CN101389649A - 多肽拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了环状变序的生长激素多肽拮抗剂；包括所述拮抗剂的组合物和治疗会从所述拮抗剂的给药中受益的状态的方法。

Description

多肽拮抗剂
本发明涉及环状变序(circularly permuted)的生长激素多肽拮抗剂、包括所述拮抗剂的组合物和治疗会从所述拮抗剂的给药中受益的状态的方法。
一大群被称为细胞因子的生长因子与众多不同的细胞功能有关。这些功能包括免疫系统的调整、能量代谢的调节以及生长和发育的控制。细胞因子通过表达在靶细胞细胞表面的受体介导其效应。细胞因子受体可被分为四种单独的亚类。1型(生长激素(GH)家族)受体的特征在于它们的胞外结构域的氨基末端部分的四个保守的半胱氨酸残基且在C-末端部分存在保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。所述重复的Cys基序也存在于2型(干扰素家族)和III型(肿瘤坏死因子家族)。
已知许多细胞因子配体通过特异位点与它们的关联受体相互作用。一些细胞因子受体既有高亲和性配体结合位点，又有低亲和性结合位点。
例如，已知单分子GH与两个受体分子(GHR)结合(Cunningham etal.，1991；de Vos et al.，1992；Sundstrom et al.，1996；Clackson et al.，1998)。这通过GH上两个独特的受体结合位点和两受体胞外结构域上的常见结合袋发生。GH分子上的位点1的亲和性高于位点2，且受体二聚化被认为随着一个受体结合到GH上的位点1，接着另一受体被募集到位点2而顺次发生。所述GHR的胞外结构域以每个约100个氨基酸的两个连接的结构域存在。在所述三聚复合物GHR-GH-GHR形成和激素结合时发生的是这两个结构域的构象变化。所述GHR-GH-GHR复合物内化后接着是由此所述受体分子被再生用于在细胞内进一步利用的再循环步骤。
不同的细胞因子和受体结合时的其他配体使用多种不同的化学计量法。因而与GH类似，促红细胞生长素形成三聚的受体-激素-受体复合物。白介素-4形成三聚的受体-激素-不同受体复合物。其它细胞因子，例如瘦素和GCSF，形成四聚的受体-激素-激素-受体复合物，且其它(例如，白介素6)很可能形成由两个可溶性受体分子、两个跨膜受体分子和两个细胞因子分子组成的六聚复合物。在每种情况中，都有使所述细胞因子定位于所述受体复合物的主要的高亲和性结合位点，以及在改变所述构象或募集其它分子及由此起始信号中发挥次要作用的另外位点。
变体细胞因子多肽是已知的。例如，在US5,849,535中公开的GH变体。对GH的修饰是在位点1和位点2结合位点。对位点1的修饰产生与野生型GH相比，对GHR有更高亲和性的GH分子。这些修饰的GH分子作为激动剂起作用。也有导致产生GH拮抗剂的位点2修饰的公开。在US 5,854,026；US 6,004,931；US 6,022,711；US6,057,292；和US6136563中公开了改变GH位点1的结合亲和性的对GH的修饰的另外实例。这些修饰涉及在GH的特定位置的点突变，所述点突变产生具有改变的信号性质的分子。
环状变序是生成多肽变体的手段，所述多肽变体保留天然多肽的整体线性序列一级结构但通过形成新的氨基和羧基末端使所述序列重新排序。所述方法生成具有改变的生物学性质的分子。所述方法包含天然氨基和羧基末端的直接融合或通过使用通常是肽连接子的连接子分子的融合。然后将环化分子概念地切开以产生新的氨基和羧基末端。可重组地或通过体外肽合成生成环状变序的多肽。
环状变序已经被用于生成具有改变的生物学活性的嵌合分子。
例如，WO95/27732公开了融合到细胞毒药剂的环状变序的IL-4配体的产生。所述变序的IL-4-药剂与天然IL-4-药剂相比，具有改变的亲和性和细胞毒性，并且在杀死被暴露于所述偶联的多肽的癌细胞方面具有功效。
WO99/51632描述了使用环状变序以生成具有降低的生物素亲和性的新的链霉抗生物素蛋白结合蛋白。将所述环状变序的链霉抗生物素蛋白融合到另一多肽以产生差异结合生物素的融合蛋白。当生物素被用作药物递送媒介时，所述链霉抗生物素蛋白融合蛋白对生物素的降低的亲和性促进所述融合蛋白的释放。
WO01/51629公开了环状变序的细菌β-内酰胺酶和它作为标志物蛋白用于检测与所述变序的多肽组装的胞内和胞外蛋白之间的相互作用的用途。
鉴定环状变序的多肽的方法也是已知的。例如，通过引用其整体被并入的WO00/18905描述了使用插入变序基因的文库的噬菌体展示载体(vector)，鉴定被称为“变序子(permuteins)”的变序的多肽的方法。通过将所表达的文库暴露于与变序子潜在地相互作用的结合蛋白来检测所述文库在所述展示载体表面的表达。
通过引用其整体被并入的WO01/30998公开了生成并鉴定环状变序的蛋白的另外方法。该发明涉及包括与不同的第二蛋白的羧基末端部分融合的第一蛋白的氨基末端部分的融合蛋白的形成，变序合成自所述融合蛋白。能通过噬菌体展示筛选的融合蛋白文库被产生。
在我们共同未决的申请WO 2005/003165A2中，我们除其它事情以外公开了环状变序的生长激素分子。我们公开一种这样的分子的激动剂活性以及该分子对具有生长激素受体活性的拮抗剂的修饰。
按照本发明的一方面，提供了包括核酸序列的分离的核酸分子，其中所述核酸序列选自：
(i)由图1所示的序列(SEQ ID NO：1)组成的核酸分子；
(ii)包括与(i)中鉴定的序列杂交的序列的核酸分子，其中所述核酸分子包括修饰，所述修饰包括编码如图1中所示的176位氨基酸残基的序列，其中所述修饰导致至少一个氨基酸残基的添加、替换或删除，且所述核酸分子编码具有生长激素受体拮抗剂活性的多肽；
