RU2325400C2 - Мультимеры рецептор-связывающих лигандов - Google Patents
Мультимеры рецептор-связывающих лигандов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2325400C2 RU2325400C2 RU2004121969/13A RU2004121969A RU2325400C2 RU 2325400 C2 RU2325400 C2 RU 2325400C2 RU 2004121969/13 A RU2004121969/13 A RU 2004121969/13A RU 2004121969 A RU2004121969 A RU 2004121969A RU 2325400 C2 RU2325400 C2 RU 2325400C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- polypeptide dimer
- linker
- cytokine receptor
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title abstract description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title abstract description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 title description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 title description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 82
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 20
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 20
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 20
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 16
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 206010018265 Gigantism Diseases 0.000 claims description 3
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 3
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 12
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 12
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 6
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 6
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- VDHRJLNOQQQFNZ-UHFFFAOYSA-O [n'-[3-[1-[2-[4-[4-[4-[2-[4-[3-[[amino(azaniumyl)methylidene]amino]propyl]triazol-1-yl]acetyl]piperazin-1-yl]-6-[2-[2-(2-prop-2-ynoxyethoxy)ethoxy]ethylamino]-1,3,5-triazin-2-yl]piperazin-1-yl]-2-oxoethyl]triazol-4-yl]propyl]carbamimidoyl]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].N1=NC(CCCN=C([NH3+])N)=CN1CC(=O)N1CCN(C=2N=C(N=C(NCCOCCOCCOCC#C)N=2)N2CCN(CC2)C(=O)CN2N=NC(CCCN=C(N)[NH3+])=C2)CC1 VDHRJLNOQQQFNZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- IEUUDEWWMRQUDS-UHFFFAOYSA-N (6-azaniumylidene-1,6-dimethoxyhexylidene)azanium;dichloride Chemical compound Cl.Cl.COC(=N)CCCCC(=N)OC IEUUDEWWMRQUDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101150047053 GR gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 101150009057 JAK2 gene Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229940122363 Leptin receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101150024075 Mapk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- -1 N 6 -acetylysine Chemical compound 0.000 description 1
- MXNRLFUSFKVQSK-QMMMGPOBSA-O N(6),N(6),N(6)-trimethyl-L-lysine Chemical compound C[N+](C)(C)CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O MXNRLFUSFKVQSK-QMMMGPOBSA-O 0.000 description 1
- XXEWFEBMSGLYBY-ZETCQYMHSA-N N(6),N(6)-dimethyl-L-lysine Chemical compound CN(C)CCCC[C@H](N)C(O)=O XXEWFEBMSGLYBY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- PQNASZJZHFPQLE-LURJTMIESA-N N(6)-methyl-L-lysine Chemical compound CNCCCC[C@H](N)C(O)=O PQNASZJZHFPQLE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 108700021031 cdc Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940096384 chicken egg white lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 208000037244 polycythemia vera Diseases 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к области биотехнологии. Олигомерные полипептидные димеры включают в себя лиганд-связывающие домены лептина. Домены соединены посредством гибких полипептидных линкерных молекул. Линкерные молекулы, возможно, включают в себя сайты чувствительности к протеазам. Изобретение может быть использовано для модулирования высвобождения биологически активных цитокинов при введении субъекту человеку или животному. 11 н. и 20 з.п. ф-лы, 11 ил.
Description
Изобретение относится к полипептидам, которые включают в себя более чем два лиганд-связывающих домена цитокина, где указанные домены соединены гибким линкером, который, возможно, включает в себя сайт протеолитического расщепления.
Лиганды, которые взаимодействуют с рецепторами для того, чтобы вызвать подходящий биологический ответ, известны как агонисты, а лиганды, которые предотвращают биологический ответ или препятствуют ему, известны как антагонисты. В качестве примера, но не ограничения, факторы роста, специфичные для клеток, представляют собой лиганды, которые действуют как агонисты и связываются с рецепторами, расположенными на клеточной поверхности. Активация рецепторов посредством лиганд-специфичного связывания способствует пролиферации клеток путем активации внутриклеточных каскадов передачи сигнала, что приводит в результате к экспрессии, помимо прочего, специфических генов клеточного цикла и активации пролиферации покоящихся клеток. Факторы роста могут также активировать клеточную дифференцировку.
Большая группа факторов роста, называемая также цитокинами, вовлечена во множество различных клеточных функций. Последние включают в себя в качестве примера, но не ограничения, модулирование иммунной системы, регуляцию энергетического метаболизма и контроль роста и развития. Цитокины, которые секретируются лимфоцитами, называются лимфокинами (также известными как интерлейкины). Цитокины, секретируемые моноцитами и макрофагами, называются монокинами. Цитокины также секретируются эндокринными железами (например, гормон роста (ГР) секретируется гипофизом) и жировыми клетками (например, лептин). Цитокины опосредуют свое действие через рецепторы, экспрессирующиеся на клеточной поверхности клеток-мишеней.
Рецепторы, относящиеся к семейству рецепторов цитокинов, имеют один трансмембранный домен и не имеют собственной ферментативной активности (Kishimoto et al., 1994). После связывания цитокина с родственным рецептором происходит либо гомо- или гетеродимеризация, либо олигомеризация рецептора. Этот рецепторный комплекс интернализуется, и осуществляется передача сигнала посредством активации ассоциированных каскадов передачи сигнала, которые включают в себя пути Jak/Stat и Mapk. За интернализацией следует стадия рециклинга, посредством которой молекула рецептора регенерируется для дальнейшего использования в клетке.
Вышеуказанный пример описан в отношении ГР и его связывания с рецепторами гормона роста (РГР). Этот пример приведен только для иллюстрации, а не ограничения, и представляет собой пример цитокина, который активирует каскад передачи сигнала путем связывания, димеризации и интернализации комплекса рецептор:лиганд. Известно, что одна молекула гормона роста (ГР) связывается с двумя идентичными молекулами рецептора (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clackson et al., 1998). Это происходит посредством двух уникальных рецептор-связывающих сайтов на ГР и общего связывающего "кармана" на внеклеточном домене двух рецепторов. Сайт 1 в молекуле ГР обладает более высокой аффинностью, чем сайт 2, и димеризация рецептора, как полагают, происходит последовательно со связыванием одного рецептора с сайтом 1 на ГР с последующим привлечением второго рецептора к сайту 2.
