SK280114B6

SK280114B6 - Mutantný hil-4 proteín a terapeutické činidlo túto

Info

Publication number: SK280114B6
Application number: SK554-94A
Authority: SK
Inventors: Walter Sebald
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 1991-11-13
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 1999-08-06
Also published as: JP3470970B2; DE59209196D1; ATE163196T1; KR100276410B1; NO941681L; WO1993010235A1; DK0613499T4; JPH07501522A; GR3026600T3; CZ283467B6; ES2112340T5; DE4137333A1; US5723118A; EP0613499B1; AU2928292A; CA2123315C; SK55494A3; CZ118594A3; HU217326B; DK0613499T3

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka hIL-4 mutantných proteínov a terapeutických činidiel, ktoré sú antagonistami alebo čiastočnými antagonistami ľudského interleukínu-4 alebo ho obsahujú.

Doterajší stav techniky

V súčasnosti trpia široké vrstvy obyvateľstva na alergie. Je možné očakávať stúpajúce znečistenie vzduchu a stúpajúci počet do prostredia difundujúcich, alergie vyvolávajúcich substancii, vďaka ktorý m bude v budúcnosti počet ochorení ešte ďalej stúpať. Preto je nevyhnutné vyvinúť lieky, ktoré môžu zasiahnuť do priebehu alergického procesu.

Ľudský interleukín-4 (hIL-4) je jeden z mnohých cytokinov, ktoré indukujú a koordinujú proliferáciu, zretie, prežívanie a diferenciáciu lymfoidných a myeloidných buniek (Arai, K. I., Lee, F., Miyajima, A., Miyatake, S., Arai, N. and Yokota, T., 1990 Annu. Rev. Biochem. 59, 783-836; Finkelman, F. D., Holmes, J., Katona, I. M., Urban, J. F., Beckmann, M. P., Park, L. S., Schooley, K. A., Coffman, R. L., Mosmann, T. R. a Paul, W. E. 1990 Annu. Rev. Immunol. 8., 303-333; Yokota, T., Arai, N., De Vrieš, J., Spits, H., Banchereau, J., Zlotnik, A., Rennick, D., Howard, M., Takebe, Y., Miyatake, S., Lee, F. a Arai, K. I. 1988 Immunol. Rev. 102, 137-187). Hlavne sa hIL-4 podieľa na IgE - sprostredkovaných imunoreakciách a priamo urýchľuje proliferáciu lymfocytov a aktivovaných T-buniek. Bolo možne identifikovať vysoko afinitný IL-4 - receptorový proteín s Mr 140 000, ktorý je podľa svojej cDNA sekvencie tvorený 800 aminokyselinovými zvyškami (Idzerda, R. L., March, C. J., Mosley, B., Lymna, S. D., Vanden Bos, T., Gimpel, S. D., Din, W. S., Grabstein, K. H., Widmer, M. B., Park, L. S., Cosman, D. a Beckmann, M. P. 1990 J. Exp. Med. 171, 861-873).

Patrí do skupiny receptorov opísaných v poslednom čase, ktoré sú označované ako superrodina hematopoietín - receptorov (Cosman, D., Lyman, S. D., Idzerda, R. L., Beckmann, M. P., Park, L. S., Goodwin, R. G. a March, C. J. 1990 Trends Biochem. Sci. 15, 265-270).

Aminokyselinová sekvencia IL-4 je tvorená 129 zvyškami, vzhľadom na klonovanú cDNA (Yokota, T., Otsuka,

T., Mosmann, T., Banchereau, J., DeFrance, T., Blanchard,

D. , De Vrieš, J. E., Lee, F. a Arai, K. I. 1986 Proc Natl. Acad. Sci, USA 83, 5894-5898). cDNA je exprimovaná v

E. coli (Van Kimmenade, A., Bond, M. W., Schumacher, J. H., Laquoi, C and Katelein, R. A. 1988 Eur. J. Biochem. 173, 109-114; Jayaram, B. Bevos, R., Guisez, A. a Fiers, W. 1989 Gene 79, 345-354 ) a kvasinkách (Solari, R., Quint, D., Obray, H., McNamee, A., Bolton, E., Hissey, P., Champion, B., Zanders, E., Chaplin, A., Coomber, B., Watson, M., Roberts, B. a Wcir, M. 1989 Biochem. J. 262, 897-908). Z týchto zdrojov môže byť získaný rekombinantný IL-4 s vysokou biologickou aktivitou.

V publikácii Febs. Letter, Bd. 286, č. 1, 2, júl 1991, Amsterdam NL, 58 - 60 je opísaný mutantný hIL-4 proteín, ktorý má v aminokyselinovej sekvencii aminokyselinu tyrozín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 124, nahradenú kyselinou asparágovou. Žiadne farmakologické účinky však pri tomto proteíne nie sú opísané.

