JP3470970B2 - ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびにそれらの製造法 - Google Patents
ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびにそれらの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
今日、アレルギーに苦しんでいる人口の割合は高い。
空気の汚染の進行及び環境中に拡散するアレルギー誘起
物質の数の増加は、おそらく将来特に子供においてさら
にアレルギーの数が増加するであろうことを予想させ
る。この理由でアレルギー過程の経路に介在しうる薬剤
の開発が緊急に必要である。
空気の汚染の進行及び環境中に拡散するアレルギー誘起
物質の数の増加は、おそらく将来特に子供においてさら
にアレルギーの数が増加するであろうことを予想させ
る。この理由でアレルギー過程の経路に介在しうる薬剤
の開発が緊急に必要である。
ヒトインターロイキン４（hIL−４）はリンパ系細胞
及び骨髄細胞の増殖、成熟、生存及び分化を誘導し、協
調させる（coordinate）多数のサイトカインの１つであ
る（１−３）。特にhIL−４はIgE−媒介免疫反応に関与
し、胸腺細胞及び活性化Ｔ細胞の増殖を直接加速する。
140,000Mrの高親和性IL−１レセプタータンパク質を同
定することができ、それはそのcDNA配列により800アミ
ノ酸残基を含む（４）。このタンパク質はヘマトポイエ
チンレセプタースーパーファミリーと名付けられた最近
記載されたレセプターの群に属する（５）。
及び骨髄細胞の増殖、成熟、生存及び分化を誘導し、協
調させる（coordinate）多数のサイトカインの１つであ
る（１−３）。特にhIL−４はIgE−媒介免疫反応に関与
し、胸腺細胞及び活性化Ｔ細胞の増殖を直接加速する。
140,000Mrの高親和性IL−１レセプタータンパク質を同
定することができ、それはそのcDNA配列により800アミ
ノ酸残基を含む（４）。このタンパク質はヘマトポイエ
チンレセプタースーパーファミリーと名付けられた最近
記載されたレセプターの群に属する（５）。
クローニングされたcDNAに基づき（６）、成熟IL−４
のアミノ酸配列は129残基を含む。このcDNAはE.コリ
（E.coli）（7,8）及び酵母（９）で発現された。高い
生物学的活性を有する組み換えIL−４をこれらの供給源
から単離することができる。
のアミノ酸配列は129残基を含む。このcDNAはE.コリ
（E.coli）（7,8）及び酵母（９）で発現された。高い
生物学的活性を有する組み換えIL−４をこれらの供給源
から単離することができる。
アレルギー過程におけるIL−４の役割は、インターロ
イキン−４−媒介過程を阻害するか、又はhIL−４と競
合する物質が疾患−誘起反応連鎖を中断させるであろう
ことを予想させる。
イキン−４−媒介過程を阻害するか、又はhIL−４と競
合する物質が疾患−誘起反応連鎖を中断させるであろう
ことを予想させる。
従ってその活性成分がヒトインターロイキン４のアン
タゴニスト（拮抗薬）であるか又は部分的アゴニスト
（作動薬）である治療薬を利用できるようにすること
は、本発明の目的である。
タゴニスト（拮抗薬）であるか又は部分的アゴニスト
（作動薬）である治療薬を利用できるようにすること
は、本発明の目的である。
ごく最近、ヒトインターロイキン４に対してアンタゴ
ニスト性を示すモノクローナル抗体が見いだされた（1
0）。この抗体はFabフラグメントを含み、ヒト−ヒトハ
イブリドーマ細胞系により生産される。さらに（非−）
グリコシル化ヒトIL−４に対して免疫化されたラットの
脾臓細胞からのハイブリドーマ細胞系はhIL−４に対す
るモノクローナル抗体を生産する（11）。
ニスト性を示すモノクローナル抗体が見いだされた（1
0）。この抗体はFabフラグメントを含み、ヒト−ヒトハ
イブリドーマ細胞系により生産される。さらに（非−）
グリコシル化ヒトIL−４に対して免疫化されたラットの
脾臓細胞からのハイブリドーマ細胞系はhIL−４に対す
るモノクローナル抗体を生産する（11）。
上記の目的は本発明に従う、hIL−４のアンタゴニス
ト又は部分的アゴニストであるか、あるいはこれらのア
ンタゴニスト又は部分的アゴニストを含み、アンタゴニ
スト又は部分的アゴニストが突然変異hIL−４タンパク
質であることを特徴とする治療薬を利用できるようにす
ることにより達成された。本発明の治療薬の選択は、標
的化された態様で“遺伝子工学”を用い、野生型hIL−
４と類似しているためにhIL−４レセプターの占有に関
してhIL−４と競合するタンパク質を製造できるという
利点を有する。
ト又は部分的アゴニストであるか、あるいはこれらのア
ンタゴニスト又は部分的アゴニストを含み、アンタゴニ
スト又は部分的アゴニストが突然変異hIL−４タンパク
質であることを特徴とする治療薬を利用できるようにす
ることにより達成された。本発明の治療薬の選択は、標
的化された態様で“遺伝子工学”を用い、野生型hIL−
