CZ283467B6

CZ283467B6 - Lidské IL-4 mutantní proteiny

Info

Publication number: CZ283467B6
Application number: CZ941185A
Authority: CZ
Inventors: Walter Sebald
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 1991-11-13
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 1998-04-15
Also published as: JP3470970B2; DE59209196D1; ATE163196T1; KR100276410B1; NO941681L; WO1993010235A1; DK0613499T4; JPH07501522A; GR3026600T3; ES2112340T5; DE4137333A1; US5723118A; EP0613499B1; AU2928292A; CA2123315C; SK55494A3; CZ118594A3; HU217326B; DK0613499T3; NO941681D0

Abstract

Terapeutická činidla, která jsou antagonisty nebo parciálními antagonisty lidského interleukinu-4, nebo je obsahují, hIL-4mutantní proteiny a způsob jejich přípravy.ŕ

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká hIL-4 mutantních proteinů a terapeutických činidel, které jsou antagonisty nebo částečnými antagonisty lidského interleukinu-4 nebo jej obsahují.

Dosavadní stav techniky

V současné době trpí široké vrstvy obyvatelstva alergiemi. Je možno očekávat stoupající znečištění vzduchu a stoupající počet do prostředí difundujících, alergie vyvolávajících substancí, díky nimž bude v budoucnosti počet onemocnění ještě dále stoupat. Proto je nezbytné vyvinout léčiva, která mohou zasáhnout do průběhu alergického procesu.

Lidský interleukin-4 (hIL-4) je jedním z mnoha cytokinů, které indukují a koordinují proliferaci, zrání, přežívání a diferenciaci lymfoidních a myeloidních buněk¹'³’, Zejména se hIL-4 podílí na IgE- zprostředkovaných imunoreakcích a přímo urychluje proliferaci thymocytů a aktivovaných T-buněk. Bylo možno identifikovat vysoce afinitní IL-4- receptorový protein s Mr 140 000, který je podle své cDNA sekvence tvořen 800 aminokyselinovými zbytky ⁴’. Patří do skupiny receptorů popsaných v poslední době, které jsou označovány jako superrodina hematopoietin receptorů⁵’.

Aminokyselinová sekvence IL-4 je tvořena 129 zbytky, vzhledem ke klonované cDNA⁶’. cDNA je exprimována v E.coli^7,8) a kvasinkách⁹⁾. Z těchto zdrojů může být získán rekombinantní IL-4 s vysokou biologickou aktivitou.

V publikaci Febs. Letters, Bd. 286, Nr. 1,2, Juli 1991, Amsterdam NL, 58 - 60 je popsán mutantní hIL-4 protein, který má v aminokyselinové sekvenci aminokyselinu tyrosin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 124, nahrazenou kyselinou asparagovou. Žádné farmakologické účinky však u tohoto proteinu nejsou popsány.

Úloha interleukinu-4 v alergických procesech umožňuje se domnívat, že substance, které inhibují procesy zprostředkované interleukinem-4 nebo konkurují s hIL-4, přeruší reakční řetězec, způsobující chorobu.

Úlohou vynálezu proto je nalezení terapeutického prostředku, jehož aktivní podstatnou částí jsou antagonisté nebo parciální agonisté lidského interleukinu-4.

V poslední době je již známa monoklonální protilátka, která vykazuje proti lidskému interleukinu-4 antagonistické vlastnosti¹⁰’. Tato protilátka obsahuje Fab-fragment a je produkována hybridomovou buněčnou linií člověk-člověk. Také hybridomová linie ze slezinných buněk proti (ne-)glykosylovanému lidskému IL-4 imunizované krysy produkuje monoklonální protilátky hIL-4¹¹’.

Podstata vynálezu

Uvedená úloha je podle předloženého vynálezu vyřešena nalezením mutantního hIL-4 proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se vněm v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, neboje aminokyselivová sekvence ukončena v jedné z těchto poloh, s výjimkou muteinu kde je tyrosin v poloze 124 nahrazen kyselinou asparagovou.

