ITRM940805A1 - Metodo per selezionare superagonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130 - Google Patents
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Abstract
Si è trovato che i ligandi del gruppo delle citochine simili alla Interleuchina 6 (IL-6), vale a dire Oncostatina M (OSM), Leukemia Inhibitory Factor (LIF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) e Interleuchina 11 (IL-11), inducono la formazione di un complesso recettoriale di cui fa parte la molecola di membrana gp 130. Si può pertanto ipotizzare che due diverse superfici della proteina (in questa classe di ormoni), definite come sito 1 e sito 2, si legano a due diverse molecole: il sito 1 con il recettore specifico e il sito 2 con gp 130. L'invenzione permette l'identificazione di questi siti e l'isolamento di varianti che hanno, rispetto all'ormone selvatico, una maggiore affinità per il recettore specifico (superagonisti e superantagonisti) oppure una affinità ridotta o nulla per gp 130 (antagonisti e superantagonisti). La figura 1 mostra il costrutto pHen?hIL-6 e la produzione di particelle fasmidiche che sono utilizzabili per la selezione di agonisti dell'Interleuchina 6.
Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "METODO PER SELEZIONARE SUPERAGONISTI, ANTAGONISTI E SUPERANTAGONISTI DI ‘ORMONI DEL CUI COMPLESSO RECETTORIALE FA PARTE GP 130"
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130.
Come è noto, WO 92/21029 della Genentec Ine. insegna un metodo per la determinazione di agonisti o antagonisti di ormoni della crescita e ligandi con struttura conformazionale simile. I potenziali agonisti e antagonisti vengono messi a contatto con un recettore dell'ormone e si determina la formazione di un complesso ternario che consiste di una molecola del potenziale agonista o antagonista e due molecole di detto recettore dell'ormone da agonistizzare o da antagonistizzare . La dimerizzazione di recettori indotta da una molecola di ligando porta alla conclusione che il ligando ha due differenti siti di interazione (sito 1 e sito 2) sui quali si può agire mediante metagenesi per generare di volta in volta agonisti o antagonisti.
Si è ora trovato inaspettatamente che i ligandi del gruppo delle citochine simili alla Interleuchina 6 (IL-6), vale a dire Oncostatina M (OSM), Leukemia Inhibitory Factor (LIF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), e Interleuchina 11 (IL-11) , inducono la formazione di un complesso recettoriale di cui fa parte la molecola di membrana gp 130. In questo complesso recettoriale sono sempre presenti il recettore specifico per ognuna di queste citochine e la molecola di membrana gp 130 come elemento comune. Si può pertanto ipotizzare che il sito 1 e il sito 2, in questa classe di ormoni, si legano a due diverse molecole: il sito 1 con il recettore specifico e il sito 2 con gp 130.
La identificazione dei due siti può essere resa possibile, come si vedrà meglio nel seguito, dalla formulazione di un modello tridimensionale del complesso recettoriale basato sulla analogia funzionale tra sequenze del recettore dell'ormone umano della crescita (hGH), e sequenze dei recettori degli ormoni in questione. L'isolamento di varianti che hanno, rispetto all'ormone selvatico, uria maggiore affinità per il recettore specifico (superagonisti o superantagonisti ) si ottiene con la costruzione di librerie di fagi filamentosi, ad esempio M13 che portano l'ormone, sia nella versione selvatica che mutata.
La differenza tra il modello tridimensionale, ad esempio di IL-6, qui adottato e quello adottato in WO92/21029 portano ad ipotizzare residui differenti nella elica A e C come costituenti del sito 2.
Il modeling della molecola di interleuchina 6 umana procede come segue. Si sa da dati disponibili nella letteratura scientifica che la sequenza amminoacidica dell1interleuchina 6 umana mostra somiglianze con quella del fattore di stimolazione di colonie di granulociti (G-CSF). La struttura tridimensionale del G-CFS bovino (bG-CSF) determinata mediante cristallografia a raggi X è stata usata come stampo per sviluppare un modello tridimensionale della IL-6 umana a partire dal residuo 16 fino al 184. In prima istanza la sequenza amminoacidica dell'IL-6 umana è stata allineata con quella del bG-CSF. Sulla base dell'allineamento derivato i residui amminoacidici nella struttura tridimensionale del bG-CSF sono stati’sostituiti con i corrispondenti residui della IL-6 umana impiegando programmi di modellistica molecolare su di una unità di grafica interattiva computerizzata. Nelle posizioni dove l'allineamento predice o delezioni o inserzioni (che suggeriscono una diversa conformazione locale nella molecola della interleuchina 6) sono stati effettuati degli aggiustamenti applicando delle opzioni incluse nel programma di modellamento molecolare.
Questo modello tridimensionale di interleuchina 6 ha consentito di identificare i due siti di interazione dell'interleuchina 6 umana con i suoi due recettori: il recettore gp 80 a bassa affinità (sito 1) e il recettore di trasduzione del segnale gp 130 ad elevata affinità (sito 2). Per la identificazione dei due siti si è proceduto come segue. Dai confronti di sequenza è già noto che tutti i membri di una famiglia di recettori ematopoietici sono relazionati l'uno all'altro mediante condivisione di un dominio chiamato dominio di riconoscimento delle citochine. Questa similarità di sequenze indica con elevata probabilità anche una similarità strutturale delle parti corrispondenti dei diversi recettori, inclusi i due recettori dell 'interleuchina 6, gp 80 e gp 130. La osservazione che le citochine che si legano a questi recettori hanno ( o si può predire che abbiano) tutte una struttura simile, precisamente un motivo di quattro eliche, supporta con forza l'ipotesi che l'interazione tra queste citochine e i loro recettori, via il dominio di riconoscimento delle citochine, debba essere molto simile nei complessi biologicamente attivi.
Dato che per uno di questi complessi (il complesso tra l'ormone della crescita e il dominio extiracellulare del recettore dimerico dell'ormone della crescita) è stata determinata mediante cristallografia a raggi X la struttura tridimensionale, il nostro modello di interleuchina 6 umana ci permette di identificare i siti potenziali di interazione tra interleuchina 6 e i suoi due recettori gp 80 (sito 1) e gp 130 (sito 2). Ciò per analogia con il complesso che coinvolge l'ormone della crescita ed assumendo che gli amminoacidi importanti sotto il profilo funzionale siano localizzati in posizioni simili sulla superficie dei due ormoni.
