JPH07501522A - ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびにそれらの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるい はこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈ ＩＬ−４タンパク質、ならびにそれらの製造法今日、アレルギーに苦しんでいる 人口の割合は高い。空気の汚染の進行及び環境中に拡散するアレルギー誘起物質 の数の増加は、おそらく将来特に子供においてさらにアレルギーの数が増加する であろうことを予想させる。この理由でアレルギー過程の経路に介在しつる薬剤 の開発が緊急に必要である。

ヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）はリンパ系細胞及び骨髄細胞の増殖、成 熟、生存及び分化を誘導し、協調させる（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）多数のサイト カインの１つである（１−３）。特にｈｌＬ−４はＩｇＥ−媒介免疫反応に関与 し、胸腺細胞及び活性化Ｔ細胞の増殖を直接加速する。１４０．０００Ｍｒの高 親和性ＩＬ−１レセブタータンパク質を同定することができ、それはそのｃＤＮ Ａ配列により８００アミノ酸残基を含む（４）。このタンパク質はへマトポイエ チンレセブタースーパーファミリーと名付けられた最近記載されたレセブターの 群に属する（５）。

クローニングされたｃＤＮＡに基づき（６）、成熟ＩＬ−４のアミノ酸配列は１ ２９残基を含む。このｃＤＮＡはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（７．８）及び酵母 （９）で発現された。高い生物学的活性を有する組み換えＩＬ−４をこれらの供 給源から単離することができる。

アレルギー過程におけるＩＬ−４の役割は、インターロイキン−４−媒介過程を 阻害するか、又はｈｌＬ−４と競合する物質が疾患−誘起反応連鎖を中断させる であろうことを予想させる。

従ってその活性成分がヒトインターロイキン４のアンタゴニスト（拮抗薬）であ るか又は部分的アゴニスト（作動薬）である治療薬を利用できるようにすること は、本発明の目的である。

ご（最近、ヒトインターロイキン４に対してアンタゴニスト性を示すモノクロー ナル抗体が見いだされた（１０）。この抗体はＦａｂフラグメントを含み、ヒト −ヒトハイブリドーマ細胞系により生産される。さらに（非−）グリコジル化ヒ トＩＬ−４に対して免疫化されたラットの牌臓細胞からのハイブリドーマ細胞系 はｈｌＬ−４に対するモノクローナル抗体を生産する（１１）。

上記の目的は本発明に従う、ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的アゴニスト であるか、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含み、アン タゴニスト又は部分的アゴニストが突然変異ｈＩＬ−４タンパク質であることを 特徴とする治療薬を利用できるようにすることにより達成された。本発明の治療 薬の選択は、標的化された態様で“遺伝子工学”を用い、野生型ｈ　Ｉ　Ｌ−４ と類似しているためにｈＩＬ−４レセプターの占有に関してｈ　Ｉ　Ｌ−４と競 合するタンパク質を製造できるという利点を有する。

さらに突然変異ｈ　Ｉ　Ｌ−４タンパク質ならびにそれらの製造法を利用バク質 （ｒｈＩＬ−４）として生産することができる。これらの状況下で形成されるタ ンパク質は可溶化、再生及び単離することができる。そのｒｈＩＬ−４は高い生 物学的な比活性を有し、それは例えば活性化Ｔ細胞のＤＮＡ合成／増殖、あるい は活性化Ｂ細胞のＣＤ２３発現の測定により決定することができる（例えばＫｒ ｕｓｅ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ、（１を参照）。

本発明によれば、ｈｌＬ−４アンタゴニスト又は部分的ｈ　Ｉ　Ｌ−４アゴニス トの性質を有するｈ　Ｉ　Ｌ−４野生型の突然変異タンパク質を製造できる方法 が現に設計された。特にｈ　Ｉ　Ｌ−４のアンタゴニストはｈｌＬ−４の効果を 特異的に阻害する可能性を与える。この目的で、−ｈｌＬ−４の成熟領域をコー ドするＤＮＡ領域を含むｃＤＮＡに、可能な天然のアミノ酸から選択された異な るアミノ酸が所望の位置で発現されるように、又は停止コドンによりポリペプチ ド鎖の中断が生ずるように標的オリゴヌクレオチド突然変異誘発（部位特異的突 然変異誘発）を行い、 一突然変異を起こしたｈ　Ｉ　Ｌ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を発現 ベクターに組み込み、 一形成されたハイブリッドベクターをＥ、コリ中に挿入し、−突然変異ｈ　Ｉ　 Ｌ−４タンパク質を発現させ、適宜単離する。

