CN1070866C - 用受体复合物三维模型筛选人白细胞介素-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法 - Google Patents

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Abstract

已知类似白细胞介素6(IL-6)的细胞因子组的配体(即制癌蛋白M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)和白细胞介素11(IL-11)可诱导含膜分子gp130的受体复合物的形成。本发明涉及筛选IL-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法。该方法包括以下步骤：
--比较牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)和所述激素的氨基酸序列：
--在上述比较的基础上，构建IL-6三维模型，可通过该模型鉴别分别构成与特异受体相互作用的位点(位点1)和与gp130相互作用的位点(位点2)的残基。
本发明可用于鉴别人IL-6中这些位点并分离对受体有更大亲和力(超激动剂或超拮抗剂)或与gp130亲和力减少或丧失(拮抗剂或超拮抗剂)的所述野生型激素的变体。附图表示了用于鉴别人IL-6位点1和位点2的方案。
本发明也描述了白细胞介素-6的具体超激动剂或超拮抗剂的获得方法和超拮抗剂作为野生型白细胞介素依赖性人骨髓瘤细胞生长的低剂量抑制剂的用途。

Description

用受体复合物三维模型筛选人白细胞介素-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法
本发明涉及用三维模型筛选人白细胞介素-6(以下简称为hIL-6或IL-6)的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法。
已知Genetec公司的WO92/21029教导了确定同生长激素和配体有相似结构构象的激动剂或拮抗剂的方法。这些潜在的激动剂和拮抗剂与激素受体相接触会形成一个三元复合物，该复合物包含一分子潜在的激动剂或拮抗剂和两分子被激动或拮抗的这样的激素受体。配体分子诱导受体二聚化是由于配体有两个不同的作用位点(位点1和位点2)，通过这两个位点的诱变而产生激动剂或拮抗剂是可能的。
已知类似白细胞介素-6的细胞因子组中的配体，如制癌蛋白M(OSM)，白血病抑制因子(LIF)，睫状神经营养因子(CNTF)和白细胞介素11(IL-11)诱导含膜分子gp130的受体复合物的形成。在此受体复合物中，这些细胞因子各自的特异受体和膜分子gp130总是共同元件。因此可以推断位点1和位点2结合此类激素的两种不同分子：位点1结合特异受体，位点2结合gp130。鉴别所述两个位点是可能的，从以下可以更清楚地看到这一点，即构建基于人生长激素(hGH)受体序列和所研究的激素受体序列之间的功能相似性的三维模型。通过构建携带野生型和突变型激素的丝状噬菌体文库(如M13)可分离到就野生型而论对特异受体(超激动剂或超拮抗剂)有更大亲和力的突变体。
按照本发明，本发明所采用的与WO92/21029所采用的三维模型(如IL-6的)之间的差异导致鉴别出螺旋A和C的不同残基作为位点2成员。实际上，按照本发明，就构建IL-6模型而言，用不同细胞因子的结构而不是生长激素结构为模板。
人白细胞介素-6分子模型构建如下，从文献数据可知，人IL-6表现出与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的氨基酸序列的相似性。以用X-射线晶体学测定的牛粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)三维结构为模板研究人IL-6残基16到184的三维模型。首先，对比人IL-6与bG-CSF的氨基酸序列。基于衍化的线性排列，利用电脑化的相互作用图表仪(Unit)中的分子模型构建程序，将bG-CSF三维结构中的氨基酸残基用人IL-6对应的残基取代。排列对比过程中的缺失或插入(表明IL-6分子中不同的局部结构)的调整由分子模型构建程序提供的选择完成。
建立于bG-CSF结构之上的这种IL-6三维模型使得能够确定人IL-6及其两个受体间相互作用的两上位点：低亲和力受体gp80(位点1)和高亲和力信号传导受体gp130(位点2)。下述步骤用以确定这两个位点。从序列对比可知，造血受体家族所有成员相互联系，因为它们都有一个结构域，即细胞因子结合域。序列的这种相似性也表明包括gp80和gp130这两个IL-6受体在内的众多受体相应部位很可能有结构相似性。结合这些受体的细胞因子都有(或预计有)四螺旋束的相似结构的观察结果，有力支持了生物活性复合物中细胞因子及其受体通过细胞因子结合域相互作用必定是非常类似的(尽管不完全相同)这一观点。
鉴于用X-射线晶体学确定了这些受体复合物(生长激素和生长激素二聚化受体的胞外域的复合物，即GHbp)之一的三维结构，我们的bG-CSF基础上建成的人IL-6的模型允许我们鉴别IL-6与其两个受体gp80(位点1)和gp130(位点2)间相互作用的潜在位点。按照本发明，此任务已经通过构建gp80和gp130的结构模型完成，模型构建是基于用生长激素受体X-射线晶体学结构和用我们的G-CSF基础上建立的人IL-6模型代替这种复合物中生长激素所达成的一致性(见图1)。
如上所述，已知IL-6是一个184个氨基酸的多肽，属于螺旋细胞因子类。它是多种细胞产生的多功能细胞因子。它作为诸如免疫系统细胞、肝细胞、肾细胞、造血干细胞、角质形成细胞和神经元等多种细胞系的分化和生长因子。