Úloha interleukínu-4 v alergických procesoch umožňuje sa domnievať, že substancie, ktoré inhibujú procesy sprostredkované interleukínom-4 alebo konkurujú s hIL-4, prerušia reakčný reťazec, spôsobujúci chorobu.

Úlohou vynálezu preto je nájdenie terapeutického prostriedku, ktorého aktívnou podstatnou časťou sú antagonisty alebo parciálne agonisty ľudského interleukinu-4.

V poslednom čase je už známa monoklonálna protilátka, ktorá má proti ľudskému interleukínu-4 antagonistické vlastnosti (Coffman, R. L., De Vrieš, J. E., Schering Biotech Corp., USA, EP 327283 Al). Táto protilátka obsahuje Fab-fragment a je produkovaná hybridómovou bunkovou líniou človek - človek. Tiež hybridómová línia zo slezinových buniek proti (ne)-glykozylovanému ľudskému IL-4 imunizovanej krysy produkuje monoklonálne protilátky hIL-4 (Abrams, J. S.: Chretien, L, Lee, F. D., Pearce, M.

K., Schering Biotech Corp., USA, EP 314402 A2).

Podstata vynálezu

Uvedená úloha je podľa predloženého vynálezu vyriešená nájdením mutantného hIL-4 proteínu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde jedna až tri aminokyseliny, vyskytujúce sa v ňom v polohách 121, 124 alebo 125 sú nahradené inou prirodzenou aminokyselinou alebo je aminokyselinová sekvencia ukončená v jednej z týchto polôh, s výnimkou muteínu, kde je tyrozín v polohe 124 nahradený kyselinou asparágovou.

Výhodný je mutantný hIL-4 proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde aminokyselina tyrozín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 124, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou s výnimkou kyseliny asparágovej, výhodne glycínom.

Ďalej je výhodný mutantný hIL-4 proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde aminokyselina arginín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 121, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou, výhodne kyselinou asparágovou.

Rovnako je výhodný mutantný hIL-4 proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde aminokyselina serín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 125, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou, výhodne kyselinou asparágovou.

Ďalej je predmetom predloženého vynálezu terapeutické činidlo na ošetrenie alergických procesov, ktoré obsahuje:

a) mutantný hIL-4 proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde jedna až tri aminokyseliny, vyskytujúce sa v polohách 121, 124 alebo 125, sú nahradené inou prirodzenou aminokyselinou alebo je aminokyselinová sekvencia skončená v jednej z týchto polôh a

b) fyziologicky prijateľný nosič.

Takto sú poskytnuté terapeutické prostriedky, ktoré sú antagonistami alebo parciálnymi agonistami hIL-4 alebo tieto obsahujú a vyznačujú sa tým, že antagonisty alebo čiastočné agonisty sú hIL-4 mutantné proteíny. Voľba terapeutických prostriedkov iná tú výhodu, že „genetickým,, inžinierstvom je možné vyrobiť cielené proteíny, ktoré vďaka svojej podobnosti s divokým typom hlL-4 môžu súperiť v obsadení hIL-4 receptorov.

Ďalej je úlohou vynálezu pripraviť hIL-4 mutantné proteíny a nájsť spôsob ich prípravy.

hIL-4 je možné vyrobiť ako rekombinantný proteín (rhIL-4) génovou technológiou, napr. v E. coli. Takto vytvorený proteín je možné solubilizovať, renaturovať a izolovať. rHL-4 potom má vysokú špecifickú biologickú aktivitu, ktorú je možné stanoviť napr. meraním DNA-syntézy (proliferácia aktivovaných T-buniek alebo CD23 expresia v aktivovaných B-bunkách (pozri napr. Kruse N. a spol. 1991

SK 280114 Β6

FEBS Lett. 286, 58-60; Kikutani H. a spol. 1986 Celí 47, 657-665).

V súlade s vynálezom bol teraz navrhnutý spôsob, ktorým je možné produkovať mutantné proteíny hIL-4-divokého typu, ktoré majú vlastnosti hIL-4 antagonistov alebo parciálnych hIL-4 agonistov. Hlavne antagonisty hIL-4 poskytujú možnosť špecificky potláčať účinok hIL-4.

Na tento účel sa

- cDNA obsahujúca DNA-oblasť, ktorá kóduje maturovanú oblasť hIL-4, podrobí cielenej oligonukleotidovej mutagenéze (miestne riadená mutagenéza) tak, že sa v požadovanej polohe (polohách) exprimuje zvolená iná z možných prirodzených aminokyselín, alebo sa preruší stop-kodónom polypeptidový reťazec,

- DNA-oblasť, kódujúca mutovanú maturovanú oblasť hlL-4 sa integruje do expresného vektora,

- vytvorený hybridný vektor sa inzertuje do E. coli a

- hIL-4-mutantný proteín sa exprimuje a prípadne izoluje.