(iii)编码包括图2a中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽的核酸分子。
在本发明的优选实施方案中，提供了在严紧杂交条件下退火连接以上(i)和(ii)中所述的序列的分离的核酸分子。
核酸分子的杂交发生在两互补核酸分子经历一定量的相互间氢键结合时。杂交的严紧性可以根据核酸周围的环境条件、杂交方法的性质以及使用的核酸分子的组合和长度而变化。在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)和Tij ssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I，Chapter 2(生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交，第一部分，第2章)(Elsevier，New York，1993)中讨论了关于为获得特定的严紧性程度所需的杂交条件的计算。所述的Tm是核酸分子给定链的50％与它的互补链杂交的温度。下面是杂交条件的示例性组且是非限制的：
非常高的严紧性(允许共享至少90％一致性的序列杂交)
杂交：         5×SSC，65℃下，16小时
洗2次：        2×SSC，室温(RT)下，每次15分钟
洗2次：        0.5×SSC，65℃下，每次20分钟
高严紧性(允许共享至少80％一致性的序列杂交)
杂交：        5×-6×SSC，65℃-70℃下，16小时至20小时
洗2次：       2×SSC，RT下，每次5分钟到20分钟
洗2次：       1×SSC，在55℃-70℃下，每次30分钟
低严紧性(允许共享至少50％一致性的序列杂交)
杂交：      6×SSC，在RT至55℃下，16小时至20小时
至少洗2次： 2×-3×SSC，在RT至55℃下，每次20分钟至30分钟。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子编码包括如图8中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)的多肽。
根据本发明的另外方面，提供了包括图2中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽，其序列已通过添加、删除或替换至少一个氨基酸残基而被修饰，其中所述修饰包括176位氨基酸残基，其中所述多肽是生长激素受体拮抗剂。
本发明的多肽可以通过以包括176位氨基酸残基的任何组合存在的一个或多个替换、添加、删除、截断而在氨基酸序列上不同。
在本发明的优选实施方案中，通过将176位的的甘氨酸替换为选自组氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的氨基酸来修饰所述多肽。
优选地，所述替换是由精氨酸或赖氨酸或丙氨酸替换176位甘氨酸；优选地所述修饰是由精氨酸替换甘氨酸。
在本发明的优选实施方案中，所述多肽包括如图8所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
此外，本发明的特征是与本文公开的多肽序列具有至少75％的一致性的多肽序列，或其片段和其功能性等价多肽。在一个实施方案中，所述多肽与本文说明的氨基酸序列有至少85％的一致性，更优选是至少90％的一致性，甚至更优选的是至少95％的一致性，还更优选的是至少97％的一致性，且最优选的是至少99％的一致性。
在本发明的另外实施方案中，提供连接到生长激素受体的至少一个胞外结合结构域以形成融合蛋白的如本发明所述的多肽；优选地，所述结合结构域由生长激素受体的胞外结构域组成。
在本发明的优选实施方案中，所述结构域通过肽连接分子被连接。
在本发明的优选实施方案中，所述肽连接分子是柔性肽连接子。
优选地，所述连接子是包括5个至30个氨基酸残基的肽。更优选地，所述连接子包括10个至20个氨基酸残基。
更优选地，所述连接子包括下述肽的至少一个拷贝：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(被称为“Gly4Ser”)(SEQ ID NO：3)。
在本发明的一个实施方案中，所述连接子长10个氨基酸且包括所述Gly4Ser连接子的两个拷贝。在本发明的可选择实施方案中，所述连接子长15个氨基酸且包括所述Gly4Ser连接子的三个拷贝。仍在可选择实施方案中，所述连接子长20个氨基酸且包括所述Gly4Ser连接子的四个拷贝。
在通过引用整体被并入的我们共同未决的申请WO01/096565中，我们公开了融合蛋白，所述融合蛋白将细胞因子的配体结合结构域通过肽连接子翻译地融合到所述配体的胞外受体结合结构域。这些融合蛋白具有延迟的清除和激动剂活性。如通过引用整体被并入的我们共同未决的中请WO 2006/010891所述，将本发明的多肽相互连接以形成寡聚多肽(二聚物、三聚物等等)以及连接到生长激素胞外受体结合结构域的肽连接子是有柔性的或非柔性的(例如螺旋状的)或是中等柔性的(例如部分螺旋状的组合连接子)。连接子也可以包含切割位点，例如蛋白酶切割位点，以提供具有延迟释放特征的融合多肽；这些在通过引用整体被并入的我们共同未决的申请WO 03/062276中被描述。
根据本发明的另外方面，提供包括串联连接的至少两个如本发明所述的多肽的融合多肽。
在本发明的优选实施方案中，提供包括多个如本发明所述的多肽的融合多肽。
在本发明的另外优选实施方案中，提供由串联连接的两个如本发明所述的多肽组成的融合多肽。
在本发明的可选择优选实施方案中，提供包括3、4、5、6、7、8、9、10个如本发明所述的多肽的融合多肽。