４と類似しているためにhIL−４レセプターの占有に関
してhIL−４と競合するタンパク質を製造できるという
利点を有する。
さらに突然変異hIL−４タンパク質ならびにそれらの
製造法を利用できるようにすることも本発明の目的であ
る。
製造法を利用できるようにすることも本発明の目的であ
る。
hIL−４は例えばE.コリにおける遺伝子操作により組
み換えタンパク質（rhIL−４）として生産することがで
きる。これらの状況下で形成されるタンパク質は可溶
化、再生及び単離することができる。そのrhIL−４は高
い生物学的な比活性を有し、それは例えば活性化Ｔ細胞
のDNA合成／増殖、あるいは活性化Ｂ細胞のCD23発現の
測定により決定することができる（例えばKruse,N.et
al.（1991）FEBS Lett.286,58−60;Kikutani,H.et a
l.（1986）Cell 47,657−665を参照）。
み換えタンパク質（rhIL−４）として生産することがで
きる。これらの状況下で形成されるタンパク質は可溶
化、再生及び単離することができる。そのrhIL−４は高
い生物学的な比活性を有し、それは例えば活性化Ｔ細胞
のDNA合成／増殖、あるいは活性化Ｂ細胞のCD23発現の
測定により決定することができる（例えばKruse,N.et
al.（1991）FEBS Lett.286,58−60;Kikutani,H.et a
l.（1986）Cell 47,657−665を参照）。
本発明によれば、hIL−４アンタゴニスト又は部分的h
IL−４アゴニストの性質を有するhIL−４野生型の突然
変異タンパク質を製造できる方法が現に設計された。特
にhIL−４のアンタゴニストはhIL−４の効果を特異的に
阻害する可能性を与える。この目的で、 −hIL−４の成熟領域をコードするDNA領域を含むcDNA
に、可能な天然のアミノ酸から選択された異なるアミノ
酸が所望の位置で発現されるように、又は停止コドンに
よりポリペプチド鎖の中断が生ずるように標的オリゴヌ
クレオチド突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）を
行い、 −突然変異を起こしたhIL−４の成熟領域をコードするD
NA領域を発現ベクターに組み込み、 −形成されたハイブリッドベクターをE.コリ中に挿入
し、 −突然変異hIL−４タンパク質を発現させ、適宜単離す
る。
IL−４アゴニストの性質を有するhIL−４野生型の突然
変異タンパク質を製造できる方法が現に設計された。特
にhIL−４のアンタゴニストはhIL−４の効果を特異的に
阻害する可能性を与える。この目的で、 −hIL−４の成熟領域をコードするDNA領域を含むcDNA
に、可能な天然のアミノ酸から選択された異なるアミノ
酸が所望の位置で発現されるように、又は停止コドンに
よりポリペプチド鎖の中断が生ずるように標的オリゴヌ
クレオチド突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）を
行い、 −突然変異を起こしたhIL−４の成熟領域をコードするD
NA領域を発現ベクターに組み込み、 −形成されたハイブリッドベクターをE.コリ中に挿入
し、 −突然変異hIL−４タンパク質を発現させ、適宜単離す
る。
hIL−４の成熟領域をコードするDNA領域を含むか、又
はhIL−４の成熟領域をコードするcDNAの入手に関し、
（６）及びそこに挙げられている文献を参照する。この
ような関係において“hIL−４の成熟領域をコードするc
DNA"は、そう称せられるhIL−４突然変異タンパク質が
やはりアンタゴニスト又は部分的アゴニストであるなら
ば、大体同数の塩基対を有するが該技術の現状において
特に示されているcDNAの突然変異体を与えるcDNAを意味
するとも理解される。
はhIL−４の成熟領域をコードするcDNAの入手に関し、
（６）及びそこに挙げられている文献を参照する。この
ような関係において“hIL−４の成熟領域をコードするc
DNA"は、そう称せられるhIL−４突然変異タンパク質が
やはりアンタゴニスト又は部分的アゴニストであるなら
ば、大体同数の塩基対を有するが該技術の現状において
特に示されているcDNAの突然変異体を与えるcDNAを意味
するとも理解される。
hIL−４の成熟領域をコードするDNA領域の番号付けは
Garr,C.et al.（Biochemistry（1991）30,1515−152
3）に従う。
Garr,C.et al.（Biochemistry（1991）30,1515−152
3）に従う。
hIL−４の成熟領域をコードするcDNAは、遺伝子操作
により生産されたcDNA（例えばBritish Bio−Technolo
gy Ltd.,Oxford,Englandから）からEcoR V/BamH Iフラ
グメントを切断することにより得ることができる。イン
ターロイキン４の最初の４つのアミノ酸コドン及び開始
メチオニンのためのコドンを含む、例えば5'−CATGCACA
AGTGCGAT及び5'−ATCGCACTTGTGなどの合成オリゴヌクレ
オチドを加え、DNAフラグメントを発現ベクター中に、
