JP5036727B2 - ヘパリン結合タンパク質の組み換え体産生 - Google Patents
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Description
本出願は、本明細書中にその全体が援用される2005年12月22日に出願の米国特許仮出願第60/753615号および2006年7月14日に出願の米国特許仮出願第60/807432号の優先権を主張する。
本発明は、細胞培養で生産されるヘパリン-結合タンパク質を得る方法に関する。本発明は、原核生物宿主細胞で産生され、これらの細胞中、典型的には周辺質又は細胞内腔に存在する再び折り畳まれた(refolded)ヘパリン結合タンパク質の回収及び精製に関する方法を包含する。また、原核生物の宿主細胞で産生されるヘパリン結合タンパク質は、可溶タンパク質又は可溶性と不溶性のタンパク質の混合物として提供されてもよい。
天然に生じ、生物学的に活性な多様なポリペプチドがヘパリンを結合することは公知である。このようなヘパリン-結合ポリペプチドには、サイトカイン、例として、血小板因子4及びIL-8(Barber等, (1972) Biochim. Biophys. Acta, 286:312-329;Handin等, (1976) J. Biol. Chem., 251:4273-422;Loscalzo等, (1985) Arch. Biochem. Biophys. 240:446-455;Zucker等, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7571-7574;Talpas等, (1991) Biochim. Biophys. Acta, 1078:208-218;Webb等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7158-7162)、ヘパリン-結合増殖因子(Burgess and Maciag, (1989) Annu. Rev. Biochem., 58:576-606;Klagsbrun, (1989) Prog. Growth Factor Res., 1:207-235)、例として、上皮細胞増殖因子(EGF);血小板由来増殖因子(PDGF);塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF);酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF);血管性内皮増殖因子(VEGF);及び、肝細胞増殖因子(HGF) (Liu等, (1992) Gastrointest. Liver Physiol. 26: G642-G649);そして、セレクチン、例えばL-セレクチン、E-セレクチンおよびP-セレクチン (Norgard-Sumnicht等, (1993) Science, 261:480-483)が含まれる。また、Munoz and Linhardt., (2004) Arterioscler Thromb Vasc Biol., 24:1549-1557を参照のこと。
本発明は、再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質の細胞培養物からの回収及び精製のための方法を提供する。特に、本発明は、原核生物の宿主細胞、例えば細菌細胞からヘパリン結合タンパク質を回収する方法を提供する。例えば、方法は、(a) 不溶性ヘパリン結合タンパク質を該細菌細胞の周辺質又は細胞内腔から単離する;(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液に単離された不溶性ヘパリン結合タンパク質を可溶化する、そして(c) ヘパリン結合タンパク質の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤と硫酸化ポリ陰イオン剤を含む第二緩衝溶液中で、可溶化させたヘパリン結合タンパク質をインキュベートする;そして、(d) 該再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を回収する、工程を含んでなり、このとき硫酸化ポリ陰イオン剤とインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質の回収がおよそ2〜10倍に増加する。一実施態様では、第二緩衝溶液はさらにアルギニンを含む。一実施態様では、第二緩衝溶液はさらにシステイン又は軽度の還元剤を含む。
定義
「ヘパリン」(ヘパリンの酸とも称される)は非常に硫酸化した、直鎖の陰イオン性ムコ多糖の不均一な基であり、グリコサミノグリカンと称される。他も存在しうるが、ヘパリンの主要な糖質は、α-L-イズロン酸2-硫酸塩、2-デオキシ-2-スルファミノ-α-グルコース6-硫酸塩、β-D-グルクロン酸、2-アセタミド-2-デオキシ-α-D-グルコースおよびL-イズロン酸である。これら及び場合によって他の糖質は様々な大きさのポリマーを形成するグリコシド結合によって連結される。その共有結合した硫酸塩とカルボン酸基の存在のために、ヘパリンは非常に酸性である。起源及び測定法によって、ヘパリンの分子量はおよそ3000からおよそ20000ダルトンに変化する。
天然のヘパリンは、いくつかの哺乳類種の様々な組織、特に肝臓および肺や肥満細胞の構成要素である。ヘパリンおよびヘパリン塩類(ヘパリンナトリウム)は市販されており、主に様々な臨床状態において抗凝血物質として用いられる。
ヘパリン結合タンパク質の単離