L'esigenza di disporre di una metodologia per la messa a’ punto di agonisti, "antagonisti e superantagonisti di ormoni del sistema immunitario il cui complesso recettoriale è costituito anche da gp 130, verrà chiarita con riferimento al caso di interleuchina-6.
Come è noto, l 'interleuchina 6 è un polipeptide di 184 amminoacidi che, come abbiamo visto, appartiene alla classe delle citochine elicoidali. L 1interleuchina 6 è una citochina multifunzionale prodotta da vari tipi di cellule. Essa agisce come fattore di differenziazione e crescita su cellule di vario tipo, quali ad esempio cellule del sistema immunitario, epatociti, cellule renali, cellule staminali ematopoietiche, cheratinociti e neuroni.
La messa a punto di superagonisti della interleuchina 6 consentirebbe di adottare dosaggi terapeutici inferiori a quelli necessari con l'interleuchina 6 selvatica nella cura di numerose malattie gravi. La interleuchina 6 infatti trova importanti e promettenti applicazioni nella terapia del cancro al seno, della leucemia, e di malattie infettive o legate a disordini delle cellule progenitrici del midollo osseo.
D'altro canto la messa a punto di antagonisti o superantagonisti della interleuchina 6 umana consentirebbe la inibizione dell 1interleuchina 6 in numerose malattie caratterizzate da una sua sovrapproduzione, quali disordini autoimmuni cronici, mieloma/plasmacitoma,
osteoporosi successiva alla menopausa e cachessia da cancro.
La metodologia per la selezione di superagonisti , antagonisti oppure superantagonisti di un ormone che utilizza la molecola di membrana gp 130 per attivare i meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, secondo la presente invenzione, comprende le seguenti operazioni:
confrontare le sequenze amminoacidiche dell'ormone della crescita e/o del b-GSFcon le sequenze di detto ormone;
confrontare le sequenze amminoacidiche del recettore dell'ormone della crescita con quelle dei due recettori dell'ormone in questione: il recettore ormone- specifico e gp 130;
sulla base dei confronti, formulare un modello tridimensionale del complesso recettoriale basato sulla analogia funzionale tra sequenze del recettore dell'ormone della crescita e i due recettori dell'orinone in questione; e
identificare i residui dell'ormone selvatico in questione che fanno parte rispettivamente del sito di interazione con il recettore specifico e del sito di interazione con gp 130.
L'ormone in questione può essere scelto dal gruppo comprendente Interleuchina 6 (IL-6), Oncostatina M (OSM), Leukemia Inhibitory Factor (LIF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) e Interleuchina 11 (IL-11).
Per la selezione di superagonisti di interleuchina 6, la metodologia secondo la presente invenzione comprende inoltre le seguenti operazioni addizionali:
- produzione di una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei seguenti residui selvatici della interleuchina 6 presente come prodotto di fusione con proteine di fagi filamentosi
- produzione di una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei seguenti residui selvatici della interleuchina 6 (presente come prodotto di fusione con proteine di fagi filamentosi) :
elica A:
Ser 22, Giu 23, Asp 26, Arg 30, Leu 33, Ser 37, Arg 40, Glu 42;
regione (ansa) AB:
Ser 52, Ser 53, Ala 56, Leu 57, Giu 59, Asn 60, Leu 62, Leu 64, Pro 65, Lys 66, Met 67, Ala 68, Giu 69, Lys 70, Asp 71, Phe 74, Gin 75, Ser 76; elica D:
His 164, Leu 165, Argl68, Ser 169, Lys 171, Giu 172, Phe 173, Gin 175, Serl76, Ser 177, Leu 178, Arg 179, Ala 180, Leu 181, Arg 182, Gin 183, Met 184.
- selezione, dalla popolazione mista di fagi che appartengono a ciascuna individuale libreria fagica e che esprimono interleuchine 6 mutanti, quella o quelle che presentano una affinità per il recettore specifico superiore alla interleuchina 6 selvatica; e
identificazione della migliore o delle migliori sequenze amminoacidiche leganti il recettore mediante sequenziamento del DNA estratto dalle particelle fagiche selezionate.
In questo caso, si può produrre una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei detti residui selvatici dell'interleuchina 6 presente come prodottò di fusione con la proteina pili di M13 .
La metodologia per la selezione di antagonisti di interleuchina 6, secondo la presente invenzione, comprende - oltre alle operazioni sopra menzionate riguardanti il modellamento molecolare della proteina IL-umana e delle sue catene recettoriali - le seguenti operazioni :
mutagenesi dei residui identificati per essere parte del sito di interazione con gp 130 (Arg 30, Tyr 31, Gly 35, Ser 37, Ala 38, Ser 118,
Lys 120, Val 121, Gin 124, Phe 125, Gin 127, Lys 128 e Lys 129) con tecniche convenzionali di biologia molecolare;
valutazione dell'attività biologica e dell'affinità per il recettore specifico per la interleuchina 6 dei mutanti prodotti come sopra, al fine di identificare varianti di interleuchina 6 con intatta affinità al recettore specifico che presentano riduzioni o perdita dell'attività biologica; e
valutazione delle suddette varianti di interleuchina 6 come antagonisti dell'attività biologica dell1interleuchina 6 selvatica.
Nel caso di selezione di superantagonisti dell 'interleuchina 6 mediante combinazioni delle variazioni di sequenza amminoacidiche responsabili dell'attività antagonista, identificate come sopra, con variazioni amminoacidiche responsabili di una aumentata affinità del recettore specifico per l'interleuchina 6.
Nella metodologia per la selezione di antagonisti o superantagonisti di interleuchina 6, la mutagenesi dei residui identificati come sopra può essere eseguita con una tecnica di biologia molecolare scelta dal gruppo comprendente Polimerase Chain Reaction, Primer Extension, Oligonucleotide Directed Mutagenesis, e loro combinazioni .
La presente invenzione non si limita alla metodologia per la selezione di agonisti, antagonisti o superantagonisti di interleuchina 6. Si estende invece anche agli agonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni che utilizzano la molecola di membrana gpl30 per attivare meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, e che sono ottenibili con la metodologia di selezione descritta in precedenza.