Kvôli vytvoreniu cDNA, ktorá obsahuje DNA-oblasť, kódujúcu maturovanú oblasť hIL-4 alebo maturované oblasti hIL-4, je možné sa obrátiť na prácu: Yokota, T., Otsuka, T., Mosmann, T., Banchereau, J., DeFrance, T., Blanchard, D., De Vrieš, J. E., Lee, F. a Arai, K. I. (1986) Proc Natl. Acad. Sci, USA 83, 5894-5898 a tam uvedenú literatúru. V uvedených súvislostiach je pod výrazom cDNA, ktorá kóduje maturovanú oblasť hIL-4 tiež zahrnutá cDNA, ktorá pri takmer rovnakom počte párov báz predstavuje konkrétne v uvedenom stave techniky mutanty uvedenej cDNA, pokiaľ sú tieto mutanty hIL-4 antagonisty alebo parciálne agonisty hIL-4.

Číslovanie maturovanej oblasti hIL-4 kódujúcich DNA-oblasti je vykonané podľa Garra C. a spol. (Biochemistry 1991 30, 1515-1523).

cDNA, ktorá kóduje maturovanú oblasť hIL-4, môže byť získaná vyštiepením EcoR/BamHI-fragmentu génovou technológiou vyrobených cDNA (napr. od British Bio-Technology Ltd., Oxford, Anglicko). DNA-fragment sa integruje po pridaní syntetických oligonukleotidov, napr. 5'-CATGCACAAGTGCGAT a 5'-ATCGCACTTGTG, ktoré obsahujú prvé 4 aminokyselinové kodóny interleukínu-4 a ďalej štartovací kodón pre metionín, medzi expresný vektor, napríklad medzi Ncil- a BamHI- namiesto štiepenia expresného vektora R^T3 pRC 109 (Weigel, U., Meyer, M. a Sebald, W. (1989) Eur. J. Biochem. 180, 295-300 ).

Miestne riadená mutagenéza môže byť vykonaná podľa Kramera a spol. (Nucleic Acids Research (1984) 12, 9441 -9455; Celí (1984) 38, 879-887 a Boehringer - Mannheim -

- Prospekt, Biochemicals for Molecular Biology (1987) 35 etc., pozri tiež Weigel, U., Meyer, M. a Sebald, W. (1989) Eur. J. Biochem. 180, 295-300. Na mutagenézu použitý oligopeptid môže obsahovať asi 6 až 10 báz a asi 6 až 10 báz pod ňou (nimi) môže byť zmenených.

Pre odborníka je tiež zrejmé, ako vyštiepiť mutovanú maturovanú oblasť hIL-4 kódujúcu DNA-oblasť z vektora, integrovať ju do expresného vektora, potom inzertovať do E. coli, ako aj exprimovať hIL-4 mutantné proteíny a tiež ako vykonať ich fakultatívnu izoláciu (McCarthy a spol.: Gene 1986 41, 201-206; Kato a spol.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985 130, 692-699), pričom sú možné modifikácie podľa práce: Weigel, U., Meyer, M. a Sebald, W. 1989 Eur. J. Biochem. 180, 295-300.

Podľa špeciálneho vyhotovenia spôsobu podľa vynálezu sa do cDNA, ktorá obsahuje DNA-oblasť, ktorá kóduje maturovanú oblasť hIL-4, inkorporuje DNA pre iniciátor-metionín predtým, ako sa vykoná cielená oligonukleotidová mutagenéza.

Podľa ďalšej špeciálnej formy vyhotovenia sa môže DNA-oblasť, ktorá kóduje mutovanú maturovanú oblasť hIL-4, vystrihnúť z cDNA-mutantu ako nCoI-BamHI-fragment.

Výhodne sa pre expresiu použije teplotou regulovaný expresný vektor, napríklad pILA502 (bez naľavo sa nachádzajúceho lambda - promótora a polylinkéra) a/alebo zvyčajný kmeň E. coli ako hostiteľ, napríklad JM103 (recA-). Pri pILA502 porovnaj s prácou Schaudera a spol. (Gene 1987 52, 279-283). Ďalšie vhodné expresné systémy je možné získať od Pharmacia (Prokaryotic Gene Fusion Vectors). Kmeň E. coli JM103 je možné tiež pripadne získať od fy Pharmacia.

Podľa ďalšieho spôsobu vyhotovenia sa vynález tiež týka hIL-4-mutantu divokého typu, v ktorom je v oblasti v polohe 124 Tyr vymenený za Asp.

Ďalej je vynález bližšie vysvetlený dvoma príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 cDNA, ktorá kóduje maturovanú oblasť hIL-4 a počiatok metionínu, sa podrobí cielenej oligonukleotidovej mutagenéze podľa Kramera a spol. Syntetický oligonukleotid obsahuje 6 báz pred a po vymenenom nukleotide a bol vyrobený pomocou DNA-syntetizátora (Applied Biosystems, Modeli 380).

