的尿素水溶液(透明化试剂)、透明化试剂SCALE-A2(含有4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、10％(w/v)浓度的甘油的水溶液)、及透明化试剂SCALE-D2(含有4M浓度的尿素和0.1％(w/v)浓度的Triton X-100、10％(w/v)浓度的DMSO的水溶液)处理了1天的小鼠脑切片(厚度60μm)的大脑皮质部分，测定了其在波长200nm～1 000nm的光下的透光率。在此，光的波段200nm～1 000nm包罗了双光子显微镜观察上常用的激发波长域、以及观察对象即荧光蛋白质的主要荧光波长域。
另外，使用多通道(multichannel)式检测PMA-2(日本Hamamatsu Photonics公司制造)进行了透光率测定。测定的结果示于图6。如图6所示，使用8M浓度的尿素水溶液、4M浓度的尿素水溶液、透明化试剂SCALE-A2、及透明化试剂SCALE-D2时的透光率均为80％以上，这与使用水或PBS的处理不同，发挥了显著的透明化处理效果。
[参考例7：小鼠胎仔的透明化处理]
将表达Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)的转基因小鼠(日本理化学研究所脑科学综合研究中心的细胞功能探索技术开发小组所独自制造、繁殖的小鼠；参考文献：Sakaue-Sawano et al.，Cell，132(3)：487-98，2008.)的胎生后第13.5天的胎仔，用4(v/w)％PFA-PBS固定了2天后，将其浸渍到20(v/w)％蔗糖-PBS溶液中，暂时冷冻后又进行了解冻。然后，再次用4(v/w)％PFA-PBS固定了1小时。其后，浸渍到参考例2中记载的SCALE-A2中7天，由此进行了透明化处理。
然后，将所述胎仔封入琼脂糖凝胶(浓度0.5％(w/v)以下)中，利用荧光立体显微镜(商品名MZ10F；Leica公司制造)进行了观察。供观察的物镜的工作距离是70mm。
观察的结果示于图7。如图7所示，利用本参考例的生物材料用透明化试剂来进行透明化处理后，虽然仅肝脏稍有黄色残留，但小鼠胎仔的全身显著变得透明。另外，图7中记载的“mr”(Mounting rubber)是用来支撑小鼠胎仔头部的衬垫橡胶。
[参考例8：小鼠海马区的神经干细胞的观察]
(全身固定步骤)
使用出生后6周龄的表达Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)的转基因小鼠(日本理化学研究所脑科学综合研究中心的细胞功能探索技术开发小组所独自制造、繁殖的小鼠；[参考文献]Sakaue-Sawano et al.，Cell，132(3)：487-98，2008.)，用蠕动泵自该小鼠的左心室灌注冰冷PBS后，灌注冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH值为7.4)，由此将小鼠的全身完全固定。
(生物材料的摘出及固定步骤)
然后，除去小鼠的头盖骨，十分小心地摘出海马区的齿状回。然后，在4℃的环境下使摘出的海马区的齿状回在冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS，pH值为7.4)中浸渍一晚。其后，将该海马区的齿状回转移到20％蔗糖-PBS溶液中，并在4℃的环境下缓慢振荡24小时。
接着，用20％蔗糖-PBS溶液对海马区的齿状回实施了完全的置换后，将其埋于OCT compound中，并用液态氮进行冷冻。接着，将冷冻后的海马区的齿状回转移到PBS中，在室温下解冻。将解冻后的海马区的齿状回再次在4％多聚甲醛-PBS中固定1小时。
另外，本参考例所使用的海马区的齿状回是由凝集素-德克萨斯红(Lectin-Texas Red)共轭物将其血管染色。
(生物材料的透明化处理及观察步骤)
最后，在室温下，将再固定了的海马区的齿状回在本参考例的生物材料用透明化试剂中浸渍、振荡了3天。该生物材料用透明化试剂是将4M浓度的尿素、0.1％(w/v)浓度的TritonX-100、10％(w/v)浓度的甘油溶解于纯水中而成的水溶液。在透明化完成的同时(自处理开始起3天后)，将海马区的齿状回封入琼脂糖凝胶(浓度为0.5％(w/v)以下)的薄膜中，利用具备920nm波长激光器的正置式双光子显微镜(商品名FV1000MPE，Olympus公司制造)进行了观察。另外，供进行观察的物镜的工作距离(working distance)为2mm。另外，自腹侧海马区表面起至1.7mm的深度为止，对18个连续区域进行了观察，然后将观察的结果重新合成为一个整合图像。