Si è data finora del ritrovato oggetto della presente invenzióne una descriziorìé di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi verrà ora fornita una descrizione particolareggiata di specifiche forme di realizzazione della invenzione finalizzate a farne meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità applicative.
La figura 1 annessa mostra il costrutto pHen^ hIL-6 e la produzione di particelle fasmidiche (v.esempio 1, "Costruzione del vettore"), utilizzabili per la selezione di agonisti della hIL-6 .
La figura 2 mostra l'attività antagonistica del mutante IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe/Serll8Arg/Vall21Asp al crescere della sua concentrazione (vedi esempio 4).
DEPOSITI
Batteri E.Coli K12 - trasformati con il plasmide pHen hIL-6 che contiene dal sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione Sali a quello per l'enzima di restrizione Noti, una sequenza nucleotidica codificante per la sequenza amminoacidica dell'interleuchina-6 umana selvatica - sono stati depositati in data 10/6/1993 presso The National Collection of Industriai and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen Scozia, UK, con il numero di accesso’NCIMB 40563.
Esempio 1
Applicazione della metodologia secondo l'invenzione per la selezione di aqonisti della interleuchina-6
1) COSTRUZIONE DEL VETTORE
La strategia consiste nel costruire un gene ibrido contenente tutta la regione codificante per hIL-6 (SEQ ID NO: 1) seguita dagli ultimi 157 amminoacidi della proteina pili del fago M13 e preceduta dalla sequenza Pel B, che indirizzerà la proteina sintetizzata nello spazio periplasmico.
L'espressione del gene ibrido viene guidata dal promotore lacZ. Il costrutto viene realizzato nel contesto del vettore pHenΔ e prende il nome di pHenΔ hIL-6 (vedi unica figura annessa). Questo plasmide è dotato anche di una origine di replicazione fagica. Se una cellula batterica contenente questo plasmide viene infettata da un batteriofago detto "helper", come M13K07, dal plasmide verranno prodotte copie a singolo filamento che verranno rivestite dalle proteine fagiche, proprio come se si trattasse di un vero genoma fagico. Queste particelle fagiche contenenti il plasmide vengono definite fasmidi. Essi conterranno,’ oltre alle normali molecole di pili anche le molecole di fusione hIL6-pIII. Nella medesima entità sono quindi riuniti una molecola di hIL-6 e il gene che ne codifica la sequenza amminoacidica. Nel caso di molecole mutanti, sarà possibile conoscere la sequenza amminoacidica di molecole esposte sulla superficie di fagi risultanti da procedure di selezione semplicemente sequenziando il DNA del fasmide.
Una ulteriore caratteristica del costrutto pHenΔ hIL-6 è la presenza di un codone di stop della traduzione tra il gene di IL-6 e il gene di pili. La produzione della proteina ibrida viene effettuata in ceppi batterici in grado di sopprimere tale codone di Stop. Viceversa l'utilizzo di ceppi non soppressori consente la produzione di hIL-6 da sola, direttamente nello spazio periplasmico.
Gli esperimenti che seguono dimostrano la possibilità di utilizzare shrIL-6R per purificare, mediante cicli di selezione amplificazione, tra la vasta gamma di interleuchine-6 mutanti esposte sul fago grazie a pHenΔ hIL-6. quelle che presentino affinità maggiore per tale recettore.
2) ESPERIMENTI DI CARATTERIZZAZIONE DEL SISTEMA a) Saggio ELISA
I pozzetti di piastre ELISA sono stati rivestiti con fasmidi hIL-6 o con M13K07 e fatti reagire con shrIL-6R (Soluble Human Recombinant IL-6R) . Dopo ripetuti lavaggi la presenza del recettore è stata rivelata con un anticorpo monoclonale specifico coniugato con fosfatasi alcalina. Il segnale ottenuto è maggiore nel caso dei fasmidi hIL-6 ed aumenta con l'aumentare della quantità del recettore utilizzato.
b) Arricchimento del fasmide hIL-6 da miscele fasmide-K07 mediante shrIL-6R
Particelle fasmidiche hIL-6 sono state miscelate con particelle di M13K07 in proporzione 1:100. Questa miscela è stata incubata con palline di polistirene rivestite con shrIL-6R. Dopo ripetuti lavaggi a pH neutro le palline sono state sottoposte ad un lavaggio stringente a pH 4,2, seguito da una eluizione a pH 3,6. Nell'eluato risultante è stata determinata la proporzione fasmidi hIL-6:M13K07. La proporzione risulta essere di 1:10, con conseguente arricchimento di dieci volte dei fasmidi hIL-6 rispetto a M13K07. c) Selezione da miscele di interleuchine-6 mutanti di quelle a maggiore affinità per il recettore ero 80 '
Sono state prodotte particelle fasmidiche recanti sulla superficie molecole mutanti di hIL-6 con affinità maggiore (176 Arg) o minore (179 Ala) per il recettore, rispetto alla versione naturale. Queste particelle sono state miscelate in rapporto 1:1. La miscela è stata incubata con il recettore in fase solida, come descritto al punto b). Nell 'eluato a pH 3,6, il rapporto tra i due tipi di particelle è risultato essere di 15:1 in favore di 176 Arg.
d) Determinazione dell'affinità relativa per il recettore gp 80 delle particelle di M13K07, fasmide hIL-6. fasmide 176 Ara e fasmide 179 Ala Uguali quantità di particelle dei vari tipi sopra elencati sono state incubate separatamente con le palline rivestite di recettore. Dopo la consueta serie di lavaggi è stata determinata la quantità di particelle recuperate nell'eluato a pH 3,6 per ogni tipo di fago. Ponendo pari a 1 il valore di particelle recuperate nel caso del fasmide hIL-6, si ottiene un valore di 3 per 176 Arg, di 0,2 per 179 Ala e di 0,18 per M13K07. Questi valori riflettono le affinità relative delle molecole di IL-6 non esposte sul fago. E' infatti noto ché 176 Arg lega il'recettore con affinità di tre volte superiore alla molecola naturale, mentre nel caso di 179 Ala l'affinità per il recettore è ridotta quasi a zero ( infatti un fasmide con tale mutante si comporta, nei riguardi del legame al recettore, come M13K07).
