NO312707B1 - Terapeutiske midler omfattende humane IL-4 mutantproteiner samt fremgangsmåte for fremstilling derav - Google Patents
Terapeutiske midler omfattende humane IL-4 mutantproteiner samt fremgangsmåte for fremstilling derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO312707B1 NO312707B1 NO19941681A NO941681A NO312707B1 NO 312707 B1 NO312707 B1 NO 312707B1 NO 19941681 A NO19941681 A NO 19941681A NO 941681 A NO941681 A NO 941681A NO 312707 B1 NO312707 B1 NO 312707B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hil
- proteins
- amino acid
- replaced
- amino acids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 title abstract description 50
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 title abstract description 50
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 101100069857 Caenorhabditis elegans hil-4 gene Proteins 0.000 claims abstract 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims 17
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 11
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003915 air pollution Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Terapeutiske midler som er antagonister eller partielle antagonister til humane interleukin-4, hIL-4 mutante proteiner og en fremgangsmåte for fremstilling av disse er beskrevet.
Description
Store deler av populasjonen lider i dag av allergier. Øket' forurensning i luft og økning i antallet allergi-utløsende forbindelser som er diffundert i omgivelsene gjør det sannsynlig at antall tilfeller vil fortsette å øke i fremtiden, spesielt blant barn. Av denne grunn er det nødvendig å utvikle medikamenter som kan intervenere forløpet av allergiske prosesser.
Human interleukin 4 (hIL-4) er et av mange cytokiner som induserer og koordinerer proliferasjonen, modningen, overlevelsen og differensieringen av lymfoide og myeloide celler (1-3). hIL-4 deltar i IgE-formidlet immunreaksjon og aksellererer direkte proliferasjonen av thymocyter og aktiverte T-celler. Det har vært mulig å identifisere et høy-affinitets IL-4 reseptor protein med Mr 140.000 som ifølge cDNA sekvensen består av 800 aminosyreresidier (4). Dette proteinet hører til en nylig beskrevet gruppe av reseptorer som hører inn under haematopoietin reseptor superfamilien
Basert på klonet cDNA (6) består aminosyresekvensen til moden IL-4 av 129 residier. cDNA er blitt uttrykt i E. coli (7, 8) og gjær (9). Rekombinant IL-4 med høy biologisk aktivitet kan isoleres fra disse kildene.
Rollen til interleukin 4 i allergiske prosesser gjør det sannsynlig at forbindelser som inhiberer interleukin-4-formidlede prosesser eller som konkurrerer med hIL-4 avbryter den sykdoms-utløsende reaksjonskjeden.
Det er derfor en hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe terapeutiske midler hvor de aktive bestanddelene er antagonister eller partielle agonister av human interleukin 4.
Nylig er et monoklonalt antistoff blitt kjent og dette har antagonistiske egenskaper overfor human interleukin 4 (10). Dette antistoffet inneholder et Fab fragment og blir produsert av en human-human hybridom cellelinje. I tillegg produserer en hybridom cellelinje fra miltcellene til en rotte immunisert overfor (ikke-)glykosylert human IL-4 monoklonale antistoffer mot hIL-4 (11).
Hensikten ifølge foreliggende oppfinnelse ble oppnådd ved å gjøre tilgjengelig terapeutiske midler som er antagonister eller partielle agonister av hIL-4, eller som inneholder disse antagonistene eller partielle antagonistene, og er kjennetegnet ved at antagonistene eller partielle agonister er mutant hIL-4-proteiner. Valget av terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen har fordelen av at genteknologi kan anvendes på en målsøkende måte for å fremstille proteiner som på grunn av deres likhet med vill-type hIL-4, konkurrerer med sistnevnte for okkupasjon av hIL-4-reseptoren.
Det er i tillegg en hensikt ifølge oppfinnelsen å gjøre tilgjengelig mutante hIL-4 proteiner samt fremgangsmåter for fremstilling derav.
hIL-4 kan bli produsert som et rekombinant protein (rhIL-4) ved genetisk manipulasjon, for eksempel i E. coli. Proteinet som blir dannet under disse betingelsene kan oppløses, rena-tureres og isoleres. rhIL-4 har deretter et høyt nivå av spesifikk biologisk aktivitet som for eksempel kan bli bestemt ved å måle DNA syntesen/proliferasjonen av aktiverte T-celler eller CD23 ekspresjonen av aktiverte B-celler (se for eksempel Kruse, N. et al. (1991) FEBS Lett. 286, 58-60; Kikutani , H. et al. (1986 ) Cell 47, 657-665 ).