Mutovaným miestom bola poloha 124 v C-terminálnej, pravdepodobne d-helikálnej oblasti (polohy 110 až 129). Pritom bol Tyr zamenený za Gly. Získaná mutácia bola overená sekvenčnou analýzou jednoreťazcovej bakteriofágovej DNA. Mutovaná cDNA bola vyštiepená ako NcoI/BamHI-fragment z dvojreťazcovej vírusovej DNA a kombinovaná s teplotné regulovaným expresným vektorom, ktorý zodpovedal pILA502 s tou výnimkou, že naľavo sa nachádzajúca lambda - promótor a polylinkér chýbali. Ako hostiteľ bol použitý recA- derivát kmeňa E. coli JM103. Integrovaná hIL-4-cDNA bola sekvenovaná s cieľom overiť mutáciu. Potom bol kmeň použitý na expresiu muteínu.

Po expresii a izolácii sa ukázalo, že mutein (Y124G) sa viaže s nezmenenou afinitou na receptor hIL-4. Aj tak maximálna indukovaná proliferácia aktivovaných periférnych T-buniek je len 10 až 20 % proliferáciou indukovaných hIL-4-divokého typu. Toto ukazuje, že mutein Y124G má vlastnosti parciálneho agonistu.

Príklad 2

Opakuje sa príklad 1, ale v polohe 124 sa exprimuje Asp namiesto Tyr. Izolovaný mutein Y123D nemá ani pri koncentrácii 1 TM žiadnu aktivitu oproti aktivovaným periférnym T-bunkám. Potláča však aktivitu hIL-4-divokého typu s inhibičnou konštantou Ki asi 600 pM. Toto ukazuje, že mutein Y124D má vlastnosti antagonistu. Mutein Y124D má malú zvyškovú aktivitu pri indukcii CD23 na aktivované B-bunky. Maximálne dosiahnuteľná indukcia však je len asi 5 % indukcie dosahovanej hIL-4-divokého typu. Aktivita hIL-4-divokého typu sa v tomto systéme potláča muteínom Y124D s inhibičnou konštantou Ki asi 800 pM. Mutein Y14D mal v B-bunkovom systéme tiež vlastnosti veľmi slabého agonistu.

Príklad 3

Opakuje sa príklad 1 s tým rozdielom, že sa v polohe 121 exprimuje Asp namiesto Arg. Izolovaný mutein má ne zmenenú väzbu na hIL-4 receptor. Maximálne indukovateľná proliferácia aktivovaných T-buniek však je len asi 30 % proliferácie indukovatcľncj hIL-4-divokého typu. Toto ukazuje, že muteín R 121 D má vlastnosti parciálneho agonistu.

Príklad 4

Opakuje sa príklad 1 s tým rozdielom, že sa v polohe 125 exprimuje Asp namiesto Ser. Izolovaný mutein S 125 D sa viaže s nezmenenou afinitou na receptor pre hIL-4. Maximálne indukovateľná proliferácia aktivovaných periférnych T-buniek však je len asi 35 % proliferácie indukovateľnej hIL-4-divokého typu.

Testy účinku hIL-4 - mutantného proteínu

Pokusy na hodnotenie patologického modelu vyvolaného IL-4 sa vykonávajú nasledujúcim spôsobom:

Zvieratá

Na tento výskum sa použijú dospelé samičky opice cynomolgus (Macaca fasicularis, Charles River Primáte Imports, Boston, Mass.), vážiace približne 4 až 6 kg. Všetky zvieratá použité v tomto výskume, majú bežnú kožu a respiračnú citlivosť k proteínovému extraktu Ascaris suum. Všetky zvieratá sú vo výbornom zdravotnom stave, v krvnom obehu majú zvyčajný počet leukocytov a majú bežný chemizmus krvi. Zvieratá sú umiestnené jednotlivo v priestoroch s riadeným prostredím v otvorených klietkach a dostávajú jedlo dvakrát denne a vodu ad libitum. Všetky zvieratá boli držané bez stravy počas približne 12 hodín pred prvým dňom začatia výskumu.

Reakcia kože na IL-4

Pre každý pokus sa zvieratá anestetikujú intramuskulámou injekciou hydrochloridu ketamínu (Ketast, 10 mg/kg). Chrbtová časť každého zvieraťa sa vystrihá a vyčistí 70 % alkoholickým roztokom betadínu. IL-4 alebo mutantný IL-4 (10 pg), alebo vehikulum (0,2 % ľudské albumínové sérum, HSA) sa injikuje podkožné do chrbta zvierat v objeme 0,1 ml s použitím 1 ml tuberkulínovej striekačky. Miesta vpichu sú od seba vo vzdialenosti najmenej 10 cm a označené nezmazateľným značkovačom. Vzorky tkaniva pre biopsiu sa získajú s použitím 6 mm odberového nástroja pre biopsiu a vzorky sa umiestnia v (OTC) a zmrazia v kvapalnom dusíku. Biopsia sa vykonáva v intervale 0, 4, 8 a 24 hodín po injekcii.