-1 CZ 283467 B6

Výhodný je mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina tyrosin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 124 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou s výjimkou kyseliny asparagové, výhodně glycinem.

Dále je výhodný mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina arginin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 121 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, výhodně kyselinou asparagovou.

io Rovněž je výhodný mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina serin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 125, je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, výhodně kyselinou asparagovou.

Dále je předmětem předloženého vynálezu terapeutické činidlo pro ošetření alergických procesů, 15 které obsahuje

a) mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, neboje aminokyselinová sekvence ukončena v jedné z těchto poloh a

b) fyziologicky přijatelný nosič.

Takto jsou poskytnuty terapeutické prostředky, které jsou antagonisty nebo parciálními agonisty 25 hIL-4 nebo tyto obsahují a vyznačují se tím, že antagonisté nebo částeční agonisté jsou hIL-4 mutantní proteiny. Volba terapeutických prostředků má tu výhodu, že genetickým inženýrstvím je možno vyrobit cílené proteiny, které díky své podobnosti s divokým typem hIL-4 mohou soupeřit v obsazení hIL-4 receptorů.

Dále je úlohou vynálezu připravit hIL-4 mutantní proteiny a nalézt způsob jejich přípravy.

hIL-4 je možno vyrobit jako rekombinantní protein (rhIL-4) genovou technologií, např. vE.coli. Takto vytvořený protein je možno solubilizovat, renaturovat a izolovat, rHL-4 potom vykazuje vysokou specifickou biologickou aktivitu, kterou je možno stanovit např. měřením DNA35 syntézy/proliferace aktivovaných T-buněk nebo CD23 exprese v aktivovaných B-buňkách (viz např. Kruše N. aspol. (1991) FEBS Lett. 286, 58-60; Kikutani H. a spol. (1986) Cell 47, 657-665).

V souladu s vynálezem byl nyní navržen způsob, kterým je možno produkovat mutantní proteiny 40 hIL-4-divokého typu, které mají vlastnosti hIL-4 antagonistů nebo parciálních hIL-4 agonistů.

Zejména antagonisté hIL-4 poskynutí možnost specificky potlačovat účinek hIL-4.

Pro tento účel se

- cDNA, obsahující DNA-oblast, které kóduje maturovanou oblast hIL-4, podrobí cílené oligonukleotidové mutagenezi (místně řízená mutagenese) tak, že se v požadované poloze (polohách) exprimuje zvolená jiná zmožných přirozených aminokyselin, nebo se přeruší stopkodonem polypeptidový řetězec,

- DNA-oblast, kódující mutovanou maturovanou oblast hIL-4, se integruje do expresního vektoru,

- vytvořený hybridní vektor se inzertuje do E.coli a

-2 CZ 283467 B6

- hIL-4-mutantní protein se exprimuje a popřípadě izoluje.

Pro pořízení cDNA, která obsahuje DNA-oblast, kódující maturovanou oblast hIL-4, nebo maturované oblasti hIL-4, je možno se obrátit na práci⁶⁾ a tam uvedenou literaturu. V uvedených souvislostech je pod výrazem cDNA, která kóduje maturovanou oblast hIL-4 také zahrnuta cDNA, která při téměř stejném počtu párů bází představuje konkrétně v uvedeném stavu techniky mutanty uvedené cDNA, pokud jsou tyto mutanty hIL-4 antagonisty nebo parciálními agonisty hIL-4.

Číslování maturované oblasti hIL-4 kódujících DNA-oblastí je provedeno podle Garra C. a spol., (Biochemistry (1991) 3 0, 1515-1523).

cDNA, která kóduje maturovanou oblast hIL-4, může být získána vyříznutím EcORV/BamHIfragmentu z genovou technologií vyrobených cDNA (např. od British Bio-Technology Ltd., Oxford, Anglie). DNA-fragment se intergruje po přídavku syntetických oligonukleotidů, např. 5'-CATGCACAAGTGCGAT a 5-ATCGCACTTGTG, které obsahují první 4 aminokyselinové kodony interleukinu-4 a dále kodon pro start methioninu, mezi expresní vektor, například mezi Ncil- a BamHI- místo štěpení expresního vektoru R^T3 pRC 109¹²⁾.