不溶性の誤って折り畳まれたヘパリン結合タンパク質(HBP)は、当分野の多くの標準的な技術のいずれかによりタンパク質を発現する原核生物の宿主細胞から単離される。例えば、不溶性のHBPは、適切な単離バッファ中で、細胞を適切なイオン強度のバッファに曝露して殆どの宿主タンパク質を可溶化させるか(しかし対象のタンパク質は実質的に不溶性である)、又は封入体ないしは周辺質又は細胞内腔のタンパク質を放出させ、例えば遠心分離による回収に利用できるようにするために細胞を破壊することにより、単離される。この技術は周知であり、例えば米国特許第4511503号に記載されている。Kleid等は均質化の後に遠心分離をすることによる屈折小体の精製を開示している(Kleid等, (1984) in Developments, Industrial Microbiology, (Society for Industrial Microbiology, Arlington, VA) 25:217-235)。例としてFischer等, (1993) Biotechnology and Bioengineering 41:3-13も参照のこと。
単離した不溶性の誤って折り畳まれたヘパリン結合タンパク質は、ヘパリン結合タンパク質を実質的に可溶化するために十分な量のカオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中でインキュベートする。このインキュベートは、いくつか又は実質的にすべてのヘパリン結合タンパク質の可溶化とアンフォールド(unfolding)を可能とする濃度、インキュベート時間、及びインキュベート温度の条件下で行う。
一般に、可溶性の誤って折り畳まれたタンパク質のこの第二インキュベーションの条件は、タンパク質のいくらか又は実質的又は完全な再折り畳みが起こるようにする。正確な条件は、例えばバッファのpHや、存在するのであれば、硫酸化ポリ陰イオン剤及びカオトロピック剤及び還元剤の種類と濃度に依存するであろう。培養温度は通常、およそ0〜40℃、又は10〜40℃であり、インキュベートは通常、再折り畳みに効果を示すように少なくともおよそ1時間行う。ある実施態様では、反応は、例えばおよそ15〜37℃、又は20〜30℃で、少なくともおよそ6時間、少なくともおよそ10時間、又はおよそ10から48時間の間、又はおよそ15から20時間の間、又は6から20時間の間、又は12から24時間の間で行う。
第二緩衝溶液は、HPBの再折り畳みが起こる濃度のカオトロピック剤を含む。通常、カオトロピックはおよそ0.5から2モルの間で存在する。本発明の一実施態様では、本明細書中のカオトロピック剤は、およそ0.5〜2M、0.5〜2M 、又はおよそ1Mの尿素である。一実施態様では、カオトロピック剤はおよそ1.3M 濃度の尿素である。本発明の他の実施態様では、カオトロピック剤はおよそ1Mの塩酸グアニジンである。図10はVEGFの再折り畳みに対する尿素と還元剤DTTの効果を示す。ピーク3のVEGFは適切に折り畳まれた生物学的に活性なVEGFを指す。
場合によって、陽性荷電アミノ酸、例えばアルギニン(例えばL-アルギニン/HCl)、リジンなどは再折り畳みバッファに存在してもよい。本発明のある実施態様では、アルギニンの濃度は、例えばおよそ0〜1000mM、又はおよそ25〜750mM、又はおよそ50〜500mM、又はおよそ50〜250mM、又はおよそ100mM終濃度などである。本発明のある実施態様では、タンパク質は、0.5〜3M 尿素、0〜30mg/L デキストラン硫酸、0〜0.2%トリトンX-100、2〜15mM システイン、0.1〜1mM DTTおよび0〜750mM アルギニン終濃度を含む、pH7.0〜9.0の緩衝溶液中にある。一実施態様では、50mM HEPPSが使われる。一実施態様では、再折り畳みバッファ溶液の終濃度は、1M 尿素、50mM HEPPS、15mg/L デキストラン硫酸、0.05%トリトンX-100、7.5mM システイン、100mM アルギニン、pH8.0である。一実施態様では、再折り畳みバッファ溶液の終濃度は、1.3M 尿素、50mM HEPPS、15mg/L デキストラン硫酸、0.05%トリトンX-100、7.5mM システイン、0.5mM DTT、100mM アルギニン、pH8.0である。
培養物からのヘパリン結合タンパク質の回収と精製は、例えば、塩と溶媒分別法、コロイド性物質による吸着、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、免疫親和性クロマトグラフィ、電気泳動法および高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)などの様々な方法及び公知の手法をタンパク質の分離のために実施することができるが、前記の再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体;第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出させることを含む4工程のクロマトグラフィの手順の例が記載される。あるいは、前記の再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出することを含む他のクロマトグラフィ手順が記載される。いずれかの手順の工程はいずれの順序でも行うことができると理解される。本発明の一実施態様では、工程は順次行われる。
疎水性相互作用クロマトグラフィは当分野で周知であり、「クロマトグラフィ支持体」に付着した疎水性リガンドと相互作用する分子の疎水性部分の相互作用に基づく。基質にカップリングした疎水性リガンドは、HICクロマトグラフィ支持体、HICゲル又はHICカラムなどとさまざまに称される。さらに、タンパク質とHICとの相互作用の強度は、タンパク質上の極性表面に対する非極性表面の割合に依存するだけでなく、同様に非極性表面の関与にも依存する。