IL-6超激动剂的产生允许使用比许多严重疾病治疗中所需的野生型IL-6剂量低的治疗剂量。实际上，在治疗乳腺癌、白血病、传染病或与骨髓祖细胞失常有关的疾病中，IL-6有重要作用，并且应用前景可观。
另外，IL-6超激动剂可用于骨髓移植和基因治疗中造血祖细胞离体扩增方案中。
另一方面，人IL-6拮抗剂和超拮抗剂可抑制众多以IL-6过量为特征的疾病中IL-6的作用。这些疾病有慢性自体免疫疾病、骨髓瘤/浆细胞瘤、绝经后的骨质疏松症和癌性恶骨质。
按照本发明，筛选IL-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂包括以下步骤：
—比较中粒细胞集落刺激因子(bG-CSF)和所说激素的氨基酸序列。
—在上述比较基础上，构建IL-6三维模型，可通过该模型鉴别分别构成与特异受体相互作用的位点(位点1)和与gp130相互作用的位点(位点2)的残基。
为筛选IL-6超激动剂，按照本发明的方法还包括下述其它的操作步骤：
—建立一系列包含下述IL-6野生型残基突变的噬菌体文库(以与丝状噬菌体蛋白融合产物的形式存在)：
螺旋A：
Ser22,Glu23,Asp26,Arg30,Leu33,Ser37,Arg40,Glu42；
环AB：
Ser52,Ser53,Ala56,Leu57,Glu59.Asn60,Leu62,Leu64,Pro65,Lys66,
Met67,Ala68,Glu69,Lys70,Asp71,Phe74,Gln75,Ser76；
螺旋D：
His164,Leu165,Arg168,Ser169,Lys171,Glu172,Phe173,Gln175,Ser176,Ser177,Leu178,Arg179,Ala180,Leu181,Arg182,Gln183,Met184；
—从属于各个噬菌体文库并表达IL-6变体的噬菌体混合群中筛选出比野生型白细胞介素与特异受体有更大亲和力的噬菌体；和
—通过测序从所选噬菌体粒子抽提的DNA来鉴别最佳受体结合氨基酸序列。
在这种情况下,可产生一系列以与M13pⅢ蛋白的融合产物存在的含IL-6的所说野生型残基的变体的噬菌体文库。
筛选本发明的IL-6拮抗剂的方法除上述建立人IL-6蛋白及其受体链的分子模型构建操作外还包括下述操作步骤：
—用常规分子生物学技术诱变鉴别为形成与gp130作用的位点的残基(Arg30,Tyr31,Gly35,Ser37,Ala38,Ser118,Lys120,Val121,Gln124,Phe125,Gln127,Lys128和Lys129)；
—评价以上产生的变体的生物学活性和与特异IL-6受体的亲和力，用以鉴别与特异受体有正常亲和力而生物学活性降低或丧失的白细胞介素6变体；和
—评价上述作为拮抗剂的野生型IL-6变体在人细胞系上的生物学活性。
通过将决定拮抗活性的氨基酸序列的突变(以上鉴别的)和决定与IL-6特异受体增加的亲和力的氨基酸突变相结合，可能获得IL-6超拮抗剂。
在获得白细胞介素6的拮抗剂或超拮抗剂的方法中，可以用选自聚合酶链反应、引物延伸、寡核苷酸定向诱变和这些方法的组合的分子生物学技术完成以上鉴别的残基的突变。
本发明不限于筛选IL-6的超激动剂、拮抗剂或超拮抗剂的方法。相反，它涉及可由所述筛选方法获得的分子，即涉及除了具有下列三种取代Gln175Ile/Ser176Arg/Gln183Ala的称作IL-6IRA的分子外的hIL-6超激动剂；除了具有下述取代的三种分子外的hIL-6的拮抗剂：
Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp    (DFRD)Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Phe/Val121Asp(DFFD)Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Leu/Val121Asp(DFLD)；和除了具有下列7种取代Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp/Gln175Ile/Ser176Arg/Gln183Ala的称作Sant1的分子外的hIL-6的超拮抗剂。
至此已完成了该发明主题的一般性描述。现在将借助下列实施例给出本发明特定实施方案的详细描述，以期能更好地了解其目的、特征、优点及其应用方法。
图1表示说明用于鉴别人白细胞介素6的位点1和位点2的方案。
图2表示按照本发明的三种超拮抗剂即Sant3、Sant4、Sant5随浓度增加相对于拮抗剂Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp(图中用单字母码表示)的效价的增加。
保藏
大肠杆菌K12(被质粒pHenΔhIL-6转化，此质粒从限制酶SalⅠ识别位点到限制酶NotⅠ识别位点含有编码野生型人IL-6氨基酸序列的核苷酸序列)已于1993年6月10日在The National Col-lection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)(Aberdeen,Scotland,UK)保藏，保藏号为NCIMB40563。
实施例1使用本发明的方法通过AB环中氨基酸残基突变筛选IL-6的超激动剂
实验方案包括构建在噬菌体M13pⅢ蛋白的后157个氨基酸之前并在运载合成蛋白到壁膜间隙的PelB的序列之后包含hIL-6全部编码区(SEQ ID NO:1)的杂合基因。
此构建体使得可获得在其表面上表现出正确折叠的噬菌体粒子和有生物学活性的人白细胞介素-6。
