JPWO2012147965A1 - 生物材料を透明化する方法、及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(透明化処理方法の概要)
本発明に係る透明化処理法は、生物材料を透明化する方法であって、以下に示す第一浸潤工程と第二浸潤工程とをこの順に含む方法である。本発明に係る透明化処理法は、さらに、第二浸潤工程の後に第三浸潤工程を含むことが好ましい。
1)尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物(尿素系化合物と総称する場合がある)を所定の濃度で含む溶液(「第一生物材料用透明化試薬」)を、生物材料中に浸潤する第一浸潤工程、
2)第一浸潤工程で用いた上記溶液より高濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液(「第二生物材料用透明化試薬」)を、上記生物材料中に浸潤する第二浸潤工程、
3)第二浸潤工程で用いた上記溶液より低濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液(「第三生物材料用透明化試薬」)を、上記生物材料中に浸潤する第三浸潤工程。
第一浸潤工程は、上記第一生物材料用透明化試薬を、生物材料中に浸潤する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「第一生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
第二浸潤工程は、上記第二生物材料用透明化試薬を、生物材料中に浸潤する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「第二生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。第二生物材料透明化試薬は、第一生物材料透明化試薬、及び、必要に応じて用いる第三生物材料透明化試薬より高濃度で上記尿素系化合物を含むことによって、生物材料に対する尿素系化合物の浸透を促進すると推定される。
必要に応じて行われる第三浸潤工程は、上記第三生物材料用透明化試薬を、生物材料中に浸潤する工程である。より具体的には、例えば、透明化処理用の容器内で、上記の「生物材料」に対して「第三生物材料用透明化試薬」を浸潤させる。
本発明では、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素」を含む溶液を用いる。本発明にかかる他の態様では、生物材料を透明化する必須の有効成分として「尿素誘導体」を含む溶液を用いる。これら溶液は、上記「生物材料用透明化試薬」に相当する。
1)R1〜R4より選択される任意の3つの基が水素原子であり、残りの1つの基がハロゲン原子、又は炭素数1〜6以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの1つの基が、炭素数1〜3、又は炭素数が1〜2のアルキル基である。
2)R1〜R4より選択される任意の2つの基が水素原子であり、残りの2つの基が互いに独立にハロゲン原子、又は炭素数1〜6以下の鎖状炭化水素基である。より好ましくは残りの2つの基が何れも、炭素数1〜3、又は炭素数が1〜2のアルキル基である。なお、水素原子となる2つの基の一方はR1、R2の何れかから選ばれ、他方はR3、R4の何れかから選ばれることがより好ましい。
尿素は、毒性が極めて低い生体由来の成分である。そのため、本発明に用いる「生物材料用透明化試薬」は、1)固定化された生物材料はもとより、固定化されていない(生きた)生物材料の透明化にも用いうるものとなる。2)また、尿素は、蛍光タンパク質へのダメージ、及びその蛍光の消失が比較的少なく、蛍光タンパク質を用いた生物材料の観察にも適用しうるものとなる。3)尿素は、極めて安価で入手容易でもあり、かつ取扱い性に優れるため、極めて低コストかつ簡単な手順で透明化処理を行いうるものとなる。
本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、生物組織への本試薬の侵入を緩やかに向上させるという理由から、非イオン性の界面活性剤が好ましい。非イオン性の界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の脂肪酸系;ポリビニルアルコール等の高級アルコール系;ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のアルキルフェノール系の界面活性剤が挙げられる。具体的には、例えば、TritonX−100、及びTritonX-140等のTritonX(登録商標)シリーズ;Tween−20、Tween-40、Tween-60、及びTween-80等のTween(登録商標)シリーズ;NP-40(商品名);からなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。界面活性剤は、必要に応じて、二種以上を混合して使用することもできる。