Místě řízená mutageneze může být provedena podle Kramera a spol. (Nucleic Acids Research (1984) 12, 9441-9455; Cell (1984) 38, 879-887 a Boehringer-Mannheim-Prospekt, Biohemicals for molecular Biology (1987) 35 etc., viz také^l2). K mutagenezi použitý oligopeptid může obsahovat asi 6 až 10 bází a asi 6 až 10 bází pod ní (němi) může být změněno.

Pro odborníka je také zřejmé, jak vyříznout mutovanou maturovanou oblast hIL-4 kódující DNAoblast z vektoru, převést ji do expresního vektoru, potom inzertovat do E.coli, jakož i exprimovat hIL-4 mutantní proteiny a jak provést jejich fakultativní izolaci (McCarthy a spol.: Gene (1986)41, 201-206; Kato a spol.; Biochem. Biophys, Res. Commun(1985)130, 692-699), přičemž jsou možné modifikace¹²⁵.

Podle speciálního provedení způsobu podle vynálezu se do cDNA, která obsahuje DNA-oblast, která kóduje maturovanou oblast hIL-4, inkorporuje DNA pro iniciátor-methionin, před tím, než se provede cílená oligonukleotidová mutageneze.

Podle další speciální formy provedení se může DNA-oblast, která kóduje mutovanou maturovanou oblast hIL-4, vystřihne z cDNA-mutantu jako nCol-BamHI-fragment.

Výhodně se pro expresi použije teplotou regulovaný expresní vektor, například pILA502 (bez nalevo se nacházejícího lambda-promotoru a polylinkeru) a/nebo obvyklý kmen E.coli jako hostitel, například JMI03 (recA ). U pILA502 srovnej s prací Schaudera a spol., (Gene(1987) 52, 279283). Další vhodné expresní systémy je možno získat od Pharmacia (Prokaryotic Gene Fusion Vectors). Kmen E.coli JM103 je možno také popřípadě získat od fy Pharmacia.

Podle dalšího způsobu provedení se vynález také týká hIL-4-mutantu divokého typu, ve kterém je v oblasti v poloze 124 Tyr vyměněn za Asp.

Dále je vynález blíže vysvětlen dvěma příklady.

-3CZ 283467 B6

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1 cDNA, která kóduje maturovanou oblast hIL-4 a počátek methioninu, se podrobí cílené oligonukleotidové mutagenezi podle Kramera a spol. Syntetický olinukleotid obsahuje 6 bází před a po vyměňovaném nukleotidu a byl vyroben pomocí DNA-syntetizátoru (Applied Biosystems. Modell 380).

Vyměňovaným místem byla poloha 124 v C-terminální, pravděpodobně α-helikální oblasti (polohy 110 až 129). Přitom byl Tyr zaměněn za Gly-. Získaná mutace byla ověřena sekvenční analýzou jednořetězcové bakteriofágové DNA. Mutovaná cDNA byla vyříznuta jako NcoI/BamHl-fragmet ze dvojřetězcové virové DNA a kombinována s teplotně regulovaným 15 expresním vektorem, který odpovídal pILA502 s tou výjimkou, že nalevo se nacházející lambdapromotor apolylinker chyběly. Jako hostitel byl použit recA- derivát kmenu E.coli JMI03. Integrovaná hIL-4-cDNA byla sekvenována za účelem ověření mutace. Potom byl kmen použit pro expresi muteinu.

Po expresi a izolaci se ukázalo, že mutein (Y124G) se váže s nezměněnou afinitou na receptor hIL-4. Nicméně maximální indukovaná proliferace aktivovaných periferních T-buněk činí jen 10 až 20 % proliferací indukovaných hIL-4-divokého typu. Toto ukazuje, že mutein Y124G vykazuje vlastnosti parciálního agonisty.