例えば発現ベクターRTGpRC109のNco IとBamH I切断部位
の間に組み込む（12）。
により生産されたcDNA（例えばBritish Bio−Technolo
gy Ltd.,Oxford,Englandから）からEcoR V/BamH Iフラ
グメントを切断することにより得ることができる。イン
ターロイキン４の最初の４つのアミノ酸コドン及び開始
メチオニンのためのコドンを含む、例えば5'−CATGCACA
AGTGCGAT及び5'−ATCGCACTTGTGなどの合成オリゴヌクレ
オチドを加え、DNAフラグメントを発現ベクター中に、
例えば発現ベクターRTGpRC109のNco IとBamH I切断部位
の間に組み込む（12）。
部位特異的突然変異誘発はKramer et al.（Nucleic
Acids Research（1984）12,9441−9455;Cell（198
4）38,879−887;及びBoehringer−Mannheim catalogu
e,Biochemicals for Molecular Biology（1987）35
など、（12）も参照）に従って行うことができる。突然
変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドは、改変する
べき塩基の上流に約６−10塩基、及び下流に６−10塩基
を含むことができる。
Acids Research（1984）12,9441−9455;Cell（198
4）38,879−887;及びBoehringer−Mannheim catalogu
e,Biochemicals for Molecular Biology（1987）35
など、（12）も参照）に従って行うことができる。突然
変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドは、改変する
べき塩基の上流に約６−10塩基、及び下流に６−10塩基
を含むことができる。
当該技術分野における熟練者は、突然変異を起こした
hIL−４の成熟領域をコードするDNA領域のベクターから
の切り出し、このDNA領域の発現ベクターへの転移、続
く発現ベクターのE.コリ中への挿入、ならびに突然変異
hIL−４タンパク質の発現及びその任意の単離にも慣れ
ており（McCarthy et al.;Gene（1986）41,201−206;
Kato et al.;Biochem.Biophys.Res.Commun.（1985）1
30,692−699）、それに伴う改変（12）が可能である。
hIL−４の成熟領域をコードするDNA領域のベクターから
の切り出し、このDNA領域の発現ベクターへの転移、続
く発現ベクターのE.コリ中への挿入、ならびに突然変異
hIL−４タンパク質の発現及びその任意の単離にも慣れ
ており（McCarthy et al.;Gene（1986）41,201−206;
Kato et al.;Biochem.Biophys.Res.Commun.（1985）1
30,692−699）、それに伴う改変（12）が可能である。
本発明の特定の実施態様に従い、部位特異的突然変異
誘発を行う前に開始メチオニンをコードするDNAを、hIL
−４の成熟領域をコードするDNA領域を含むcDNA中に挿
入する。
誘発を行う前に開始メチオニンをコードするDNAを、hIL
−４の成熟領域をコードするDNA領域を含むcDNA中に挿
入する。
さらに特定の実施態様に従い、突然変異を起こしたhI
L−４の成熟領域をコードするDNA領域を、cDNA突然変異
体からNco I/BamH Iのフラグメントとして切り出すこと
ができる。
L−４の成熟領域をコードするDNA領域を、cDNA突然変異
体からNco I/BamH Iのフラグメントとして切り出すこと
ができる。
発現のために温度−調節発現ベクター、例えばpILA50
2（左（left−hand）ラムダプロモーター及びポリリン
カーを含まない）及び／又は宿主として普通のE.コリ
株、例えばJM103（recA-）を用いるのが好ましい。pILA
502に関し、Schauder et al.（Gene（1987）52,279−
283）を参照されたい。さらに適した発現系はPharmacia
から得ることができる（“Prokaryotic Gene Fusion
Vectors"）。E.コリ株JM103もPharmaciaから得ること
ができる。
2（左（left−hand）ラムダプロモーター及びポリリン
カーを含まない）及び／又は宿主として普通のE.コリ
株、例えばJM103（recA-）を用いるのが好ましい。pILA
502に関し、Schauder et al.（Gene（1987）52,279−
283）を参照されたい。さらに適した発現系はPharmacia
から得ることができる（“Prokaryotic Gene Fusion
Vectors"）。E.コリ株JM103もPharmaciaから得ること
ができる。
さらに別の実施態様に従い、本発明は野生型hIL−４
の突然変異体に関し、その突然変異体では位置124の領