构建了包括IL-6的Asp71,Phe74,Gln75和Ser76残基突变的噬菌体文库，这些噬菌体从WO95/00852中描述的变体IL-6IRA(有如下取代：Gln175Ile/Ser176Arg/Gln183Ala)开始构建，比野生型hIL-6对受体的亲和力大5倍左右以与丝状噬菌体M13pⅢ蛋白的融合产物形式存在。此文库采用引物延伸技术构建。突变寡核苷酸(其序列是SEQ ID NO:2)是一个95个核苷酸的IL-6 DFQS。引物IL-6DFQS向编码71位氨基酸(野生型为Asp)、74位(野生型为Phe)、75位(野生型为Gln)和76位(野生型为Ser)密码子引入。寡核苷酸IL-6AB引物(其序列是SEQ ID NO:3)用作引物延伸反应的引物。这两上寡核苷酸在体外退火，退火的寡核苷酸用作引物延伸反应的底物。然后将由此获得的双链DNA片段消化并连接到质粒pHenΔhIL-6上，以便用突变的序列代替野生型序列。将连接产物插入到细菌中，产生大约三百万独立的转化体。转化的细菌用M13K07辅助噬菌体转染以构建噬菌体文库(噬菌粒文库)。
在shrIL-6R和shrgp130存在下，用抗shrIl-6R的单克隆抗体包覆的磁珠温育来筛选文库。然后将在pH3.6下洗脱的噬菌粒群在细菌中扩增。经筛选—扩增四个循环后，对随机筛选列的噬菌粒突变区测序。在适宜的细菌株壁膜间隙产生相应的突变IL-6蛋白，测定其结合IL-6特异受体的能力。表1表明用按照本发明的方法筛选到IL-6的变体是可能的，所述变体是在螺旋D和A-B区均有突变的分子，具有额外增加的对特异受体的亲和力。
表1包括A-B区71、74、75、76位残基上额外突变的白细胞介素6-IRA变体的受体结合特性位   点       71    74    75    76  受体结合( ％ )野生型        Asp   Phe   Gln   Ser       100 ％IL-6IRA       Asp   Phe   Gln   Ser       450 ％噬 菌 粒 D3-3     Asp   Tyr   Phe   Ile      2350 ％噬 菌 粒 D4-1     Asp   Tyr   Tyr   Val      2750 ％噬 菌 粒 D3-7     Asp   Phe   Tyr   Ile      2770 ％噬 菌 粒 D4-19    Asp   Phe   Tyr   Ser      1800 ％噬 菌 粒 D4-20   Asp     Phe     Tyr     Lys     4200 ％噬 菌 粒 D3-16   Asp     Phe     Tyr     Leu     1450 ％噬 菌 粒 D4-17   Asp     Phe     Phe     Ile     2430 ％
实施例2使用本发明的方法获得IL-6的超拮抗剂
如WO95/00852中所述，四突变Tyr31Asp/Gly35Phe/Ser118Arg/Val121Asp(DFRD)赋予拮抗性质。运用分子生物学的聚合酶链反应(PCR)技术使上述四突变与能够增强特异受体结合能力的突变(例1中所述)相结合。更具体地说：
噬菌体D3-7(例1所述)的螺旋D和AB区的超结合突变产生突变蛋白Sant3；
噬菌体D3-3(例1所述)的螺旋D和AB区的超结合突变产生突变蛋白Sant4；
噬菌体D4-20(例1所述)的螺旋D和AB区的超结合突变产生突变蛋白Sant5。
突变蛋白有9个(Sant3和Sant5)或10个(Sant4)氨基酸取代，测定其结合特异IL-6受体的能力和在人肝癌细胞及骨髓瘤细胞上拮抗IL-6生物学活性的能力。表2和图2表示DFRD、Sant3、Sant4、Sant5结合特异受体的特性，以及抑制50％IL-6生物学活性所需的突变体的浓度(以每毫升培养物中突变体的纳克数表示)。(用每毫升培养物4纳克野生型IL-6刺激肝细胞，用每毫升培养物0.1纳克IL-6刺激骨髓瘤细胞，因为后者对野生型IL-6更为敏感)。
表2作为突变拮抗剂的特异IL-6受体结合能力的函数的、对肝癌细胞和骨髓瘤细胞中野生型白细胞介素-6的生物学活性的抑制作用受体         50％抑制IL-6           活性拮抗剂         结合         肝癌细胞         骨髓瘤细胞(野生型的百分数)    Hep3B             XG-1DFRD      97％               164ng/ml         190.0ng/mlSant 3    2800％             2.4ng/ml         1.85ng/mlSant 4    2000％             2.7ng/ml         3.90ng/mlSant 5    4500％             2.3ng/ml         2.45ng/ml
从表中可看出，引入例1所述的氨基酸取代立即增加了亲代突变体DFRD的特异受体结合能力，并降低了抑制所测试的两种细胞系中野生型IL-6生物学活性50％所需的量。因此产生了非常有效的且作用力强的IL-6的超拮抗剂。
                      序列表
        一般信息
(ⅰ)申请人：ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.
(ⅱ)发明的名称：用受体复合物三维模型筛选人白细胞介素-6的超激动剂、拮抗剂和超拮抗剂的方法
(ⅲ)序列数目：3
(ⅳ)通讯地址：
    (A)地址：Societa Italiana Brevetti
    (B)街道：Piazza di Pietra,39
    (C)城市：罗马
    (D)国家：意大利
    (E)邮政编码：Ⅰ-00186
(ⅴ)计算机可读形式
    (A)介质类型：3.5”软盘1.44兆字节
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS Rev6.22
    (D)软件：Microsoft Word6.0
(ⅷ)律师信息