本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて水溶性の高分子化合物をさらに含んでいてもよい。ここで、高分子化合物とは、分子量が例えば5万〜6万程度以上の大きさであって、細胞内に実質的に侵入しないものである。また、高分子化合物は、生物材料の変性等を引き起こさないものが好ましい。水溶性の高分子化合物として、具体的には、例えば、架橋型シュークロース高分子物質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、又はパーコール(商品名。コロイド状シリカをポリビニルピロリドン皮膜で被覆した高分子物質)等が挙げられる。架橋型シュークロース高分子物質として、具体的には例えば、フィコール(Ficoll)PM70(商品名))のような、シュークロースをエピクロルヒドリンで架橋(共重合)した重量平均分子量約7万の高分子物質等が挙げられる。
本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」は、必要に応じて、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、ならびにマクロゴールから選択される少なくとも一種の化合物を「乾燥抑制成分」として含むことができる。乾燥抑制成分は、透明化処理の対象となる生物材料の乾燥を防止する。とりわけ、透明化処理後に光学顕微鏡による観察に供されるまでの時間が比較的長い場合、或いは、光学顕微鏡による長時間観察に供される場合には、本発明の試薬は、上記の乾燥抑制成分を含むことが好ましい。また、上記列挙した乾燥抑制成分は、生物材料透明化試薬の浸透圧を調節し、生物材料の膨潤をある程度抑制する効果も示す。
本発明で用いる「生物材料用透明化試薬」は、尿素が可溶な溶媒を含む溶液である。溶媒の種類は、尿素が可溶な限り特に限定されないが、水を主溶媒として用いることが好ましく、水のみを溶媒として用いることが特に好ましい。なお、本発明において、「水を主溶媒として用いる」とは、使用される全溶媒に占める水の体積の割合が他の溶媒と比較して最も多いことを指し、好ましくは使用される全溶媒の体積の合計の50%を超え100%以下の量の水を用いることを指す。また、水を主溶媒として用いて調製された「生物材料用透明化試薬」を、水溶液としての「生物材料用透明化試薬」と称する。
本発明で用いる上記「生物材料用透明化試薬」における「尿素」の含有量は、生物材料の透明化処理が進展する限りにおいて特に限定されない。なお、「尿素」の含有量の上限、すなわち第二生物材料用透明化試薬における尿素の含有量の上限は、使用する溶媒に対する尿素の溶解度により決定される。対象とする生物材料の種類にも依存するが、例えば、「生物材料用透明化試薬」における尿素の含有量が比較的少ない場合には処理時間を長くし、尿素の含有量が比較的多い場合には処理時間を短くすることで必要な透明化処理を行うことができる。
上記「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理の対象となる生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料又は動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類(哺乳動物)等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物;イヌ、ネコ等の愛玩動物(ペット);ウシ、ウマ等の家畜;ヒト;が挙げられる。
本発明で用いる「生物材料用透明化試薬」の調製方法は、「尿素及び/又は尿素誘導体」、並びに、必要に応じて用いる「界面活性剤」、「水溶性の高分子化合物」、及び「乾燥抑制成分」等を、溶媒中に溶解することで調製される。溶媒中に溶解、又は混合する手順は特に限定されない。
透明化処理された生物材料は、次いで、例えば、光学顕微鏡による観察工程に供される。観察工程に供される生物材料は、必要に応じて、上記透明化処理工程の事前に、又は透明化処理工程後で観察工程前に、染色或いはマーキング等の可視化処理工程が施されてもよい。