Systémová reakcia na IL-4 alebo mutantný IL-4

IL-4 alebo mutantný IL-4 sa podáva subkutánne dvakrát denne (približne po 10 - 12 hodinách) po štyri po sebe nasledujúce dni v objeme 0,1 ml/kg a dávke 0, 2,5, 25 alebo 250 pgv/kg v celkovej dennej dávke 0, 5, 50 a 500 pg/kg v danom poradí. Periférna krvná vzorka sa každému zvieraťu odoberá pred prvou injekciou vehikula alebo IL-4 a/alebo mutantného IL-4 na začiatku každého dňa výskumu a pri alikvótoch sa analyzuje na celkový počet krvných buniek a ich diferencie, cytometriou sa analyzujú periferálne mononukleáme krvné bunky so značeným povrchom. Zvyšok krvných vzoriek sa odstredí a alikvóty plazmy sa skladujú pri -70 °C kvôli následným analýzam hladiny chemokínu.

Príprava IL-4

Lyoftlizovaný rekombinantný ľudský IL-4 (E. coli) sa rekonštituuje v sterilnom ľudskom albumínovom sére s koncentráciou 0,2 % (Baxter Healthcare Corp., Glendale, CA) pri skladovacej koncentrácii 2,5 mg/ml. Prípravok IL-4 neobsahuje endotoxíny, ako sa zistilo pomocou testu lyzátu Limulus amoebocyte, ktorý preukázal, že hladina endotoxínu je menej ako 0,2 endotoxínových jednotíek/ml, čo je limitná citlivosť testu.

Chemizmus imunohistológic

Pripravené zmrazené vzorky sa nechajú do vyrovnania s teplotou miestnosti, vysušia sa na vzduchu a stabilizujú sa v acetóne pri 4 °C počas 5 minút. Rezy sa umiestnia na 5 minút do 10 mM PBS s 0,1 % BSA. Lokalizácia VCAM-1 sa vykonáva s použitím C313.3 , monoklonovanou protilátkou ľudského VCAM-1, ktorá bola získaná od M E. Gerritsena z Bayer Corporation. Irelevantný, vhodný imunoglobulín, ktorý bol rovnako získaný od M. E. Gerritsena z Bayer Corporation, sa vo vhodnej koncentrácii použije ako látka pre porovnávaciu kontrolu. Endogénny biotín sa blokuje s použitím blokovacej súpravy Vector Biotin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Jednotlivé sekcie sa inkubujú 1,5 hodiny pri teplote miestnosti vo vlhkej komore s indikovanými antisérami rozpustenými v PBS s koncentráciou 0,1 % BSA a 1 % normálneho králičieho séra. Po trojitom premytí PBS sa rezy vyfarbia pomocou súpravy Vector ABC Elite v súlade s pokynmi na použitie a konjugát protilátky sa detekuje inkubáciou rezov v 3-amino-9-etylkarbazol/peroxid vodíka (súprava AEC substrát, Vector). Rezy sa starostlivo premyjú 0,1 M acetátovým pufrom, premyjú sa destilovanou vodou a upevnia v Lemerovej AQUQ-MOUNT (Lemer Laboratories, Pittsburgh, PA).

Vyhodnotenie

Vzorky sú vyhodnotené dvoma nezávislými pozorovateľmi s použitím slepého pokusu stupnicou medzi 0 a 3+, umožňujúcou odhad tak intenzity, ako i distribúcie vyfarbenia. Systém vyhodnotenia pre expresiu VCAM-1, ktorý je založený na systéme pôvodne opísanom autormi Brisco a iní (13), je nasledujúci: 0 absencia alebo slabé vyfarbenie nemnohých ciev, 1+ slabé sfarbenie niekoľkých ciev, 2+ vyfarbenie strednej intenzity' väčšiny ciev, 3+ intenzívne vyfarbenie väčšiny ciev. Krvné cesty boli identifikované v sérii sekcií vyfarbených kvôli stanoveniu von Willebrandovho faktora (polyklonovaný králičí antihumánny VWF, Dakoplatts, Carpinteria, CA).

Hematológia

Analýzy počtu erytrocytov, hematokritov, počtu leukocytov a počtu doštičiek sa vykonávajú na heparizovanej krvnej vzorke s použitím krvného analyzéra Serono 9000 (Baker Diagnostics, Allentown, PA). Rozdiely v leukocytoch boli hodnotené rýchlym stanovením (Diff-Quick) vyfarbených krvných škvŕn, kde je spočítané celkové množstvo dvoch stoviek buniek a percentá každého typu buniek sú zaznamenané.