Внеклеточный участок РГР существует в виде двух связанных доменов, каждый из которых состоит приблизительно из 100 аминокислот (SD-100), причем С-концевой домен SD-100 наиболее близок к клеточной поверхности, а N-концевой домен SD-100 наиболее удален. В этих двух доменах имеется конформационное изменение, которое возникает при связывании гормона, с образованием гетеро-тримерного комплекса РГР-ГР-РГР. Предположили, что лиганд-управляемая димеризация рецептора является ключевым событием, ведущим к активации сигнала (Cunningham et al., 1991), запуская каскады фосфорилирования, которые включают в себя путь Jak2/Stat5 (Argetsinger & Carter-Su, 1996). С использованием конфокальной микроскопии и флуоресцентного резонансного переноса энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) известно, что происходит очень быстрая интернализация РГР после связывания лиганда и что эта интернализация и передача сигнала представляют собой независимые функции (Maamra et al., 1999). За интернализацией комплекса РГР-ГР-РГР следует стадия рециклинга, посредством которой молекула рецептора регенерируется для дальнейшего использования внутри клетки.
Примеры цитокинов, которые относятся к ГР, представляют собой лептин и эритропоэтин (ЕРО). Рецептор лептина и рецептор ЕРО демонстрируют значительную структурную гомологию с РГР и требуют подобного процесса димеризации для запуска процесса передачи сигнала. Лептин подавляет аппетит, и устойчивость к лептину ассоциирована с ожирением. Антагонист рецептора лептина будет обеспечивать лечение анорексии. Избыток ЕРО вызывает полицитемию, которая может быть вторичной по отношению к гипоксии (хроническое заболевание легких) или первичной в случае эритремии (расстройство, заключающееся в избытке эритроцитов). Агонист ЕРО будет обеспечивать лечение полицитемии.
Расстройства акромегалия и гигантизм возникают вследствие избытка гормона роста, обычно вследствие опухолей гипофиза. Находящееся в настоящее время на испытании лекарство представляет собой пегилированный антагонист ГР В2036, разработанный с использованием недавно полученного знания молекулярной структуры РГР.
К сожалению, для того чтобы антагонизировать действие ГР, требуются очень высокие уровни В2036, которые более чем в 1000 раз выше по сравнению с уровнями эндогенного ГР.
Данное изобретение, среди прочего, относится к предложению олигомерных полипептидов (димеров, тримеров и так далее), включающих в себя лиганд-связывающие домены цитокинов, которые соединены посредством гибких полипептидных линкерных молекул, которые, возможно, включают в себя сайты чувствительности к протеазам для модулирования высвобождения биологически активных цитокинов при введении животному.
В соответствии с первым аспектом данного изобретения предложен полипептид, включающий в себя более чем два лиганд-связывающих домена рецептора цитокина, где указанные домены соединены посредством линкерной молекулы.
Предпочтительно, линкерная молекула включает в себя по меньшей мере один сайт протеолитического расщепления.
Предпочтительно, указанный сайт расщепления чувствителен к сывороточной протеазе.
Предпочтительно, указанный сайт расщепления включает в себя последовательность аминокислот: LVPRGS или ее модификацию.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный сайт расщепления включает в себя по меньшей мере одну копию последовательности аминокислот: SGGGG или ее функциональную модификацию. Предпочтительно, указанный сайт расщепления включает в себя последовательность аминокислот: PGISGGGGGG.
Более предпочтительно, указанный сайт расщепления включает в себя последовательность аминокислот: LVPRGSPGISGGGGGG или ее модификацию.
Альтернативно, указанный сайт расщепления включает в себя по меньшей мере две копии последовательности аминокислот: SGGGG или ее функциональной модификации, которые фланкируют указанный сайт расщепления.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный сайт расщепления чувствителен к сывороточной протеазе тромбину.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид включает в себя множество лиганд-связывающих доменов. Предпочтительно, указанный полипептид имеет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лиганд-связывающих доменов. Предпочтительно, указанный полипептид имеет более чем 10 лиганд-связывающих доменов.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид имеет 4, 6, 8,10 или 12 лиганд-связывающих доменов.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид включает в себя по меньшей мере четыре лиганд-связывающих домена.
В еще одном воплощении данного изобретения указанный полипептид представляет собой антагонист.
В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид представляет собой агонист.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный лиганд-связывающий домен выбран из лиганд-связывающих доменов цитокинов, выбранных из группы, состоящей из: гормона роста; лептина; эритропоэтина; пролактина; интерлейкинов (ИЛ), ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11; субъединицы р35 интерлейкинов ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-15; гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ); гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF); кардиотропина-1 (СТ-1); фактора, ингибирующего лейкемию (LIF); онкостатина М (OSM); интерферона, ИФНα и ИФНγ.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный лиганд-связывающий домен представляет собой лиганд-связывающий домен гормона роста.
Одна молекула гормона роста человека (чГР) связывается с двумя молекулами РГР. Молекула чГР взаимодействует с одной молекулой рецептора посредством сайта высокой аффинности и с другой молекулой посредством сайта низкой аффинности. Одна цепь белка, состоящая из чГР, связанного с чГР, содержит два сайта высокой аффинности, которые могут прочно связываться с парой молекул рецепторов и двумя сайтами низкой аффинности.
В одном воплощении данного изобретения две или более чем две копии лиганд-связывающего домена экспрессируются на одной полипептидной цепи, и последовательность тандема или олигомерного цитокина располагается в порядке лиганд-связывающий домен - линкер - лиганд-связывающий домен.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный лиганд-связывающий домен представляет собой связывающий домен лептина.
Предпочтительно, линкер включает в себя по меньшей мере одну копию пептида:
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser (далее называемый как "Gly4Ser4").
В одном воплощении данного изобретения линкер имеет длину 8 аминокислот и состоит из одной копии линкера Gly4Ser4. В альтернативном воплощении данного изобретения линкер имеет длину 16 аминокислот и состоит из двух копий линкера Gly4Ser4. В еще одном альтернативном воплощении данного изобретения указанный линкер имеет длину 24 аминокислоты и состоит из трех копий линкера Gly4Ser4.
Более предпочтительно, линкер представляет собой полипептид, который включает в себя от 5 до 50 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительно, линкер включает в себя от 5 до 30 аминокислотных остатков.
Наиболее предпочтительно, линкер включает в себя по меньшей мере одну копию пептида:
Gly Gly Gly Gly Ser (далее называемый как "(Gly4Ser") или (G4S)).
В первом воплощении данного изобретения линкер имеет длину 5 аминокислот и состоит из одной копии линкера (Gly4Ser). В альтернативном воплощении данного изобретения линкер имеет длину 10 аминокислот и состоит из двух копий линкера (Gly4Ser)2. В еще одном альтернативном воплощении данного изобретения указанный линкер имеет длину 15 аминокислот и состоит из трех копий линкера (Gly4Ser). В еще одном альтернативном воплощении данного изобретения указанный линкер имеет длину 20 аминокислот и состоит из 4 копий линкера (Gly4Ser)4.