在本发明的另外优选实施方案中，所述融合多肽包括其由连接子分子连接在一起的两个或至少两个如本发明所述的多肽。优选地，所述连接子分子如上文所公开。
根据本发明的另外方面，提供包括至少两个如本发明所述的多肽且还包括生长激素受体的至少一个生长激素结合结构域的融合多肽。
优选地，所述融合多肽由如本发明所述的两个多肽和生长激素受体的一个生长激素结合结构域组成。
在本发明的优选实施方案中，所述结合结构域包括生长激素受体的胞外结合结构域；优选地，所述结构域由生长激素受体的胞外结构域组成。
根据本发明的另外方面，提供包括直接或间接连接到催乳素多肽的如本发明所述的多肽的嵌合融合多肽。
在本发明的优选实施方案中，所述催乳素多肽包括氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在如图3中所示的人催乳素(SEQ ID NO：7)的129位被修饰。
在本发明的优选实施方案中，在图3(SEQ ID NO：7)所示的129位的所述修饰是氨基酸替换。优选地，所述替换用精氨酸氨基酸残基替代甘氨酸氨基酸残基。优选地，所述修饰还包括删除催乳素的至少9、10、11、12、13或14个氨基末端氨基酸残基。
在本发明的另外优选实施方案中，所述嵌合多肽还包括细胞因子受体的结合结构域。优选地，所述细胞因子受体是生长激素受体。
在本发明的优选实施方案中，所述结合结构域包括生长激素受体的胞外结合结构域；优选地，所述结构域由生长激素受体的胞外结构域组成。
在本发明的可选择优选实施方案中，所述受体是催乳素受体。
在本发明的优选实施方案中，所述结合结构域包括催乳素受体的胞外结合结构域；优选地，所述结构域由催乳素受体的胞外结构域组成。
根据本发明的另外方面，提供编码如本发明所述的融合或嵌合融合多肽的核酸分子。
根据本发明的一方面，提供包括如本发明所述的核酸分子的载体。
在本发明的优选实施方案中，所述载体适合于所述核酸分子的重组表达。
包含如本发明所述的核酸的载体不需要包含启动子或其它调节性序列，特别是如果该载体将被用于将所述核酸导入细胞以重组入基因组用于稳定转染。
优选地，所述载体内的所述核酸被可操作地连接到适合在宿主细胞中转录的启动子或其它调节性元件。所述载体可以是在多种宿主内起作用的双功能表达载体。
“启动子”是指转录起始位点上游的核苷酸序列且包含转录所需的所有调节性区域。合适的启动子包括组成性的、组织特异的、诱导的、发育的或其它用于真核或原核细胞内表达的启动子。
“可操作连接的”指作为相同核酸分子的部分结合的，适于所述启动子起始的转录而定位和定向的。可操作连接到启动子的DNA受所述启动子的“转录起始调节”。
在优选的实施方案中，所述启动子是组成性的、诱导性的或可调节的启动子。
根据本发明的另外方面，提供用如本发明所述的核酸分子或载体转染或转化的细胞。
优选地，所述细胞是真核细胞。可选择地，所述细胞是原核细胞。
在本发明的优选实施方案中，所述细胞选自真菌细胞(例如毕赤酵母(Pichia spp)、酵母(Saccharomyces spp)、链孢霉(Neurospora spp))；昆虫细胞(例如，夜蛾(Spodoptera spp)；哺乳动物细胞(例如COS细胞、CHO细胞)；植物细胞。
根据本发明的另外方面，提供制备如本发明所述的多肽的方法，所述方法包括：
i)提供如本发明所述的细胞；
ii)在有利于产生所述多肽的条件下，孵育所述细胞；以及任选地
iii)从所述细胞或所述细胞周围的生长培养基分离所述多肽。
在本发明的优选方法中，提供带有氨基酸亲和性标签的所述多肽以便于所述多肽的分离。
亲和性标签在本领域是已知的，且包括麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、钙调素结合蛋白以及将多聚组氨酸束工程化至随后在含镍基质上通过亲和纯化而被纯化的蛋白。在许多情况中，可商购载体和/或试剂盒可以被用于将目的蛋白融合到适当的亲和性标签，所述标签随后被转染入宿主细胞，用于表达和随后的提取及在亲和性基质上的纯化。
根据本发明的另外方面，提供如本发明所述的多肽以用作药物。
根据本发明的另外方面，提供如本发明所述的核酸以用作药物。
根据本发明的另外方面，提供包括如本发明所述的多肽的药物组合物。
根据本发明的另外方面，提供包括如本发明的核酸分子的药物组合物。优选地，所述核酸分子是载体的部分；优选适合于真核表达的表达载体。
在本发明的优选实施方案中，所述药物或药物组合物包含赋形剂或药物载体(carrier)。
在本发明的优选实施方案中，所述药物或药物组合物与另外的治疗性药剂结合。
当给予时，本发明的药物/组合物是以药学上可接受的制剂被给予。所述制剂常规可以包含药学上可接受浓度的盐、缓冲试剂、防腐剂、兼容药物载体以及任选的其它治疗性药剂。
可以通过包括注射在内的任何常规途径给予本发明的药物/组合物。例如，所述给药和应用可以是口服的、静脉的、腹膜内的、肌内的、腔内的、关节内的、皮下的、局部的(眼睛)、真皮的(例如进入皮肤或粘膜的脂溶性膏剂)、经皮的或鼻内的。
本发明的药物/组合物以有效量给予。“有效量”是指单独或与另外剂量或增效的药物一起产生所需反应的药物/组合物的量。这可包括仅暂时减慢了疾病的进程，尽管更优选地，它包括永久终止了疾病的进程。这可以被通常的方法所监测或可以依照诊断方法被监测。
给予个体的所述药物/组合物的所述剂量可以依据不同的参数来选择，特别是依据使用的给予方式和所述个体的状态(即年龄、性别)。当给予时，本发明的药物/组合物以药学上可接受的量和以药学上可接受的组合物被应用。这些制剂可以常规地包含盐、缓冲试剂、防腐剂、兼容药物载体以及任选的其它治疗性药剂。当用于医学时，所述盐应该是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可被便利地用于制备其药学上可以接受的盐并且不会被排除本发明的范围。这些药理学上和药学上可接受的盐包括，但不限于制备自下述酸的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸及其类似物。同样，药学上可接受的盐可被制备为诸如钠盐、钾盐或钙盐的碱金属盐或碱土金属盐。