域でTyrがAspにより置換されている。
の突然変異体に関し、その突然変異体では位置124の領
域でTyrがAspにより置換されている。
本発明を２つの実施例を用い、下記においてより詳細
に説明する。
に説明する。
実施例１
hIL−４の成熟領域及び開始メチオニンをコードするc
DNAにKramer et al.に従って部位特異的突然変異誘発
を行った。合成オリゴヌクレオチドは置換するべきヌク
レオチドの上流及び下流に６塩基含み、DNA合成機（App
lied Biosystems,Model 380）を用いて生産した。置
換するべき部位は、おそらくα−らせんであるＣ−末端
領域（位置110−129）の位置124であった。この場合、T
yrをGlyに置換した。起こった突然変異は１本鎖バクテ
リオファージDNAのDNA配列分析により確かめられた。突
然変異cDNAをNco I/BamH Iフラグメントとして２本鎖ウ
ィルスDNAから切り出し、左ラムダプロモーター及びポ
リリンカーがない以外はpILA502に相当する温度−調節
発現ベクターと結合させた。E.コリ株JM103のrecA-誘発
体を宿主として用いた。組み込みhIL−４ cDNAを配列
決定し、突然変異を確認した。その後、突然変異タンパ
ク質の発現に株を用いた。
DNAにKramer et al.に従って部位特異的突然変異誘発
を行った。合成オリゴヌクレオチドは置換するべきヌク
レオチドの上流及び下流に６塩基含み、DNA合成機（App
lied Biosystems,Model 380）を用いて生産した。置
換するべき部位は、おそらくα−らせんであるＣ−末端
領域（位置110−129）の位置124であった。この場合、T
yrをGlyに置換した。起こった突然変異は１本鎖バクテ
リオファージDNAのDNA配列分析により確かめられた。突
然変異cDNAをNco I/BamH Iフラグメントとして２本鎖ウ
ィルスDNAから切り出し、左ラムダプロモーター及びポ
リリンカーがない以外はpILA502に相当する温度−調節
発現ベクターと結合させた。E.コリ株JM103のrecA-誘発
体を宿主として用いた。組み込みhIL−４ cDNAを配列
決定し、突然変異を確認した。その後、突然変異タンパ
ク質の発現に株を用いた。
発現及び単離の後、突然変異タンパク質（Y124G）はh
IL−４のレセプターに変わらぬ親和力で結合することが
見いだされた。しかし誘導可能な最大の活性化末梢Ｔ細
胞の増殖は今や、hIL−４野生型により誘導可能な増殖
のわずか10−20％である。これは突然変異タンパク質Y1
24Gが部分的アゴニストの性質を有することを示す。
IL−４のレセプターに変わらぬ親和力で結合することが
見いだされた。しかし誘導可能な最大の活性化末梢Ｔ細
胞の増殖は今や、hIL−４野生型により誘導可能な増殖
のわずか10−20％である。これは突然変異タンパク質Y1
24Gが部分的アゴニストの性質を有することを示す。
実施例２
位置124においてTyrの代わりにAspを発現する以外は
実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質Y124D
は１μＭの濃度でも活性化末梢Ｔ細胞に対して活性を示
さなかった。しかしこれはhIL−４野生型の活性を、約6
00pMの阻害定数で阻害する。これは突然変異タンパク質
Y124Dがアンタゴニストの性質を有することを示す。突
然変異タンパク質Y124Dは活性化Ｂ細胞上のCD23の誘導
に関して小さい残留活性を有する。しかし達成できる最
大の誘導はhIL−４野生型の場合に達成できる誘導のわ
ずか約５％である。この系の場合、hIL−４野生型の活
性は約800pMの阻害定数で突然変異タンパク質Y124Dによ
り阻害される。かくしてＢ細胞系において突然変異タン
パク質Y124Dは非常に弱いアゴニストの性質を有する。
実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質Y124D
は１μＭの濃度でも活性化末梢Ｔ細胞に対して活性を示
さなかった。しかしこれはhIL−４野生型の活性を、約6
00pMの阻害定数で阻害する。これは突然変異タンパク質
Y124Dがアンタゴニストの性質を有することを示す。突
然変異タンパク質Y124Dは活性化Ｂ細胞上のCD23の誘導
に関して小さい残留活性を有する。しかし達成できる最
大の誘導はhIL−４野生型の場合に達成できる誘導のわ
ずか約５％である。この系の場合、hIL−４野生型の活
性は約800pMの阻害定数で突然変異タンパク質Y124Dによ
り阻害される。かくしてＢ細胞系において突然変異タン
パク質Y124Dは非常に弱いアゴニストの性質を有する。
実施例３
位置121においてArgの代わりにAspを発現する以外は
実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質のhIL
−４レセプターへの結合は変わらなかった。しかし誘導
することができる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖は、hIL
−４野生型の場合に誘導される増殖のわずか約30％であ