特定のゲルの選択は当業者により決定されうる。通常、タンパク質およびHICリガンドの相互作用の強度はアルキルリガンドの鎖長によって増加するが、およそ4からおよそ8の炭素原子を有するリガンドがほとんどの分離に適する。フェニル基はペンチル基とほぼ同じ疎水性を有するが、選択性はタンパク質の芳香族基とのπ-π相互作用の可能性のために異なりうる。
順に又は勾配の形態のいずれであっても、HIC支持体からの溶出は、例として、a) 塩濃度を変える、b) 溶媒の極性を変える、又はc) 界面活性剤を加えるなどの様々な方法で達成されうる。塩濃度を下げることによって、吸着したタンパク質は疎水性を増すに従って溶出される。極性の変化は、エチレングリコール又はイソプロパノールなどの溶媒の添加とこれによる疎水性相互作用の強度の低減に影響されうる。界面活性剤は、タンパク質のディスプレーサーとして機能し、膜タンパク質の精製と関連して主に使われていた。
簡潔に言えば、自律複製が可能な発現ベクターと宿主の原核生物細胞ゲノムと関連するタンパク質発現を宿主細胞に導入する。適する発現ベクターの構築は、本明細書中に記載のヘパリン結合タンパク質のヌクレオチド配列を含め、当分野で周知である。例えば、Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001);Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols John Wiley and Sons (New Jersey) (2002);及びBaneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421を参照。細菌を含む適切な原核生物細胞、発現ベクターは、例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Marylandにより市販されている。原核細胞、特に細菌細胞培養物の大規模増殖のための方法は当分野で周知であり、これらの方法が本発明の関係において用いられうる。
本発明のポリペプチドは、直接産生されるだけではなく、典型的にはシグナル配列あるいは成熟ポリペプチドないしはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても産生される。典型的には選択された異種性シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然のポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換できる。
発現ベクターは、一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は様々な細菌についてよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大腸菌などの大部分のグラム陰性細菌に好適である。
通常、発現ベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地中で生存できない。この選択可能マーカーは、本発明で利用され、定義されるような遺伝学的マーカーとは異なる。典型的な選択遺伝子は、(a)例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質又はその他の毒素に耐性を付与し、(b)遺伝学的マーカー(一又は複数)の存在によって誘導される欠陥以外の栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバチラス菌に対するD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
対象のヘパリン結合タンパク質を産生するための発現ベクターは、宿主微生物によって認識され、対象のポリペプチドをコードする核酸と作用可能に連結される適切なプロモーターを含む。原核生物の宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系(Chang等, Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979))、アラビノースプロモータシステム(Guzman等, J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980);欧州特許第36776号)、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター(deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))を含む。しかし、他の既知の細菌性プロモーターも適当である。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それにより、任意の必要な制限酵素部位を供給するためのリンカー又はアダプターを用いて、当業者は対象のポリペプチドをコードするDNAにそれらを作用可能に連結する(Siebenlist等, Cell, 20:269 (1980))ことが可能となる。また、上記のSambrook等;及び上記のAusubel等も参照のこと。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。必要とされるプラスミドの生成のために、単離されたプラスミド又はDNA断片を切断させ、整え、そして望ましい型に再ライゲーションする。