如果需要的话，所述药物/组合物可以与药学上可接受的药物载体结合。本文使用的术语“药学上可接受的药物载体”指适于给予人的一种或多种兼容性固体或液体填充物、稀释液或包封物质。术语“药物载体”表示与活性成分结合以便于应用的有机的或无机的、天然的或合成的成分。所述药物组合物的组分也能够以没有会基本上损害所需药物功效的相互作用的方式与本发明的分子共混合，且相互混合。
所述药物/组合物可以包含合适的缓冲试剂，所述缓冲试剂包括醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及磷酸盐。
所述药物/组合物也可以任选地包含诸如苯扎氯铵、氯丁醇、苯甲酸酯类和硫柳汞的合适的防腐剂。
所述药物组合物可以以单位剂量形式便利地存在，且可通过药学领域公知的任何方法制备。所有的方法包括使所述活性试剂与组成一种或多种助剂的药物载体结合的步骤。通常，通过统一且密切地使所述活性化合物与液体药物载体、精细分开的固体药物载体或两者结合，且随后，如果需要的话，使该产物成形，来制备所述组合物。
适于口服的组合物可以以诸如胶囊、片剂、锭剂的分散单位存在，每一含有预定量的所述活性化合物。其它组合物包括诸如糖浆、酏剂或乳剂的水性液体或非水性液体的悬浮剂。
适于肠胃外给药的组合物便利地包括优选与受者的血液等渗的灭菌水性或非水性制剂。该制剂可依照已知的方法使用合适的分散剂或润湿剂及悬浮剂制成。灭菌的可注射制剂也可以是用无毒的肠胃外可接受的稀释液或溶剂的灭菌的可注射溶液或悬浮液，例如，作为用1，3-丁二醇的溶液。在可被使用的可接受的溶剂中有水、林格氏液(Ringer’ssolution)，以及等渗的氯化钠溶液。此外，灭菌的不挥发性油可被便利地作为溶剂或悬浮介质使用。为了该目的，可以使用包括合成单甘油酯或双甘油酯在内的任何温和的不挥发性油。此外，诸如油酸的脂肪酸可以被用于可注射剂的制备。在Remington’s PharmaceuticalSciences(雷敏顿氏药物科学)Mack Publishing Co.，Easton，PA中可以找到适于口、皮下、静脉、肌内等给药的药物载体制剂。
如本发明所述的多肽/核酸分子等可以被并入脂质体。脂质体是封装随后被导入患者的所选择的治疗性药剂的脂基泡。所述脂质体由纯的磷脂或磷脂和磷酸甘油酯的混合物生产。
通常可以生产直径小于200nm的脂质体。这使它们能由静脉注射且能通过肺部毛细血管床。而且脂质体的生化性质赋予跨过血管膜的渗透性以能够进入所选择的组织。脂质体的确有相对短的半衰期。已经开发了包括包被聚乙二醇(PEG)的脂质体的所谓的STEALTHR脂质体。所述的PEG处理的脂质体在被由静脉给予患者时，有显著增加的半衰期。此外，STEALTHR脂质体显示了在网状内皮组织系统摄取降低，且在选择的组织积累增加。此外，所谓的免疫-脂质体已被开发，其将脂基囊与一种抗体或多种抗体结合，以增加所述试剂递送到选择的细胞/组织的特异性。
在US 5580575和US 5542935中描述了作为递送手段的脂质体的用途。
根据本发明的另外方面，提供了如本发明所述的多肽在制备用于治疗疾病状态的药物中的用途，所述疾病状态选自巨人症、肢端肥大症、癌症(例如威尔姆氏瘤(Wilm’s tumour)、骨源性肉瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌)、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病以及其它的糖尿病和GH过剩的并发症。
根据本发明的另外方面，提供治疗动物，优选人的方法，所述方法包括给予需要治疗会从抑制生长激素或泌乳刺激素活性中受益的疾病或状态的所述动物有效量的如本发明所述的多肽。
会从给予所述多肽拮抗剂中受益的疾病的实例对技术人员而言是明显的，且可以是涉及生长激素或催乳素受体信号转导的活化或活化增加的任何疾病或状态。
在本发明的优选方法中，所述疾病或状态选自巨人症、肢端肥大症、癌症(例如威尔姆氏瘤、骨源性肉瘤，乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌)、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病以及糖尿病和GH过剩的其它并发症。
如本文中所使用的，术语“癌症”指具有自主生长能力的细胞，即以迅速增殖的细胞生长为特征的异常的状态或情况。所述术语意图包含所有类型的癌性生长或致癌过程，转移的组织或恶性转化的细胞、组织或器官，与组织病理学类型或侵袭的阶段无关。所述术语“癌症”包含多种器官系统的恶性肿瘤，诸如影响，例如，肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和生殖-泌尿道的那些，以及包括诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤的恶性肿瘤的腺癌，肺的非小细胞癌，小肠癌及食道癌。术语“癌”是本领域公认的且指包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤的上皮或内分泌组织的恶性肿瘤。示例性癌包括形成自子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织的那些。所述术语“癌”也包括癌肉瘤，例如，其包括由癌瘤性组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”指源于腺体组织的癌或其中瘤细胞形成可辨认的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的且指间充质来源的恶性肿瘤。