Prietoková cytometria

Analýza povrchového značenia periférnych mononukleámych krvných buniek (PBMC) sa vykonáva nasledujúcim spôsobom. Vzorka 4 ml heparinizovanej krvi sa rozpustí v Hankovom rovnovážnom soľnom roztoku (HBSS, bez Mg++ alebo Ca++), prenesie sa do 4 ml Percollu (s hustotou 1.070 gm/ml). Skúmavky sa centrifugujú pri

1800 otáčkach za minútu (Beckman GS-6R) počas 20 minút pri teplote 24 °C. Vrstva obsahujúca lymfocyt sa odsaje a centrifuguje pri 1100 otáčkach za minútu počas 10 minút. Výsledný bunkový koláč sa opäť suspenduje v 6 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanmi (PBS), obsahujúcom 0,1 % azidu a 5 % kozieho séra. Alikvóty 1 ml sa použijú na analýzu povrchového značenia buniek, ako sa opisuje nižšie.

Protilátky proti CD 2, CD 4, CD 8, CD 1 lb, CD 16, CD 25, CD 49 a HLA-DR (R&D Systems, Minneapolis, MN) sa použijú pre analýzy prietokovou cytometriou. Alikvóty 20 μΐ značených protilátok sa inkubujú s 1 ml alikvotnú bunkovej suspenzie v tme počas 60 minút pri teplote 4 °C a vzorky sa centriíúgujú (1000 otáčok za minútu, 10 minút pri teplote 4 °C). Koláče sa premyjú trikrát 1 ml PBS obsahujúcim 0,1 % azidu a 5 % kozieho séra, potom sa vykonáva analýza FAC.

Chemokínový test (MCP-1)

Na vzorkách plazmy, získaných počas každej štúdie, sa analyzuje hladina MCP-1 špecifickou ELISA, ako bolo prv opísané (19, 20). Na 96 vzorkovacích doštičiek (Nunc, Kamstrup, Dánsko) sa nanesie 50 μΐ /'vzorka králičej anti-MCP-1 na 16 hodín pri teplote 4 °C a potom sa premyje PBS, pH 7,5, 0,05 % Tween-20 (premývací pufor). Nešpecifické spojovacie miesta sa blokujú 2 % BSA v PBS (200 μΐ) a doštičky sa inkubujú počas 90 minút pri teplote 37 °C. Doštičky sa premyjú trikrát pufrom, pridá sa rozpustená rovnaká (čistá, 1 : 5 a 1 : 10) testovacia vzorka (50 μΐ), nasleduje inkubácia počas 1 hodiny pri teplote 37 °C. Doštičky sa štyrikrát premyjú a pridáva sa 50 μΐ/vzorka biotinylovaného králičieho anti-MCP-1 počas 45 minút pri teplote 37 °C. Doštičky sa premyjú štyrikrát, pridá sa konjugát straptavidin-peroxidáza (100 μΐ/ml) (Dakopatts, Carpintcria, CA) a doštičky sa inkubujú počas 30 minút pri teplote 37 °C. Doštičky sa trikrát premyjú a pridá sa 100 μΐ chromogénneho substrátu (0,67 mg/ml dichloridu ortofenyléndiamínu) (Dakopatts, Carpinteria, CA). Doštičky sa inkubujú pri teplote 25 °C počas 6 minút a reakcia sa skončí roztokom 50 μΐ/vzorka 3 M H₂SO₄ v premývacom pufre s 2 % FCS. Doštičky sa vyhodnotia pri 490 nm v prístroji ELISA. Štandardom je 0,5 log roztok rekombinantnej MCP-1 od 100 ng/ml do 1 pg/ml (50 μΐ/vzorka). ELISA detekuje spoľahlivo koncentrácie MCP-1 >50 pg/ml.

Štatistická analýza

Údaje zo všetkých pokusov sa štatisticky vyhodnocujú s použitím nepárového Študentovho t-testu, kde p hodnota < 0,05 sa pokladá za štatisticky významnú.

Model astmy pri primátoch - 10-denný experiment

Metódy

Zvieratá

Na tieto štúdie sa použijú dospelé samičky opice cynomolgus (Macaca fasicularis, Charles River Primáte Imports, Boston, MA) s váhou 4 - 6 kg. Všetky zvieratá použité v tejto štúdii majú kožu, ktorá sa bežne vyskytuje a respiračnú citlivosť k proteínovému extraktu Ascaris suum. Všetky zvieratá boli vo výbornom zdravotnom stave, v krvnom obehu mali zvyčajný výskyt leukocytov a zvyčajný chemizmus krvi. Zvieratá boli umiestnené jednotlivo v priestoroch s riadeným prostredím v otvorených klietkach a dostávali jedlo dvakrát denne a vodu ad libitum. Všetky zvieratá boli držané bez stravy počas približne 12 hodín pred prvým dňom experimentu. Všetky protokoly preveril a schválil Bayer Corporation Intemal Animal Čare and Use Committee.