L'insieme di questi esperimenti ha dimostrato la possibilità di selezionare, con la metodologia della presente ivnenzione, da miscele di mutanti esposti sul fago, quelli con affinità maggiore per il recettore.
Esempio 2
Selezione di nuovi superagonisti e/o superleganti il recettore specifico della interleuchina 6 mediante mutagenesi di residui amminoacidici nella elica D
Una libreria fagica (contenente mutazioni dei residui Glnl75, Serl77, Leul81 e Glnl83 della interleuchina 6 normale e presente nella forma di prodotto di fusione con la proteina pIII del fago filamentoso M13) è stata costruita facendo uso della tecnica di primer extension.
L 'oligonucleotide mutagenetico è stato IL-6 QSLQ (AS), un oligonucleotide di 62 basi, la cui sequenza è SEQ ID NO: 2. Il primer IL-6 QSLQ (AS) si estende dalla posizione 507 al 'codone di stop del cDNA della interleuchina 6 (filamento antisenso) , esso introduce degenerazioni nei codoni che codificano per gli amminoacidi 175 (Gin naturale), 177 (Ser naturale), 181 (Leu naturale) e 183 (Gin naturale), e introduce anche un sito di restrizione Noti a valle del codone di terminazione della IL-6. L' oligonucleotide IL-6 QSLQ pr Barn, la cui sequenza è SEQ ID NO: 3, è stato utilizzato come innesco per la reazione di primer extension. L’ologonucloetide IL-6 QSLQ pr Barn si estende dalla posizione 503 alla posizione 522 (filamento senso) del cDNA dell 'interleuchina-6 e contiene un sito di riconoscimento per l'enzima BamHI nei primi 9 nucleotidi al suo 5'. I due oligonucleotidi sono complementari l'uno all'altro in una regione corrispondente alle posizioni dal nucleotide 507 al nucleotide 522 del cDNA dell'interleuchina-6. I due oligonucleotidi sono stati ibridati in vitro e gli oligonucleotidi ibridati sono stati utilizzati come substrato per la reazione di primer extension, effettuata utilizzando l'enzima Klenow. IL frammento di DNA a doppio filamento così ottenuto è stato poi digerito con Barn HI (compatibile'con ’BlglI) e con Not Ί e ligato nel plasmide pHen/\ hIL-6. digerito con BglII (compatibile con BamHI) e con Noti, per rimpiazzare la sequenza naturale con quelle mutate. Il prodotto della ligazione è stato inserito in batteri producendo circa IO6 trasformanti indipendenti ("trasformante" è la definizione che si dà ad un batterio che abbia incorporato un plasmide ricombinante). I batteri trasformati sono stati infettati con il fago helper M13 k07 per generare una libreria fagica (una libreria di fasmidi) come descritto al punto 2 dell'esempio 1.
La libreria è stata sottoposta a selezione tramite incubazione con palline di polistirene rivestite con shrIL-6R, come descritto nell'esempio 1. La popolazione fasmidica eluita a pH3,6 è stata poi amplificata in batteri. Dopo cinque cicli di selezione-amplificazione, fasmidi scelti a caso sono stati sequenziati nella regione mutata, le corrispondenti proteine mutanti di interleuchina 6 sono state prodotte nello spazio periplastnico del ceppo batterico appropiato (come descritto nell'esempio 1) ed analizzate sia per il legame al recettore specifico dell'interleuchina 6 che per attività biologica su cellule umane di epatoma. La tabella 1 mostra che, utilizzando la metodologia della presente invenzione, è possibile selezionare superagonisti dell 'interleuchina 6, molecole mutate nell'elica D, che hanno aumentato sia la capacità di legare il recettore specifico dell 'interleuchina 6 che l'attività biologica su cellule umane di epatoma.
TABELLA 1
Proprietà di legame al recettore ed attività biologica dell ' interleuchina 6 naturale e di suoi mutanti nell'elica D
N. D.: non determinato
Le mutazioni selezionate con la metodologia della presente invenzione possono essere utilizzate come punto di partenza per lo sviluppo di più potenti superagonisti (o superleganti il recettore specifico) dell'interleuchina-6. Ciò è mostrato in questo esempio, in cui le mutazioni identificate nel fasmide 5-2 sono combinate con la mutazione Serl76Arg che, da conoscenze precedenti, aumenta sia il legame al recettore che l'attività biologica (vedere la pubblicazione internazionale
WO 94/11402 dell'I.R.B .M. P. ANGELETTI, depositata il 2.11.93 con priorità Italiana del 6.11.92). Le tre mutazioni sono state riunite nello stesso cDNA tramite ’ ologonucleotide- directed mutagenesis. L'oligonucleotide 175I/176R/183A (S), la cui sequenza è SEQ ID NO: 4 è lungo 76 nucleotidi e si estende dalla posizione 499 al codone di stop del cDNA dell 'interleuchina-6 (filamento senso) presente in pHen/lh.IL-6 ed ha un sito di riconoscimento per l'enzima Noti a valle del codone di stop. L 'oligonucleotide 175I/176R/183A (AS), la cui sequenza è SEQ ID NO:5, è lungo 73 nucleotidi e si estende dalla posizione 499 al codone di stop del cDNA dell 'interleuchina 6 (filamento antisenso) presente in pHenΔ hIL-6 e ha un sito di riconoscimento per l'enzima Noti a monte del codone di stop. I due oligonucleotidi sono complementari l'uno all'altro ed entrambi codificano l’amminoacido isoleucina in posizione 175, l'amminoacido aerina in posizione 176 e 1 1amminoacido alanina in posizione 183. I due oligonucleotidi sono stati ibridati in vitro, il frammento di DNA a doppio filamento così otttenuto è stato digerito con gli enzimi di restrizione BglII e Noti e ligato nel vettore hIL-6 digerito con gli stessi due enzimi, per rimpiazzare la sequenza naturale con quella mutata. La ctorrispondente variante di interleuchina-6 con le tre muatzioni desiderate è stata prodotta nello spazio periplasmico del ceppo batterico appropriato (come descritto nell'esempio 1) e analizzata sia per legame al recettore che per attività biologica su cellule umane di epatoma. La tabella 2 mostra le proprietà di legame al recettore e di attività biologica su cellule umane di epatoma sia del nuovo triplo mutante che del doppio mutante originario.