Příklad 2

Opakuje se příklad 1, ale v poloze 124 se exprimuje Asp místo Tyr. Izolovaný mutein Y124D nevykazuje ani při koncentraci 1 μΜ žádnou aktivitu proti aktivovaným periferním T-buňkám. 30 Potlačuje však aktivitu hIL-4-divokého typu s konstantou inhibitoru asi 600 pM. Toto ukazuje, že mutein Y124D má vlastnosti antagonisty. Mutein Y124D má malou zbytkovou aktivitu při indukci CD23 na aktivované B-buňky. Maximálně dosažitelná indukce však činí jen asi 5 % indukce dosahované hIL-4-divokého typu. Aktivita hIL-4-divokého typu se v tomto systému potlačuje muteinem Y124D s konstantou inhibitoru Ki asi 800 pM. Mutein Y124D měl v B35 buněčném systému také vlastnosti velmi slabého agonisty.

Příklad 3

Opakuje se příklad 1 stím rozdílem, že se v poloze 121 exprimuje Asp místo Arg. Izolovaný mutein vykazuje nezměněnou vazbu na hIL-4 receptor. Maximálně indukovatelná proliferace aktivovaných T-buněk však činí jen asi 30 % proliferace indukovatelné hIL-4-divokého typu. Toto ukazuje, že mutein R 121 D má vlastnosti parciálního agonisty.

Příklad 4

Opakuje se příklad 1 s tím rozdílem, že se v poloze 125 exprimuje Asp místo Ser. Izolovaný mutein S 125 D se váže s nezměněnou afinitou na receptor pro hIL-4. Maximálně indukovatelná 50 proliferace aktivovaných periferních T-buněk však činí jen asi 35 % proliferace indukovatelné hIL-4-divokého typu.

-4 CZ 283467 B6

Testy účinku hIL-4-mutantního proteinu

Pokusy k hodnocení patologického modelu vyvolaného IL-4 se provádí následujícím způsobem:

Zvířata:

Pro tento výzkum se použijí dospělé samičky opice cynomolgus (Macaca fasicularis, Charles River Primáte Imports, Boston, Mass.), vážící přibližně 4 až 6 kg. Všechna zvířata, použitá v tomto výzkumu, mají obvyklou kůži arespirační citlivost k proteinovému extraktu Ascaris suum. Všechna zvířata jsou ve výborném zdravotním stavu, v krevním oběhu mají obvyklý počet leukocytů a mají obvyklý chemismus krve. Zvířata jsou umístěna jednotlivě v prostorech s řízeným prostředím v otevřených klecích a dostávají jídlo dvakrát denně a vodu ad libitum. Všechna zvířata byla držena bez stravy po dobu přibližně 12 hodin před prvním dnem započetím výzkumu.

Reakce kůže na 11-4

Pro každý pokus se zvířata anestetikují intramuskulámí injekcí hydrochloridu ketaminu (Ketast, lOmg/kg). Hřbetní část každého zvířete se vystříhá a vyčistí 70% alkoholickým roztokem betadinu. 11-4 nebo mutantní 11-4 (10 pg) nebo vehikulum (0,2% lidské albuminové sérum. HSA) se injikuje podkožně do hřbetu zvířat v objemu 0,1 ml s použitím 1 ml tuberkulinové stříkačky. Místa vpichu jsou od sebe ve vzdálenosti nejméně 10 cm a označena nesmazatelným značkovačem. Vzorky tkáně pro biopsii se získají s použitím 6 mm odběrového nástroje pro biopsii a vzorky se umístí v (OTC) a zmrazí v kapalném dusíku. Biopsie se provádí v inervalu 0,4, 8 a 24 hodin po injekci.

Systémová reakce na 11-4 nebo mutantní 11-4

11-4 nebo mutantní 11-4 se podává subkutánně dvakrát denně (přibližně po 10 - 12 hodinách) po čtyři po sobě následující dny v objemu 0,1 ml/kg a dávce 0, 2,5, 25 nebo 250 pg/kg v celkové denní dávce 0, 5, 50 a 500 pg/kg v daném pořadí. Periferní krevní vzorek se každému zvířeti odebírá před první injekcí vehikula nebo IL-4 nebo mutatního 11-4 na začátku každého dne výzkumu au alikvotů se analyzuje na celkový počet krevních buněk a jejich diference, cytometrií se analyzují periferální mononukleámí krevní buňky se značeným povrchem. Zbytek krevních vzorků se odstředí aalikvoty plazmy se skladují při -70 °C pro následné analyzy hladiny chemokinu.