Foreliggende oppfinnelse omfatter terapeutiske midler, kjennetegnet ved at de omfatter mutante hIL-4-proteiner hvori én eller flere av aminosyrene som forekommer naturlig i villtypen i posisjonene 121, 124 eller 125, respektivt blir erstattet av en annen (eller andre) forskjellig(e) aminosyre^) av de mulige naturlige aminosyrene.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse mutante hIL-4-proteiner, kjennetegnet ved at én eller flere av aminosyrene som forekommer naturlig i posisjonene 121 eller 125, og også fakultativt i posisjon 124, respektivt, blir erstattet av en annen aminosyre fra de mulige naturlige aminosyrene.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av mutante hIL-4-proteiner som nevnt ovenfor, kjennetegnet ved
cDNA som omfatter en DNA-region som koder for den modne regionen av hIL-4, blir utsatt for en målsøkt oligonukleo-tidmutagenese (setedirigert mutagenese) slik at en selektert annen aminosyre av de mulige naturlige aminosyrene blir uttrykt i de(n) ønskede posisjonen(e),
DNA-regionen som koder for den muterte, modne regionen til
hIL-4 settes inn i en ekspresjonsvektor,
hybridvektoren som er blitt dannet blir introdusert inn i
E. coli, gjær eller en annen eukaryotisk celle, og
de mutante hIL-4-proteinene blir uttrykt og, hvor dette er
egnet, isolert.
Ifølge oppfinnelsen er det nå tilveiebragt en fremgangsmåte hvorved mutante proteiner av hIL-4 villtype kan produseres, idet proteinene har egenskaper som hIL-4 antagonister eller partielle hIL-4 agonister. Antagonistene til hIL-4 gir spesielt muligheten av spesifikk inhibering av virkningen av hIL-4.
På grunn av dette blir cDNA, som inneholder en DNA region som koder for den modne regionen til hIL-4 , utsatt for en målsøkt oligonukleotid mutagenese (sete-rettet mutagenese) slik at en selektert annen aminosyre til de muligens naturlige aminosyrene, blir uttrykt ved ønsket posisjon(er), eller at et avbrudd i polypeptidkjeden blir dannet av et stoppkodon,
DNA-regionen som koder for den muterte, modne regionen til hIL-4 er integrert inn i ekspresjonsvektor, hybridvektoren som er blitt dannet blir skutt inn i E. coli og
mutant IL-4 proteinet blir uttrykt, og hvor hensiktsmessig isolert.
Med hensyn på oppnåelse av cDNA som inneholder en DNA-region som koder for den modne regionen til hIL-4, eller som koder for den modne regionen til hIL-4, kan det refereres til (6) og litteraturen angitt deri. I denne sammenheng skal "cDNA som koder for den modne regionen til hIL-4" også angi cDNA som, i det det har et omtrent likt antall basepar, represen-terer mutanter av cDNA som er spesifikt angitt innenfor dette fagområdet, forutsatt at hIL-4 muteinene som derved frem-kommer også er antagonister eller partielle agonister.
Nummerering av DNA-regionen som koder for den modne regionen av hIL-4 er ifølge Garr, C. et al. (Biochemistry (1991) 30, 1515-1523 ).
cDNA som koder for den modne regionen til hIL-4 kan oppnås ved å kutte ut et EcoRV/BamHI fragment fra et cDNA som er blitt dannet ved genetisk manipulering (for eksempel fra British Bio-Technology Ltd., Oxford, England).
DNA fragmentet blir integrert med tilsetning av syntetiske oligonukleotider, for eksempel 5'-CATGCACAAGTGCGAT og 5'-ATCGCACTTGTG som inneholder de første fire aminosyrekodonene til interleukin 4 og også kodonet for initierende methionin, inn i en ekspresjonsvektor, for eksempel mellom Ncol og BamHI kuttingssetene til ekspresjonsvektor R<T>^ pRC 109 (12).