上記「生物材料用透明化試薬」を用いた透明化処理は可逆的である。そのため、透明化処理された生物材料は、例えば、平衡塩類溶液に浸漬することにより、生物材料透明化試薬の成分を取り除き、透明化処理前の状態に戻すことが可能である。ここで、平衡塩類溶液とは、具体的には例えば、PBS、HBSSなどリン酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液;トリス塩酸塩によって緩衝液化された平衡塩類溶液(TBS);人工脳脊髄液(ACSF);MEM, DMEM, 及びHam’s F-12などの細胞培養用の基礎培地;等が挙げられる。
(生物材料用透明化処理キット)
本発明にかかる「生物材料用透明化処理キット」は、上記尿素系化合物を所定の濃度で含む第一溶液と、当該第一溶液より高濃度で上記尿素系化合物を含む第二溶液とを備える。ここで、第一溶液は上記第一及び第三生物材料用透明化試薬に相当し、第二溶液は上記第二生物材料用透明化試薬に相当する。また、第一・第三生物材料用透明化試薬として異なるものを用いる場合、「生物材料用透明化処理キット」は、上記尿素系化合物を第二溶液より低濃度で含み、第一溶液とは組成が異なる第三溶液を備えていてもよい。
・第一溶液(1)、又は第三溶液(1):
水に、尿素を2.5M以上で5.5M以下の範囲内の濃度で溶解した水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、3.5M以上で4.5M以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、3.7M以上で4.3M以下の範囲内である。
・第一溶液(2)、又は第三溶液(2):
水に、尿素を2.5M以上で5.5M以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤(例えば、TritonX-100)を0.05(w/v)%以上で0.2(w/v)%以下の範囲内の濃度で、さらに「乾燥抑制成分(例えば、グリセロール)」を8(w/v)%以上で12(w/v)%以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、3.5M以上で4.5M以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、3.7M以上で4.3M以下の範囲内である。
・第一溶液(3)、又は第三溶液(3):
水に、尿素を2.5M以上で5.5M以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤(例えば、TritonX-100)を0.05(w/v)%以上で0.2(w/v)%以下の範囲内の濃度で、「乾燥抑制成分(例えば、グリセロール)」を8(w/v)%以上で12(w/v)%以下の範囲内の濃度で、さらに「水溶性の高分子化合物(例えば、Ficoll)」を5(w/v)%以上で25(w/v)%以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、3.5M以上で4.5M以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、3.7M以上で4.3M以下の範囲内である。
・第一溶液(4)、又は第三溶液(4):
水に、尿素を2.5M以上で5.5M以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤(例えば、TritonX−100)を0.05(w/v)%以上で0.2(w/v)%以下の範囲内の濃度で、ジメチルスルホキシド(DMSO)を8(w/v)%以上で12(w/v)%以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、3.5M以上で4.5M以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、3.7M以上で4.3M以下の範囲内である。
・第二溶液(1):
水に、尿素を5.5M以上で8.5M以下の範囲内の濃度で溶解した水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、6M以上で8.5M以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、7.7M以上で8.2M以下の範囲内である。
・第二溶液(2):
水に、尿素を5.5M以上で8.5M以下の範囲内の濃度で、非イオン性の界面活性剤(例えば、TritonX-100)を0.05(w/v)%以上で0.2(w/v)%以下の範囲内の濃度で含ませてなる水溶液。より好ましくは、尿素の濃度が、6M以上で8.5M以下の範囲内であり、さらに好ましくは、尿素の濃度が、7.7M以上で8.2M以下の範囲内である。