構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌K12菌株294(ATCC31446)又は他の株を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び/又はSanger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法により、又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499(1980)の方法により配列決定を行った。また、上記のSambrook等;及び上記のAusubel等も参照のこと。
対象のヘパリン結合タンパク質をコードする核酸は、宿主細胞に挿入される。これは、典型的に、上記の発現ベクターにて宿主細胞を形質転換させ、様々なプロモーターを誘導するために適するように変更した従来の栄養培地中で培養することによって達成される。
対象のヘパリン結合タンパク質を発現するために用いる好適な原核生物細胞は当分野で周知である。典型的に、封入体の形態で、又は周辺質ないしは細胞内腔に大量に組み換えタンパク質を発現する宿主細胞が用いられる。適切な原核生物には、例として、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌、桿菌、例えば枯草菌、シュードモナス属種、例えば、緑膿菌、ネズミチフス菌又はセラチア‐マルセスセンスなどがある。大腸菌宿主の一例は大腸菌294(ATCC 31,446)である。また、他の細胞株、例として、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC 31,537)および大腸菌W3110(ATCC 27,325)も好適である。これらの例は限定するものでなく例示である。株W3110は、組換えDNA産生発酵のための共通の宿主株であるので典型的な宿主である。本発明のある態様では、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、タンパク質をコードする遺伝子に遺伝子変異を起こすように修飾してもよく、このような宿主の例には1995年4月25日発行の米国特許第5410026号に記載の大腸菌W3110株1A2、27A7、27B4及び27C7が含まれる。例えば、VEGFの産生のための株は、49B3と称される、遺伝子型tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 degP41 ilvgを有する大腸菌株W3110である。他の例では、VEGFの産生のための株は、遺伝子型ΔfhuA (ΔtonA) ptr3,lacIq,lacL8,ΔompT Δ(nmpC-fepE) ΔdegP ilvG+を有する大腸菌株(62A7)である。また、例えば国際公開第2004/092393号の頁23〜24にわたる表を参照のこと。
アルカリホスフェートプロモーターが使用される場合、本発明の対象のポリペプチドの生産のために使用される大腸菌細胞は、例えばSambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)に一般的に記載されるようにアルカリホスフェートプロモーターが部分的に又は完全に誘導され得る適切な培地中で培養される。必要とされる培養は、無機リン酸塩の非存在下又はリン酸塩欠乏レベル下では、決して起こらない。第一に、培地はタンパク質合成の誘導レベル以上であり、細菌の増殖に十分な量の無機リン酸塩を含む。細胞が増殖し、リン酸塩を利用する場合、培地中のリン酸塩レベルを低下させ、それによりポリペプチドの合成の誘導を引き起こす。
必要ないかなる補充物も、単独で、或いは又は別の補充物ないしは複合窒素源等の培地と組み合わせて導入し、当業者に既知の適切な濃度で含めることができる。培地のpHは、主に宿主生物に応じて、およそ5〜9とすることができる。大腸菌については、pHはおよそ6.8〜およそ7.4であり、又はおよそ7.0である。
例えば本明細書中に記載の方法を用いて回収したポリペプチドは、薬学的に受容可能な担体に調製化してもよく、様々な診断、治療、又は該分子について公知の他の使用のために用いられる。例として、本明細書中に記載のVEGFは、酵素免疫アッセイなどのイムノアッセイに使われてもよい。本明細書中に記載の方法を用いて得られたヘパリン結合タンパク質についての治療的使用も考慮される。例として、増殖因子又はホルモン、例えばVEGFは所望のように増殖を促すために用いられうる。例として、VEGFは、例えば急性の創傷(例えば熱傷、外科的創傷、通常の創傷など)又は慢性の創傷(例えば糖尿病性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、静脈潰瘍など)の創傷治癒の促進、発毛促進、組織増殖及び修復(例えば骨、肝臓など)などのために用いられうる。
典型的に創傷治癒のために、HBPは部位特異的運搬用に調製される。局所に適応される場合、HBPは担体及び/又はアジュバントなどの他の成分と適切に組み合わされる。前記の他の成分の性質に制限はないが、ただし意図する投与のために効果的かつ薬学的に受容可能でなければならず、組成物の活性成分の活性を有意に分解することができないものである。精製されたコラーゲンの有無にかかわらず、適切な溶媒の例には、軟膏、クリーム、ゲル、噴霧又は懸濁液が含まれる。また、組成物は、場合によって液体又は半流動体形態で、滅菌包帯、経皮パッチ、絆創膏及び包帯にしみ込ませてもよい。