Příprava 11-4

Lyofilizovaný rekombinantní lidský 11-4 (E.Coli) se rekonstituuje ve sterilním lidském albuminovém seru o koncentraci 0,2 % (Baxter Healthcare Corp., Glendale, CA) při skladovací koncentraci 2,5 mg/ml. Přípravek 11-4 neobsahuje endotoxiny, jak bylo zjištěno pomocí testu lyzátu Limulus amoebocyte, který prokázal, že hladina endotoxinu je méně než 0,2 endotoxinových jednotek/ml, což je limitní citlivost testu.

Chemismus imunohistologie

Připravené zmrazené vzorky se ponechají do vyrovnání s teplotou místnosti, vysuší se na vzduchu a stabilizují v acetonu při 4 °C po dobu 5 min. Řezy se umístí na 5 min, do 10 mM PBS s0,l% BSA. Lokalizace VCAM-1 se provádí s použitím C313.3, monoklonovanou protilátkou lidského VCAM-1, která byla získána od M. E.Gerritsena zBayer Corporation. Irelevantní, vhodný imunoglobulin, který byl rovněž získán od M. E.Gerritsena z Bayer Corporation, se ve vhodné koncentraci použije jako látka pro srovnávací kontrolu. Endogenní biotin se blokuje za

-5CZ 283467 B6 použití blokovací soupravy Vector Biotin (Vector Laboratories. Burlingame, CA). Jednotlivé sekce se inkubují 1,5 hodiny při teplotě místnosti ve vlhké komoře s indikovanými antisery rozpuštěnými v PBS o koncentraci 0,1% BSA al% normálního králičího sera. Po trojím promytí PBS se řezy vybarví pomocí soupravy Vector ABC Elitě v souladu s pokyny k použití 5 akonjugát protilátky se detekuje inkubací řezů v 3-amino-9-ethylkarbazolu/peroxid vodíku (souprava AEC substrát, Vector). Řezy se pečlivě promyjí 0,1 M acetátovým pufrem, promyjí se destilovanou vodou a upevní v Lemerově AQUQ-MOUNT (Lemer Laboratories, Pittsburgh, PA).

ίο Vyhodnocení

Vzorky jsou vyhodnoceny dvěma nezávislými pozorovateli s použitím slepého pokusu stupnicí mezi 0 a 3+, umožňující odhad jak intensity, tak i distribuce vybarvení. Systém vyhodnocení pro expresi VCAM-1, který je založen na systému původně popsaném autory Brisco aost., (13) je 15 následující: 0 absence nebo slabé vybarvení nečetných cév, 1+ slabé zbarvení několika cév, 2+ vybarvení střední intensity většiny cév, 3+ intensivní vybarvení většiny cév. Krevní cesty byly identifikovány v sérii sekcí vybarvených pro stanovení von Willebrandova faktoru (polyklonovaný králičí antihumání VWF:, Dakoplatts, Carpinteria, CA)

Hematologie

Analýzy počtu erythrocytů, hematokritů, počtu leukocytů a počtu destiček se provádějí na heparizovaném krevním vzorku za použití krevního analyzeru Serono 9000 (Baker Diagnostics, Allentown, PA). Rozdíly v leukocytech byly hodnoceny rychlým stanovením (Diff-Quick) 25 vybarvených krevních skvrn, kde je spočteno celkové množství dvou set buněk a procenta každého typu buněk jsou zaznamenány.

