JP2003174894A - ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびにそれらの製造法 - Google Patents
ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびにそれらの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト
（拮抗薬）であるか又は部分的アゴニスト（作動薬）で
ある治療薬の提供。 【解決手段】 ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的
アゴニストであるか、あるいはこれらのアンタゴニスト
又は部分的アゴニストを含み、アンタゴニスト又は部分
的アゴニストが突然変異ｈＩＬ−４タンパク質でありこ
とを特徴とする治療薬を利用できるようにすることによ
り達成された。治療薬の選択は、標的化された態様で、
遺伝子工学を用い、野生型ｈＩＬ−４と類似しているた
めにｈＩＬ−４レセプターの占有に関してｈＩＬ−４と
競合するタンパク質を製造できるという利点を有する。
さらに突然変異ｈＩＬ−４タンパク質ならびにそれらの
製造法を利用できるようにすることも本発明の目的であ
る。
（拮抗薬）であるか又は部分的アゴニスト（作動薬）で
ある治療薬の提供。 【解決手段】 ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的
アゴニストであるか、あるいはこれらのアンタゴニスト
又は部分的アゴニストを含み、アンタゴニスト又は部分
的アゴニストが突然変異ｈＩＬ−４タンパク質でありこ
とを特徴とする治療薬を利用できるようにすることによ
り達成された。治療薬の選択は、標的化された態様で、
遺伝子工学を用い、野生型ｈＩＬ−４と類似しているた
めにｈＩＬ−４レセプターの占有に関してｈＩＬ−４と
競合するタンパク質を製造できるという利点を有する。
さらに突然変異ｈＩＬ−４タンパク質ならびにそれらの
製造法を利用できるようにすることも本発明の目的であ
る。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】今日、アレルギーに苦しんで
いる人口の割合は高い。空気の汚染の進行及び環境中に
拡散するアレルギー誘起物質の数の増加は、おそらく将
来特に子供においてさらにアレルギーの数が増加するで
あろうことを予想させる。この理由でアレルギー過程の
経路に介在しうる薬剤の開発が緊急に必要である。
いる人口の割合は高い。空気の汚染の進行及び環境中に
拡散するアレルギー誘起物質の数の増加は、おそらく将
来特に子供においてさらにアレルギーの数が増加するで
あろうことを予想させる。この理由でアレルギー過程の
経路に介在しうる薬剤の開発が緊急に必要である。
【０００２】
【従来の技術】ヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）
はリンパ系細胞及び骨髄細胞の増殖、成熟、生存及び分
化を誘導し、協調させる（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）多数
のサイトカインの１つである（１−３）。特にｈＩＬ−
４はＩｇＥ−媒介免疫反応に関与し、胸腺細胞及び活性
化Ｔ細胞の増殖を直接加速する。１４０，０００Ｍｒの
高親和性ＩＬ−１レセプタータンパク質を同定すること
ができ、それはそのｃＤＮＡ配列により８００アミノ酸
残基を含む（４）。このタンパク質はヘマトポイエチン
レセプタースーパーファミリーと名付けられた最近記載
されたレセプターの群に属する（５）。
はリンパ系細胞及び骨髄細胞の増殖、成熟、生存及び分
化を誘導し、協調させる（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）多数
のサイトカインの１つである（１−３）。特にｈＩＬ−
４はＩｇＥ−媒介免疫反応に関与し、胸腺細胞及び活性
化Ｔ細胞の増殖を直接加速する。１４０，０００Ｍｒの
高親和性ＩＬ−１レセプタータンパク質を同定すること
ができ、それはそのｃＤＮＡ配列により８００アミノ酸
残基を含む（４）。このタンパク質はヘマトポイエチン
レセプタースーパーファミリーと名付けられた最近記載
されたレセプターの群に属する（５）。
【０００３】クローニングされたｃＤＮＡに基づき
（６）、成熟ＩＬ−４のアミノ酸配列は１２９残基を含
む。このｃＤＮＡはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（７，
８）及び酵母（９）で発現された。高い生物学的活性を
有する組み換えＩＬ−４をこれらの供給源から単離する
ことができる。
（６）、成熟ＩＬ−４のアミノ酸配列は１２９残基を含
む。このｃＤＮＡはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（７，
８）及び酵母（９）で発現された。高い生物学的活性を
有する組み換えＩＬ−４をこれらの供給源から単離する
ことができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】アレルギー過程におけ
るＩＬ−４の役割は、インターロイキン−４−媒介過程
を阻害するか、又はｈＩＬ−４と競合する物質が疾患−
誘起反応連鎖を中断させるであろうことを予想させる。
るＩＬ−４の役割は、インターロイキン−４−媒介過程
を阻害するか、又はｈＩＬ−４と競合する物質が疾患−
誘起反応連鎖を中断させるであろうことを予想させる。
【０００５】従ってその活性成分がヒトインターロイキ
ン４のアンタゴニスト（拮抗薬）であるか又は部分的ア
ゴニスト（作動薬）である治療薬を利用できるようにす
ることは、本発明の目的である。
ン４のアンタゴニスト（拮抗薬）であるか又は部分的ア
ゴニスト（作動薬）である治療薬を利用できるようにす
ることは、本発明の目的である。
【０００６】ごく最近、ヒトインターロイキン４に対し
てアンタゴニスト性を示すモノクローナル抗体が見いだ
された（１０）。この抗体はＦａｂフラグメントを含
み、ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系により生産され
る。さらに（非−）グリコシル化ヒトＩＬ−４に対して
免疫化されたラットの脾臓細胞からのハイブリドーマ細
胞系はｈＩＬ−４に対するモノクローナル抗体を生産す
る（１１）。
てアンタゴニスト性を示すモノクローナル抗体が見いだ
された（１０）。この抗体はＦａｂフラグメントを含
み、ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系により生産され
る。さらに（非−）グリコシル化ヒトＩＬ−４に対して
免疫化されたラットの脾臓細胞からのハイブリドーマ細
胞系はｈＩＬ−４に対するモノクローナル抗体を生産す
る（１１）。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記の目的は本発明に従
う、ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的アゴニスト
であるか、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的
アゴニストを含み、アンタゴニスト又は部分的アゴニス
トが突然変異ｈＩＬ−４タンパク質であることを特徴と
する治療薬を利用できるようにすることにより達成され
た。本発明の治療薬の選択は、標的化された態様で“遺
伝子工学”を用い、野生型ｈＩＬ−４と類似しているた
めにｈＩＬ−４レセプターの占有に関してｈＩＬ−４と
競合するタンパク質を製造できるという利点を有する。
う、ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的アゴニスト
であるか、あるいはこれらのアンタゴニスト又は部分的
アゴニストを含み、アンタゴニスト又は部分的アゴニス
トが突然変異ｈＩＬ−４タンパク質であることを特徴と
する治療薬を利用できるようにすることにより達成され
た。本発明の治療薬の選択は、標的化された態様で“遺
伝子工学”を用い、野生型ｈＩＬ−４と類似しているた
めにｈＩＬ−４レセプターの占有に関してｈＩＬ−４と
競合するタンパク質を製造できるという利点を有する。
【０００８】さらに突然変異ｈＩＬ−４タンパク質なら
びにそれらの製造法を利用できるようにすることも本発
明の目的である。
びにそれらの製造法を利用できるようにすることも本発
明の目的である。
【０００９】ｈＩＬ−４は例えばＥ．コリにおける遺伝
子操作により組み換えタンパク質（ｒｈＩＬ−４）とし
て生産することができる。これらの状況下で形成される
タンパク質は可溶化、再生及び単離することができる。
そのｒｈＩＬ−４は高い生物学的な比活性を有し、それ
は例えば活性化Ｔ細胞のＤＮＡ合成／増殖、あるいは活
性化Ｂ細胞のＣＤ２３発現の測定により決定することが
できる（例えばＫｒｕｓｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９
１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８６，５８−６０；Ｋｉ
ｋｕｔａｎｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｃｅｌ
ｌ ４７，６５７−６６５を参照）。
子操作により組み換えタンパク質（ｒｈＩＬ−４）とし
て生産することができる。これらの状況下で形成される
タンパク質は可溶化、再生及び単離することができる。
そのｒｈＩＬ−４は高い生物学的な比活性を有し、それ
は例えば活性化Ｔ細胞のＤＮＡ合成／増殖、あるいは活
性化Ｂ細胞のＣＤ２３発現の測定により決定することが
できる（例えばＫｒｕｓｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９
１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８６，５８−６０；Ｋｉ
ｋｕｔａｎｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｃｅｌ
ｌ ４７，６５７−６６５を参照）。
【００１０】本発明によれば、ｈＩＬ−４アンタゴニス
ト又は部分的ｈＩＬ−４アゴニストの性質を有するｈＩ
Ｌ−４野生型の突然変異タンパク質を製造できる方法が
現に設計された。特にｈＩＬ−４のアンタゴニストはｈ
ＩＬ−４の効果を特異的に阻害する可能性を与える。こ
の目的で、 −ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を含む
ｃＤＮＡに、可能な天然のアミノ酸から選択された異な
るアミノ酸が所望の位置で発現されるように、又は停止
コドンによりポリペプチド鎖の中断が生ずるように標的
オリゴヌクレオチド突然変異誘発（部位特異的突然変異
誘発）を行い、 −突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードす
るＤＮＡ領域を発現ベクターに組み込み、 −形成されたハイブリッドベクターをＥ．コリ中に挿入
し、 −突然変異ｈＩＬ−４タンパク質を発現させ、適宜単離
する。
ト又は部分的ｈＩＬ−４アゴニストの性質を有するｈＩ
Ｌ−４野生型の突然変異タンパク質を製造できる方法が
現に設計された。特にｈＩＬ−４のアンタゴニストはｈ
ＩＬ−４の効果を特異的に阻害する可能性を与える。こ
の目的で、 −ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を含む
ｃＤＮＡに、可能な天然のアミノ酸から選択された異な
るアミノ酸が所望の位置で発現されるように、又は停止
コドンによりポリペプチド鎖の中断が生ずるように標的
オリゴヌクレオチド突然変異誘発（部位特異的突然変異
誘発）を行い、 −突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードす
るＤＮＡ領域を発現ベクターに組み込み、 −形成されたハイブリッドベクターをＥ．コリ中に挿入
し、 −突然変異ｈＩＬ−４タンパク質を発現させ、適宜単離
する。
【００１１】
【発明の実施の形態】ｈＩＬ−４の成熟領域をコードす
るＤＮＡ領域を含むか、又はｈＩＬ−４の成熟領域をコ
ードするｃＤＮＡの入手に関し、（６）及びそこに挙げ
られている文献を参照する。このような関係において
“ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするｃＤＮＡ”は、そ
う称せられるｈＩＬ−４突然変異タンパク質がやはりア
ンタゴニスト又は部分的アゴニストであるならば、大体
同数の塩基対を有するが該技術の現状において特に示さ
れているｃＤＮＡの突然変異体を与えるｃＤＮＡを意味
するとも理解される。 ｈＩＬ−４の成熟領域をコード
するＤＮＡ領域の番号付けはＧａｒｒ，Ｃ．ｅｔ ａ
ｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１） ３０，
１５１５−１５２３）に従う。
るＤＮＡ領域を含むか、又はｈＩＬ−４の成熟領域をコ
ードするｃＤＮＡの入手に関し、（６）及びそこに挙げ
られている文献を参照する。このような関係において
“ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするｃＤＮＡ”は、そ
う称せられるｈＩＬ−４突然変異タンパク質がやはりア
ンタゴニスト又は部分的アゴニストであるならば、大体
同数の塩基対を有するが該技術の現状において特に示さ
れているｃＤＮＡの突然変異体を与えるｃＤＮＡを意味
するとも理解される。 ｈＩＬ−４の成熟領域をコード
するＤＮＡ領域の番号付けはＧａｒｒ，Ｃ．ｅｔ ａ
ｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１） ３０，
１５１５−１５２３）に従う。
【００１２】ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするｃＤＮ
Ａは、遺伝子操作により生産されたｃＤＮＡ（例えばＢ
ｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔ
ｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄから）からＥｃｏ
ＲＶ／ＢａｍＨＩフラグメントを切断することにより得
ることができる。インターロイキン４の最初の４つのア
ミノ酸コドン及び開始メチオニンのためのコドンを含
む、例えば５’−ＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴ及
び５’−ＡＴＣＧＣＡＣＴＴＧＴＧなどの合成オリゴヌ
クレオチドを 加え、ＤＮＡフラグメントを発現ベクタ
ー中に、例えば発現ベクター ＲＴＧｐＲＣ１０９のＮ
ｃｏＩとＢａｍＨＩ切断部位の間に組み込む（１２）。
Ａは、遺伝子操作により生産されたｃＤＮＡ（例えばＢ
ｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔ
ｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄから）からＥｃｏ