Sete-rettet mutagenese kan utføres i henhold til Kramer et al. (Nucleic Acids Research (1984) 12, 9441-9455; Cell (1984) 38, 879-887; og Boehringer Mannheim catalogue, Biochemicals for Molecular Biology (1987) 35 osv. se også (12)). Oligonukleotidet anvendt for mutagenesen kan inneholde omtrent 6 til 10 baser oppstrøms for og omtrent 6 til 10 baser nedstrøms for basen(ene) som skal endres.
Fagfolk innenfor området er også familiær med utspaltning av DNA-regionen som koder for den muterte, modne regionen til hIL-4 fra vektoren, overføring av denne DNA regionen inn i en ekspresjonsvektor, påfølgende innskudd av ekspresjonsvektoren inn i E. coli, samt ekspresjon av mutant hIL-4-protein og den fakultative isoleringen derav (McCarthy et al.; Gene (1986) 41, 201-206; Kato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1985) 130, 692-699), sammen med modifikasjonene (12) er mulig.
I henhold til en spesiell utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir DNA kodende for et initierende methionin inkorporert inn i cDNA som inneholder DNA regionen som koder for den modne regionen til hIL-4 før den sete-rettede mutagenesen blir utført.
I henhold til en ytterligere spesiell utførelsesform kan DNA regionen som koder for den muterte, modne regionen til hIL-4 bli spaltet ut fra cDNA mutanten som et NcoI/BamHI fragment.
For ekspresjonen anvendes fortrinnsvis en temperatur-regulert ekspresjonsvektor, for eksempel pILA502 (uten venstre side i lambdapromoter og polylinker) og/eller en felles E. coli stamme som vert, for eksempel JM103 (recA"). Med hensyn på pILA502 sammenlignSchauder et al. (Gene (1987) 52, 279-283). Andre egnede ekspresjonssystemer fåes fra Pharmacia ("Proka-ryotic Gene Fusion Vectors"). E. coli stamme JM103 kan også fåes fra Pharmacia.
I henhold til en ytterligere utførelsesform vedrører oppfinnelsen en hIL-4 mutant av villtype hvor mutant Tyr er erstattet med Asp i regionen i posisjon 124.
Oppfinnelsen vil bli beskrevet ytterligere ved hjelp av eksempler.
Eksempel 1
cDNA som koder for den modne regionen til hIL-4 og et initierende methionin ble utsatt for sete-rettet mutagense i henhold til Kramer et al. Det syntetiske oligonukleotidet inneholdt seks baser oppstrøms og nedstrøms for nukleotidet som skulle erstattes og ble dannet ved hjelp av en DNA syntesemaskin (Applied Biosystems, Model 380). Setet som skulle erstattes var posisjon 124 i den C-terminale, sannsynligvis a-heliske, regionen (posisjonene 110 til 129). I dette tilfellet ble Tyr erstattet med Gly. Den resulterende mutasjonen ble verifisert ved DNA-sekvens analyse av enkelt-trådet bakteriofag DNA. Mutert cDNA ble kuttet ut som et NcoI/BamHI-fragment fra dobbelt-trådet viralt DNA og kombinert med en temperatur-regulert ekspresjonsvektor som tilsvarer pILA502 med unntagelse av at venstrehånds lambda-promoteren og polylinkeren manglet. Et recA- derivat av E. coli stammen JM103 ble anvendt som vert. Integrert hIL-4 cDNA ble sekvensert for å bekrefte mutasjonen. Stammen ble anvendt for uttrykking av muteinet.
Etter ekspresjon og isolering ble det oppdaget at muteinet (Y124G) bindes med uforandret affinitet til reseptoren for hIL-4. Maksimal induserbar proliferasjon av aktiverte perifere T-celler er nå bare på 10-20$ av proliferasjonen som er induserbar av hIL-4 villtypen. Dette viser at mutein Y124G har samme egenskaper som en partiell agonist.