В альтернативном воплощении данного изобретения полипептид представляет собой слитый белок, включающий в себя внутри рамки считывания трансляционные слияния лиганд-связывающих доменов по данному изобретению.
Специалисту в данной области техники понятно, что для сшивки лиганд-связывающих доменов могут быть использованы альтернативные линкеры, например, могут быть использованы химические белковые кросс-линкеры. Например, гомобуфункциональный кросс-линкер, такой как дисукцинимидил-суберимидат-дигидрохлорид; диметил-адипимидат-дигидрохлорид; 1,5,-2,4-динитробензол; либо гетеробифункциональные кросс-линкеры, такие как N-гидроксисукцинимидил-2,3-дибромпропионат; гидрохлорид 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида; сукцинимидил-4-[н-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилат.
Дополнительные примеры химических кросс-линкеров включают в себя химически модифицированные линкерные молекулы и/или лиганд-связывающие домены. Например, если один конец линкерной молекулы оканчивается аминоконцевым остатком лизина, и лиганд связывается с карбоксиконцевым остатком глутамина, то лиганд-связывающие домены могут быть олигомеризованы с трансглутаминазой.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, включающая в себя последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по данному изобретению.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
1) последовательности, представленной на Фиг.4 или 6;
2) последовательности, которая гибридизуется с последовательностью (1), указанной выше, и которая обладает активностью модулирования рецептора цитокина; и
3) последовательности, которая является вырожденной в результате генетического кода до последовательностей, определенных в (1) и (2) выше.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная нуклеиновая кислота гибридизуется в строгих условиях гибридизации до последовательностей, представленных на Фиг.4 или 6.
Хорошо известно из уровня техники, что оптимальные условия гибридизации могут быть рассчитаны в том случае, если известна последовательность нуклеиновой кислоты. Например, условия гибридизации могут быть определены по содержанию GC в нуклеиновой, кислоте, которая подвергается гибридизации. Описано в Sambrok et. al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Approach. Общая формула для расчета строгости условий, необходимых для достижения гибридизации между молекулами нуклеиновой кислоты определенной гомологии, представляет собой:
Тm=81,5°С+16,6 Log [Na+]+0,41[%G+С]-0,63 (% формамид).
Типично, в условиях гибридизации используют 4-6x SSPE (20x SSPE содержит 175,3 г NaCl, 88,2 г NaH2PO4 Н2О и 7,4 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), растворенной в 1 литре, и рН доведен до 7,4); 5-10x раствора Денхардса (50х раствор Денхардса содержит 5 г фиколла (Ficoll, тип 400, Pharmacia), 5 г поливинилпирролидона и 5 г бычьего сывороточного альбумина/500 мл; 100 мкг-1,0 мг/мл обработанной ультразвуком ДНК лосося/сельди; 0,1-1,0% додецилсульфат натрия; возможно 40-60% деионизированный формальдегид. Температура гибридизации изменяется в зависимости от содержания GC в последовательности нуклеиновой кислоты - мишени, но, как правило, составляет от 42 до 65°С.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложен полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по данному изобретению.
В предпочтительном воплощении данного изобретения кодируемый таким образом полипептид модифицирован путем делеции, добавления или замещения по меньшей мере одного аминокислотного остатка. В идеале, указанная модификация усиливает антагонистическое или агонистическое действие указанного полипептида в отношении ингибирования или активации опосредованной рецептором передачи сигнала в клетке.
Альтернативно или предпочтительно указанная модификация включает в себя использование модифицированных аминокислот при получении рекомбинантных или синтетических форм полипептидов.
Специалисту в данной области техники понятно, что модифицированные аминокислоты включают в себя, в качестве примера, а не ограничения, 4-гидроксипролин, 5-гидроксилизин, N6-ацетиллизин, N6-метиллизин, N6,N6-диметиллизин, N6,N6,N6-триметиллизин, циклогексиаланин, D-аминокислоты, орнитин. Включение модифицированных аминокислот может обеспечить полипептидам благоприятные свойства. Например, включение модифицированных аминокислот может увеличить аффинность полипептида в отношении сайта его связывания, или модифицированные аминокислоты могут обеспечить полипептидам увеличенную стабильность in vivo, таким образом давая возможность для уменьшения эффективного количества терапевтического полипептида, вводимого пациенту.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложен вектор, включающий в себя молекулу ДНК по любому предшествующему аспекту или воплощению данного изобретения.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный вектор предложен для получения полипептида по данному изобретению рекомбинантным способом.
В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный вектор представляет собой вектор экспрессии, адаптированный для экспрессии прокариотических генов.
Прокариотические системы экспрессии хорошо известны в уровне техники и включают в себя векторы, адаптированные для высокоуровневой конститутивной и индуцибельной экспрессии. Системы индуцибельной экспрессии особенно благоприятны в том случае, если рекомбинантный полипептид токсичен для бактериальной клетки. Индукция экспрессии строго регулируется промоторами, чувствительными к различным индукторам (например, изопропилтиогалактозид (IPTG)-индуцибельные). Бактериальные клетки могут расти до стационарной фазы перед индукцией, тем самым уменьшая вредные эффекты токсических полипептидов.
Кроме того, из уровня техники хорошо известно, что некоторые полипептиды сложно получать рекомбинантным способом вследствие, например, нестабильности белка или проблем агрегации. Хорошо известно, что доступны генетически модифицированные бактериальные штаммы, которые имеют мутации в генах (например, бактериальных протеаз), которые облегчают получение нативных и рекомбинантных бактериальных полипептидов.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный вектор представляет собой вектор экспрессии, адаптированный для экспрессии эукариотических генов.
Типично указанная адаптация включает в себя в качестве примера, а не ограничения, последовательности контроля транскрипции (последовательности промотора), которые опосредуют экспрессию. Эти последовательности промотора могут быть клеточно/тканеспецифичными, индуцибельными или конститутивными.
Промотор представляет собой термин, признанный в области техники, и, для ясности, включает следующие признаки, которые приведены исключительно в качестве примера, а не ограничения. Энхансерные элементы представляют собой цис-действующие последовательности нуклеиновой кислоты, часто обнаруживаемые в положении 5' относительно сайта инициации транскрипции гена (энхансеры могут также быть обнаружены в положении 3' относительно последовательности гена или даже могут быть расположены в последовательностях интронов и поэтому независимы от положения). Функция энхансеров в том, чтобы усиливать степень транскрипции гена, с которым этот энхансер связан. Энхансерная активность чувствительна к транс-действующим факторам транскрипции (полипептидам), которые, как было показано, специфически связываются с энхансерными элементами. Связывающая активность факторов транскрипции (описано в Eukaryotic Transcription Factors, by David S. Latchman, Academic Press Ltd., San Diego) чувствительна к множеству сигналов из окружающей среды, которые включают в себя в качестве примера, а не ограничения, метаболиты-посредники (например, глюкоза, липиды), эффекторы окружающей среды (например, свет, тепло).