ＲＶ／ＢａｍＨＩフラグメントを切断することにより得
ることができる。インターロイキン４の最初の４つのア
ミノ酸コドン及び開始メチオニンのためのコドンを含
む、例えば５’−ＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴ及
び５’−ＡＴＣＧＣＡＣＴＴＧＴＧなどの合成オリゴヌ
クレオチドを 加え、ＤＮＡフラグメントを発現ベクタ
ー中に、例えば発現ベクター ＲＴＧｐＲＣ１０９のＮ
ｃｏＩとＢａｍＨＩ切断部位の間に組み込む（１２）。
【００１３】部位特異的突然変異誘発はＫｒａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（１９８４） １２，９４４１−９４５５；Ｃ
ｅｌｌ（１９８４） ３８，８７９−８８７；及びＢｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ ｃａｔａｌｏｇ
ｕｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）３５など、（１
２）も参照）に従って行うことができる。突然変異誘発
に用いられるオリゴヌクレオチドは、改変するべき塩基
の上流に約６−１０塩基、及び下流に６−１０塩基を含
むことができる。
ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（１９８４） １２，９４４１−９４５５；Ｃ
ｅｌｌ（１９８４） ３８，８７９−８８７；及びＢｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ ｃａｔａｌｏｇ
ｕｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）３５など、（１
２）も参照）に従って行うことができる。突然変異誘発
に用いられるオリゴヌクレオチドは、改変するべき塩基
の上流に約６−１０塩基、及び下流に６−１０塩基を含
むことができる。
【００１４】当該技術分野における熟練者は、突然変異
を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領
域のベクターからの切り出し、このＤＮＡ領域の発現ベ
クターへの転移、続く発現ベクターのＥ．コリ中への挿
入、ならびに突然変異ｈＩＬ−４タンパク質の発現及び
その任意の単離にも慣れており（ＭｃＣａｒｔｈｙｅｔ
ａｌ．；Ｇｅｎｅ（１９８６） ４１，２０１−２０
６；Ｋａｔｏ ｅｔａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８５） １３
０，６９２−６９９）、それに伴う改変（１２）が可能
である。
を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領
域のベクターからの切り出し、このＤＮＡ領域の発現ベ
クターへの転移、続く発現ベクターのＥ．コリ中への挿
入、ならびに突然変異ｈＩＬ−４タンパク質の発現及び
その任意の単離にも慣れており（ＭｃＣａｒｔｈｙｅｔ
ａｌ．；Ｇｅｎｅ（１９８６） ４１，２０１−２０
６；Ｋａｔｏ ｅｔａｌ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８５） １３
０，６９２−６９９）、それに伴う改変（１２）が可能
である。
【００１５】本発明の特定の実施態様に従い、部位特異
的突然変異誘発を行う前に開始メチオニンをコードする
ＤＮＡを、ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領
域を含むｃＤＮＡ中に挿入する。
的突然変異誘発を行う前に開始メチオニンをコードする
ＤＮＡを、ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領
域を含むｃＤＮＡ中に挿入する。
【００１６】さらに特定の実施態様に従い、突然変異を
起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域
を、ｃＤＮＡ突然変異体からＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラ
グメントとして切り出すことができる。
起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域
を、ｃＤＮＡ突然変異体からＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラ
グメントとして切り出すことができる。
【００１７】発現のために温度−調節発現ベクター、例
えばｐＩＬＡ５０２（左 発現のために温度−調節発現
ベクター、例えばｐＩＬＡ５０２（左 （ｌｅｆｔ−ｈ
ａｎｄ）ラムダプロモーター及びポリリンカーを含まな
い）及び／又は宿主として普通のＥ．コリ株、例えばＪ
Ｍ１０３（ｒｅｃＡ−）を用いるのが好ましい。ｐＩＬ
Ａ５０２に関し、Ｓｃｈａｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇ
ｅｎｅ（１９８７）５２，２７９−２８３）を参照され
たい。さらに適した発現系はＰｈａｒｍａｃｉａから得
ることができる（“Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ
Ｆｕｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”）。Ｅ．コリ株ＪＭ
１０３もＰｈａｒｍａｃｉａから得ることができる。
えばｐＩＬＡ５０２（左 発現のために温度−調節発現
ベクター、例えばｐＩＬＡ５０２（左 （ｌｅｆｔ−ｈ
ａｎｄ）ラムダプロモーター及びポリリンカーを含まな
い）及び／又は宿主として普通のＥ．コリ株、例えばＪ
Ｍ１０３（ｒｅｃＡ−）を用いるのが好ましい。ｐＩＬ
Ａ５０２に関し、Ｓｃｈａｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇ
ｅｎｅ（１９８７）５２，２７９−２８３）を参照され
たい。さらに適した発現系はＰｈａｒｍａｃｉａから得
ることができる（“Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ
Ｆｕｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”）。Ｅ．コリ株ＪＭ
１０３もＰｈａｒｍａｃｉａから得ることができる。
【００１８】さらに別の実施態様に従い、本発明は野生
型ｈＩＬ−４の突然変異体に関し、その突然変異体では
位置１２４の領域でＴｙｒがＡｓｐにより置換されてい
る。
型ｈＩＬ−４の突然変異体に関し、その突然変異体では
位置１２４の領域でＴｙｒがＡｓｐにより置換されてい
る。
【００１９】本発明を２つの実施例を用い、下記におい
てより詳細に説明する。
てより詳細に説明する。
【００２０】
【実施例】実施例１
ｈＩＬ−４の成熟領域及び開始メチオニンをコードする
ｃＤＮＡにＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．に従って部位特
異的突然変異誘発を行った。合成オリゴヌクレオチドは
置換するべきヌクレオチドの上流及び下流に６塩基含
み、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｍｏｄｅｌ ３８０）を用いて生産した。置換す
るべき部位は、おそらくα−らせんであるＣ−末端領域
（位置１１０−１２９）の位置１２４であった。この場
合、ＴｙｒをＧｌｙに置換した。起こった突然変異は１
本鎖バクテリオファージＤＮＡのＤＮＡ配列分析により
確かめられた。突然変異ｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとして２本鎖ウィルスＤＮＡから切り出
し、左ラムダプロモーター及びポリリンカーがない以外
はｐＩＬＡ５０２に相当する温度−調節発現ベクターと
結合させた。Ｅ．コリ株ＪＭ１０３のｒｅｃＡ−誘導体
を宿主として用いた。組み込みｈＩＬ−４ ｃＤＮＡを
配列決定し、突然変異を確認した。その後、突然変異タ
ンパク質の発現に株を用いた。
ｃＤＮＡにＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．に従って部位特
異的突然変異誘発を行った。合成オリゴヌクレオチドは
置換するべきヌクレオチドの上流及び下流に６塩基含
み、ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｍｏｄｅｌ ３８０）を用いて生産した。置換す
るべき部位は、おそらくα−らせんであるＣ−末端領域
（位置１１０−１２９）の位置１２４であった。この場
合、ＴｙｒをＧｌｙに置換した。起こった突然変異は１
本鎖バクテリオファージＤＮＡのＤＮＡ配列分析により
確かめられた。突然変異ｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとして２本鎖ウィルスＤＮＡから切り出
し、左ラムダプロモーター及びポリリンカーがない以外
はｐＩＬＡ５０２に相当する温度−調節発現ベクターと
結合させた。Ｅ．コリ株ＪＭ１０３のｒｅｃＡ−誘導体
を宿主として用いた。組み込みｈＩＬ−４ ｃＤＮＡを
配列決定し、突然変異を確認した。その後、突然変異タ
ンパク質の発現に株を用いた。
【００２１】発現及び単離の後、突然変異タンパク質
（Ｙ１２４Ｇ）はｈＩＬ−４のレセプターに変わらぬ親
和力で結合することが見いだされた。しかし誘導可能な
最大の活性化末梢Ｔ細胞の増殖は今や、ｈＩＬ−４野生
型により誘導可能な増殖のわずか１０−２０％である。
これは突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｇが部分的アゴニス
トの性質を有することを示す。
（Ｙ１２４Ｇ）はｈＩＬ−４のレセプターに変わらぬ親
和力で結合することが見いだされた。しかし誘導可能な
最大の活性化末梢Ｔ細胞の増殖は今や、ｈＩＬ−４野生
型により誘導可能な増殖のわずか１０−２０％である。
これは突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｇが部分的アゴニス