TABELLA 2
Proprietà di legame al recettore ed attività biologica di interleuchina 6 selvatica e di mutanti nell'elica D doppio e triplo
Come si può vedere dalla tabella, il mutante triplo con le sostituzioni Glnl75Ile/Serl76Arg/Glnl83Ala (chiamato IL-6 IRA) è un " superagonista "(superlegante) dell 1interleuchina 6 molto più potente del mutante originario con soltanto le due sostituzioni Glnl75Ile/Glnl83Ala.
Esempio 3
Selezione di nuovi e più potenti superleqanti il recettore specifico della interleuchina 6 mediante mutagenesi di residui amminoacidici nella regione AB
E' stata costruita una nuova libreria fagica contenente mutazioni dei residui Asp71, Phe74, Gln75 e Ser76 della interleuchina 6 a partire dalla variante IL-6 IRA descritta nell'esempio 2 e che presenta una affinite per il recettore superiore di circa cinque volte a quella della interleuchina-6 umana naturale, e presente nella forma di prodotto di fusione con la proteina pIII del fago filamentoso M13. La libreria è stata costruita facendo uso della tecnica di primer extension. L'oligonucleotide mutagenetico è stato IL-6 DFQS, un oligonucleotide di 95 basi, la cui sec[uenza è SEQ ID NO: 6. Il primer IL-6 DFQS introduce degenerazioni nei codoni che codificano per gli amminoacidi 71 (Asp naturale), 74 (Phe naturale) , 75 (Gin naturale) e 76 (Ser naturale). L 'oligonucleotide IL-6 AB primer, "la cui sequenza è SEQ ID NO: 7, è stato utilizzato come innesco per la reazione di primer extension. I due oligonucleotidi sono stati ibridati in vitro e gli oligonucloetidi ibridati sono stati utilizzati come substrato per la reazione di primer extension, effettuata utilizzando l'enzima Klenow secondo lo stesso schema illustrato nell'esempio 2. Il frammento di DNA a doppio filamento così ottenuto è stato poi digerito e ligato nel plasmide pHenΔhIL-6 per rimpiazzare la sequenza naturale con quelle mutate. Il prodotto della ligazione è stato inserito in batteri producendo circa tre milioni di trasformanti indipendenti. I batteri trasformati sono stati infettati con il fago helper M13 K07 per generare una libreria fagica (una libreria di fasmidi) come descritto al punto 2 dell'esempio 1.
La libreria è stata sottoposta a selezione tramite incubazione con palline magnetiche rivestite con anticorpo monoclonale diretto contro shrIL-6R ed in presenza di shrIL-6R e di shrgpl30. La popolazione fasmidica eluita a pH 3,6 è stata poi amplificata in batteri. Dopo tre o quattro cicli di selezione-amplificazione, fasmidi scelti a caso sono stati sequenziati nella regione mutata, le corrispondenti proteine mutanti di interleuchina 6 sono state prodotte nello spazio periplasmico del ceppo batterico appropiato (come descritto nell'esempio 1) ed analizzate per il legame al recettore specifico dell 'interleuchina 6. La tabella 3 mostra che, utilizzando la metodologia della presente invenzione, è possibile selezionare varianti dell 'interleuchina 6 che presentano un ulteriore incremento della affinità per il recettore specifico, molecole mutate sia nell'elica D che nella regione A-B.
TABELLA 3
Proprietà di legame al recettore di varianti di interleuchina 6-IRA contenenti mutazioni addizionali nei residui 71,74, '75 e 76 della regione A-B
)
Esempio 4
Generazione e selezione di antagonisti completi della interleuchina 6 con la metodologia della presente invenzione
Per tutte le reazioni di mutagenesi è stato usato come stampo il plasmide PhenΔhIL-6 . Questo plasmide è un derivato del plasmide pHENl e contiene la regione codificante della IL-6 umana (SEQ.ID NO:1) a monte della regione codificante per la parte carbossi-terminale (dal codone 250 alla estremità 'C00H) della proteina pIII del batteriofago M13; le due regioni codificanti sono in fase di lettura e sono separate da un codone di Stop Amber UAG, che può essere soppresso in ceppi batterici che portano integrato nel genoma il gene del soppressore SupE. La regione codificante per IL-6 umana è anche in fase di lettura, a valle del peptide PelB, sequenza segnale per la secrezione, e 1'intero gene è sotto il controllo del promotore LacZ. Infine, è stato introdotto un sito unico per l'enzima di restrizione Sacl nella sequenza nucleotidica che codifica per gli amminoacidi 20-21-22 di hIL-6 senza cambiare la loro identità e, parimenti, è stato introdotto un sito unico per l'enzima di restrizione BfrI nella regione che codifica per gli amminoacidi 38-39-40 di hIL-6, nche questa volta senza cambiarli.
E' stata usata una strategia PCR (polymerase Chain Reaction) per generare mutazioni entro i codoni selezionati per la regione codificante per interleuchina-6 umana. Ilprimer a valle è HP/1, un primer di 29 nucleotidi, corrispondente alle posizioni 1.99 (filamento senso) del cDNA di hIL-6 (assumendo come 1 il primo nucleotide del primo codone del polipeptide maturo) . Il sito di ibridazione delpfrimer è a monte” del sito di riconoscimento peri 'enzima Sacl artificialmente introdotto nel cDNA senza cambiare la sequenza codificante dello stesso come descritto nell'esempio 2. Il primer mutagenico a valle è IL-6 118RCLF/121VD, unprimer di 72 nucleotidi, la cui sequenza è SEQ ID NO: 8.
Il primer IL-6118RCLF/121VD si estende dalla posizione 334 alla posizione 405 (filamento antisenso) del cDNA di hIL-6 e introduce degenerazioni nei codoni che codificano per 1 'amminoacido 118 (resina deltipo selvatico) e 121. (vaiina del tipo selvatico). Un frammento di DNA di 415 paia dibasi viene amplificato mediante PCR secondo protocolli standard di amplificazione PCR. L'amplificazione viene eseguita in 35 cicli. Ciascun ciclo consiste di incubazione per 2 minuti a 94°C per la denaturazione dello stampo, 2 minuti a 50°C per l'ibridazione dell ' oligonucleottide e 3 minuti a 72°C per l'estensione della catena. Il frammento amplificato viene digerito con Sacl e XbaI e purificato da gel di agarosio al 2%. Il frammento generato per PCR e digerito dai due enzimi viene ligato nel nelv ettore pHenΔhIL-6, digerito con gli stessi due enzimi, purificato su gel di agarosio allo 0,8%, per sostituire la sequenza di tipo selvatico.