Промоторные элементы также включают в себя так называемую последовательность ТАТА и последовательности выбора РНК-полимеразы для инициации (RIS), которые действуют для выбора сайта инициации транскрипции. Эти последовательности также связываются с полипептидами, которые действуют, среди прочего, для облегчения выбора инициации транскрипции РНК-полимеразой.
Адаптации также включают в себя селектируемые маркеры и последовательности автономной репликации, которые оба способствуют поддержанию указанного вектора в эукариотической клетке или прокариотическом хозяине. Векторы, которые поддерживаются автономно, называют также эписомными векторами.
Адаптации, которые способствуют экспрессии генов, кодируемых в векторе, включают в себя транскрипцию последовательностей терминации/полиаденилирования. Они также включают в себя внутренние сайты вхождения в рибосому (IRES), которые действуют для максимизации экспрессии генов, кодируемых в векторе, расположенных в бицистроновых или мультицистроновых кассетах экспрессии.
Эти адаптации хорошо известны из уровня техники. В литературе имеется значительное количество публикаций, касающихся создания векторов экспрессии и общей технологии рекомбинантной ДНК. Описано в Sambrook et. al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY и ссылки в ней; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol. Ill IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
В еще одном аспекте данного изобретения предложен способ получения полипептида по данному изобретению, при котором:
1) культивируют клетку, трансформированную или трансфицированную нуклеиновой кислотой или вектором по настоящему изобретению, в условиях, благоприятных для получения указанного полипептида; и
2) очищают указанный полипептид от указанных клеток или культуральной среды.
В предпочтительном способе по данному изобретению указанный вектор кодирует сигнал секреции, и тем самым указанный рекомбинантный полипептид обеспечен таким сигналом секреции для облегчения очистки указанного связывающего агент полипептида.
В еще одном аспекте данного изобретения предложена клетка, трансформированная/трансфицированная вектором или нуклеиновой кислотой по данному изобретению.
Предпочтительно, указанная клетка является эукариотической и выбрана из: клетки грибов; насекомых (например, Spodoptera frugiperda), амфибий; растений; млекопитающих.
Более предпочтительно, указанная клетка является прокариотической и представляет собой клетку Е.coll.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложено применение полипептида по данному изобретению в качестве фармацевтического препарата. Предпочтительно, предложена фармацевтическая композиция, включающая в себя полипептид по данному изобретению. Предпочтительно, указанная фармацевтическая композиция включает в себя носитель, эксципиент и/или разбавитель.
В еще одном воплощении настоящего изобретения указанный полипептид применяют для приготовления лекарства при лечении заболевания, выбранного из группы, состоящей из: акромегалии; гигантизма; дефицита гормона роста (ГР); синдрома Тернера; почечной недостаточности; остеопороза; сахарного диабета; рака; ожирения; инсулинорезистентности; гиперлипидемии; гипертензии; анемии; аутоиммунного и инфекционного заболевания; воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит.
В данном изобретении также предложен способ лечения субъекта человека или животного, при котором указанному субъекту вводят эффективное количество полипептида, фармацевтической композиции или лекарства.
Полипептиды или композиции по данному изобретению могут быть введены любым общепринятым путем, включая инъекцию, или путем постепенной инфузии в течение периода времени. Введение может быть, например, пероральным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриполостным, подкожным, трансдермальным, или представлять собой доставку посредством непатологического генетически модифицированного организма (genetically modified organism, GMO), сконструированного для секреции полипептида.
Фармацевтические композиции, применяемые в вышеупомянутых способах, предпочтительно являются стерильными и содержат эффективное количество полипептида по данному изобретению для получения желаемого ответа в единице массы или объема, подходящей для введения пациенту.
При введении фармацевтические препараты по данному изобретению применяют в фармацевтически приемлемых количествах и в фармацевтически приемлемых композициях. Термин "фармацевтически приемлемый" означает нетоксичное вещество, которое не влияет на проявление биологической активности активных ингредиентов. Такие препараты могут стандартно содержать соли, буферные агенты (например, уксусную кислоту в виде соли; лимонную кислоту в виде соли; борную кислоту в виде соли и фосфорную кислоту в виде соли), консерванты (например, хлорид бензалкония; хлорбутанол; парабены и тимеросал, совместимые носители и, возможно, другие терапевтические агенты).
Композиции могут быть объединены, если желательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или более чем один совместимый твердый или жидкий наполнитель, разбавитель либо инкапсулирующее вещество, которые пригодны для введения человеку. Термин "носитель" означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения.
Фармацевтические композиции могут для удобства быть представлены в виде лекарственной формы и могут быть приготовлены любым способом, хорошо известным в области фармации. Все способы включают в себя стадию объединения активного агента с носителем, который составляет один или более чем один дополнительный ингредиент. В общем композиции готовят путем равномерного и однородного объединения активного соединения с жидким носителем, мелкоизмельченным твердым носителем или обоими и затем, если необходимо, формования продукта.
Композиции, пригодные для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, таблетки, лепешки, каждая из которых содержит определенное количество активного соединения. Другие композиции включают в себя суспензии в водных жидкостях или неводных жидкостях, таких как сироп, эликсир или эмульсия.
Композиции, пригодные для парентерального введения, для удобства включают в себя стерильный водный или неводный препарат полипептидов, который предпочтительно является изотоническим с кровью реципиента. Этот препарат может быть приготовлен в соответствии с известными способами с использованием диспергирующих агентов или увлажнителей и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат также может представлять собой стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут применяться, имеются вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. В дополнение в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные жирные масла. Для этой цели может быть использовано любое мягкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. В дополнение при приготовлении инъецируемых растворов могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Препараты носителя, пригодные для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и другого введения, могут быть обнаружены в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложен способ лечения, при котором животному, предпочтительно человеку, вводят эффективное количество нуклеиновой кислоты или вектора по данному изобретению.
Воплощение данного изобретения далее будет описано только в качестве примера и со ссылкой на следующие чертежи, где:
Фиг.1 иллюстрирует карту плазмиды pTrcHisχ1A1.
Фиг.2 иллюстрирует праймеры, использованные в синтезе тандемных конструкций.
Фиг.3 представляет собой схематическую диаграмму конструкции pTrcHisχ1C1. pTrcHisχ1C2 сконструирован таким же образом, однако используемый прямой праймер представляет собой DiGHNotF, и используемые рестрикционные ферменты представляют собой NotI и HindIII.