    (A)姓名：DI CERBO,Mario(Dr.)
    (B)登记号：
    (C)卷号：RM/X88471/PC-DC
(ⅸ)电讯信息：
    (A)电话：06/6785941
    (B)传真：06/6794692
    (C)电传：612287ROPAT(1)SEQ ID NO:1的信息
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：555个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链类型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅲ)假定的：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅶ)直接来源
    (A)合成：细菌产生
(ⅸ)特征：
    (A)名称：IL-6cDNA
    (C)鉴别方法：聚丙烯酰胺凝胶
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CCA GTA CCC CCA GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA   48Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg1               5                   10                  15CAG CCS CTC ACG AGC TCA GAA CGA ATT GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC   96Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile
        20                  25                  30CTC GAC GGC ATC TCA GCC TTA AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC   144Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn
    35                  40                  45ATG TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT   192Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
50                  55                  60CCA AAG ATG GCT GAA AAA GAT GGA TGC TTC CAA TCT GGA TTC AAT GAG   240Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu65                  70                  75                         80GAG ACT TGC CTG GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA   288Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
            85                  90                  95TAC CTA GAG TAC CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC   336Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
        100                 105                 110AGA GCT GTC CAG ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA   384Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
    115                 120                 125AAG GCA AAG AAT CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACA AAT   432Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
130                 135                 140GCC AGC CTG CTG ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC   480Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp145                 150                 155                 160ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG AGA TCT TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC   528Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser
            165                 170                 175AGC CTG AGG GCT CTT CGG CAA ATG TAG                               555Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
        180(2)SEQ ID NO:2信息
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：95个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链类型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：合成DNA
(ⅲ)假定的：否
(ⅳ)反义：否
(ⅴ)片段类型：内
(ⅶ)直接来源：
    (A)合成：寡核苷酸合成仪
(ⅸ)特征：
    (A)名称：DFQS
    (C)鉴别方法：聚丙烯酰胺凝胶
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:GTGAGAGCTC   CAAAGAGGCA   CTGGCAGAAA   ACAACCTGAA  CCTTCCAAAG   ATGGCTGAAA  60AANNSGGATG   CNNSNNSNNS   GGATTCAATG   AGGAG                                95(3)SEQ ID NO:3信息
(ⅰ)序列特征
    (A)长度：72个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链类型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：合成DNA
(ⅲ)假定的：否
(ⅳ)反义：是
(ⅴ)片段类型：内部
(ⅶ)直接来源：
    (A)合成：寡核苷酸合成仪
(ⅸ)特性：
    (A)名称：AB引物
    (C)鉴别方法：聚丙烯酰胺凝胶
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:GGCCTCTAGA   TATACCTCAA   ACTCCAAAAG   ACCAGTGATG   ATTTTCACCA   GGCAAGTCTC  60CTCATTGAAT   CC                                                              72

Claims (7)

1．一种筛选IL-6的超激动剂，拮抗剂和超拮抗剂的方法，该方法包括以下步骤：
--比较牛粒细胞集落刺激因子和所述激素的氨基酸序列；和
--在上述比较的基础上构建所述激素的三维模型，可通过该模型鉴别构成低亲和力受体信号gp80的位点的残基和构成高亲和力信号传导受体gp130的位点的残基。
2．根据权利要求1的筛选IL-6超激动剂的方法，该方法还包括下述步骤：
--建立一系列包含下述IL-6野生型残基的突变、以与丝状噬菌体蛋白融合产物形式存在的噬菌体文库：Ser22,Glu23,Asp26,Arg30,Leu33,Ser37,Arg40,Glu42,Ser52,Ser53,ALa56,Leu57,Glu59,Asn60,Leu62,Leu64,Pro65,Lys66,Met67,Ala68,Glu69,Lys70,Asp71,Phe74,Gln75,Ser76,His164,Leu165,Arg168,Ser169,Lys171,,Glu172,Phe173,Gln175,Ser176,Ser177,Leu178,Arg179,Ala180,Leu181,Arg182,Gln183,Met184；
--从表达型IL-6变体的混合噬菌体群中筛选出比野生型白细胞介素与特异受体有更大亲和力的噬菌体；和
--通过对从所选噬菌粒子抽提的DNA序列测序来鉴别结合受体的最佳氨基酸序列，
其中不包括具有三取代Gln175 Ile/Ser176 Arg/Gln183 Ala的hIL-6分子。
3．根据权利要求2的筛选白细胞介素6超激动剂的方法，该方法包括构建一系列包括白细胞介素6的所说野生型残基突变、以与M13pⅢ蛋白的融合产物形式存在的噬菌体文库。
4．一种IL-6的突变体，其中所述突变体表现出对特异受体增加的亲和力，并含有以下突变：谷氨酰胺175异亮氨酸、丝氨酸176精氨酸、谷氨酸183丙氨酸以及在苯丙氨酸74、谷氨酰胺75和丝氨酸76残基上的多取代。
5．根据权利要求4的IL-6突变体，其中所述突变体表现出对特异受体增加的亲和力并包括选自以下的突变：
--谷氨酰胺75酪氨酸，丝氨酸76异亮氨酸，谷氨酰胺175异亮氨酸，丝氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸；
--苯丙氨酸74酪氨酸，谷氨酰胺75苯丙氨酸、丝氨酸76异亮氨酸，谷氨酰胺175异亮氨酸，丝氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸；和
--谷氨酰胺75酪氨酸，丝氨酸76赖氨酸，谷氨酰胺175异亮氨酸，丝氨酸176精氨酸和谷氨酰胺183丙氨酸，所说突变体表现出对特异受体亲和力分别增加27.7倍，23.5倍和42倍。
6．根据权利要求4或5的超激动剂在用于制备治疗人血小板减少症的药物中的用途。
7．根据权利要求4或5的超激动剂在骨髓移植和基因治疗的人造血祖细胞离体扩增中的用途。
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