挙げられている文献を参照する。このような関係において“ｈ　Ｉ　Ｌ−４の成 熟領域をコードするｃＤＮＡ”は、そう称せられるｈ　Ｉ　Ｌ−４突然変異タン パク質がやはりアンタゴニスト又は部分的アゴニストであるならば、大体同数の 塩基対を有するが該技術の現状において特に示されているｃＤＮＡの突然変異体 を与えるｃＤＮＡを意味するとも理解される。

ｈ　Ｉ　Ｌ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域の番号付けはＧａ　ｒ　ｒ。

Ｃ，ｅｔ　ａｌ、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）　１旦、１５１５− １５２３）に従う。

ｈｌＬ−４の成熟領域をコードするｃＤＮＡは、遺伝子操作により生産されたｃ ＤＮＡ（例えばＢｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｙ　Ｌｔｄ、、０ｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄから）からＥｃｏＲＶ／Ｂａｍ ＨＩフラグメントを切断することにより得ることができる。インターロイキン４ の最初の４つのアミノ酸コドン及び開始メチオニンのためのコドンを含む、例え ば５’　−ＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴ及び５°　−ＡＴＣＧＣＡＣＴＴ ＧＴＧなどの合成オリゴヌクレオチドを加え、ＤＮＡフラグメントを発現ベクタ ー中に、例えば発現ベクターＲ”ｐＲｃ１０９のＮｃｏｌとＢａｍＨＩ切断部位 の間に組み込む（１２）。

部位特異的突然変異誘発はＫｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎｕｃｌｅｈｒｉｎｇ ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ｃａｔａｌｏｇｕｅ、Ｂｉｏｃｈ異誘発に用いられる オリゴヌクレオチドは、改変するべき塩基の上流に約６−１０塩基、及び下流に ６−１０塩基を含むことができる。

当該技術分野における熟練者は、突然変異を起こしたｈ　Ｉ　Ｌ−４の成熟領域 をコードするＤＮＡ領域のベクターからの切り出し、このＤＮＡ領域の発現ベク ターへの転移、続く発現ベクターのＥ、コリ中への挿入、ならびに突然変異ｈ　 Ｉ　Ｌ−４タンパク質の発現及びその任意の単離にも慣れており（ＭｃＣａｒｔ ｈｙ　ｅｔ　ａｌ、；Ｇｅｎｅ　（１９８６）４１．２０１−２０６；Ｋａｔｏ 　ｅｔ　ａｌ、；Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、（１９８５）　１３０，６９２−６９ ９）、それに伴う改変（１２）が可能である。

本発明の特定の実施態様に従い、部位特異的突然変異誘発を行う前に開始メチオ ニンをコードするＤＮＡを、ｈ　Ｉ　Ｌ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域 を含むｃＤＮＡ中に挿入する。

さらに特定の実施態様に従い、突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコー ドするＤＮＡ領域を、ｃＤＮＡ突然変異体からＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメン トとして切り出すことができる。

発現のために温度−調節発現ベクター、例えばｐＩＬＡ５０２（左（ｌ　ｅ　ｆ 　ｔ−ｈａｎｄ）ラムダプロモーター及びポリリンカーを含まない）及び／又は 宿主として普通のＥ、コリ株、例えばＪＭ１０３　（ｒｅｃＡつを用いるのが好 ましい。ｐｌＬＡ５０２に関し、５ｃｈａｕｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｇｅｎｅ（ １９８７）　５２．２７９−２８３）を参照されたい。さらに適した発現系はＰ ｈａｒｍａｃｉａから得るこることができる。

さらに別の実施態様に従い、本発明は野生型ｈｌＬ−４の突然変異体に関し、そ の突然変異体では位置１２４の領域でＴｙｒがＡｓｐにより置換されている。

本発明を２つの実施例を用い、下記においてより詳細に説明する。

実施例１ ｈｌＬ−４の成熟領域及び開始メチオニンをコードするｃＤＮＡにＫｒａｍｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、に従って部位特異的突然変異誘発を行った。