观察的结果示于图8。如图8所示，利用本参考例的生物材料用透明化试剂来进行透明化处理后，可在血管周围看到Fucci-S-Green(Fucci-S/G2/M)阳性的神经干细胞。
[参考例9：神经干细胞移植的观察]
从表达荧光蛋白Venus的成年大鼠的海马区获取神经干细胞，将该神经干细胞移植到大鼠系统Fisher(F344)(从日本SLC购入)的大脑皮质部分(第V层附近、深度约1.7mm的部位)中。
移植了神经干细胞后，按照所述参考例8的“(全身固定步骤)”中记载的方法，对经过了3天的大鼠系统Fisher(F344)进行固定。然后，按照所述参考例8的“(生物材料的摘出及固定步骤)”中记载的方法，将大鼠系统Fisher(F344)的大脑皮质固定。另外，本参考例中所用的大鼠的大脑皮质，其血管通过凝集素-德克萨斯红(Lectin-Texas Red)共轭物而被染色。
接着，按照所述参考例8的“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中记载的方法对大脑皮质进行观察。观察的结果示于图11。如图11所示，利用本参考例的生物材料透明化试剂来进行透明化处理后，观察到了表达荧光蛋白Venus的神经干细胞聚集在血管(经过了Lectin Texas-Red共轭物的染色)附近的样子。本方法也适合于观察移植后的细胞的移动及形态变化等。
[参考例10：与BABB法的比较(1)]
从出生后12周龄的在神经系统上表达了荧光蛋白质YFP的转基因小鼠(YFP-H line：由美国Harvard大学Josh Sanes教授提供。参考文献：Feng et al.Neuron，28：41-51，2000)中摘出大脑，用SCALE-A2试剂(参照参考例2)进行透明化处理，还运用非专利文献2中记载的由Dodt等人提出的苯甲酸苄酯/苄醇(benzylbenzoate/benzylalchol(BABB))法进行透明化处理，并对这两种透明化处理进行了比较。
另外，透明化处理均是通过将大脑浸渍到透明化处理液中2天的方式来进行的。另外，所述BABB法中所用的透明化处理液的组分为benzylalchol和benzylbenzoate(两者的组分比=1：2)。
将结果示于图9。在图9的记有“Transmission”图列以及记有“YFP”的图列中，上半部分是用SCALE-A2试剂进行处理后的结果，下半部分是用BABB法进行处理后的结果。另外，“Transmission”表示的是穿透式显微镜的观察结果，“YFP”表示的是荧光显微镜观察到的来自YFP的荧光的结果。
如图9所示，利用SCALE-A2试剂进行的透明化处理中，可明确地观察到YFP发出的荧光。另一方面，利用BABB法进行透明化处理的大脑有显著的缩小，且来自YFP的荧光有显著的减弱。
[参考例11：与BABB法的比较(2)]
将编码荧光蛋白质的各种基因导入HeLa细胞(由东京大学医科学研究所分让而得的细胞；参考文献：Scherer et al.，J.Exp.Med.97(5)：695-710，1953)，以使其表达相应的荧光蛋白质。在此，用以使HeLa细胞进行表达的荧光蛋白质为：SECFP、EGFP、mAG1、Venus、及DsRed。EGFP及DsRed是从Clontech公司购入的。mAG1是从MBL公司购入的。Venus及SECFP，是由日本理化学研究所日本脑科学综合研究中心的细胞功能探索技术开发小组根据GFP，以基因水平来引发变异而制作的。参考文献：SECFP，Hadjantonakis et al.，BMC Biotechnol.，2：1 1，2002.：EGFP，Zhang et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，227：707-7 11，1996.：Venus，Nagai et al.，Nat.Botech.，20：87-90，2002.：mAG1，Karasawa et al.，J.Biol.Chem.，278(36)：34167-34171，2003.：Baird et al.，PNAS.，97(22)：11984-11989.2000.。
然后，以与参考例10相同的方式，用SCALE-A2试剂(参照参考例2)进行透明化处理，还运用非专利文献2中记载的由Dodt等人提出的苯甲酸苄酯/苄醇(benzylbenzoate/benzylalchol(BABB))法进行透明化处理，并比较这两种透明化处理的结果。