本発明に係る生物材料透明化処理システムは、本発明に用いる「生物材料用透明化試薬」と、単離された上記「生物材料」とを含んでなり、この「生物材料」を透明化するために当該「生物材料」の内部に「生物材料用透明化試薬」が浸潤したものである。すなわち、当該処理システムとは、例えば、透明化処理の途中段階にある生物材料を含む処理システム、又は、透明化処理が完了した生物材料を含む処理システムを包含する概念である。
(全身固定工程)
神経系のニューロンに蛍光タンパク質YFPを発現したトランスジェニックマウス(YFP−H line:米国Harvard大学 Josh Sanes教授より供与されたもの。[参考文献] Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000)の生後7−8週齢のものを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷PBSを灌流した後、氷冷固定液(4% パラホルムアルデヒド−PBS, pH7.4)を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、海馬を注意深く摘出した。そして、摘出した海馬を氷冷固定液(4% パラホルムアルデヒド−PBS, pH7.4)に一晩、4℃の環境下で浸漬した。その後、この海馬を、20% シュークロース−PBS溶液中に移し24時間、4℃の環境下で緩やかに振盪した。
最後に、再固定した海馬を、本参考例に係る生物材料用透明化試薬に3日間、浸漬し、室温で振盪した。生物材料用透明化試薬は、4M濃度の尿素を純水に溶解した水溶液である。透明化が進んだ時点(処理開始から3日後)で、アガロースゲル(濃度0.5%(w/v)以下)中に海馬を封入し、920nmの波長のレーザーを備えた正立型2光子顕微鏡(商品名FV1000MPE:オリンパス社製)で、海馬の基底側から表面側まで観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離(working distance)は2mmであった。
上記(生物材料の透明化処理工程)で用いる生物材料用透明化試薬として、4M濃度の尿素、0.1%(w/v)濃度のTritonX−100、10%(w/v)濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液(SCALE−A2試薬と呼称)を用いた点、及び、海馬の表面側から基底側へ観察を行った点以外は、上記参考例1と同じ方法に従い、マウスの海馬の観察を行った。
以下の点1)〜3)以外は、参考例1と同じ方法に従い、マウスの大脳の観察を行った。
1) 上記(生物材料の摘出及び固定工程)において大脳全体を摘出し、この大脳を固定したものを生物材料として用いた点。
2) 上記(生物材料の透明化処理及び観察工程)において、参考例2と同一のSCALE−A2試薬を生物材料用透明化試薬として用いた点。
3) 上記(生物材料の透明化処理及び観察工程)において、作動距離が3mmの対物レンズを用いて大脳の表面(大脳皮質)側から海馬側に向けて観察を行った点。
以下の条件に従い、SCALE−A2試薬が生物材料を膨潤させる程度の評価、及びFicollを併用した膨潤抑制の効果について評価をした。
1)まず、透明化処理の期間を2日間とした以外は、参考例3に記載の方法に従い、SCALE−A2試薬を用いてマウスの大脳の透明化処理を行った。そして、透明化処理後の大脳の体積を測定した。なお、透明化処理の期間を2日間確保すれば、マウスの大脳は、観察可能な程度に透明化されていた。
2)また、透明化試薬として、SCALE−A2試薬にFicollを5%(w/v)濃度、或いは20%(w/v)濃度、添加したものを用いた以外は、上記1)と同様にしてマウスの大脳の透明化処理を行った。そして透明化処理後の大脳の体積をそれぞれ測定した。
3)コントロールとして、PBS中に浸漬した直後(0日間)のマウスの大脳の体積を測定した。
以下の点1)・2)以外は、参考例1と同じ方法に従い、マウスの大脳の観察を行った。
1) (生物材料の透明化処理及び観察工程)において、4M濃度の尿素、0.1%(w/v)濃度のTritonX−100、10%(w/v)濃度のグリセロール、及び10%(w/v)濃度のFicollを純水に溶解した水溶液を生物材料用透明化試薬として用い、3日間の透明化処理を行った点。
2) (生物材料の透明化処理及び観察工程)において、作動距離が2mmの対物レンズを用いて大脳の表面(大脳皮質)側から海馬側に向けて観察を行った点。