Průtoková cytometrie

Analýza povrchového značení periferních mononukleámích krevních buněk (PBMC) se provádí následujícím způsobem. Vzorek 4 ml heparinizované krve se rozpustí vHankově rovnovážném solném roztoku (HBSS, bez Mg++ nebo Ca++) a přenese se do 4 ml Percollu (o hustotě 1070 gm/ml). Zkumavky se centrifugují při 1800 otáčkách za minutu (Beckman GS-6R) po dobu 20 minut při teplotě 24 °C. Vrstva obsahující lymfocyty se odsaje a centrifuguje při 1100 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Výsledný buněčný koláč se opět suspenduje v 6 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnany (PBS), obsahujícím 0,1 % azidu a 5 % kozího sera. Alikvoty 1 ml se použijí pro analýzu povrchového značení buněk, jak se popisuje níže.

Protilátky proti CD 2, CD 4, CD 8, CD 1 lb, CD 16, CD 25, CD 49 a HLA-DR (R&D Systems, 40 Minneapolis, MN) se použijí pro analýzy průtokovou cytometrií. Alikvoty 20 μΐ značených protilátek se inkubují s 1 ml alikvoty buněčné suspenze v temnu po dobu 60 minut při teplotě 4 °C a vzorky se centrifugují (1000 otáček za minutu, 10 minut při teplotě 4 °C). Koláče se promyjí třikrát 1 ml PBS obsahujícím 0,1 % azidu a 5 % kozího sera, potom se provádí analýza FAC.

Chemokinový test (MCP-1)

Na vzorcích plasmy, získaných během každé studie, se analyzuje hladina MCP-1 specifickou ELIS A, jak bylo dříve popsáno (19,20). Na 96 vzorkovacích destiček (Nunc, Kamstrup, Dánsko) 50 se nanese 50 μΐ/vzorek králičí anti-MCP-1 na dobu 16 hodin při teplotě 4 °C a potom se promyje

PBS, pH 7,5, 0,05 % Tween-20 (promývací pufr). Nespecifická spojovací místa se blokují 2 % BSA v PBS (200 μΐ) a destičky se inkubují po dobu 90 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyjí třikrát pufrem, přidá se rozpuštěný stejný (čistý, 1:5 a 1:10) testovací vzorek (50 μΐ),

-6 CZ 283467 B6 následuje inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Destičky se čtyřikrát promyjí a přidává se 50 μΐ/vzorku biotinylovaného králičího anti-MCP-1 po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyjí čtyřikrát, přidá se konjugát straptavidin-peroxidáza (100 μΐ/ml) (Dakopatts, Carpintería, CA) a destičky se inkubují po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Destičky se třikrát 5 promyjí a přidá se 100 μΐ chromogenního substrátu (0,67 mg/ml dichloridu ortofenylendiaminu) (Dakopatts, Carpintería, CA). Destičky se inkubují při teplotě 25 °C po dobu 6 minut a reakce se ukončí roztokem 50 μΐ/vzorek 3 M H2SO4 v promývacím pufru s 2 % FCS. Destičky se vyhodnotí při 490 nm v přístroji ELISA. Standardem je 0,5 log roztok rekombinantní MCP-1 od 100 ng/ml do 1 pg/ml (50 μΐ/vzorek). ELISA detekuje spolehlivě koncentrace MCP-1 > 10 50 pg/ml.

Statistická analýza

Data ze všech pokusů se statisticky vyhodnocují s použitím nepárového Studentova t-testu, kde 15 p hodnota < 0,05 se považuje za statisticky významnou.

Model astmatu u primátů - 10-denní experiment

Methody:

Zvířata

Pro tyto studie se použijí dospělé samičky opice cynomolus (Macaca fasicularis, Charles River Primáte Imports, Boston, MA), o váze 4 - 6 kg. Všechna zvířata, použitá v této studii, mají kůži, 25 která se běžně vyskytuje a respirační citlivost k proteinovému extraktu Ascaris suum. Všechna zvířata byla ve výborném zdravotním stavu, v krevním oběhu měla obvyklý výskyt leukocytů a obvyklý chemismus krve. Zvířata byla umístěna jednotlivě v prostorech s řízeným prostředím v otevřených klecích a dostávala jídlo dvakrát denně a vodu ad libitum. Všechna zvířata byla držena bez stravy po dobu přibližně 12 hodin před prvním dnem experimentu. Všechny 30 protokoly prověřil a schválil Bayer Corporation Intemal Animal Care and Use Committee.