根据本发明的另外方面，提供修饰如本发明所述的多肽的拮抗剂活性的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供由选自下述的核酸分子编码的多肽：
a)由如图1中所示的序列(SEQ ID NO：1)组成的核酸分子；
b)包括与(a)中鉴定的序列杂交的序列的核酸分子，其中所述核酸分子包含修饰，所述修饰包括编码176位氨基酸残基的序列，其中所述修饰导致至少一个氨基酸残基的添加、替换或删除，且所述核酸分子编码具有生长激素受体拮抗剂活性的多肽。
ii)使编码所述多肽的第一氨基酸残基的密码子突变以产生变体多肽；
iii)确定所述变体多肽对生长激素受体活化的抑制活性，由此鉴定所述多肽的功能性变体。
根据本发明的另外方面，提供通过如本发明所述的方法得到的或可得到的变体多肽拮抗剂。
根据本发明的另外方面，提供多肽突变的合理设计的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供由图2中氨基酸序列(SEQ ID NO：2)所示的第一多肽的3D模型。
ii)提供变体多肽的3D模型，其中所述变体多肽是所述第一多肽的修饰的序列变体，所述第一多肽通过在图2(SEQ ID NO：2)中添加、删除或替换至少一个氨基酸残基而被修饰；
iii)比较相对于所述第一多肽的3D模型，所述突变对所述第二多肽的3D模型的作用；以及任选地
iv)测试相对于所述第一多肽，所述修饰对所述第二多肽的生长激素受体活化的作用。
根据本发明的另一方面，提供包括多肽的同型二聚体，所述多肽包括第一和第二多肽，其中所述多肽包括第一部分，所述第一部分包含直接或间接连接到第二部分的如本发明的多肽，其中所述第二部分包括生长激素受体的胞外结构域。
在本发明的优选实施方案中，所述第一部分包括如图2a中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述氨基酸序列通过在176位添加、删除或替换至少一个氨基酸残基而被修饰，并且所述第二部分包括由图2b(SEQ ID NO：4)、图2c(SEQ ID NO：5)或图2d(SEQ ID NO：6)中的氨基酸序列所示的生长激素受体的胞外结构域。
贯穿本申请文件的说明书和权利要求书，所述词语“包括(comprise)”和“包含(contain)”及所述词语的变形，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”意味“包括但不限于”，且并非意在(且没有)排除其它部分、添加物、组分、整数或步骤。
贯穿本申请文件的说明书和权利要求书，单数包括复数，除非上下文另外有要求。特别地，如果使用了不定冠词，本申请文件将被理解为涉及复数以及单数，除非上下文另外有要求。
与本发明的特定的方面、实施方案或实施例一道描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团将被理解为可应用于本文描述的任何其它的方面、实施方案或实施例，除非与之不相兼容。
本发明的实施方案现在将仅通过实施例并参照下面的附图被描述：
图1(SEQ ID NO：1)是生长激素环状变序的GHCP07的核酸序列；
图2a(SEQ ID NO：2)是生长激素环状变序的GHCP07的氨基酸序列；图2b(SEQ ID NO：4)是生长激素受体的胞外结构域的氨基酸序列；图2c(SEQ ID NO：5)是生长激素受体的A结构域的氨基酸序列；图2d(SEQ ID NO：6)是生长激素受体的B结构域的氨基酸序列；
图3是人催乳素的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)；
图4是用于环状变序生长激素的策略；
图5(SEQ ID NO：8)是GHCP07BHis的核苷酸和氨基酸(3字母氨基酸密码)序列。所述结合位点2的突变以粗体显示。由所述突变实现的氨基酸的变化显示在所述序列的右边(用1字母的氨基酸密码)；
图6显示GHCP07BHis纯化物的SDS-PAGE凝胶；所述泳道的内容物显示在所述凝胶的下方，且通过Bradford分析测量的以mg/ml表示的蛋白浓度显示在每一孔的下方；
图7A)GHCP07BHis的生物分析，显示存在和不存在0.5nmolrhGH下它的剂量反应。GHCP07BHis本身没有活性且它拮抗rhGH的作用。B)GHCP07BHis对GH.G120R的拮抗剂活性的比较。GHCP07BHis和GH.G120R的活性是相似的；
图8(SEQ ID NO：9)：GHCP07CHis的核苷酸和氨基酸(3字母氨基酸密码)序列。所述结合位点1的突变以下划线显示，且所述结合位点2的突变以粗体显示。由所述突变实现的氨基酸变化显示在所述序列的右边(用1字母的氨基酸密码)；
图9显示GHCP07CHis纯化物的SDS-PAGE凝胶；所述泳道的内容物显示在所述胶的下方，且通过Bradford分析测量的以mg/ml表示的蛋白浓度显示在每一孔的下方；以及
图10A)GHCP07CHis的生物分析，显示存在和不存在1nmolrhGH下它的剂量反应。GHCP07CHis本身没有活性且它拮抗rhGH的作用。B)GHCP07CHis对B2036的拮抗剂活性的比较。GHCP07CHis和B2036的所述活性是相似的。
定义
核酸分子：核苷酸是包含连接到糖的碱基的单体，所述碱基诸如嘧啶、嘌呤或其合成的类似物，所述核苷酸当连接在一起时形成核酸分子。核酸序列指核酸分子的碱基序列。