Zvieratá boli podrobené vyšetrovaniu po anestézii hydrochloridom ketamínu (4 mg/kg, i.m., Ketaset, Bristol Laboratories, Syracuse, N.Y.) a xylazínom (1 mg/kg, i.m. Rompun, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind.), intubované pomocou zavedenej endotracheálnej trubičky (5,5 mm ID, Mallinckrodt Critical Čare, St. Louis, Mo.) a boli umiestnené vo vzpriamenej pozícii v špeciálnej navrhnutej podpornej stoličke. Ketamín (4 mg/kg, i.m.) sa používal samostatne podľa potreby na podporu anestézie.

Protokol o štúdii

Citlivosť dýchacích ciest (metacholín PC 100) sledovaná podľa zloženia buniek dýchacích ciest (bronchoalveolar lavage, BAL), bola stanovovaná 3 dni pred (deň 0) a 3 dni po (deň 10) inhalácii extraktu Ascaris suum trikrát každý druhý deň (dni 3, 5, 7). Zvieratám sa poskytol čas na relaxáciu počas 4 až 6 týždňov medzi výskumami, aby sa citlivosť dýchacích ciest a zápaly mohli vrátiť k pôvodnej (preantigén) hodnote. Spracovanie výskumu sa vykonávalo v porovnaní s kontrolnou štúdiou s vehikulom, aby sa zaistilo, že nedošlo k žiadnym zmenám v citlivosti k antigénu v závislosti od času.

Pri experimentálnom vykonávaní pokusov (R121D/Y124D IL-4 muteín alebo dexametazón) boli zvieratám dávkované druhý deň štúdie (podkožná injekcia) a každý nasledujúci deň až do deviateho dňa štúdie. Lyofilizovaný rekombinantný ľudský R121D/Y124D IL-4 bol rekonštituovaný v sterilnom 0,2 % ľudskom sére albumínu HSA (Baxter Healthcare Corp., Glendale, CA), má používanú koncentráciu 2,5 mg/1. Prípravok R121D/Y124D IL-4 neobsahoval endotoxíny, ako sa zistilo pomocou testu lyzátu Limulus amoebocyte, ktorý preukázal, že hladina endotoxínu bola menej ako 0,2 endotoxínových jednotiek/ml, čo je limitná citlivosť testu. Dexametazón je obchodne dodávaný a predávajú ho externí predajcovia.

Citlivosť dýchacích ciest

Citlivosť dýchacích ciest bola stanovená určením koncentrácie rozprášeného a inhalovaného metacholínu, ktorý spôsobuje 100 % zvýšenie rezistencie dýchacích ciest pri prechode vzduchu do pľúc a z pľúc. Toto sa skončí podaním zvýšenej koncentrácie metacholínu (rozpustený v soľnom fosfátovom pufre) v polovičných logaritmických krokoch, kým sa nedosiahne >100% zvýšenie rezistencie dýchacích ciest. PC 100 sa potom vyčísli lineárnou regresnou analýzou posledných 2 alebo 3 bodov na logaritmickej závislosti koncentrácie metacholínu oproti percentuálnemu zvýšeniu v diagrame rezistencie dýchacích ciest.

Bronchoalvcolámy výplach (BAL)

Zloženie buniek dýchacích ciest sa určuje pomocou BAL. Pediatrický fiberoptický bronchoskop (model BF-3C4, Olympus Corp., Lake Success, N.Y.) sa zavedie pozdĺž prsnej kosti, kým nedosiahne piatu až siedmu generáciu bronchov. Potom sa zavedie a jemne sa ašpiruje kanálikom bronchoskopu jeden alikvót 15 ml bikarbonátu pufrovaného normálnou soľou (pH 7,4). Celkový počet leukocytov v mililitri kvapaliny BAL sa stanoví počítaním hemocytometrom. Počítanie odlišných buniek (bolo spočítané celkom 200 buniek) sa vykonáva na farebných Wright-Giemsa cytocentrifugálnych prípravkoch. Na zamedzenie vplyvov primárneho BAL na následné BAL sa vykonávajú

BALy pred a po testovaní antigénu na opačných stranách pľúc.

Štatistická analýza

Údaje zo všetkých pokusov sa štatisticky vyhodnocujú s použitím nepárového Študentovho testu, kde p hodnota < 0,05 sa pokladá za štatisticky významnú.

Výsledky

Vplyvy na eozinofílie dýchacích ciest vyvolané antigénom

Opakované inhalácie antigénu vyvolávajú zápaly dýchacích ciest, ako indikuje veľký počet regenerovaných eozinofilov v kvapaline BAL. Aplikácia R121D/Y124D IL-4 muteínu v dávke 500 pg/kg, b.i.d. výrazne inhibuje prienik eozinofilu do pľúc.

V ďalšej sérii štúdií sa skúmal vplyv dexametazónu. Podávanie dexametazónu v dávke 200 pg/kg výrazne inhibuje eozinoflliu dýchacích ciest, vyvolanú antigénom podobne ako pri podávaní IL-4 dvojitého muteínu.