合成オリゴヌクレオチドは置換するべきヌクレオチドの上流及び下流に６塩基含 み、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｍｏｄｅｌ　３８０）を用いて生産した。置換するべき部位は、おそらくα−ら せんであるＣ−末端領域（位置１１０−１２９）の位Ｗ１２４であった。この場 合、ＴｙｒをＧｌｙに置換した。起こった突然変異は１本鎖バクテリオファージ ＤＮＡのＤＮＡ配列分析により確かめられた。

突然変異ｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして２本鎖ウィルスＤ ＮＡから切り出し、左ラムダプロモーター及びポリリンカーがない以外はｐＩＬ Ａ５０２に相当する温度−調節発現ベクターと結合させた。Ｅ、コリ株ＪＭ１０ ３のｒｅｃＡ−誘導体を宿主として用いた。組み込みｈｌＬ−４ｃＤＮＡを配列 決定し、突然変異を確認した。その後、突然変異タンパク質の発現に株を用いた 。

発現及び単離の後、突然変異タンパク質（Ｙ　１２４　Ｇ）はｈＩＬ−４のレセ プターに変わらぬ親和力で結合することが見いだされた。しがしバク質Ｙ１２４ Ｇが部分的アゴニストの性質を有することを示す。

位置１２４においてＴｙｒの代わりにＡｓｐを発現する以外は実施例１を繰り返 した。単離突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄは１μＭの濃度でも活性化末梢Ｔ細胞 に対して活性を示さなかった。しかしこれはｈＩＬ−４野生型の活性を、約６０ ０　ｐＭの阻害定数で阻害する。これは突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄがアンタ ゴニストの性質を有することを示す。

突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄは活性化Ｂ細胞上のＣＤ２３の誘導に関して小さ い残留活性を有する。しかし達成できる最大の誘導はｈＩＬ−４野生型の場合に 達成できる誘導のわずか約５％である。この系の場合、ｈ　Ｉ　Ｌ−４野生型の 活性は約８００ｐＭの阻害定数で突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄにより阻害され る。かくしてＢ細胞系において突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄは非常に弱いアゴ ニストの性質を有する。

実施例３ 位置１２１においてＡｒｇの代わりにＡｓｐを発現する以外は実施例１を繰り返 した。単離突然変異タンパク質のｈＩＬ−４レセプターへの結合は変わらなかっ た。しかし誘導することができる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖は、ｈｌＬ−４野 生型の場合に誘導される増殖のわずか約３０％であった。これは、突然変異タン パク質Ｒ１２１Ｄが部分的アゴニストの性質を有することを示す。

実施例４ 位置１２５においてＳｅｒの代わりにＡｓｐを発現する以外は実施例細胞の最大 増殖はｈ　Ｉ　Ｌ−４野生型の場合に誘導される増殖のわずか約３５％である。

文献表 １）　Ａｒａｉ、Ｋ−ニー、Ｌｅｅ、Ｆ、、Ｍｉｙａｊｉｍａ、Ａ−、Ｍｉｙａ ｔａｋｅ、　Ｓ、。

Ａｒａｉ、　Ｎ−およびＹｏｋｏｔａ、　？、（１９９０）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅ ｖ−Ｅｉｏｃｈａｍ。

５９、　７８３−８３６゜ ２）　Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ、　Ｆ、Ｄ、、　Ｔｉｏｌｍｅｓ、　Ｊ、、　Ｋａｔ ｏｎａ、工、Ｘ、。

Ｕｒｂａｎ、　Ｊ、Ｆ、、　Ｂｅｃｋｍａｎｎ、　Ｍ、Ｐ−、Ｐａｒｋ、　Ｌ、 Ｓ、。

５ｃｈｏｏｌｅｙ、に−Ａ−、Ｃｏｆｆｍａｎ＋　Ｒ−Ｌ、、Ｍｏｇｍａｎｎ　 Ｔ、Ｒ，および　。

Ｐａｕｌ、　Ｗ−３’、（１９９０）　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、　≧Ｉ工ｏ１．８． ３０３−３３３゜３）　Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ、ｒ　Ａｒａｉ、Ｎ−、Ｄｅ　Ｖｒｉ ｅｌｌ、Ｊ、ｔ　Ｓｐｉセｓ、！！、。

Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ、　Ｊ、、　Ｚｌｏｔｎｉｋ、　Ａ、、　Ｒｅｎｎ１ｃｋ 、　Ｄ、。

Ｈｏｗａｒｄ、　Ｍ、、Ｔａ）ｃａｂｓ、　Ｙ、、Ｍｉｙａｔａｋｅ、　Ｓ、、 Ｌｅｅ、Ｆ、およびＡｒａｉ、　Ｋ−工、（１９８Ｂ）　−圓二ｏ１．　Ｒｅｖ 、　１０２．１３７−１８７−４）　正ｚｅｒｄａ、　Ｒ，Ｌ−、Ｍａｒｃｈ、 　Ｃ−＋：ｒ、、　Ｍｏｇｌｅｙ、　Ｂ、、　Ｌｙｍａｎ、　Ｓ−Ｄ、。

Ｖａｎｄｅｎ　Ｂｏｓ、τ、Ｉ　Ｇｉｍｐｅｌ、　Ｓ、Ｄ、、　Ｄｉｎ、　ｗ、 ｓ、。

Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ、　Ｋ、Ｔ１．ｒ　Ｗｉｄｍｅｒ、　Ｍ、Ｂ、、　Ｐａｒｋ 、　Ｌ−５，。

Ｃｏｍ曝コ、　Ｄ、およびＢｅｃｋｍａｎｎ、　Ｍ−Ｐ、（１９９０）　Ｊ、　 ＥＸＰ、Ｍｅｄ。

１７１、　８６１−８７１ ５）　Ｃｏｓｍａｎ、　Ｄ、’＋　Ｌｙｍａｎ、Ｓ、Ｄ−、Ｉｄｚｅｒｄａ、Ｒ ，Ｌ、。

Ｂｅｃｋｍａｎｎ、　Ｍ−Ｐ、、　Ｐａｒｋｔ　Ｌ−５−、Ｇｏｏｄｗｉｚ、　 Ｒ，Ｇ、およびＭａｒｃｈ、　Ｃ−Ｊ−（１９９０）　Ｔｒａｎｄｓ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１ｓ、　２６５−２７０゜６）　Ｙｏｋｏｔａ、τ、、　 ０ｔｓｕ）ｃａ、　Ｔ−、Ｍｏａｍａｎｎτ、、　Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ、　Ｊ −。

ＤｅＦｒａｎｃｅ、　Ｔ−、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、　Ｄ、、　Ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ 、　Ｊ−Ｅ−＋　Ｌｅｅ、　Ｆ。

ａｎｄ　Ａｒａｉ、　Ｋ、１．　（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３゜５８９４−５８９８゜ ７　）　Ｖ　ａ　ｎ　Ｋ　ｌ　ｍ　ｍｅ！　ｎ　ａ　ｄ　ｅ　ｒ　Ａ　−ｒ　Ｂ 　Ｏｎ　ｄ　ｔ　Ｍ　−Ｗ　、　。

Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、Ｊ−Ｅ！、、Ｌａｑｕｏ土・　Ｃ１および　Ｋａｓセｅ ｌｅｉｎ、Ｒ，Ａ。

（１９８Ｂ）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ−１７３，１０９−１１４゜８ ）　Ｊａｙａｒａｍ、　Ｂ、、Ｂｅｖｏｇ、　Ｒ，、Ｇｕｉｓｅｚ、　Ｙ、およ びＦｉｅｒｓ、　Ｗ。

（１９Ｂ９）　Ｇｅｎｅ　７９．３４５−３５４゜９）　５ｏｌａｒｉ、Ｒ，、 Ｑｕｉｎｔ、Ｄ−、０ｂｒａｙ、Ｈ−、ＭｃＮａｍｅｅ、Ａ、。

Ｂｏｌｔｏｎ、Ｅ、、Ｅｉｓｎｅｙ、Ｐ−、Ｃｈａｍｐｉｏｎ、Ｂ−、Ｚａｎｄ ｅｒｓ、Ｅ、。

Ｃｈａｐｌｉｎ、　入、、Ｃｏｏｍｂｅｒ、Ｂ−、Ｗａｔｓｏｎ、Ｍ−、Ｒｏｂ ｅｒｔｓ、Ｂ。

およびＷｅｉｒ、　Ｍ、（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ−２６２，８９７ −９０８゜１０）　Ｃｏｆｆｍａｎ、Ｒ−Ｌ−；　ｄｅ　Ｖｒｉｅｇ、Ｊ−Ｅ− （Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　ＢｉｏｔｅｃｈＣｏｒｐ−、ＵＳＡ）、ＥＰ　３２７２８ ３　Ａｌ。