观察的结果示于图10。将来自透明化处理前荧光蛋白质的荧光强度设为100，在图10中表示了来自透明化处理后的各荧光蛋白质的荧光强度的相对值。根据图10，明确可见在用SCALE-A2试剂进行的透明化处理中，来自荧光蛋白质的荧光强度均维持在80％以上，而在利用BABB法进行的透明化处理中，来自荧光蛋白质的荧光强度均显著减弱。
[参考例12：透明化处理后的组织的恢复]
用GFP转基因小鼠及YFP转基因小鼠(GFP-M line及YFP-H line，由美国哈佛大学Josh Sanes教授提供)的海马区制作了2.5mm厚的切片，先用SCALE-A2试剂(参照参考例2)进行透明化处理5天而使其透明化，而后用PBS冲洗3次而将其恢复成非透明状态的组织，对恢复后的免疫染色性、以及尚未用SCALE-A2试剂进行透明化处理前的免疫染色性进行了比较。
免疫染色的步骤如下：将可对幼稚神经细胞表面上存在的PSA-NCAM的聚唾液酸进行识别的源自小鼠的抗PSA-NCAM(polysialilated neural cell adhesionmolecule)单克隆抗体(Millipore公司制造)、以及在星形胶质细胞中可对特异性中间丝GFAP(glial fibrillary acidic protein，胶质原纤维酸性蛋白)进行识别的源自兔的抗GFAP多克隆抗体(Sigma公司制造)作为1次抗体，在4℃下反应24小时后用PBS进行冲洗。其后，使用被Alexa Fluor546标记了的抗小鼠IgM抗体(Invitrogen，Molecular Probes公司制造)作为2次抗体，使其与抗PSA-NCAM单克隆抗体在室温下进行3小时的反应。还使用被Alexa Fluor633标记了的抗兔IgG抗体作为2次抗体(Invitrogen，Molecular Probes公司制造)，使其与GFAP多克隆抗体在室温下进行3小时的反应，由此进行了免疫组织染色。由于这些切片的荧光无衰减，因此获得了包括GFP和YFP的荧光在内的3重荧光影像。观察时，使用倒置式共焦激光显微镜(FV500，Olympus公司制造)，并用20倍物镜(UplanApo20，Olympus公司制造)来进行了观察。
如图12所示，无论是用SCALE-A2进行处理前(图中“SCALE处理前”所示的部分)还是处理后(图中“恢复后”所示的部分)，海马区齿状回中存在的幼稚神经细胞、以及自该细胞沿伸到CA3区域的苔状纤维均通过抗PSA-NCAM单克隆抗体而得以实质正常地染色。另外，星形胶质细胞也通过抗GFAP多克隆抗体而同样被正常地染色。
[实施例1：大脑的观察]
(生物材料的摘出及固定步骤)
将全身麻醉而昏睡的小鼠的胸腹切开，自左心室注入4％多聚甲醛-PBS溶液来进行全身灌注、固定，然后摘出大脑。将摘出的大脑浸渍到冰冷固定液(4％多聚甲醛-PBS溶液)中固定8～12小时。其后，将该大脑浸渍到20％蔗糖-PBS溶液中2天，以完全地置换。
然后，将该大脑埋于OCT compound中，并用液态氮进行冷冻。接着，将冷冻的大脑连同OCT compound一起在PBS中一面振荡一面解冻。交换PBS并冲洗后，使用4％多聚甲醛-PBS对大脑进行约30分钟的再固定。
(透明化处理步骤)
接着，将再固定了的大脑转移到参考例2所述的生物材料用透明化试剂(SCALE-A2)中，在室温下振荡2天(第一浸润步骤)。接着，将大脑转移到含有更高浓度的尿素的生物材料用透明化试剂(称其为“试剂B”)中，在室温下振荡2天(第二浸润步骤)。试剂B是将8M浓度的尿素、及0.1％(w/v)浓度的TritonX-100溶解于纯水中而成的水溶液。然后，将大脑转移到新鲜的SCALE-A2液中，在室温下振荡2～3天，由此完成了透明化(第三浸润步骤)。另外，相对于大脑的湿重1g，所用的SCALE-A2的液量以及试剂B的液量分别约为30ml。
如上所述，与单使用SCALE-A2进行透明化处理的方案相比，通过在整个处理流程的中间插入用尿素浓度较高的试剂B进行透明化处理的这一方法，可在极短的处理时间(约一半)内达成相同的透明化度。
[实施例2：海马区的观察]
除以下处理1)～3)以外，均按照与参考例1相同的方法，对小鼠的海马区进行观察。
1)使用了出生后6周龄的野生型(非转基因)的正常C57BL6系统雄小鼠。
2)在“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中，按以下方式进行了透明化处理：首先，在室温下，用SCALE-A2试剂(参考例2)将再固定了的海马区浸渍、振荡了48小时(第一浸润步骤)；而后，在室温下，用试剂B(实施例1)浸渍、振荡了48小时。