Nella seguente tabella 4 vengono riportati l'attività biologica, in cellule di epatoma umano, e il legame al recettore per la interleuchina-6 selvatica e sue varianti mutate nei residui indicati .
TABELLA 4
Proprietà di legame al recettore e attività biologica di inter leuchina 6 selvatica e di mutanti della stessa nell'elica C
Si può notare come il mutante 10-6 Serll8Arg/Vall21Asp abbia caratteristiche molto simili al mutante IL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe , descritto in letteratura (Savino, R., Lahm, A., Salvati, A.L., Ciapponi, L., Sporeno, E., Altamura, S'., Paonessa, G., Toniatti, C. and Ciliberto, g. (1994) Embo J. 13, 1357-1367), cioè una normale attività di legame al recettore di tipo I della interleuchina 6, ma una riduzione di circa 30 volte della attività biologica della citochina .
Per successive reazioni di mutagenesi è stato usato come stampo il plasmide pHEN hIL-6 Tyr31Asp/gly35Phe, descritto in letteratura (Savino, R., Lahm, A., Salvati, A. L., Ciapponi, L., Sporeno, E., Altamura, S., Paonessa, G., Toniatti, C. and Ciliberto, G. (1994) Embo J. 13, 1357-1367) .
E' stata usata una strategia PCR (Polymerase Chain Reaction) per generare mutazioni entro i codoni selezionati nella regione codificante per l'interleuchina 6 umana. Il primer a monte è HP1, descritto nel precedente esempio. Il primer mutagenico a valle è IL-6118RCLF/121VD, descritto precedentemente in questo. Un frammento di DNA di 415 paia di basi viene amplificato mediante PCR secondo protocolli standard di amplificazione PCR. L'amplificazione viene eseguita in 35 cicli. Ciascun ciclo consiste di incubazione per 2 minuti a 94°C per la denaturazione dello stampo, 2 minuti a 50°C per l'ibridazione dell'oligonucleotide e 3 minuti a 72°C per l'estensione della catena. Il frammento amplificato viene digerito con Sacl e con XbaI e purificato su gel di agarosio al 2%. Il frammento generato per PCR e digerito daidue enzimi viene ligato nel vettore pHEN Δ hIL-6, digerito con gli stessi due enzimi, purificato su gel di agarosio allo 0,8%, per sostituire la sequenza di tipo selvatico.
Nella seguente tabella 5 vengono riportati l'attività biologica in cellule di epatoma umano e il legame al recettore per la interleuchina 6 selvatica e le sue varianti mutate nei residui indicati .
TABELLA 5
Proprietà di legame al recettore e attività biologica di interleuchina 6 selvatica e di mutanti della stéssa nelle eliche A e C
N.D.: non determinato.
Tre delle varianti che contengono mutazioni sia sull'elica A sia sull'elica C non mostrano nessun segno di attività biologica in cellule di epatoma umano, mentre preservano ancora la capacità di legare il recettore gp80. Tra le tre proteine, il mutante IL-6
è stato
scelto per esperimenti di competizione dell'attività biologica dell 'interleuchina 6 selvatica in cellule di epatoma umano. Le cellule vengono stimolate con interleuchina 6 selvatica a 4 nanogrammi per millilitro (ng/ml) di mezzo di coltura, in presenza di concentrazioni crescenti del mutante. Come illustrato in figura 2 {in cui l'attività biologica della interleuchina 6 selvatica è espressa in unità arbitraria) , concentrazioni crescenti delmutante riescono ad antagonizzare gli effetti della interleuchina 6 selvatica sulle cellule di epatoma umano.
Nella tabella 6 sono riportati i livelli di inibizione (in pecentuale) dell'attività biologica dell 'interleuchina 6 selvatica in funzione della concentrazione di antagonista (espressa rispettivamente in nanogrammi per millilitro, eccesso molare rispetto all 'interleuchina 6 selvatica e nanomoli per litro).
TABELLA 6
Inibizione dell'attività biologica dell'interleuchina 6 selvatica in funzione della concentrazione di antagonista.
Esempio 5
Gli antagonisti della interleuchina 6. generati e selezionati usando la metodologia descritta nella presente invenzione , inibiscono la crescita di cellule di mieloma umane stimolata da interleuchina 6
Nell'esempio precedente si è mostrato che uno dei mutanti, per la precisione IL-6
(DFRD) , era
in grado di inibire l'attività1 biologica esercitata dall'interleuchina 6 {stimolazione della trascrizione da parte di un promotore inducibile da interleuchina 6) su cellule di epatoma umano. Nella parte introduttiva di questa domanda di brevetto si è affermato che la messa a punto di antagolisti e superantagonisti della interleuchina 6 umana avrebbe applicazioni pratiche perchè consentirebbe la inibizione dell 'interleuchina 6 in numerose malattie caratterizzate da una sua sovrapproduzione, quali disordini autoimmuni cronici, mielomi e plasmacitomi . Si provvede qui un ulteriore esempio mostrando che i tre mutanti
(DFRD) ,
(DFLD) inibiscono efficacemente là stimolazione provocata dall 'interleuchina 6 della crescita di una linea cellulare di mieloma umano, chiamata XG-1 e derivata da cellule mielomatose isolate direttamente da un paziente in stadio terminale . La crescita delle cellule di mieloma XG-1 è assolutamente dipendente da interleuchina- 6 aggiunta dall'esterno in maniera simile a ciò che è stato dimostrato per cellule di mieloma appena isolate, perciò questa linea cellulare può essere considerata un modello eccellente per lo studio in vitro del mieloma multiplo (Jourdan, M., Zhang, X-G., Portier, M., Boiron, J.-M., Bataille, R. and Klein, B.(1991) J. Immunol . 147, 4402-4407) . Per misurare l'effetto antagonistico esercitato sull'interleuchina- 6 naturale dalle varianti, le cellule di mieloma XG-1 sono state coltivate in piastre di cultura da 96 pozzetti alla concentrazione di 6000 cellule per pozzetto in presenza di interleuchina-6 naturale alla concentrazione di 0,1 nanogrammi per millilitro di terreno di coltura e di ognuno dei tre mutanti a concentrazioni crescenti. Dopo sette giorni di coltura il numero di cellule è stato stimato tramite misura colorimetrica dei livelli di esosaminidas'i (Landegren, U. (1984) J. Immunol. Methods 67, 379-388) . La tabella 7 mostra l'inibizione della crescita cellulare dipendente dall 'interleuchina-6 naturale in funzione della concentrazione (espressa in nanogrammi di mutante per millilitro di mezzo di coltura) di ognuno dei tre antagonisti.
