JP2009521232A5 - - Google Patents
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誤った折り畳みは発酵又は単離手順の間に細胞中で起こる。周辺質又は細胞内腔から回収されるタンパク質は可溶化され、可溶性タンパク質は天然の状態に再び折り畳まれなければならない。正しく、生物学的に活性な立体構造にタンパク質を再び折り畳むためのインビトロの方法は、機能的なタンパク質を得るために必須である。封入体から回収されたタンパク質の典型的な以降のプロセシングには、高濃度の尿素などの変性剤に封入体を溶解し、再折り畳みが生じるように変性剤を希釈することを含む(米国特許第4512922号；同第4511502号;及び同第４５１１５０３号を参照)。また、例えばRudolph and Lilie, (1996) FASEB J. 10:49-56；及びFischer等, (1993), Biotechnology and Bioengineering, 41:3-13を参照。このような回収方法は普遍的な適用法であると理解でき、封入体からの生物学的に活性な組み換えタンパク質の回収にわずかな変更も考慮される。これらの方法は、ＶＥＧＦなどのヘパリン結合タンパク質に応用されている(Siemeister等 (1996) supra)。これらの方法は、その他の安定化作用により組み換えタンパク質を生物学的に活性な立体構造にする前にランダムなジスルフィド結合を取り除くことを目的とし、不適当に折り畳まれた中間生成物を取り除かず、適切に折り畳まれた生成物の均質な集団を提供しない。
Claims (18)
- 原核生物の細胞培養物から血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)を回収するための方法であって、
(a) 該原核生物の細胞培養物の周辺質から該ＶＥＧＦを単離する；
(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離されたＶＥＧＦを変性させる；
(c) ＶＥＧＦの再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む第二緩衝溶液中で、変性したＶＥＧＦをインキュベートする；そして、
(d) 該再び折り畳まれたＶＥＧＦを回収する
工程を含んでなり、このときデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムとインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたＶＥＧＦの回収がおよそ２〜５倍に増加する方法。 - 前記ＶＥＧＦがＶＥＧＦ１６５である、請求項１に記載の方法。
- 前記デキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムがおよそ３０００ダルトンから１００００ダルトンの間である、請求項１に記載の方法。
- 前記デキストラン硫酸がおよそ８０００から１００００ダルトンの間である、請求項１に記載の方法。
- 前記第一および第二の緩衝溶液がＨＥＰＰＳ ｐＨ８．０を含む、請求項１に記載の方法。
- さらに、前記第二緩衝溶液が還元剤を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第二緩衝溶液の還元剤がシステインとＤＴＴの組合せを含む、請求項６に記載の方法。
- さらに、前記第二緩衝溶液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
- さらに、前記第二緩衝溶液がアルギニンおよび／またはリジンを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記の回収工程(d)が、前記の再び折り畳まれたＶＥＧＦを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体；陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ＶＥＧＦを溶出させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第一及び第二の疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がブチル-、プロピル-、オクチル-及びアリル-アガロース樹脂からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
- 前記第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がブチル-アガロース支持体であり、前記第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がフェニル-アガロース支持体樹脂である、請求項１０に記載の方法。
- 前記回収工程(d)が、前記の再び折り畳まれたＶＥＧＦを、陽イオン交換支持体；疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ＶＥＧＦを溶出することを含む、請求項１に記載の方法。
- 原核生物の細胞培養物から血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)を回収するための方法であって、
(a) 該ＶＥＧＦを該原核生物の細胞培養物の周辺質から単離する；
(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離した該ＶＥＧＦを変性させる；
(c) ＶＥＧＦの再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む第二緩衝溶液中で、変性したＶＥＧＦをインキュベートし、このときデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムとインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたＶＥＧＦの回収がおよそ２〜５倍に増加するものであり；そして、
(d) 再び折り畳まれた該ＶＥＧＦを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ＶＥＧＦを溶出させる
という工程を含んでなる方法。 - 血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む緩衝溶液中で、変性したＶＥＧＦをインキュベートする工程、及び再び折り畳まれたＶＥＧＦを、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ＶＥＧＦを溶出させる工程を含んでなる、ＶＥＧＦを精製するための方法。
- 原核生物の細胞培養物から血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)を回収するための方法であって、
(a) 該ＶＥＧＦを該原核生物の細胞培養物の周辺質から単離する；
(b) カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離した該ＶＥＧＦを変性させる；
(c) ＶＥＧＦの再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む第二緩衝溶液中で、変性したＶＥＧＦをインキュベートし、このときデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムとインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたＶＥＧＦの回収がおよそ２〜５倍に増加するものであり；そして、
(d) 再び折り畳まれた該ＶＥＧＦを、陽イオン交換支持体；疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ＶＥＧＦを溶出させる
という工程を含んでなる方法。 - 前記デキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムが、およそ３０００ダルトンから１００００ダルトンの間である、請求項１４又は１６に記載の方法。
- 血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤とデキストラン硫酸又は硫酸ナトリウムを含む緩衝溶液中で、変性したＶＥＧＦをインキュベートする工程、及び再び折り畳まれたＶＥＧＦを、陽イオン交換支持体；疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ＶＥＧＦを溶出させる工程を含んでなる、ＶＥＧＦを精製するための方法。
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