トの性質を有することを示す。
【００２２】実施例２
位置１２４においてＴｙｒの代わりにＡｓｐを発現する
以外は実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質
Ｙ１２４Ｄは１μＭの濃度でも活性化末梢Ｔ細胞に対し
て活性を示さなかった。しかしこれはｈＩＬ−４野生型
の活性を、約６００ｐＭの阻害定数で阻害する。これは
突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄがアンタゴニストの性質
を有することを示す。突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄは
活性化Ｂ細胞上のＣＤ２３の誘導に関して小さい残留活
性を有する。しかし達成できる最大の誘導はｈＩＬ−４
野生型の場合に達成できる誘導のわずか約５％である。
この系の場合、ｈＩＬ−４野生型の活性は約８００ｐＭ
の阻害定数で突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄにより阻害
される。かくしてＢ細胞系において突然変異タンパク質
Ｙ１２４Ｄは非常に弱いアゴニストの性質を有する。
以外は実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質
Ｙ１２４Ｄは１μＭの濃度でも活性化末梢Ｔ細胞に対し
て活性を示さなかった。しかしこれはｈＩＬ−４野生型
の活性を、約６００ｐＭの阻害定数で阻害する。これは
突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄがアンタゴニストの性質
を有することを示す。突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄは
活性化Ｂ細胞上のＣＤ２３の誘導に関して小さい残留活
性を有する。しかし達成できる最大の誘導はｈＩＬ−４
野生型の場合に達成できる誘導のわずか約５％である。
この系の場合、ｈＩＬ−４野生型の活性は約８００ｐＭ
の阻害定数で突然変異タンパク質Ｙ１２４Ｄにより阻害
される。かくしてＢ細胞系において突然変異タンパク質
Ｙ１２４Ｄは非常に弱いアゴニストの性質を有する。
【００２３】実施例３
位置１２１においてＡｒｇの代わりにＡｓｐを発現する
以外は実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質
のｈＩＬ−４レセプターへの結合は変わらなかった。し
かし誘導することができる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖
は、ｈＩＬ−４野生型の場合に誘導される増殖のわずか
約３０％であった。これは、突然変異タンパク質Ｒ１２
１Ｄが部分的アゴニストの性質を有することを示す。 実施例４ 位置１２５においてＳｅｒの代わりにＡｓｐを発現する
以外は実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質
Ｓ１２５ＤはｈＩＬ−４のレセプターに変わらぬ親和力
で結合した。しかし誘導できる活性化末梢Ｔ細胞の最大
増殖はｈＩＬ−４野生型の場合に誘導される増殖のわず
か約３５％である。
以外は実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質
のｈＩＬ−４レセプターへの結合は変わらなかった。し
かし誘導することができる活性化末梢Ｔ細胞の最大増殖
は、ｈＩＬ−４野生型の場合に誘導される増殖のわずか
約３０％であった。これは、突然変異タンパク質Ｒ１２
１Ｄが部分的アゴニストの性質を有することを示す。 実施例４ 位置１２５においてＳｅｒの代わりにＡｓｐを発現する
以外は実施例１を繰り返した。単離突然変異タンパク質
Ｓ１２５ＤはｈＩＬ−４のレセプターに変わらぬ親和力
で結合した。しかし誘導できる活性化末梢Ｔ細胞の最大
増殖はｈＩＬ−４野生型の場合に誘導される増殖のわず
か約３５％である。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA26 CA04 CA05 CA06
CA09 DA01 DA02 DA06 DA11
DA12 EA04 FA20 GA11 GA17
GA18 GA19 HA03 HA08 HA12
4B064 AG03 CA02 CA19 CC24 DA01
4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 CA18
CA53 DA16 DA59 NA14 ZB131
ZB132 ZC022
4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40
DA02 EA22 FA72 FA74
(54)【発明の名称】 ヒトインターロイキン４のアンタゴニスト又は部分的アゴニストである、あるいはこれらのアン
タゴニスト又は部分的アゴニストを含む治療薬、及び突然変異ｈＩＬ−４タンパク質、ならびに
それらの製造法