水、PBS、8M濃度の尿素水溶液(透明化試薬)、4M濃度の尿素水溶液(透明化試薬)、透明化試薬SCALE−A2(4M濃度の尿素、0.1%(w/v)濃度のTritonX−100、10%(w/v)濃度のグリセロールを含む水溶液)、及び透明化試薬SCALE−D2(4M濃度の尿素+0.1%(w/v)濃度のTriton X−100、10%(w/v)濃度のDMSOを含む水溶液)、の各々で1日間処理を行ったマウス脳切片(厚さ60μm)の大脳皮質部分を用いて、波長200nm〜1000nmの光の透過率を測定した。なお、光の波長帯200nm〜1000nmは、2光子顕微鏡観察で常用する励起波長領域と、観察対象となる蛍光タンパク質の主たる蛍光波長の波長領域との双方をカバーする。
Fucci−S−Green(Fucci−S/G2/M)を発現するトランスジェニックマウス(理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。参考文献Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.)の胎生13.5日目の胎仔を、4(v/w)% PFA-PBSで2日固定後に20(v/w)%ショ糖-PBS溶液に浸漬し、一旦凍結後に解凍を行った。この後、再び4(v/w)%PFA-PBSで1時間固定を行った。その後、参考例2に記載のSCALE−A2に7日間浸漬することで透明化処理を行った。
(全身固定工程)
Fucci−S−Green(Fucci−S/G2/M)を発現するトランスジェニックマウス(理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームが作製したマウスを自家繁殖し得たもの。[参考文献] Sakaue-Sawano et al., Cell, 132(3): 487-98, 2008.)の生後6週齢のものを用い、ペリスタポンプを用いて左心室より氷冷PBSを灌流した後、氷冷固定液(4% パラホルムアルデヒド−PBS, pH7.4)を灌流してマウスの全身を完全に固定した。
次いで、マウスの頭蓋骨を除去して、海馬の歯状回を注意深く摘出した。そして、摘出した海馬の歯状回を氷冷固定液(4% パラホルムアルデヒド−PBS, pH7.4)に一晩、4℃の環境下で浸漬した。その後、この海馬の歯状回を、20% シュークロース−PBS溶液中に移し24時間、4℃の環境下で緩やかに振盪した。
最後に、再固定した海馬の歯状回を、本参考例に係る生物材料用透明化試薬に3日間、浸漬し、室温で振盪した。生物材料用透明化試薬は、4M濃度の尿素、0.1%(w/v)濃度のTritonX−100、10%(w/v)濃度のグリセロールを純水に溶解した水溶液である。透明化が進んだ時点(処理開始から3日後)で、アガロースゲル(濃度0.5%(w/v)以下)の薄膜中に海馬の歯状回を封入し、920nmの波長のレーザーを備えた正立型2光子顕微鏡(商品名FV1000MPE:Olympus社製)で観察を行った。なお、観察に用いた対物レンズの作動距離(working distance)は2mmであった。また、観察は、海馬腹側表面から1.7 mmの深さまで18個の連続視野について行い、当該観察の結果を統合画像として再構成した。
蛍光タンパクVenusを発現させた大人のラット海馬由来の神経幹細胞を取得し、この神経幹細胞をラット系統Fisher(F344)(日本SLCより購入)の大脳皮質部分(第V層付近、深さ約1.7 mmの部位)に移植した。
神経系に蛍光タンパク質YFPを発現したトランスジェニックマウス(YFP−H line:米国Harvard大学 Josh Sanes教授より供与されたもの。参考文献: Feng et al. Neuron, 28: 41-51, 2000)の生後12週齢のものから大脳を摘出して、SCALE−A2試薬(参考例2参照)を用いた透明化処理と、非特許文献2に記載のDodtらによるベンジルベンゾエート/ベンジルアルコール(benzylbenzoate / benzylalchol (BABB))法による透明化処理との比較を行った。
各種の蛍光タンパク質をコードする遺伝子をHeLa細胞(東京大学医科学研究所より分与されたもの。Scherer et al., J. Exp. Med. 97(5):695-710, 1953)に導入して対応する蛍光タンパク質を発現させた。ここで、発現させた蛍光タンパク質は、SECFP、EGFP、mAG1、Venus、及びDsRedである。EGFPおよび DsRedはClontech社より購入。mAG1はMBL社より購入。VenusおよびSECFPは理化学研究所・脳科学総合研究センター・細胞機能探索技術開発チームがGFPをもとに遺伝子的に変異を導入し作製した。参考文献:SECFP, Hadjantonakis et al., BMC Biotechnol., 2:11, 2002.: EGFP, Zhang et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 227: 707-711, 1996.: Venus, Nagai et al., Nat. Botech., 20: 87-90, 2002.: mAG1, Karasawa et al., J. Biol. Chem., 278(36): 34167-34171, 2003.: Baird et al., PNAS., 97(22): 11984-11989, 2000.。