多肽：聚合体，其中通过酰胺键连在一起的单体是氨基酸残基。本文使用的术语“多肽”或“蛋白”意在包括任何氨基酸序列且包括诸如糖蛋白的修饰的序列。具体地，所述术语“多肽”意在包括天然存在的蛋白，以及重组地或合成地产生的那些。
变体多肽：变体，即通过可以以任何组合存在的一个或多个替换、添加、删除、截断，多肽和参照多肽可以在氨基酸序列上不同。优选的变体有通过保守的氨基酸替换改变自参照多肽的那些。这些替换是由类似特性的另一氨基酸替代给定氨基酸的那些。下面氨基酸的非限定性列表被认为是保守的替代(相似的)：a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最高度优选的是保留与变体改变自的参照多肽相同的生物学功能和活性的变体。此外，本发明的特征是与图2中所示的多肽序列具有至少75％的一致性的多肽序列，或其片段和其功能性等价多肽。在一种实施方案中，所述多肽与图2中所示的氨基酸序列有至少85％的一致性，更优选是至少90％的一致性，甚至更优选的是至少95％的一致性，仍更优选的是至少97％的一致性，且最优选的是至少99％的一致性。
重组核酸：重组核酸是指具有非天然存在的序列的核酸或具有通过人工组合两个另外独立的序列片段而制备的序列的核酸。该人工组合经常通过化学合成或更经常地通过人工操作核酸的分离片段，例如通过基因工程技术而实现。类似地，重组蛋白是由重组核酸分子编码的蛋白。
融合多肽：至少两个多肽的翻译融合以形成通常作为重组多肽被制备的单一多肽。
肽连接子：可以是螺旋状的典型短肽，并因此提供所连接多肽之间的刚性连接或柔性连接，并因此提供所连接多肽之间一定程度的旋转运动；或者螺旋状和非螺旋状的结合以提供所连接多肽之间的某种旋转运动。在提供非柔性的螺旋状区维持所述结构域空间分离的同时，提供柔性的非螺旋状区使所述结构域定向于所述细胞因子受体的结合位点。肽通常是氨基酸残基的短聚合体。
治疗性药剂：这按一般意义使用且它包括治疗药剂、预防疾病的药剂以及替代药剂，例如增大或增强对会从给予本发明的多肽中受益的状态的治疗性作用的药剂，例如免疫调节性药剂或化学治疗性药剂。
胞外结合结构域：指接触配体以使受体介导的信号转导起作用的的细胞表面受体的一部分。例如，生长激素受体的胞外结构域以两个连接的结构域存在，每一个约有100个氨基酸，C末端SD-100(B结构域)离细胞表面最近而N-末端SD-100结构域(A结构域)离得最远。在生长激素或催乳素结合及所述三聚复合物形成时发生的是这两个结构域的构象变化。所述复合物内化后随之是所述受体分子在细胞内再生用于进一步利用的再循环步骤。
材料和方法
用两步PCR策略(图4)合成所述环状变序的拮抗剂；所述PCR的模板是已经在结合位点2(G120R)被突变的生长激素或已经在结合位点1和2(H18D、H21N、G120R、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S和I179T)被突变的生长激素。用于所述PCR反应的引物FOR、LINK和REV分别是GHPermLink-(5’-tggataagggaatggtgctgccctccacagag-3’SEQ ID NO：10)、Nde-GHCP07F(5’-aattaattcatatgagcccccggactgggcag-3’SEQ ID NO：11)和GHCP07-XhoR(5’-aattctcgagatcttccagcctccccatc-3’SEQ ID NO：12)。使用EXPAND PCR试剂盒(Roche)进行所述PCR反应，且遵循附带的说明书；第一次和第二次PCR的退火温度分别是55℃和45℃。所述PCR终产物在NdeI和XhoI位点之间连接入pET21a+(Novagen)。然后将所述连接的质粒转化入化学感受态大肠杆菌XL1Blue细胞。通过使用NdeI和XhoI的限制性分析来初始核对由通过所述转化生成的集落制备的质粒。递交在限制性分析中产生阳性结果的克隆用于使用T7启动子和T7终止子测序引物进行测序。
带有正确的序列的单一质粒被选择并被转化入化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)。挑取用所述质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)的集落，并用所述集落接种20ml添加羧苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基。37℃振摇孵育过夜后，所述培养物被用于向添加羧苄青霉素(100μg/ml)的500ml LB提供2％的接种体；然后使所述接种体在室温下振摇生长。当所述培养物的OD600达到约0.4时，用终浓度1mM的IPTG诱导所述培养物，并且随后使其于室温下振摇过夜。然后将所述培养物离心以使所述细胞成沉淀物并弃去上清。
将所述细胞沉淀物重悬于15ml的平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液、0.5M NaCl、20％甘油、20mM咪唑，且pH8)并且然后用溶菌酶/脱氧胆酸钠/超声破碎处理来裂解所述细胞。将裂解的细胞高速离心以使不溶组分成沉淀物且随后将上清移入新管。用平衡缓冲液将所述上清补足到20ml，且然后使其通过0.2μm的针筒式滤器以进一步澄清所述样品。
使用固定的金属离子色谱纯化所述His标签的蛋白。使用带Ni2+电荷的Probond树脂(Invitrogen)。将1ml树脂装柱并用10倍柱体积(CV)的平衡缓冲液平衡。然后将所述澄清的蛋白样品上于柱上。所述柱用20CV的平衡缓冲液清洗且然后用清洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液、0.5M NaCl、20％甘油，pH6)清洗直到洗脱液的A280低于0.01。然后用洗脱缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液、0.5M NaCl、20％甘油、0.5M咪唑，pH6)将结合的蛋白从所述柱上洗脱掉，收集六个1ml流分。通过SDS-PAGE凝胶分析和通过Bradford蛋白分析来检查所述洗脱流分的内容物。