Фиг.4 иллюстрирует последовательность ДНК для тандема гормона роста, разделенного тромбин-расщепляемым линкером. Линкерный участок показан курсивом, тогда как тромбин-расщепляемый сайт изображен жирным шрифтом.
Фиг.5 иллюстрирует белковую последовательность для тандема гормона роста, разделенного тромбин-расщепляемым линкером. Линкерный участок показан курсивом, тогда как тромбин-расщепляемый сайт изображен жирным шрифтом.
Фиг.6 иллюстрирует последовательность ДНК для тандема лептина, разделенного тромбин-расщепляемым линкером. Линкерный участок показан курсивом, тогда как тромбин-расщепляемый сайт изображен жирным шрифтом.
Фиг.7 иллюстрирует белковую последовательность для тандема лептина, разделенного тромбин-расщепляемым линкером. Линкерный участок показан курсивом, тогда как тромбин-расщепляемый сайт изображен жирным шрифтом. В этой конструкции возможен расщепляемый линкер.
Фиг.8 демонстрирует окрашенный Кумасси полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блот очищенного ГР-тандема (χ1С1).
Фиг.9 представляет собой данные биологического анализа, полученные для χ1С1, вместе с данными для ГР собственной разработки и приобретенным ГР для сравнения. Активность тандема подобна активности ГР собственной разработки. В каждом случае используемые концентрации тестируемого белка составляли 0; 6,25; 12,5; 25; 50 и 100 нг.
Фиг.10 представляет собой схематическую диаграмму, иллюстрирующую конструкцию pTrcHisχd.
Фиг.11 демонстрирует вестерн-блот SDS-PAGE, на котором было осуществлено разделение белков, экспрессированных клонами клеток E. coli SURE:pTrcHisχ2C1. Ожидаемый размер лептинового тандема составляет приблизительно 37 кДа и при этом размере наблюдается слабая полоса. Основная полоса, тем не менее, приблизительно имеет размер в половину от этого размера. Это свидетельствует о том, что лептиновый тандем экспрессируется, но, наиболее вероятно, расщепляется до одиночных лептиновых доменов.
Материалы и методы
Последовательность, кодирующая РГР в pTrcHisχ1A1 (Фиг.1), была заменена другим геном ГР (остатки 1-191) с получением двух последовательных генов HP, соединенных линкером (G4S)4. Полученная в результате конструкция (pTrcHisχ1C1) была трансформирована в клетки Е. coli SURE, представляющую собой штамм Е. coli с дефицитной рекомбинантной ДНК. Клоны, экспрессирующие белок ГР-(G4S)4-ГР, были идентифицированы путем вестерн-блоттинга с использованием анти-ГР (10А7, lgG1 мыши), обнаруживаемых с помощью антител овцы против антител мыши, связанных с пероксидазой хрена (HRP) (Amersham). С использованием того же самого метода был также сконструирован другой ГР-тандем (ГР-ГР), который лишен линкера (G4S)4 (pTrcHisχ1C2).
ГР-тандемный белок был очищен от клеточных лизатов с использованием аффинной колонки, хелатирующей металлы (смола Probond, Invitrogen) с последующей ионообменной колонкой (Mono Q, Pharmacia).
Эффект ГР-тандемных белков анализировали с использованием общепризнанного биологического анализа (Ross et at., 1997).
Ген лептина изначально клонировали в рНЕАТ, представляющий собой вектор, индуцируемый температурой. Однако для экспрессии в клетках Е. coli SURE ген субклонировали в плазмиду pTrcHis. Затем вводили линкер (G4S)4 и, наконец, второй лептиновый домен встраивали в этот ген с получением конструкции которая будет экспрессировать тандем лептина. Конструкция pTrcHisχ2C1 затем была трансформирована в клетки Е. coli SURE. Экспрессию тандема лептина контролировали вестерн-блотом с использованием антилептиновых антител (Sigma), полученных у кролика, которые обнаруживали при помощи антител против антител кролика, связанных с HRP (Sigma).
Клонирование ГР-тандемов
Для получения фрагмента ДНК, состоящего из сайта рестрикции (NotI или EcoRI) с последующим геном ГР и затем сайтом рестрикции HindIII, использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Его встраивали в pTrcHisχ1A1, который расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами, с получением конструкций χ1C1(ГР-(G4S)4-ГР) и χ1С2(ГР-ГР). Используемые праймеры для ПЦР показаны на Фиг.2, а схема реакции изображена на Фиг.3.
Очистка ГР-тандемов
Индуцированные клетки (ресуспендированные в 20 мМ буфере фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН 7,8) подвергали лизису с использованием комбинации 100 мкг/мл (конечная концентрация) лизоцима яичного белка курицы и ультразвука. Нерастворимый материал удаляли путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 20 минут.
Очищенный клеточный лизат наносили на колонку 5 мл со смолой Probond (Invitrogen), уравновешенную 20 мМ буфером фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 5% глицерина, рН 7,8. Колонку затем промывали десятикратным объемом 20 мМ буфера фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 5% глицерина, рН 6,0. Связанный белок элюировали с использованием 5 мл 20 мМ буфера фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 5% глицерина, 500 мМ имидазола, рН 6,0.
Белок подвергали диализу в течение ночи против низкосолевого буфера (25 мМ TRIS, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин, рН 8,0) и затем центрифугировали для удаления материала в виде частиц. Образец белка затем наносили на колонку Mono-Q (Pharmacia), которую предварительно уравновешивали низкосолевым буфером. После десятикратной промывки колонки низкосолевым буфером связавшиеся белки элюировали 20 объемами колонки, используя градиент от 0М хлорида натрия до 1М хлорида натрия (в 25 мМ TRIS, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин, рН 8,0). Пики на профиле элюции анализировали, используя SDS-PAGE и вестерн-блоттинг.
ГР-тандемный белок затем концентрировали (если требуется) с использованием колонки Amicon Centiprep Y-10.
Чистоту очищенного χ1С1 подтверждали, используя SDS-PAGE с окрашиванием Кумасси и вестерн-блот (Фиг.8). Как только была подтверждена целостность этого образца, χ1С1 подвергали упомянутому ранее общепризнанному биологическому анализу (Ross el al., 1997) (Фиг.9).
Клонирование тандемов лептина
Для получения последовательности ДНК, состоящей из (NheI)-LEPTIN-(NotI)-(XhoI)-(SalI)-STOP-(EcoRI), из pHEATLeptin использовали ПЦР с применением праймеров Lep2TrcFOR и Lep2TrcREV (Фиг.2). Концевые сайты рестрикции вводили путем ПЦР, а внутренние сайты рестрикции уже присутствовали в векторе pHEATLeptin. Полученный продукт ПЦР встраивали в pTrcHisχ1A1 между сайтами рестрикции NheI и EcoRI с получением pTrcHisLeptin.