GFPトランスジェニックマウスおよびYFPトランスジェニックマウス(GFP-M lineおよびYFP-H line, 米国ハーバード大学Josh Sanes教授より供与されたもの)の海馬より2.5 mm厚のスライスを作製し、一旦SCALE−A2試薬(参考例2参照)による透明化処理を5日間行って透明化した後、PBSで3回リンスして不透明状態の組織に戻した際の免疫染色性を、SCALE−A2試薬による透明化処理前のものと比較した。
(生物材料の摘出及び固定工程)
全身麻酔によって眠らせたマウスを開腹開胸し、左心室より4% パラホルムアルデヒド−PBS溶液を注入して全身を灌流固定した後、大脳を摘出した。摘出した大脳を氷冷固定液(4% パラホルムアルデヒド−PBS溶液)に浸漬して8〜12時間固定を行った。その後、この大脳を20% シュークロース−PBS溶液に2日間浸漬して完全に置換をした。
次いで、再固定後の大脳を、参考例2で示す生物材料用透明化試薬(SCALE−A2)中に移し2日間、室温で振盪した(第一浸潤工程)。次いで、より高濃度で尿素を含む生物材料用透明化試薬(試薬Bとする)中に大脳を移し、2日間、室温で振盪した(第二浸潤工程)。試薬Bは、8M濃度の尿素、及び0.1%(w/v)濃度のTritonX−100を純水に溶解した水溶液である。次いで、新鮮なSCALE−A2液中に大脳を移し、2〜3日間、室温で振盪して透明化した(第三浸潤工程)。なお、大脳の湿重量1gに対して用いるSCALE−A2の液量ならびに試薬Bの液量はそれぞれ約30mlであった。
以下の点1)〜3)以外は、参考例1と同じ方法に従い、マウスの海馬の観察を行なった。
1) 生後6週齢の野生型(非遺伝子改変)の正常C57BL6系統雄マウスを用いた点。
2) (生物材料の透明化処理及び観察工程)において、透明化処理を次のように行なった点。まず、再固定した海馬を、SCALE−A2試薬(参考例2)で48時間、浸漬し、室温で振盪した後に(第一浸潤工程)、次いで、試薬B(実施例1)で48時間、浸漬し、室温で振盪した。
3) 観察工程は、模様つきの基板上に海馬を配置して、模様が海馬を介して透けて見えるか否かで透明化度を判定した。
以下の点1)〜3)以外は、参考例1と同じ方法に従い、マウスの脳切片の観察を行なった。
1) 生後6週齢の野生型(非遺伝子改変)の正常C57BL6系統雄マウスを用いた点。
2) (生物材料の摘出及び固定工程)において、マウスの脳全体を摘出して、参考例1と同様に固定及び再固定した点。
3) (生物材料の透明化処理及び観察工程)において、透明化処理を次のように行なった点。まず、再固定した脳から海馬を含む冠状断スライス(厚さ3mm)を作成した。次いで、この冠状断スライスを、中央線で右半球側スライスと左半球側スライスとに切断した。そして一方の半球側スライスをSCALE−A2試薬で(参考例2)で24時間、浸漬し、室温で振盪した後に(第一浸潤工程)、次いで、試薬B(実施例1)で24時間、浸漬し、室温で振盪した(第二浸潤工程)。次いで、この冠状断スライスから、海馬を含む厚さ1.5mmの冠状断スライスを切り出した。このようにして得た冠状断スライスを一度目の観察工程(次の段落参照)に供した。
次いで、一度目の観察工程を終えた冠状断スライスをSCALE−A2試薬で二度リンスした後、SCALE−A2試薬で24時間、浸漬し、室温で振盪した(第三浸潤工程)。このようにして得た冠状断スライスを二度目の観察工程(次の段落参照)に供した。
3) 観察工程は、分光光度計(日立製:製品名U-3310 Spectrophotometer)を用いて、1.5mm厚の上記冠状断スライスの、300nm〜920nmの波長域の光の透過スペクトルを測定した。
8週齢の野生型C57BL6/J系統マウス(日本エスエルシーより購入)の大脳のスライスを、PBS、4M、6M、又は8Mの尿素を含む水溶液中に浸漬し、室温で12時間振盪することでインキュベーションした。
Claims (18)
- 生物材料を透明化する方法であって、
尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む溶液を、生物材料中に浸潤する第一浸潤工程、
次いで、第一浸潤工程で用いた上記溶液より高濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第二浸潤工程を含んでなる、ことを特徴とする生物材料の透明化方法。 - 上記第二浸潤工程に次いで、当該第二浸潤工程で用いた上記溶液より低濃度で尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む溶液を、上記生物材料中に浸潤する第三浸潤工程を含んでなることを特徴とする請求項1に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記第一浸潤工程で用いる溶液と、上記第三浸潤工程で用いる溶液とが実質的に同濃度で上記化合物を含むことを特徴とする請求項2に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記第一浸潤工程で用いる溶液と、上記第三浸潤工程で用いる溶液とが同じ溶液であることを特徴とする請求項3に記載の生物材料の透明化方法。
- 上記溶液が何れも上記化合物として尿素を含むことを特徴とする請求項1から4の何れか一項に記載の透明化方法。
- 上記溶液の少なくとも一つが水溶液であることを特徴とする請求項1から5の何れか一項に記載の透明化方法。
- 上記溶液の少なくとも一つが界面活性剤を含むことを特徴とする請求項1から6の何れか一項に記載の透明化方法。
- 上記界面活性剤が非イオン性の界面活性剤であることを特徴とする請求項7に記載の透明化方法。
- 上記非イオン性の界面活性剤が、TritonX(登録商標)、Tween(登録商標)、及びNP-40(商品名)からなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項8に記載の透明化方法。
- 上記水溶液が水溶性の高分子化合物をさらに含むことを特徴とする請求項6から9の何れか一項に記載の透明化方法。
- 水溶性の上記高分子化合物が、パーコール(登録商標)、フィコール(登録商標)、ポリエチレングリコール、及びポリビニルピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項10に記載の透明化方法。
- 上記溶液の少なくとも一つが、さらに、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項1から11の何れか一項に記載の透明化方法。
- 上記生物材料として、多細胞動物由来の組織又は器官、或いはヒトを除く多細胞動物を透明化するものであることを特徴とする請求項1から12の何れか一項に記載の透明化方法。
- 上記第一浸潤工程で用いる溶液における上記化合物の濃度が2.5M以上で5.5M以下の範囲内であり、かつ、上記第二浸潤工程で用いる溶液における上記化合物の濃度が6M以上で8.5M以下の範囲内であることを特徴とする請求項1から13の何れか一項に記載の透明化方法。
- 生物材料用透明化処理キットであって、
尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を所定の濃度で含む第一溶液と、
上記第一溶液より高濃度で、尿素及び尿素誘導体からなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含む第二溶液と、からなることを特徴とする生物材料用透明化処理キット。 - 上記第一溶液が、尿素を2.5M以上で5.5M以下の範囲内の濃度で、界面活性剤を0.025(w/v)%以上で5(w/v)%以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことを特徴とする請求項15に記載の生物材料用透明化処理キット。
- 上記第二溶液が、尿素を5.5M以上で8.5M以下の範囲内の濃度で、界面活性剤を0.025(w/v)%以上で5(w/v)%以下の範囲内の濃度でそれぞれ含むことを特徴とする請求項15又は16に記載の生物材料用透明化処理キット。
- 上記第一溶液が、グリセロール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プロピレングリコール、及びマクロゴールからなる群より選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項15から17の何れか一項に記載の生物材料用透明化処理キット。
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