纯化的蛋白进行所述GH生化分析；通过观察单独的测试蛋白的刺激来测试激动剂活性，并且通过观察在所述测试蛋白存在下GH的活性来测试拮抗剂活性。
实施例
环状变序的生长激素拮抗剂GHCP07B(带有位点2突变的GHCP07)由两个PCR反应生成，第一反应产生约200bp的产物且这被用作第二PCR反应的“大引物(megaprimer)”以产生约600bp的环状变序的生长激素拮抗剂(GHCP07B)基因。所述GHCP07B基因DNA片段用NdeI和XhoI消化，且然后连接入已经用相同的限制性酶消化的pET21a+。将这转化入大肠杆菌XL1Blue细胞产生约500个集落，同时没有集落出现在阴性对照(只用水转化)板上。
挑取三个克隆用于进一步处理；质粒小量制备物制备自这些克隆并且通过限制性分析来分析所述质粒，所有三个克隆均显示正确的消化图。然后将这些质粒测序并将所得序列与所需序列比较(图5)；所述三个质粒中有两个显示了正确的序列。然后选择这些质粒中的一个以表达且纯化GHCP07BHis。
所述质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)且被培养。将所得细胞裂解并且用镍螯合柱从所述可溶流分纯化His标签的蛋白。通过SDS-PAGE和Bradford蛋白分析来分析所洗脱的蛋白(图6)；总计约25mg的蛋白被纯化到大于90％的纯度。
所述纯化物的洗脱液3被用于生物分析，且GHCP07BHis活性的剂量范围被单独地及也在0.5nmol rhGH存在下测量。所述分析表明GHCP07BHis没有激动剂活性且它的确有拮抗剂活性(图7A)。GHCP07BHis的所述活性与GH.G120R的活性是可比的(图7B)。
环状变序的生长激素拮抗剂GHCP07C(位点1和位点2突变的GHCP07)以与GHCP07B相同的方式被生成和分析。GHCP07C的所述序列在图8中显示；所述蛋白的纯化物在图9中显示。所述纯化蛋白的洗脱液1被用于所述生物分析。所述分析表明GHCP07C没有激动剂活性，并且是具有可与B2036(具有位点1和位点2突变的生长激素)(图10B)比较的活性的有效拮抗剂(图10A)。

Claims (60)

1.包括SEQ ID NO：1中所示的序列的核酸分子，所述序列编码SEQ ID NO：2中所示的多肽，其中所述氨基酸序列被修饰以包括176位氨基酸残基的氨基酸添加、删除或替换。
2.包括SEQ ID NO：1中所示的序列的核酸分子，所述序列编码SEQ ID NO：2中所示的多肽。
3.如权利要求1所述的核酸分子，所述核酸分子编码包括SEQ IDNO：9中所示的氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求1至3的任一项所述的核酸分子，其中所述分子编码多肽生长激素拮抗剂。
5.包括SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的多肽，所述多肽的序列已通过至少一个氨基酸残基的添加、删除或替换而被修饰，其中所述修饰包含176位氨基酸残基且其中所述多肽是生长激素受体拮抗剂。
6.如权利要求5所述的多肽，其中所述多肽通过用选自组氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的氨基酸替换176位甘氨酸而被修饰。
7.如权利要求6所述的多肽，其中精氨酸或赖氨酸或丙氨酸替换176位甘氨酸残基。
8.如权利要求7所述的多肽，其中所述修饰是甘氨酸替换为精氨酸。
9.如权利要求5至8的任一项所述的多肽，其中所述多肽由SEQID NO：9中的氨基酸序列表示。
10.如权利要求5至9的任一项所述的多肽，其中所述多肽连接到包括生长激素受体的胞外结合结构域的另一多肽。
11.如权利要求10所述的多肽，其中所述另一多肽由生长激素受体的胞外结构域组成。
12.如权利要求11所述的多肽，其中所述另一多肽由SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列组成。
13.如权利要求11所述的多肽，其中所述胞外结构域是生长激素受体的胞外结构域的A结构域，所述A结构域由SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列组成。
14.如权利要求11所述的多肽，其中所述胞外结构域是生长激素受体的胞外结构域的B结构域，所述B结构域由SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列组成。
15.包括串联连接的至少两个如权利要求5至9的任一项所述的多肽的融合多肽。
16.如权利要求15所述的融合多肽，其中所述融合多肽由串联连接的两个多肽组成。
17.包括多个如权利要求5至9的任一项所述的多肽的融合多肽。
18.如权利要求10至17的任一项所述的融合多肽，其中所述多肽由肽连接子分子连接在一起。
19.如权利要求18所述的融合多肽，其中所述肽连接分子是柔性肽连接子。
20.如权利要求18或19所述的融合多肽，其中所述连接子是由5个至30个氨基酸残基组成的肽。
21.如权利要求20所述的融合多肽，其中所述肽连接子由10个至20个氨基酸残基组成。
22.如权利要求18至20的任一项所述的融合多肽，其中所述连接子包括至少一个拷贝的下述肽：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(被称为Gly4Ser)(SEQ ID NO：3)。