ゲル化のために有用なポリエチレングリコールは、一般的に、適当な粘性を得るために低分子量と高分子量のポリエチレングリコールの混合物である。この目的のために、例えば、分子量400〜600のポリエチレングリコールと分子量1500のポリエチレングリコールとの混合物は、ペーストを得るために適切な比率で混合される場合に有効である。
以下の実施例は、限定するものではなく例示するためのものである。
組み換えヒトVEGFを大腸菌において発現させた。合成の間、タンパク質は細胞膜周辺腔に分泌され、屈折小体として蓄積された。したがって、タンパク質の抽出および再折り畳みを達成するために研究を行った。これらの研究により、ポリ陰イオン剤を付加することなく標準的な回収技術を用いて少なくとも3種のVEGF(図1)が単離されたことが明らかとなった。天然のVEGFを用いた研究により、ヘパリン添加がカオトロプ-及びチオール-誘導性の変性剤に対する耐性を増すことが示された(図2)。さらに、ヘパリンは、小規模再折り畳み実験において適切に再折り畳みされたVEGFの量を有意に増やした。この結果を大規模な方法に応用するために、ヘパリンに構造上類似する分子であるデキストラン硫酸の存在下においてVEGFの再折り畳みを可能にした条件を探した。デキストラン硫酸の添加により、適切に折り畳まれた生物学的に活性なVEGFの収率がコントロールと比べて3〜5倍に増加した。
VEGF165発現のためのプラスミド−プラスミドpVEGF171は大腸菌周辺質におけるヒトVEGF165の発現のために設定した(例えば、Leung等, (1989) Science, 246:1306-1309を参照)。VEGFコード配列の転写は、アルカリホスファターゼ(AP)プロモーターの厳格なコントロール下にあのに対して(例えば、Kikuchi等, (1981) Nucleic Acids Research, 9:5671-8を参照)、翻訳開始に必要な配列はシャイン-ダルガーノ領域にある(例えば、Yanofsky等, (1981) Nucleic Acids Research, 9:6647-68を参照)。VEGFコード配列は、その後の大腸菌周辺質への分泌のために細菌性耐熱性毒素II(STII)シグナル配列の下流に融合した(例えば、Lee等, (1983) Infect. Immun. 42:264-8;及びPicken等, (1983) Infect. Immun. 42:269-75を参照)。STIIシグナル配列のコドン修飾により翻訳レベルが調節され、その結果、周辺質におけるVEGFが最適レベルに集積した(例えば、Simmons and Yansura, (1996) Nature Biotechnoloy, 14:629-34を参照)。転写終結区に対するラムダ(例えば、Scholtissek and Grosse, (1987) Nucleic Acids Research 15:3185を参照)はVEGF翻訳終止コドンの下流に位置した。複製起点と、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子は、プラスミドpBR322から得た。例えば、Bolivar等, (1977) Gene 2:95-113を参照。
方法
抽出と再折り畳み−屈折性ペレットは、5Lのバッファ/kgペレットで、7M 尿素/50mM HEPPS/pH8(終濃度)を含有する抽出バッファに懸濁した。次いで、固形ジチオトレイトールを、4mM終濃度となるように3.7g/kgペレットで加えた。例として、VEGFの抽出に対する尿素とDTTの効果についての図9を参照のこと。懸濁液は20℃で1〜2時間かけて完全に混合した。pHは、50%水酸化ナトリウム(w/w)にてpH8.0に調整してもよい。抽出バッファの容量当たり、19容量の再折り畳みバッファを加えて再折り畳みを生じさせた。再折り畳みバッファには、50mM HEPPS/1 M−2M 尿素/2−5mM システイン/0.05%−0.2%TRITONTMX100/pH8、終濃度を含めた。例えば、再折り畳みの間に存在する尿素およびDTT濃度の効果についての図10を参照のこと。示すように、デキストラン硫酸、ヘパリン又は硫酸ナトリウムを加えた。再折り畳みインキュベーションは室温で4〜24時間行った。場合によって、インキュベートは室温で最大およそ48時間行うことができる。折畳みは、SDS-PAGEおよび/またはヘパリンHPLCにてモニターした。生成物は、Cuno90SPフィルターによるデプス濾過(depth filtration)の後に0.45μm濾過を行って浄化した。
システインが媒介する変性からVEGFを保護するヘパリン−天然のVEGFに10mM システインを加えると、適切に折り畳まれた分子が大きく減少した(図2)。この変性は、20mMほどのわずかな濃度の2つの異なる形態のヘパリンを加えると阻止された。
VEGF再折り畳みに対するヘパリンとデキストラン硫酸の効果
表の値は、屈折性ペレット(g)当たりのピーク3の形成されたVEGF(mg)の量である。各々の添加の濃度は示すとおりである。*平均コントロール(5.6+5.0=5.3)
再折り畳み収率を増加させるヘパリンおよびデキストラン硫酸−上記の変性に対する保護的特性のため、VEGFの再折り畳みに対する様々な異なる形態の硫酸化ポリマーの効果を調べた。表Ia(及び図5)に示すように、低分子量及び高分子量の形態のヘパリンは再び折り畳まれたVEGFの収率をおよそ3倍に増加した。表Ib(及び図6)に示すように、硫酸ナトリウムは再び折り畳まれたVEGFの収率をおよそ2倍に増加した。また、10Kd形態のデキストラン硫酸は再折り畳み収率の増加に有効であったが、調査した濃度の高い範囲では基質阻害が生じた。更なる研究により、5Kd、8Kd及び10Kdの形態のデキストラン硫酸はすべて、再折り畳みの際のVEGFの収率を有意に増加したことが示された。図7を参照。また図8も参照。