ПЦР затем использовали для получения (G4S)4-кодирующего линкера, фланкированного сайтами рестрикции NotI и XhoI, причем используемые праймеры представляли собой LepLinkFOR и LepLinkREV (Фиг.2). Его затем встраивали в pTrcHisLeptin между сайтами NotI и XhoI с получением pTrcHisLepLink.
Второй ген лептина, фланкированный сайтами рестрикции XhoI и Sail, был получен путем ПЦР с использованием праймеров Lep2FOR и Lep2REV (Фиг.2). Его встраивали между сайтами рестрикции XhoI и SalI с получением конструкции, которая будет экспрессировать тандем лептина, pTrcHisχ2C1. Этот процесс получения тандема лептина показан на Фиг.10.
Эту плазмиду трансформировали в клетки Е. coli SURE и осуществляли исследование экспрессии, причем визуализацию экспрессии осуществляли, используя вестерн-блот (Фиг.11).
Литература
1. ARGETSINGER, L.S. & CARTER-SU, С. (1996) Growth hormone signalling mechanisms: involvement of the tyrosine kinase JAK2. [Review] [19 refs]. Hormone Research, 45 Suppl1, 22-24
2. CHEN, C., BRINKWORTH, R. & WATERS, M.J. (1997) The role of receptor dimerization domain residues in growth hormone signaling. Journal of Biological Chemistry, 272, 5133-5140.
3. CHEN, W.Y., CHEN, N.Y., YUN, J., WAGNER, Т.Е. & KOPCHICK, J.J. (1994) In vitro and in vivo studies of antagonistic effects of human growth hormone analogs [published erratum appears in J Biol Chem 1994 Aug 12; 269(32):20806]. Journal of Biological Chemistry, 269, 15892-15897.
4. CHEN, W.Y., WHITE, M.E., WAGNER, Т.Е. & KOPCHICK, J.J. (1991) Functional antagonism between endogenous mouse growth hormone (GH) and a GH analog results in dwarf transgenic mice. Endocrinology, 129, 1402-1408.
5. CHEN, W.Y., WIGHT, D.C., MEHTA, B.V., WAGNER, Т.Е. & KOPCHICK, J.J. (1991) Glycine 119 of bovine growth hormone is critical for growth-promoting activity. Molecular Endocrinology, 5, 1845-1852.
6. CHEN, W.Y., WIGHT, D.C., WAGNER, Т.Е. & KOPCHICK. J.J. (1990) Expression of a mutated bovine growth hormone gene suppresses growth of transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87, 5061-5065.
7. CLACKSON, Т., ULTSCH, M.H., WELLS, J.A., & DE VOS, A.M. (1998) Structural and functional analysis of the 1:1 growth hormone:receptor complex reveals the molecular basis for receptor affinity. Journal of Molecular Biology, 277, 1111-1128.
8. CUNNINGHAM, B.C., ULTSCH, M., DE VOS, A.M., MULKERRIN, M.G, CLAUSER, K.R., & WELLS, J.A. (1991) Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule. Science, 254, 821-825.
9. DE VOS, A.M., ULTSCH. M. & KOSSIAKOFF, A.A. (1992) Human growth hormone and extracellular domain of its receptor:crystal structure of the complex. Science, 255, 306-312.
10. FUH, G., CUNNINGHAM, B.C., FUKUNAGA, R., NAGATA, S., GOEDDEL, D.V. & WELLS, J.A, (1992) Rational design of potent antagonists to the human growth hormone receptor. Science, 256, 1677-1680.
11. HANIU, M., ARAKAWA, Т., BURES, E.J., YOUNG, Y., HUI, J.O., ROHDE, M.F., WELCHER, A.A. & HORAN, T. (1998) Human leptin receptor. Determination of disulfide structure and N-glycosylation sites of the extracellular domain. Journal of Biological Chemistry, 273, 28691-28699.
12. HIROIKE, Т., HIGO, J., JINGAMI, H. & ТОН, Н. (2.000) Homology modeling of human leptin/leptin receptor complex. Biochemical & Biophysical Research Communications, 275, 154-158.
13. HUKSHORN, C.J., SARIS, W.H., WESTERTERP-PLANTENGA, M.S., FARID, A.R., SMITH, F.J. & CAMPFIELD, L.A. (2000) Weekly subcutaneous pegylated recombinant native human leptin (PEG-OB) administration in obese men. [see comments]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 85, 4003-4009.
14. KISHIMOTO, Т., TAGA, T. & AKIRA, S. (1994) Cytokine signal transduction. [Review] [92 refs]. Cell, 76, 253-262.
15. LIVNAH, O., STURA, EA., MIDDLETON, S.A., JOHNSON, D.L. JOLLIFFE, LK. & WILSON, I.A. (1999) Crystallographic evidence for preformed dimers of erythropoietin receptor before ligand activation. Science, 283, 987-990.
16. MAAMRA, M., FINIDORI, J., VON LAUE, S., SIMON, S., JUSTICE, S., WEBSTER, J., DOWER & ROSS, R. (1999) Studies with a growth hormone antagonist and dual-fluorescent confocal microscopy demonstrate that the full-length human growth hormone receptor, but not the truncated isoform, is very rapidly internalized independent of Jak2-Stat5 signaling. Journal of Biological Chemistry, 274, 14791-14798.
17. MELLADO, M., RODRIGUEZ-FRADE, J.M., KREMER, L., VON KOBBE, C., DE ANA, A.M., MERIDA, L & MARTINEZ, A. (1997) Conformational changes required in the human, growth hormone receptor for growth hormone signaling. Journal of Biological Chemistry, 272, 9189-9196.
18. ROSS, R.J., ESPOSITO, N., SHEN, X.Y., VON LAUE, S., CHEW, S.L., DOBSON, P.R., POSTEL-VINAY, M.C. & FINIDORI, J. (1997) A short isoform of the human growth hormone receptor functions as a dominant negative inhibitor of the full-length receptor and generates large amounts of binding protein. Molecular Endocrinology, 11, 265-273.
19. SUNDSTROM, M, LUNDQVIST, T., RODIN, J., GIEBEL, L.B., MILLIGAN, D. & NORSTEDT, G. (1996) Crystal structure of an antagonist mutant of human growth hormone, G120R, in complex with its receptor at 2.9 A resolution. Journal of Biological Chemistry, 271, 32197-32203.