23.如权利要求22所述的融合多肽，其中所述肽连接子长10个氨基酸且包括两个拷贝的所述Gly4Ser。
24.如权利要求22所述的融合多肽，其中所述肽连接子长15个氨基酸且包括三个拷贝的所述Gly4Ser。
25.如权利要求22所述的融合多肽，其中所述肽连接子长20个氨基酸且包括四个拷贝的所述Gly4Ser连接子。
26.包括至少两个如权利要求5至9的任一项所述的多肽的融合多肽，其中所述多肽还包括生长激素受体的至少一个胞外结合结构域。
27.如权利要求26所述的融合多肽，其中所述融合多肽由两个如权利要求5至9的任一项所述的多肽以及生长激素受体的一个胞外结合结构域组成。
28.嵌合的融合多肽，所述嵌合的融合多肽包括直接或间接连接到催乳素多肽的权利要求5至9的任一项所述的多肽。
29.如权利要求28所述的嵌合的融合多肽，其中所述催乳素多肽包括氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在SEQ ID NO 7中所示的人催乳素的129位或在可选择的催乳素多肽的等价氨基酸处被修饰。
30.如权利要求29所述的嵌合的融合多肽，其中所述在SEQ IDNO：7中所示的129位的修饰是氨基酸替换。
31.如权利要求30所述的嵌合的融合多肽，其中所述替换用精氨酸氨基酸残基代替甘氨酸氨基酸残基。
32.如权利要求28至31的任一项所述的嵌合的融合多肽，其中所述催乳素多肽还包括至少9、10、11、12、13或14个氨基末端氨基酸残基的删除。
33.如权利要求29至32的任一项所述的嵌合的融合多肽，其中所述多肽还包括细胞因子受体的配体结合结构域。
34.如权利要求33所述的嵌合的融合多肽，其中所述细胞因子受体包括生长激素受体的胞外结合结构域。
35.如权利要求34所述的嵌合的融合多肽，其中所述细胞因子受体包括催乳素受体的胞外结合结构域。
36.如权利要求34所述的嵌合的融合多肽，其中所述细胞因子受体由生长激素受体的胞外结构域组成。
37.如权利要求35所述的嵌合的融合多肽，其中所述细胞因子受体由催乳素受体的胞外结构域组成。
38.编码权利要求10至37的任一项所述的融合或嵌合多肽的核酸分子。
39.包括权利要求1至3的任一项或权利要求38所述的核酸分子的载体。
40.如权利要求39所述的载体，其中所述载体适合于所述核酸分子的重组表达。
41.用权利要求1至3的任一项或权利要求38所述的核酸分子，或权利要求39或40所述的载体转染的细胞。
42.用权利要求1至3的任一项或权利要求38所述的核酸分子，或权利要求39或40所述的载体转化的细胞。
43.如权利要求41所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
44.如权利要求42所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
45.制备多肽的方法，所述方法包括：
i)提供权利要求41至44的任一项所述的细胞；
ii)在有益于产生所述多肽的条件下孵育所述细胞；以及任选地
iii)从所述细胞或所述细胞周围的生长培养基中分离所述多肽。
46.如权利要求45所述的方法，其中向所述多肽提供氨基酸亲和性标签以便于所述多肽的分离。
47.用作药物的权利要求5至37的任一项所述的多肽。
48.用作药物的权利要求1至3的任一项或权利要求38所述的核酸。
49.包括权利要求3至36的任一项所述的多肽且包含赋形剂或药物载体的药物组合物。
50.包括权利要求1至3或权利要求38的任一项所述的核酸分子且包含赋形剂或药物载体的药物组合物。
51.如权利要求50所述的组合物，其中所述核酸分子是载体的部分。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述载体是适合于真核表达的表达载体。
53.如权利要求49至52的任一项所述的组合物，其中所述组合物与另外的治疗性药剂结合。
54.权利要求5至37的任一项所述的多肽在制备用于治疗疾病状态的药物中的用途，所述疾病状态选自巨人症、肢端肥大症、癌症；糖尿病性视网膜病；糖尿病性肾病以及其它糖尿病和GH过剩的并发症。
55.治疗动物的方法，所述方法包括给予所述动物有效量的权利要求5至37的任一项所述的多肽，所述动物需要治疗会从生长激素或泌乳刺激素活性的抑制中受益的疾病或状态。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述疾病或状态选自巨人症、肢端肥大症、癌症；糖尿病性视网膜病；糖尿病性肾病以及其它糖尿病和GH过剩的并发症。
57.修饰多肽的拮抗剂活性的方法，所述方法包括下面的步骤：
i)提供由包括SEQ ID NO：1中所示的核酸序列的核酸分子编码的多肽；以及
ii)突变编码所述多肽的第一氨基酸残基的密码子以产生变体多肽。
58.通过权利要求57所述的方法获得的或可获得的变体多肽拮抗剂。
59.合理设计多肽突变的方法，所述方法包括下面的步骤：
i)提供由SEQ ID NO：2中的氨基酸序列所示的第一多肽的3D模型；
ii)提供变体多肽的3D模型，其中所述变体多肽是所述第一多肽的修饰的序列变体，所述第一多肽通过SEQ ID NO：2中所示的至少一个氨基酸残基的添加、删除或替换而被修饰；
iii)比较相对于所述第一多肽的3D模型，所述突变对所述第二多肽的3D模型的作用；以及任选地；和
iv)测试相对于所述第一多肽，所述修饰对所述第二多肽活化生长激素受体的作用。
60.同型二聚体，所述同型二聚体包括两个如权利要求10至14的任一项所述的多肽。
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