3)在观察步骤中，将海马区配置在带有图案的基板上，根据是否能透过海马区看到图案来判定透明化度。
另外，作为参考例，于室温下，将再固定了的海马区，分别在PBS中浸渍、振荡了96小时以及在SCALE-A2试剂中浸渍、振荡了96小时。由此制备了对照物。
观察的结果如图13所示。图13中的A是用PBS处理过的海马区(参考例)，B是用SCALE-A2试剂处理过的海马区(参考例)，C是用SCALE-A2试剂及试剂B处理过的海马区(实施例)。如图13所示，在以同样的处理时间进行比较的情况下，可知实施例与任意参考例相比，透明化度均明显较高。另外，由于处理前的海马区的大小均大致相同，可见图13中C所示海马区的体积相比于B所示海马区并无更大的膨胀。
[实施例3：脑切片的观察]
除以下处理1)～3)以外，均按照与参考例1相同的方法，对小鼠的脑切片进行观察。
1)使用了出生后6周龄的野生型(非转基因)的正常C57BL6系统雄小鼠。
2)在“(生物材料的摘出及固定步骤)”中，将小鼠的整个脑摘出，与参考例1同样地进行了固定及再同定。
3)在“(生物材料的透明化处理及观察步骤)”中，按以下方式进行了透明化处理：首先，用再固定了的脑，制作了含有海马区的冠状截面切片(厚度3mm)；接着，将该冠状截面切片，沿中央线切断成右半球侧切片和左半球侧切片，然后在室温下将其中一片半球侧切片用SCALE-A2试剂(参考例2)浸渍、振荡了24小时(第一浸润步骤)，接着，于室温下在试剂B(实施例1)中浸渍、振荡了24小时(第二浸润步骤)；然后，从该冠状截面切片上切下包含海马区的厚度1.5mm的冠状截面切片，将如此获得的冠状截面切片提供给第一次观察步骤(具体参见下一段落)；然后，将完成了第一次观察步骤的冠状截面切片用SCALE-A2试剂冲洗两次后，在室温下用SCALE-A2试剂浸渍、振荡了24小时(第三浸润步骤)，并将如此获得的冠状截面切片提供给第二次观察步骤(具体参见下一段落)。
3)在观察步骤中，使用分光光度计(日立公司制造，产品名U-3310Spectrophotometer)，测定了1.5mm厚的所述冠状截面切片在波长域300nm～920nm的光下的透光光谱。
另外，作为参考例，用再固定了的脑制作了包含海马区的冠状截面切片(厚度3mm)。然后，将该冠状截面切片沿中央线切断成右半球侧切片与左半球侧切片。在室温下，将其中一片半球侧切片用SCALE-A2试剂浸渍、振荡了72小时，从而制得了包含海马区的厚度1.5mm的冠状截面切片。
观察的结果如图14所示。图14中的“B”代表本实施例中第一次观察的结果，“B换为A2”代表第二次观察的结果，“SCALE-A2”代表参考例的结果。如图14所示，与参考例相比，可见实施例以相同或更短的处理时间实现了明显较高(约2倍)的透明化度。
另外，虽然未列出数据，但在使用SCALE-A2试剂、试剂B、及水时的方案中，波长域300nm～920nm的光下的透光光谱几乎相等。
[参考例13：尿素浓度对脑组织透明化的影响]
将8周龄的野生型C57BL6/J系统小鼠(从Japan SLC公司购入)的大脑的切片，浸渍于PBS、含4M浓度的尿素的水溶液、含6M浓度的尿素的水溶液、含8M浓度的尿素的水溶液中，并在室温下振荡12小时，由此进行了培养。
首先，使用丙烯系树脂制brain slicer(日本室町机械株式会社制造)，制备了2片厚度为1mm的、沿大脑的前后方向呈连续的大脑切片。接着，将2片切片大致均等地左右切开，以制成4片切片。然后，将4片切片分别浸渍于所述的各种水溶液中进行培养。结果示于图15。使用PBS时，未发现有组织的透明化。与此相比，使用含8M浓度的尿素的溶液时，虽组织发生了膨润，但透过组织而看到的背景图案最清晰。可知，在4M至8M的浓度范围下，透明化的发生程度依赖于尿素浓度。
本发明并不限于是所述各实施形态及实施例，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更。适当地组合不同实施方式中揭示的技术方案而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。
[产业上的可利用性]
本发明可提供一种运用生物亲和性优异的成分而实现的更为有效的生物材料透明化法、及其利用。
Claims (18)
1.一种生物材料的透明化方法，其特征在于包括：
第一浸润步骤，使以规定的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到生物材料中；第二浸润步骤，继而使以比第一浸润步骤中用的所述溶液高的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到所述生物材料中。