実施例I、II及びIIIのデータをまとめると、ヘパリン-結合増殖因子であるVEGFが再び折り畳まれる際にヘパリン硫酸塩又はデキストラン硫酸のいずれかを含めると収率が有意に(2〜5倍)改善することと、回収条件が示唆される。この方法は工業規模で成功裏に実施された。この方法はヘパリンを結合する他の基本的な増殖因子および他のタンパク質の再折り畳みに応用することができると期待される。
方法
抽出と再折り畳み−屈折性ペレットを抽出バッファに懸濁した。この抽出バッファの終濃度は5Lのバッファ/kgペレットで7M 尿素、2−30mM DTT(例えば10mM DTT)、50mM HEPPS/pH7−9(例えばpH8)とした。懸濁液は室温で1〜2時間かけて完全に混合した。抽出バッファの容量当たり、19容量の再折り畳みバッファを加えて再折り畳みを生じさせた。再折り畳みバッファは、終濃度として1M又は1.3M尿素、2−15mM システイン(例えば7.5mM システイン)、0.5mM DTT、0−0.75M アルギニン(例えば100mM アルギニン)、15mg/Lのデキストラン硫酸、50mM HEPPS、0.05%TRITONTMX100/pH8を含有した。荷電アミノ酸の存在下における再折り畳みに対する効果について、例えば図12を参照のこと。ここでは、ヒスチジンの添加によりアミノ酸の付加がない場合と同じ効果が生じた。再折り畳みインキュベーションは室温で12〜24時間行った。場合によって、インキュベートは室温で最大およそ48時間行うことができる。場合によって、再折り畳みの間に空気又は酸素を添加してもよい(0.3〜1cc/分/L)。折畳みは、SDS-PAGEおよび/またはヘパリンHPLCにてモニターした。生成物は、Cuno90SPフィルターによるデプス濾過(depth filtration)の後に0.45μm濾過を行って浄化した。
再折り畳みの効率は、二量体/単量体の量を測定することによって決定することができ、このとき単量体は、C18逆相HPLCカラムで測定することができ、二量体形成は、ヘパリンカラムクロマトグラフィ又はSP-5PW陽イオン交換クロマトグラフィアッセイで測定することができる。
最適化の再折り畳み条件の拡張性を試験するため、小規模(0.1L)、中規模(1L)及び試験的設備(250L〜400L)のスケールでの再折り畳みの動態を調べるために実験を行った。図4に示すように、大規模スケールの再折り畳みの動態はより小さいスケールと違いがなく、再び折り畳まれたVEGFの最終力価はわずかに増加した。これらのデータから、デキストラン硫酸による再折り畳みの拡張性が示された。さらに、生成物は、Cuno90SPフィルターによるデプス濾過(depth filtration)の後に0.45μm濾過を行って浄化した。
MacroPrepセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ−再折り畳みの後、プール中の不溶性物質をデプス濾過によって除去した。次いで、浄化したプールを、50mM HEPPS/0.05% TRITONTMX100/pH8で平衡化したセラミックヒドロキシアパタイトカラム(35D×31H=30L) (Bio Rad, Hercules, CA)に流した。非結合タンパク質は平衡バッファにて洗浄して除去し、50mM HEPPS/0.05% TRITONTMX100/0.15M リン酸ナトリウム/pH8の均一濃度工程を用いてVEGFを溶出した。流速は120cm/時とした。プールする分画を分画のヘパリンHPLC分析にて測定した。
陽イオン交換液体クロマトグラフィ−再折り畳みの後、プール中の不溶性物質をデプス濾過によって除去することができる。再び折り畳まれたプールは、pH5.0−7.5、及び2〜6.5mS/cmに調整する。一実施態様では、プールはpH6.5および5mS/cmに調整している。次いで、再び折り畳まれたプールは、スルホプロピル高度負荷カラム(sulfopropyl extreme load column、SPXL)に流し、漸増塩濃度勾配により溶出した。プールした分画を、分画のヘパリンHPLC分析で測定することができる。
Claims (18)
- 原核生物の細胞培養物から血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を回収するための方法であって、
(a) 該原核生物の細胞培養物の周辺質から該VEGFを単離する;
(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離されたVEGFを変性させる;
(c) VEGFの再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む第二緩衝溶液中で、変性したVEGFをインキュベートする;そして、
(d) 該再び折り畳まれたVEGFを回収する
工程を含んでなり、このときデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムとインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたVEGFの回収がおよそ2〜5倍に増加する方法。 - 前記VEGFがVEGF165である、請求項1に記載の方法。
- 前記デキストラン硫酸がおよそ3000ダルトンから10000ダルトンの間である、請求項1に記載の方法。