20. SYED, R.S., REID, S.W., LI, C., CHEETHAM, J.C, AOKI, K.H., LIU, В., ZHAN, H., OSSLUND, T.D., CHIRINO, A.J., ZHANG, J., FINER-MOORE, J., ELLIOTT, S., SITNEY, K., KATZ, B.A., MATTHEWS, D.J., WENDOLOSKI, J.J. EGRIE, J. & STROUD, R.M. (1998) Efficiency of signalling through cytokine receptors depends critically on receptor orientation. Nature, 395, 511-516.
21. THORNER, M.O., STRASBURGER, C.J., WU, Z., STRAUME, M., BIDLINGMAIER, M., PEZZOLI, S., ZIB K., SCARLETT, J.C. & BENNETT, W.F. (1999) Growth hormone (GH) receptor blockade with a PEG-modified GH (B2036-PEG) lowers serum insulin-like growth factor-l but does not acutely stimulate serum GH. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 84, 2098-2103.
Claims (31)
1. Полипептидный димер, состоящий из лиганд-связывающих доменов лептина (Фиг.7), где указанные домены ковалентно соединены в тандеме гибкой полипептидной линкерной молекулой, отличающийся тем, что указанный полипептидный димер является агонистом, обладающим активностью модулирования рецептора цитокина.
2. Полипептидный димер по п.1, отличающийся тем, что указанная линкерная молекула содержит по меньшей мере один сайт протеолитического расщепления.
3. Полипептидный димер по п.2, отличающийся тем, что указанный сайт расщепления является чувствительным к сывороточной протеазе.
4. Полипептидный димер по п.3, отличающийся тем, что сывороточная протеаза представляет собой тромбин.
5. Полипептидный димер по п.2, отличающийся тем, что указанный сайт расщепления включает последовательность аминокислот LVPRGS или ее модификацию.
6. Полипептидный димер по п.2, отличающийся тем, что указанный сайт расщепления включает последовательность аминокислот SGGGG или ее модификацию.
7. Полипептидный димер по п.2, отличающийся тем, что указанный сайт расщепления включает в себя последовательность аминокислот PGISGGGGGG.
8. Полипептидный димер по п.2, отличающийся тем, что указанный сайт расщепления включает в себя последовательность аминокислот LVPRGSPGISGGGGGG или ее модификацию.
9. Полипептидный димер по п.2, отличающийся тем, что указанный сайт расщепления включает в себя по меньшей мере две копии последовательности аминокислот SGGGG или ее модификации, которые фланкируют указанный сайт расщепления.
10. Полипептидный димер по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что линкер представляет собой полипептид, который состоит из 5-50 аминокислотных остатков.
11. Полипептидный димер по п.10, отличающийся тем, что линкер состоит из 5-50 аминокислотных остатков.
12. Полипептидный димер по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что ликер включает по меньшей мере одну копию пептида Gly Gly Gly Gly Ser (Gly4Ser).
13. Полипептидный димер по п.12, отличающийся тем, что линкер имеет длину 5 аминокислот и состоит из одной копии линкера (Gly4Ser).
14. Полипептидный димер по п.12, отличающийся тем, что линкер имеет длину 10 аминокислот и состоит из двух копий линкера (Gly4Ser).
15. Полипептидный димер по п.12, отличающийся тем, что линкер имеет длину 15 аминокислот и состоит из трех копий линкера (Gly4Ser).
16. Полипептидный димер по п.12, отличающийся тем, что линкер имеет длину 20 аминокислот и состоит из 4 копий линкера (Gly4Ser).
17. Полипептидный димер по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что полипептид представляет собой слитый белок и является агонистом, обладающим активностью модулирования рецептора цитокина.
18. Полипептидный димер по п.1, обладающий активностью модулирования рецептора цитокина, для применения в качестве лекарственного средства.
19. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты (Фиг.6), которая кодирует полипептидный димер, обладающий активностью модулирования рецептора цитокина, по любому из пп.1-17.
20. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептидный димер, обладающий активностью модулирования рецептора цитокина, и включающая в себя последовательность, выбранную из группы, состоящей из
1) последовательности, представленной ДНК для тандема лептина (Фиг.6), соединенного линкером;
2) последовательности, которая гибридизуется с последовательностью (1), указанной выше, и которая кодирует полипептидный димер, сохраняющий активность модулирования рецептора цитокина; и
3) последовательности, которая является вырожденной в силу вырожденности генетического кода относительно последовательности, определенной в (1) выше, и которая кодирует полипептидный димер, сохраняющий активность модулирования рецептора цитокина.
21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.20, которая гибридизуется в строгих условиях гибридизации с последовательностью, представленной ДНК для тандема лептина (Фиг.6), соединенного линкером.
22. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептидный димер по п.1, обладающий активностью модулирования рецептора цитокина, для применения в качестве лекарственного средства.
23. Полипептидный димер, обладающий активностью модулирования рецептора цитокина, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по п.20 или 21.
24. Вектор экспрессии, включающий молекулу ДНК, отличающийся тем, что указанная молекула ДНК кодирует полипептидный димер, обладающий активностью модулирования рецептора цитокина, по п.23.
25. Вектор по п.24, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой вектор экспрессии, адаптированный для экспрессии прокариотических или эукариотических генов.
26. Вектор по п.24 или 25, отличающийся тем, что указанный вектор кодирует сигнал секреции, и тем самым указанный рекомбинантный полипептид обеспечен таким сигналом секреции, для облегчения очистки указанного полипептида.
27. Способ получения полипептида по п.1, при котором 1) культивируют клетки, трансформированные или трансфицированные нуклеиновой кислотой по любому из пп.19-21 или вектором по пп.24-26, в условиях, благоприятных для получения указанного полипептида; и 2) очищают указанный полипептид от указанных клеток или культуральной среды.
28. Клетка-хозяин, трансформированная/трансфицированная нуклеиновой кислотой по любому из пп.19-21 или вектором по любому из пп.24-26.
29. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью модулирования рецептора цитокина, отличающаяся тем, что она содержит полипептидный димер по любому из пп.1-17 или 23, или нуклеиновую кислоту по любому из пп.19-21 и возможно носитель, эксципиент и/или разбавитель.
30. Применение полипептидного димера по п.1, обладающего активностью модулирования рецептора цитокина, для приготовления лекарства для лечения заболевания, где указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из гигантизма, остеопороза, сахарного диабета, рака, ожирения, инсулинорезистентности, гиперлипидемии, гипертензии, анемии, аутоиммунного заболевания, воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит.