Zvířata byla podrobena vyšetřování po anestezi hydrochloridem ketaminu (4 mg/kg, i.m.; Ketaset; Bristol Laboratories, Syracuse, N.Y.), axylazinem (1 mg/kg, i.m.; Rompun; Miles Laboratories, lne., Elkhart, Ind.), intubovány pomocí zavedené endotracheální trubičky (5,5 mm 35 ID, Mallinckrodt Critical Care, St. Louis, Mo.) a byly umístěny ve vzpřímené pozici ve specielně navržené podpůrné židli. Ketamin (4 mg/kg, i.m.) se používal samostatně podle potřeby k podpoře anesteze.

Protokol o studii

Citlivost dýchacích cest (metacholin PC100), sledovaná podle složení buněk dýchacích cest (bronchoalveolar lavage, BAL) byla stanovována 3 dny před (den 0) a 3 dny po (den 10) inhalaci extraktu Ascaris suum třikrát obden (dny 3, 5, 7). Zvířatům byl poskytnut čas k relaxaci po dobu 4 až 6 týdnů mezi výzkumy, aby se citlivost dýchacích cest a záněty mohly vrátit k původní (pre45 antigen) hodnotě. Zpracování výzkumu bylo prováděno ve srovnání s kontrolní studií s vehikulem, aby se zajistilo, že nedošlo k žádným změnám v citlivosti k antigenu v závislosti na čase.

Při experimentálním provádění pokusů (R121D/Y124D IL-4 mutein nebo dexametazon) byla 50 zvířata dávkována druhého dne studie (podkožní injekce) a každý následující den až do devátého dne studie. Lyofilizovaný rekombinantní lidský R121D/Y124D IL-4 byl rekonstituován ve sterilním 0,2 % lidském séru albuminu HSA, Baxter Healthcarea Corp., Glendale, CA) má užívanou koncentraci 2,5 mg/1. Přípravek R121D/Y124D IL-4 neobsahoval endotoxiny, jak bylo

-7 CZ 283467 B6 zjištěno pomocí testu lyzátu Limulus amoebocyte, který prokázal, že hladina endotoxinu byla méně než 0,2 endotoxinových jednotek/ml, což je limitní citlivost testu. Dexamethason je obchodně dodávaný a prodávají jej externí prodejci.

Citlivost dýchacích cest

Citlivost dýchacích cest byla stanovena určením koncentrace rozprášeného a inhalovaného metacholinu, který způsobuje 100 % zvýšení rezistence dýchacích cest při průchodu vzduchu do plic a z plic. Toto se ukončí podáním zvýšené koncentrace metacholinu (rozpuštěný v solném fosfátovém pufru) v polovičních logaritmických krocích, dokud se nedosáhne > 100 % zvýšení rezistence dýchacích cest. PC 100 se pak vyčíslí lineární regresní analýzou posledních 2 nebo 3 bodů na logaritmické závislosti koncentrace metacholinu oproti procentnímu zvýšení v diagramu rezistence dýchacích cest.

Bronchoalveolámí výplach (BAL)

Složení buněk dýchacích cest se určuje pomocí BAL. Pediatrický fiberoptický bronchoskop (model BF-3C4, Olympus Corp., Lake Success, N.Y.) se zavede podél prsní kosti, dokud nedosáhne páté až sedmé generace bronchů. Potom se zavede a jemně se aspiruje kanálkem bronchoskopu jeden alikvot 15 ml bikarbonátu pufrovaného normální solí (pH 7,4). Celkový počet leukocytů v mililitru kapaliny BAL se stanoví počítáním hemocytometrem. Počítání odlišných buněk (bylo spočteno celkem 200 buněk) se provádí na barevných Wright-Giemsa cytocentrifugálních přípravcích. K zamezení vlivů primárních BAL na následné BAL, se provádějí BALy před a po testování antigenů na opačných stranách plic.

Statistická analýza

Data ze všech pokusů se statisticky vyhodnocují s použitím nepárového Studentova testu, kde p hodnota < 0, 05 se považuje za statisticky významnou.