TABELLA 7
Inibizione dell'attività dell'interleuchina 6 naturale (stimolazione della crescita di cellule di mieloma umane XG-1) in funzione della concentrazione dei tre antagonisti.
Come si può notare dalla tabella, tutti i mutanti sono efficaci come completi antagonisti dell'attività biologica dell'interleuchina 6 naturale su cellule di mieloma umane.
Esempio 6
Applicazione della metodologia descritta nella presente invenzione per la selezione di superantaaonisti dell'interleuchina 6
Le quattro mutazioni
(DFRD),
descritte nell'esempio 4 e che mostrano il più forte carattere antagonistico, sono state combinate con mutazioni in grado di aumentare la capacità di legame per il recettore specifico (descritte negli esempi 2 e 3) tramite la tecnica di biologia molecolare di Polymerase Chain Reaction (PCR). Più precisamente, le mutazioni antagonistiche presenti in DFRD sono state combinate con:
le mutazioni superleganti dell'elica D (IRA)
(descritte nell'esempio 2), creando la proteina mutante Sant 1 (Super- antagonista 1);
le mutazioni superleganti dell'elica D e della regione 'AB presenti nel fasmide D 3-7 (descritto nell'esempio 3) creando la proteina mutante Sant 3;
le mutazioni superleganti dell'elica D e de:lla regione AB presenti nel fasmide D 3-3 (descritto nell'esempio 3) creando la proteina mutante Sant 4;
le mutazioni superleganti dell'elica D e della regione AB presenti nel fasmide D 4-20 (descritto nell'esempio 3) creando la proteina mutante Sant 5.
Le proteine mutanti, contenenti sette (Sant 1) o nove (Sant 3, Sant 4 e Sant 5) sostituzioni amminoacidiche, sono state analizzate sia per il loro legame al recettore specifico dell 'interleuchina-6, che per la capacità di antagonizzare l'attività biologica dell'interleuchina-6 su cellule umane di epatoma e di mieloma. La tabella 8 mostra le proprietà di legame al recettore specifico di DFRD e di Santi, Sant 2, Sant 4 e Sant 5 assieme alle concentrazioni (espresse in nanogrammi di mutante per millilitro di mezzo di cultura) di mutante necessarie per inibire il 50% dell'attività biologica dell'interleuchina 6 (le cellule di epatoma sono state stimolate con 4 nanogrammi di interleuchina 6 naturale per millilitro di mezzo di cultura, mentre le cellule di mieloma, che sono molto più sensibili all'interleuchina 6 naturale delle cellule di epatoma, sono state stimolate con 0,1 nanogrammi di interleuchina 6 naturale per millilitro di mezzo di cultura).
TABELLA 8
Inibizione dell 'attività biologica dell'interleuchina 6 naturale sia su cellule di epatoma che su cellule di mieloma in funzione della capacità del mutante antagonista di legare il recettore specifico dell'interleuchina 6
Come si può vedere dalla tabella, l'introduzione delle sostituzioni amminoacidiche descritte negli esempi 2 e 3 ha contemporaneamente’ aumetato la capacità di legame al recettore specifico da parte del mutante originario DFRD e diminuito la quantità di antagonista necessaria per inibire l'attività biologica dell 'interleuchina 6 naturale su ambedue le linee cellulari analizzate, perciò ha creato dei superantagonisti dell'interleuchina-6 estremamente efficaci e potenti.
Nell'annessa lista di sequenze, i simboli N,M,W,R ed S hanno i seguenti significati:
LISTA DI SEQUENZE
INFORMAZIONI GENERALI
(ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: METODO PER SELEZIONARE SUPERAGONISTI, ANTAGONISTI E SUPERANTAGONISTI DI ORMONI DEL CUI COMPLESSO RECETTORIALE FA PARTE GP 130
(iil) NUMERO DELLE SEQUENZE: 8
(iv) INDIRIZZO DI CORRISPONDENZA:
un ormone che utilizza la molecola di membrana gp 130 per attivare i meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare come da rivendicazione 1, in cui l'ormone in questione è scelto dal gruppo comprendente Interleuchina 6 (IL-6), Oncostatina M (OSM), Leukemia Inhybitory Factor (LIF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) e Interleuchina 11 (IL-11)·
3. Metodologia per la selezione di superagonisti di interleuchina 6 come da rivendicazione 2, comprendente inoltre le seguenti operazioni addizionali:
produzione di una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei seguenti residui selvatici dell 'interleuchina 6 presente come prodotto di fusione con proteine di fagi filamentosi
selezione, dalla popolazione mista di fagi esprimenti interleuchine 6 mutanti, quella o
Claims (2)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti oppure superantagonisti di un ormone'che 'utilizza la molecola di membrana gp 130 per attivare i meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, comprendente le seguenti operazioni: confrontare le sequenze amminoacidiche dell'ormone della crescita con le sequenze di detto ormone; confrontare le sequenze amminoacidiche del recettore dell'ormone della crescita con quelle dei due recettori dell'ormone in questione, cioè il recettore ormone-specifico e gp 130; sulla base dei confronti, formulare un modello tridimensionale del complesso recettoriale basato sulla analogia funzionale tra sequenze del recettore dell'ormone della crescita e i due recettori dell'ormone in questione; e identificare i residui dell'ormone selvatico in questione che fanno parte rispettivamente del sito di interazione con il recettore specifico e del sito di interazione con gp 130.