31. Применение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидный димер по п.1, обладающей активностью модулирования рецептора цитокина, для приготовления лекарства для лечения заболевания, где указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из гигантизма, остеопороза, сахарного диабета, рака, ожирения, инсулинорезистентности, гиперлипидемии, гипертензии, анемии, аутоиммунного заболевания, воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0201679.8A GB0201679D0 (en) | 2002-01-25 | 2002-01-25 | Polypeptide variants |
GB0201679.8 | 2002-01-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004121969A RU2004121969A (ru) | 2005-05-10 |
RU2325400C2 true RU2325400C2 (ru) | 2008-05-27 |
Family
ID=9929713
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004121969/13A RU2325400C2 (ru) | 2002-01-25 | 2003-01-24 | Мультимеры рецептор-связывающих лигандов |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20050214762A1 (ru) |
EP (1) | EP1468020A2 (ru) |
JP (1) | JP2005529583A (ru) |
KR (1) | KR20040096531A (ru) |
CA (1) | CA2510751A1 (ru) |
GB (1) | GB0201679D0 (ru) |
MX (1) | MXPA04007160A (ru) |
RU (1) | RU2325400C2 (ru) |
WO (1) | WO2003062276A2 (ru) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008067599A1 (en) * | 2006-12-04 | 2008-06-12 | Apollo Life Sciences Limited | Isolated leptin and adiponectin molecules and chimeric molecules thereof |
KR100980457B1 (ko) | 2008-06-27 | 2010-09-07 | 한국생명공학연구원 | 대장균에서 활성형 인간 인터루킨-6의 생산 및 정제방법 |
SG184298A1 (en) * | 2010-03-31 | 2012-11-29 | Agency Science Tech & Res | Conjugate of magnetic particle and surface modifier linked through cleavable peptide bond |
WO2011123683A2 (en) * | 2010-04-02 | 2011-10-06 | University Of Rochester | Protease activated cytokines |
KR101853405B1 (ko) | 2010-10-20 | 2018-05-02 | 주식회사 티움바이오 | 인자 ix 활성을 갖는 융합 단백질 |
GB201120634D0 (en) * | 2011-11-30 | 2012-01-11 | Univ Sheffield | Adjuvant polypeptide |
CN112142855A (zh) * | 2012-05-18 | 2020-12-29 | 爱德迪安(北京)生物技术有限公司 | 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用 |
CN104870477B (zh) | 2012-10-23 | 2018-10-09 | 爱默蕾大学 | Gm-csf和il-4轭合物、组合物以及与其相关的方法 |
CA3029813A1 (en) | 2016-06-13 | 2017-12-21 | Torque Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for promoting immune cell function |
EP3678701A4 (en) | 2017-09-05 | 2021-12-01 | Torque Therapeutics, Inc. | THERAPEUTIC PROTEIN COMPOSITIONS AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING THEREOF |
EP3802619A1 (en) | 2018-06-08 | 2021-04-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Peptidic linker with reduced post-translational modification |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2171392T3 (es) * | 1990-08-29 | 2002-09-16 | Ct Hospitalier Regional De Nan | Poliligandos de proteina unidos a un nucleo de proteina estable. |
US5525491A (en) * | 1991-02-27 | 1996-06-11 | Creative Biomolecules, Inc. | Serine-rich peptide linkers |
EP0586549B1 (en) * | 1991-05-10 | 2000-09-20 | Genentech, Inc. | Selecting ligand agonists and antagonists |
US6037329A (en) * | 1994-03-15 | 2000-03-14 | Selective Genetics, Inc. | Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment |
DE19547933A1 (de) * | 1995-12-22 | 1997-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Multimere Formen von IL-16, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung |
WO1999052877A1 (en) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Smithkline Beecham Corporation | Receptor ligands |
US7300774B1 (en) * | 1999-12-09 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands |
CA2354846A1 (en) * | 1998-12-23 | 2000-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of enhancing the biological activity of ligands |
-
2002
- 2002-01-25 GB GBGB0201679.8A patent/GB0201679D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-01-24 EP EP03702702A patent/EP1468020A2/en not_active Withdrawn
- 2003-01-24 WO PCT/GB2003/000253 patent/WO2003062276A2/en active Application Filing
- 2003-01-24 MX MXPA04007160A patent/MXPA04007160A/es unknown
- 2003-01-24 KR KR10-2004-7011435A patent/KR20040096531A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-01-24 CA CA002510751A patent/CA2510751A1/en not_active Abandoned
- 2003-01-24 US US10/502,344 patent/US20050214762A1/en active Pending
- 2003-01-24 RU RU2004121969/13A patent/RU2325400C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-01-24 JP JP2003562153A patent/JP2005529583A/ja active Pending
-
2006
- 2006-11-13 US US11/595,991 patent/US20070054364A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LIESCHKE G.J., RAO P.K., GATELY M.K., MULLIGAN R.C. Bioactive murine and human interleukin-12 fusion proteins which retain antitumor activity in vivo. Nat. Biotechnol. 1997 Jan; 15(1): 35-40. WEICH N.S. et al. Interleukin-3/erythropoietin fusion proteins; in vivo effects on hematopoietic cells. Exp. Hematol. 1993 May; 21(5):647-55. LIESCHKE G. J. et al.Bioactive murine and human interleukin-12 fusion proteins which retain antitumor activity in vivo. Nature biotehnology. 1997 Jan.Vol.l5. 35-40. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2003062276A3 (en) | 2003-10-16 |
US20070054364A1 (en) | 2007-03-08 |
JP2005529583A (ja) | 2005-10-06 |
EP1468020A2 (en) | 2004-10-20 |
GB0201679D0 (en) | 2002-03-13 |
RU2004121969A (ru) | 2005-05-10 |
MXPA04007160A (es) | 2005-03-31 |
WO2003062276A2 (en) | 2003-07-31 |
US20050214762A1 (en) | 2005-09-29 |
CA2510751A1 (en) | 2003-07-31 |
KR20040096531A (ko) | 2004-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20070054364A1 (en) | Polypeptide variants | |
US8173782B2 (en) | Fusion protein comprising growth hormone and growth hormone receptor | |
US20090239801A1 (en) | Modified Fusion Polypeptides | |
US20030187224A1 (en) | Chimeric OPG polypeptides | |
US5643749A (en) | Soluble interferon α-receptor, its preparation and use | |
US7485713B2 (en) | Polypeptides comprising growth hormone receptor extracellular domain and glycosylphosphatidylinositol | |
AU2002334161A1 (en) | Chimeric glycosylphosphatidylinositol containing peptides | |
RU2340628C2 (ru) | Слитый белок, ингибирующий рецепторную передачу сигнала гормона роста (варианты), способ его получения и очистки и фармацевтическая композиция на его основе | |
GB2380735A (en) | GPI-anchored proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL: 15-2008 FOR TAG: (57) |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100125 |