Výsledky

Vlivy na eosinophilie dýchacích cest vyvolané antigenem

Opakované inhalace antigenů vyvolávají záněty dýchacích cest, jak indikuje velký počet regenerovaných eosinofilů v kapalině BAL. Aplikace R121D/Y124D IL-4 muteinu v dávce 500 pg/kg, b.i.d, výrazně inhibuje průnik eosinofilů do plic.

V další sérii studií byl zkoumán vliv dexametazonu. Podávání dexametazonu v dávce 200 pg/kg výrazně inhibuje eosinofilii dýchacích cest, vyvolanou antigenem podobně jako při podávání 11-4 dvojitého muteinu.

Vliv na přeitlivělost dýchacích cest způsobenou antigenem

Během srovnávací studie (bez podávání přípravků) se citlivost dýchacích cest zvýší více než pětkrát. Podávání R121D/Y124D IL-4 muteinu (500 pg/kg, b.i.d.) výrazně inhibuje zvýšení přecitlivělosti dýchacích cest vůči inhalovanému metacholinu. Během druhého srovnávacího pokusu se citlivost vůči inhalovanému metacholinu opět zvýší více jak pětkrát.

V další sérii studií podávání dexametazonu (200 pg/kg) výrazně inhibuje zvýšení citlivosti dýchacích cest k inhalovanému metacholinu způsobené antigenem.

-8CZ 283467 B6

Diskuze

Některé charakteristiky astmatických dýchacích cest se vyznačují přítomností zánětů dýchacích cest, poškozením epitelu dýchacích cest a přecitlivělostí dýchacích cest. Přecitlivělost dýchacích 5 cest je důležitou složkou patologie astmatu a může se definovat jako nepřiměřené stažení bronchů v důsledku reakce na počet inhalovaných látek ve srovnání s reakcí normálních subjektů. Přestože přesný patologický mechanismus (mechanismy) zůstává neznámý, přecitlivělost dýchacích cest se považuje za důsledek chronického zánětu dýchacích cest a jeho zhoubného vlivu na dýchací cesty.

Výsledky studie s R121D/Y124D IL-4 muteinu ukazují, že podávání inhibuje jak záněty dýchacích cest, vyvolané antigenem, tak i přecitlivělost dýchacích cest. Podle výsledků se dá předpokládat, že R121D/Y124D IL-4 mutein by mohl být pro pacienty trpící astmatem a alergií přínosný.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se vněm v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, nebo je aminokyselinová sekvence ukončena

25 v jedné z těchto poloh, s výjimkou muteinu kde je tyrosin v poloze 124 nahrazen kyselinou asparagovou.
2. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 1, kde uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina tyrosin, která

30 se přirozeně vyskytuje v poloze 124 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou s výjimkou kyseliny asparagové.
3. Mutantní hIL-
4 protein podle nároku 2, kde uvedený tyrosin je nahrazen glycinem.

35 4. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 1, kde uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina arginin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 121 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
5. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 4, kde uvedený arginin je nahrazen kyselinou 40 asparagovou.
6. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 1, kde uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina serin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 125, je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
7. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 6, kde uvedený serin je nahrazen kyselinou asparagovou.

-9CZ 283467 B6
8. Terapeutické činidlo pro ošetření alergických procesů vyznačující se tím, že obsahuje

a) mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, nebo je aminokyselinová sekvence ukončena v jedné z těchto poloh a

b) fyziologicky přijatelný nosič.
9. Terapeutické činidlo podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina tyrosin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 124, je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
10. Terapeutické činidlo podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvedený tyrosin je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny, zahrnující kyselinu asparagovou a glycin.
11. Terapeutické činidlo podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina arginin, která se objevuje přirozeně v poloze 121 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
12. Terapeutické činidlo podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený arginin je nahrazen kyselinou asparagovou.
13. Terapeutické činidlo podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina serin, která se přirozeně objevuje v poloze 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
14. Terapeutické činidlo podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený serin je nahrazen kyselinou asparagovou.