2.根据权利要求1所述的生物材料的透明化方法，其特征在于，
在所述第二浸润步骤之后还包括第三浸润步骤：
使以比该第二浸润步骤中用的所述溶液低的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物的溶液，浸润到所述生物材料中。
3.根据权利要求2所述的生物材料的透明化方法，其特征在于：
所述第一浸润步骤中所用的溶液与所述第三浸润步骤中所用的溶液以实质上相同的浓度含有所述化合物。
4.根据权利要求3所述的生物材料的透明化方法，其特征在于：
所述第一浸润步骤中所用的溶液与所述第三浸润步骤中所用的溶液为相同的溶液。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的透明化方法，其特征在于：
所述溶液均含有尿素来作为所述化合物。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的透明化方法，其特征在于：
所述溶液的至少一方为水溶液。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的透明化方法，其特征在于：
所述溶液的至少一方含有表面活性剂。
8.根据权利要求7所述的透明化方法，其特征在于：
所述表面活性剂为非离子性表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的透明化方法，其特征在于：
所述非离子性表面活性剂为选自由注册商标TritonX、注册商标Tween、及商品名NP-40所组成的群中的至少一种。
10.根据权利要求6所述的透明化方法，其特征在于：
所述水溶液还含有水溶性的高分子化合物。
11.根据权利要求10所述的透明化方法，其特征在于：
水溶性的所述高分子化合物为选自由注册商标Percoll、注册商标Ficoll、聚乙二醇、及聚乙烯吡咯烷酮所组成的群中的至少一种。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的透明化方法，其特征在于：
所述溶液的至少一方还含有选自由甘油、羧基乙烯基聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、及聚乙二醇所组成的群中的至少一种。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的透明化方法，其特征在于：
其使作为所述生物材料的源自多细胞动物的组织或器官、或除人类以外的多细胞动物得以透明化。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的透明化方法，其特征在于：
所述第一浸润步骤中所用的溶液中的所述化合物的浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内，并且所述第二浸润步骤中所用的溶液中的所述化合物的浓度落在6M以上8.5M以下的范围内。
15.一种用于生物材料的透明化处理试剂盒，其特征在于包含：
第一溶液，其以规定的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物；
第二溶液，其在所述第一溶液之后使用，其以比所述第一溶液高的浓度而含有选自由尿素及尿素衍生物所组成的群中的至少一种化合物，
所述第二溶液含有浓度落在5.5M以上8.5M以下的范围内的所述化合物、以及浓度落在0.025w/v％以上5w/v％以下的范围内的非离子性表面活性剂。
16.根据权利要求15所述的用于生物材料的透明化处理试剂盒，其特征在于：
所述第一溶液含有浓度落在2.5M以上5.5M以下的范围内的尿素、以及浓度落在0.025w/v％以上5w/v％以下的范围内的表面活性剂。
17.根据权利要求15或16所述的用于生物材料的透明化处理试剂盒，其特征在于：
所述第二溶液含有作为所述化合物的尿素。
18.根据权利要求15或16所述的用于生物材料的透明化处理试剂盒，其特征在于：
所述第一溶液含有选自由甘油、羧基乙烯基聚合物、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、及聚乙二醇所组成的群中的至少一种。
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