Vplyv na precitlivenosť dýchacích ciest spôsobenú antigénom

Počas porovnávacej štúdie (bez podávania prípravkov) sa citlivosť dýchacích ciest zvýši viac ako päťkrát. Podávanie R121D/Y124D IL-4 muteínu (500 pg/kg, b.i.d.) výrazne inhibuje zvýšenie precitlivenosti dýchacích ciest na inhalovaný metacholín. Počas druhého porovnávacieho pokusu sa citlivosť na inhalovaný metacholín opäť zvýši viac ako päťkrát.

V ďalšej sérii štúdií podávanie dexametazónu (200 pg/kg) výrazne inhibuje zvýšenie citlivosti dýchacích ciest k inhalovanému metacholínu spôsobenej antigénom.

Diskusia

Niektoré charakteristiky astmatických dýchacích ciest sa vyznačujú prítomnosťou zápalov dýchacích ciest, poškodením epitelu dýchacích ciest a precitlivenosťou dýchacích ciest. Precitlivenosť dýchacích ciest je dôležitou zložkou patológie astmy a môže sa definovať ako neprimerané stiahnutie bronchov v dôsledku reakcie na počet inhalovaných látok v porovnaní s reakciou normálnych subjektov. Hoci presný patologický mechanizmus (mechanizmy) zostáva neznámy, precitlivenosť dýchacích ciest sa pokladá za dôsledok chronického zápalu dýchacích ciest a jeho zhubného vplyvu na dýchacie cesty.

Výsledky štúdie SR121D/Y124D IL-4 muteínu ukazujú, že podávanie inhibuje tak zápaly dýchacích ciest, vyvolané antigénom, ako i precitlivenosť dýchacích ciest. Podľa výsledkov sa dá predpokladať, že R121D/Y124D IL-4 muteín by mohol byť pre pacientov trpiacich na astmu a alergiu prínosný.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mutantný hIL-4 proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde jedna až tri aminokyseliny, vyskytujúce sa v ňom v polohách 121, 124 alebo 125, sú nahradené inou prirodzenou aminokyselinou alebo je aminokyselinová sekvencia ukončená v jednej z týchto polôh, s výnimkou muteínu, kde je tyrozín v polohe 124 nahradený kyselinou asparágovou.
2. Mutantný hIL-4 proteín podľa nároku 1, kde uvedený mutantný hIL-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde aminokyselina tyrozín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 124, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou s výnimkou kyseliny asparágovej.
3. Mutantný hIL-4 proteín podľa nároku 2, kde uvedený tyrozín je nahradený glycinom.
4. Mutantný hIL-4 proteín podľa nároku 1, kde uvedený mutantný hIL-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde aminokyselina arginín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 121, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou.
5. Mutantný hIL-4 proteín podľa nároku 4, kde uvedený arginín je nahradený kyselinou asparágovou.
6. Mutantný hIL-4 proteín podľa nároku 1, kde uvedený mutantný hIL-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde aminokyselina serín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 125, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou.
7. Mutantný hIL-4 proteín podľa nároku 6, kde uvedený serín je nahradený kyselinou asparágovou.
8. Terapeutické činidlo na ošetrenie alergických procesov, vyznačujúce sa tým, že obsahuje:

a) mutantný hlL-4 proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hIL-4 proteínu, ale kde jedna až tri aminokyseliny, vyskytujúce sa v polohách 121, 124 alebo 125, sú nahradené inou prirodzenou aminokyselinou alebo je aminokyselinová sekvencia ukončená v jednej z týchto polôh a

b) fyziologicky prijateľný nosič.
9. Terapeutické činidlo podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že uvedený mutantný hIL-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hlL-4 proteínu, ale kde aminokyselina tyrozín, ktorá sa prirodzene vyskytuje v polohe 124, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou.
10. Terapeutické činidlo podľa nároku 9, vyznali u j ú c e sa tým, že uvedený tyrozín je nahradený aminokyselinou vybranou zo skupiny, zahrňujúcej kyselinu asparágovú a glycín.
11. Terapeutické činidlo podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že uvedený mutantný hIL-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hlL-4 proteínu, ale kde aminokyselina arginín, ktorá sa objavuje prirodzene v polohe 121, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou.
12. Terapeutické činidlo podľa nároku II, vy žatiu j ú c e sa tým, že uvedený arginín je nahradený kyselinou asparágovou.
13. Terapeutické činidlo podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že uvedený mutantný hIL-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu divokého typu hlL-4 proteínu, ale kde aminokyselina serín, ktorá sa prirodzene objavuje v polohe 125, je nahradená inou prirodzenou aminokyselinou.
14. Terapeutické činidlo podľa nároku ^vyznačujúce sa tým, že uvedený serín je nahradený kyselinou asparágovou.