- 2. Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti o superantagonisti di quelle che presentano una affinità per il recettore specifico superiore alla interleuchina 6 selvatica; e - identificazioni della migliore o delle migliori sequenze amminoacidiche leganti il recettore mediante sequenziamento del DNA estratto dalle particelle fagiche selezionate. 4. Metodologia per la selezione di superagonisti di interleuchina 6 come da rivendicazione 3, in cui si produce una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei detti residui selvatici dell'interleuchina 6 presente come prodotto di fusione con la proteina pili di M13. 5. Metodologia per la selezione di antagonisti di interleuchina 6 come da rivendicazioni da 1 a 2, comprendente inoltre le seguenti operazioni addizionali: mutagenesi dei residui identificati come da rivendicazione 1, per essere parte del sito di interazione con gp 130 (Arg 30, Tyr 31, Gly 35, Ser 37, Ala 38, Ser 118, Lys 120,Val 121, Gin 124, Phe 125, Gin 127, Lys 128 e Lys 129) con tecniche convenzionali di biologia molecolare; valutazione dell'attività biologica e dell' affinità per il recettore specifico per 1'interleuchina 6 dei mutanti prodotti come sopra, al fine di identificare varianti di interleuchina 6 fcon intatta affinità al recettore specifico che presentano riduzione o perdita dell'attività biologica; e valutazione delle suddette varianti di interleuchina 6 come antagonisti dell'attività biologica dell'interleuchina 6 selvatica. 6. Metodologia per la selezione di superantagonisti della interleuchina 6 come da rivendicazioni da 2 a 5 mediante combinazione delle variazioni di sequenze amminoacidiche responsabili dell' attività antagonista, identificate come sopra, con variazioni amminoacidiche responsabili di una aumentata affinità del recettore specifico per 1'interleuchina 6. 7. Metodologia per la selezione di antagonisti o superantagonisti di interleuchina 6 come da rivendicazione 6, in cui la mutagenesi dei residui identificati come sopra è eseguita con una tecnica di biologia molecolare scelta dal gruppo comprendente Polimerase Chain Reaction, Primer Extension, Oligonucleotide Directed Mutagenesis, e loro combinazioni. 8. Agonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni che utilizzano la molecola di membrana gp 130 per' attivare meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, ottenibili con la metodologia delle rivendicazioni da 1 a 7. 9. Mutanti di interleuchina-6 umana, come da rivendicazione 8, che contengono mutazioni per sostituzione nelle posizioni 175, 176 e 183 e che mostrano aumentate attività biologica ed affinità per il recettore specifico. 10. Mutanti di interleuchina-6 umana come da rivendicazione 9, che presentano contemporaneamente le mutazioni Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina, e che esibiscono un aumento del legame al recettore di circa 4,5 volte. 11. Mutanti di Interleuichina-6, come da rivendicazione 8, che mostrano un aumento della affinità per il recettore specifico e che presentano le mutazioni Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina contemporaneamente a sostituzioni multiple nei residui Fenilalanina 74, Glutamina 75 e Serina 76. 12. Mutanti di Interleuchina-6, come da rivendicazione 11, che mostrano un aumento della affinità per il recettore specifico e che presentano mutazioni scelte dal gruppo comprendente: Glutamina 75 Tirosina, Serina 76 Isoleucina, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina; Fenilalanina 74 Tirosina, Glutamina 175 Fenilalanina, Serina 76 Isoleucina, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina; e Glutamina 75 Tirosina, Serina 76 Lisina, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina, detti mutanti esibendo un aumento della affinità per il recettore specifico rispettivamente di 27,7 volte, di 23,5 volte e di 42 volte. 13. Mutanti di Interleuchina-6, come da rivendicazione 8, che presentano la sostituzione contemporanea dei residui 31, 35, 118 e 121 e che acquisiscono potere antagonistico nei confronti della interleuchina-6 naturale nella sua attività biologica su cellule umane sensibili. 14. Mutanti di interleuchina-6, come da rivendicazione 13, nelle posizioni 31, 35, 118 e 121 con mutazioni scelte dal gruppo comprendente Tirosina 31 Ac. Aspartico, Glicina 35 Fenilalanina, Serina 118 Fenilalanina e Valina 121 Aspartico; Tirosina 31 Ac. Aspartico, Glicina 31 Fenilalanina, Serina 118 Leucina e Valina 121 Ac. Aspartico; e Tirosina 31 Ac. Aspartico, Glicina 31 Fenilalanina, Serina 118 Arginina e Valina 121 Ac. Aspartico . 15. Uso dei mutanti di interleucina-6, come da rivendicazione 14, per inibire la crescita interluchina-6 dipendente di cellule di mieloma umano e per la terapia del mieloma multiplo nell 1uomo. 16. Mutanti di Interleuchina-6 umana che presentano simultaneamente sostituzioni dei residui indicati nelle rivendicazioni 9-15 e che, unendo le proprietà antagonistiche a quelle di una maggiore affinità per il recettore, si comportano come superantagonisti a basse dosi. 17. Mutanti di interleuchina-6 umana, come da rivendicazioni 11 e 13, con mutazioni scelte dal gruppo comprendente: Tirosina 31 Ac. Aspartico, Glieina 35 Fenilalanina, Serina 118 Arginina, Vaiina 121 Ac. Aspartico, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina; Tirosina 31 Ac. Aspartico)" Glicina 31 Fenilalanina, Serina 118 Arginina, Valina 121 Ac. Aspartico, Glutamina 75 Tirosina, Serina 76 Lisina, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina; Tirosina 31 Ac. Aspartico, Glicina 31 Fenilalanina, Serina 118 Arginina, Vaiina 121 Ac. Aspartico, Fenilalanina 74 Tirosina, Glutamina 75 Fenilalanina, Serina 76 Isoleucina, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina; e Tirosina 31 Ac. Aspartico, Glicina 31 Fenilalanina, Serina 118 Arginina, Valina 121 Ac. Aspartico, Glutamina 75 Tirosina, Serina 76 Lisina, Glutamina 175 Isoleucina, Alanina 176 Arginina e Glutamina 183 Alanina, detti mutanti essendo capaci di inibire attività biologica dell1interleuchina 6-naturale su cellule umane sensibili incluse cellule di mieloma IL-6 dipendenti per la loro crescita. 18. Impiego dei mutanti di interluchina-6, come da rivendicazione 17, per la terapia delle malattie caratterizzate da sovrapproduzione di Interleuchina-6, in particolare del mieloma multiplo .
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