った。これは、突然変異タンパク質R121Dが部分的アゴ
ニストの性質を有することを示す。
実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質のhIL
−４レセプターへの結合は変わらなかった。しかし誘導
することができる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖は、hIL
−４野生型の場合に誘導される増殖のわずか約30％であ
った。これは、突然変異タンパク質R121Dが部分的アゴ
ニストの性質を有することを示す。
実施例４
位置125においてSerの代わりにAspを発現する以外は
実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質S125D
はhIL−４のレセプターに変わらぬ親和力で結合した。
しかし誘導できる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖はhIL−
４野生型の場合に誘導される増殖のわずか約35％であ
る。
実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質S125D
はhIL−４のレセプターに変わらぬ親和力で結合した。
しかし誘導できる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖はhIL−
４野生型の場合に誘導される増殖のわずか約35％であ
る。
文献表
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i,N.およびYokota,T.（1990）Annu.Rev.Biochem.59,783
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r.J.Biochem.180,295−300.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C07K 14/54
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
(54)【発明の名称】 ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアン
タゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびに
それらの製造法
Claims (7)
- 【請求項１】ｉ）位置121、ii）位置125、iii）位置121
及び位置124、iv）位置125及び位置124、またはｖ）位
置121、124及び125、のいずれかにおいて、天然に存在
する１つ又はそれ以上のアミノ酸が、それぞれ可能な天
然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸により置換されてい
ることを特徴とするが、突然変異タンパク質Y124Dを除
き、かつ、試験管内でＴ細胞増殖におけるhIL−４媒介
性のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである。突然
変異hIL−４タンパク質。 - 【請求項２】位置124において天然に存在するアミノ酸
チロシンが、可能な天然のアミノ酸の中のアスパラギン
酸以外の異なるアミノ酸で置換されていることを特徴と
する、突然変異hIL−４タンパク質。 - 【請求項３】チロシンがグリシンで置換されていること
を特徴とする、請求項２に記載の突然変異hIL−４タン
パク質。 - 【請求項４】ａ）hIL−４の成熟領域をコードするDNA領
域を含むcDNAに、可能な天然のアミノ酸から選択された
異なるアミノ酸が所望の位置で発現されるように標的オ
リゴヌクレオチド突然変異誘発（部位特異的突然変異誘
発）を行い、 ｂ）突然変異を起こしたhIL−４の成熟領域をコードす
るDNA領域を発現ベクターに挿入し、 ｃ）形成されたハイブリッドベクターを大腸菌、酵母又
は他の真核細肪中に導入し、 ｄ）突然変異hIL−４タンパク質を発現させ、適宜単離
することを特徴とする、請求項１−３のいずれか１つに
記載の突然変異hIL−４タンパク質の製造法。 - 【請求項５】部位特異的突然変異誘発を行う前にhIL−
４の成熟領域をコードするDNA領域を含むcDNA中に開始
メチオニンをコードするDNAを挿入することを特徴とす
る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】突然変異を起こしたhIL−４の成熟領域を
コードするDNA領域をベクターからNco I/BamH Iフラグ
メントとして切り出すことを特徴とする、請求項４又は
５に記載の方法。 - 【請求項７】温度−調節発現ベクター及び／又は宿主と
しての改変大腸菌JM103株（recA−）を用いることを特
徴とする、請求項４−６のいずれか１つに記載の方法。
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