１１）　入ｂｒａｘｎｓ、Ｊ−５，；　Ｃｈｒｅｔｉａｎ、工、；　Ｌｅｅ、Ｆ 、Ｄ、；　Ｐｅａｒｃｅ、Ｍ−に−（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ ｒｐ−、ＵＳＡ）、ＥＰ　３１４４０２　Ａ２゜１２）　Ｗｅｉｇｅｌ、　Ｕ、 、　Ｍｅｙｅｒ、　Ｍ、および５ａｂａｌｄ、　Ｗ−（ＩＪ８９）　Ｅｕｒ−Ｊ 。

Ｂｉｏｃｈａｍ、’１８０，２９５−３００゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストであるか、あるいはこれ らのアンタゴニスト又はアゴニストを含み、アンタゴニスト又は部分的アゴニス トが突然変異ｈＩＬ−４タンパク質であることを特徴とする治療薬。 ２．突然変異ｈＩＬ−４タンパク質において、野生型の場合自然に位置１２０、 １２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７又は１２８に存在する１つ又 はそれ以上のアミノ酸がそれぞれ可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸に より置換されているか、あるいはポリペプチド鎖がこれらの位置の１つで中断し ていることを特徴とする請求の範囲１に記載の治療薬。 ３．突然変異ｈＩＬ−４タンパク質において、自然に位置１２４に存在するアミ ノ酸チロシンが可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸で置換されているこ とを特徴とする、請求の範囲２に記載の治療薬。 ４．位置１２４においてチロシンがアスパラギン酸又はグリシンで置換されてい ることを特徴とする、請求の範囲３に記載の治療薬。 ５．自然に位置１２０、１２１、１２３、１２５、１２６、１２７又は１２８及 び任意に（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅｌｙ）位置１２４に存在する１つ又はそれ以 上のアミノ酸がそれぞれ可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸により置換 されているか、あるいはポリペプチド鎖がこれらの位置の１つで中断しているこ とを特徴とする突然変異ｈＩＬ−４タンパク質。 ６．自然に位置１２４に存在するアミノ酸チロシンが可能な天然のアミノ酸の中 のアスパラギン酸以外の異なるアミノ酸で置換ちれていることを特徴とする突然 変異ｈＩＬ−４タンパク質。 ７．チロシンがグリシンで置換されていることを特徴とする、請求の範囲６に記 載の突然変異ｈＩＬ−４タンパク質。 ８．−ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を含むｃＤＮＡに、可能な 天然のアミノ酸から選択された異なるアミノ酸が所望の位置で発現されるように 標的オリゴヌクレオチド突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）を行い、 −突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を発現ベク ターに挿入し、 −形成されたハイブリッドベクターをＥ．コリ、酵母又は他の真核細胞中に導入 し、 −突然変異ｈＩＬ−４タンパク質を発現させ、適宜単離することを特徴とする、 請求の範囲５−７のいずれか１つに記載の突然変異ｈＩＬ−４タンパク質の製造 法。 ９，部位特異的突然変異誘発を行う前にｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮ Ａ領域を含むｃＤＮＡ中に開始メチオニンをコードするＤＮＡを挿入することを 特徴とする、請求の範囲８に記載の方法。 １０．突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域をベク ターからＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出すことを特徴とする、 請求の範囲８又は９に記載の方法。 １１．温度−調節発現ベクター、例えばｐＩＬＡ５０２（左ラムダプロモーター 及びポリリンカーを含まない）及び／又は宿主として改変Ｅ．コリ株ＪＭ１０３ （ｒｅｃＡ−）を用いることを特徴とする、請求の範囲８−１０のいずれか１つ に記載の方法。