- 前記デキストラン硫酸がおよそ8000から10000ダルトンの間である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一および第二の緩衝溶液がHEPPS pH8.0を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、前記第二緩衝溶液が還元剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二緩衝溶液の還元剤がシステインとDTTの組合せを含む、請求項6に記載の方法。
- さらに、前記第二緩衝溶液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに、前記第二緩衝溶液がアルギニンおよび/またはリジンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記の回収工程(d)が、前記の再び折り畳まれたVEGFを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体;陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該VEGFを溶出させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一及び第二の疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がブチル-、プロピル-、オクチル-及びアリル-アガロース樹脂からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がブチル-アガロース支持体であり、前記第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がフェニル-アガロース支持体樹脂である、請求項10に記載の方法。
- 前記回収工程(d)が、前記の再び折り畳まれたVEGFを、陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該VEGFを溶出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 原核生物の細胞培養物から血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を回収するための方法であって、
(a) 該VEGFを該原核生物の細胞培養物の周辺質から単離する;
(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離した該VEGFを変性させる;
(c) VEGFの再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む第二緩衝溶液中で、変性したVEGFをインキュベートし、このときデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムとインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたVEGFの回収がおよそ2〜5倍に増加するものであり;そして、
(d) 再び折り畳まれた該VEGFを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該VEGFを溶出させる
という工程を含んでなる方法。 - 血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む緩衝溶液中で、変性したVEGFをインキュベートする工程、及び再び折り畳まれたVEGFを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該VEGFを溶出させる工程を含んでなる、VEGFを精製するための方法。
- 原核生物の細胞培養物から血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を回収するための方法であって、
(a) 該VEGFを該原核生物の細胞培養物の周辺質から単離する;
(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離した該VEGFを変性させる;
(c) VEGFの再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む第二緩衝溶液中で、変性したVEGFをインキュベートし、このときデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムとインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたVEGFの回収がおよそ2〜5倍に増加するものであり;そして、
(d) 再び折り畳まれた該VEGFを、陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該VEGFを溶出させる
という工程を含んでなる方法。 - 前記デキストラン硫酸が、およそ3000ダルトンから10000ダルトンの間である、請求項14又は16に記載の方法。
- 血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む緩衝溶液中で、変性したVEGFをインキュベートする工程、及び再び折り畳まれたVEGFを、陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該VEGFを溶出させる工程を含んでなる、VEGFを精製するための方法。
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