Claims (15)
- 【請求項１】 ｈＩＬ−４のアンタゴニスト又は部分的
アゴニストであるか、あるいはこれらのアンタゴニスト
又は部分的アゴニストを含む、アレルギー治療薬であっ
て、該アンタゴニスト又は部分的アゴニストが、位置１
２１、１２４又は１２５の１つ又はそれ以上において野
生型ｈＩＬ−４の天然に存在するアミノ酸が、それぞれ
可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸により置換
されているか、あるいはポリペプチド鎖がこれらの位置
の１つで中断されている、突然変異ｈＩＬ−４タンパク
質であることを特徴とする、アレルギー治療薬。 - 【請求項２】 突然変異ｈＩＬ−４タンパク質におい
て、位置１２４において天然に存在するアミノ酸チロシ
ンが、可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸で置
換されていることを特徴とする、請求項１に記載のアレ
ルギー治療薬。 - 【請求項３】 位置１２４においてチロシンがアスパラ
ギン酸又はグリシンで置換されていることを特徴とす
る、請求項２に記載のアレルギー治療薬。 - 【請求項４】 突然変異ｈＩＬ−４タンパク質におい
て、位置１２１において天然に存在するアミノ酸アルギ
ニンが、可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミノ酸で
置換されていることを特徴とする、請求項１に記載のア
レルギー治療薬。 - 【請求項５】 位置１２１においてアルギニンがアスパ
ラギン酸又はグリシンで置換されていることを特徴とす
る、請求項４に記載のアレルギー治療薬。 - 【請求項６】 突然変異ｈＩＬ−４タンパク質におい
て、位置１２１又は１２５及び場合によりまた位置１２
４の１つ又はそれ以上において、該位置の天然に存在す
るアミノ酸が、可能な天然のアミノ酸の中の異なるアミ
ノ酸により置換されていることを特徴とする、請求項１
に記載のアレルギー治療薬。 - 【請求項７】 位置１２４においてチロシンが、可能な
天然のアミノ酸の中のアスパラギン酸以外の異なるアミ
ノ酸で置換されていることを特徴とする、請求項６に記
載のアレルギー治療薬。 - 【請求項８】 チロシンがグリシンで置換されているこ
とを特徴とする、請求項７に記載のアレルギー治療薬。 - 【請求項９】 位置１２１又は１２５に、及び場合によ
り追加的に位置１２４において、天然に存在する１つ又
はそれ以上のアミノ酸が、それぞれ可能な天然のアミノ
酸の中の異なるアミノ酸により置換されているか、ある
いはポリペプチド鎖がこれらの位置の１つで中断されて
いることを特徴とするが、突然変異タンパク質Ｙ１２４
Ｄを除き、かつ、試験管内でＴ細胞増殖におけるｈＩＬ
−４媒介性のアンタゴニスト又は部分アゴニストであ
る、突然変異ｈＩＬ−４タンパク質。 - 【請求項１０】 位置１２４において天然に存在するア
ミノ酸チロシンが、可能な天然のアミノ酸の中のアスパ
ラギン酸以外の異なるアミノ酸で置換されていることを
特徴とする、突然変異ｈＩＬ−４タンパク質。 - 【請求項１１】 チロシンがグリシンで置換されている
ことを特徴とする、請求項１０に記載の突然変異ｈＩＬ
−４タンパク質。 - 【請求項１２】 ａ）ｈＩＬ−４の成熟領域をコードす
るＤＮＡ領域を含むｃＤＮＡに、可能な天然のアミノ酸
から選択された異なるアミノ酸が所望の位置で発現され
るように標的オリゴヌクレオチド突然変異誘発（部位特
異的突然変異誘発）を行い、 ｂ）突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟領域をコード
するＤＮＡ領域を発現ベクターに挿入し、 ｃ）形成されたハイブリッドベクターを大腸菌、酵母又
は他の真核細胞中に導入し、 ｄ）突然変異ｈＩＬ−４タンパク質を発現させ、適宜単
離することを特徴とする、請求項９−１１のいずれか１
つに記載の突然変異ｈＩＬ−４タンパク質の製造法。 - 【請求項１３】 部位特異的突然変異誘発を行う前にｈ
ＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を含むｃＤ
ＮＡ中に開始メチオニンをコードするＤＮＡを挿入する
ことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 突然変異を起こしたｈＩＬ−４の成熟
領域をコードするＤＮＡ領域をベクターからＮｃｏＩ／
ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出すことを特徴とす
る、請求項１２又は１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 温度−調節発現ベクター、例えばｐＩ
ＬＡ５０２（左ラムダプロモーター及びポリリンカーを
含まない）及び／又は宿主としての改変大腸菌ＪＭ１０
３株（ｒｅｃＡ−）を用いることを特徴とする、請求項
１２−１４のいずれか１つに記載の方法。
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