Eksempel 2
Eksempel 1 ble gjentatt med unntagelse av at Asp ble uttrykt i posisjon 124 i stedenfor Tyr. Selv ved en konsentrasjon på 1 \ im viser isolert mutein Y124D ingen aktivitet overfor aktiverte perifere T-celler. Det inhiberer aktiviteten til hIL-4 villtypen med eb inhibitorkonstant på omtrent 600 pM. Dette viser at mutein Y124D har egenskapene som en anta-gonist. Mutein Y124D har en liten gjenværende aktivitet med hensyn på induksjon av CD23 på aktiverte B-celler. Maksimal oppnåelig induksjon er på bare omtrent 5$ av induksjonen som kan bli oppnådd med hIL-4 villtype. I dette systemet er aktiviteten til hIL-4 villtypen inhibert av mutein Y124D med en inhibitorkonstant K^ på omtrent 800 pM. I B-cellesystemet har mutein Y124D dermed egenskaper som en meget svak agonist.
Eksempel 3
Eksempel 1 ble gjentatt med unntagelse av at Asp var ventet i posisjon 121 i stedenfor Arg. Binding av det isolerte muteinet til hIL-4 reseptoren var uforandret. Maksimal proliferasjon av aktiverte perifere T-celler som kunne bli indusert var på bare omtrent 30% av proliferasjonen som var induserbar med hIL-4 villtypen. Dette viser at mutein R121D har samme egenskaper som en partiell agonist.
Eksempel 4
Eksempel ble gjentatt med unntagelse av at Asp ble uttrykt i posisjon 125 i stedonfor Ser. Det isolerte muteinet S125D ble bundet med uforandret affinitet til reseptoren for hIL-4. Den maksimale proliferasjonen av aktiverte perifere T-celler som kan bli indusert er på bare omtrent 35% av proliferasjonen som er induserbar med hIL-4 villtype.
Litteraturliste:
1) Arai, K.I., Lee, F., Miyajima, A., Miyatake, S., Arai, N. og Yokota, T. (1990) Annu. Rev. Biochem. 59, 783-836. 2) Finkelman, F.D., Holmes, J., Katona, I.M., Urban, J.F., Beckmann, M.P., Park, L.S., Schooley, K.A. , Coffman, R.L., Mosmann T.R. og Paul, W.E. (1990) Annu. Rev. Immunol. 8, 303-333. 3) Yokota, T. , Arai, N. , De Vries, J., Spits, H., Banchereau, J., Zlotnik, A., Rennick, D. , Howard, M. , Takebe, Y., Miyatake, S., Lee, F. og Arai, K.I.
(1988) Immunol. Rev. 102, 137-187. 4) Idzerda, R.L., March, C.J., Mosley, B., Lyman, S.D., Vanden Bos, T. , Gimpel, S.D., Din, W.S., Grabstein, K.H., Widmer, M.B., Park, L.S., Cosman, D. og Beckmann, M.P. (1990) J. Exp. Med. 171, 861-873. 5) Cosman, D., Lyman, S.D., Idzerda, R.L., Beckmann, M.P., Park, L.S., Goodwin, R.G. og March, C.J. (1990) Trends Biochem. Sei. 15, 265-270. 6) Yokota, T., Otsuka, T., Mosmann T., Banchereau, J., DeFrance, T., Blanchard, D., De Vries, J.E., Lee, F. og Arai, K.I. (1986 ) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 5894-5998. 7) Van Kimmenade, A., Bond, M.W., Schumacher, J.H., Laquoi, C. og Kastelein, R.A. (1988) Eur. J. Biochem. 173, 109-114. 8) Jayaram, B., Bevos, R., Guisez, Y. og Fiers, W.
(1989) Gene 79, 345-354. 9) Solari, R., Quint, D., Obray, H., McNamee, A., Bolton, E. , Hissey, P., Champion, B., Zanders, E., Chaplin, A., Commber, B., Watson, M., Roberts, B. og Weir, M. (1989) Biochem. J. 262, 897-908. 10) Coffman, R.L.; de Vries, J.E. (Schering Biotech Corp., USA), EP 327283 Al. 11) Abrams, J.S.; Chretien, I.; Lee, F.D.; Pearce, M.K.
(Schering Biotech Corp., USA), EP 314402 A2. 12) Weigel, U., Meyer, M. og Sebald, W. (1989) Eur. J. Biochem. 180, 295-300.
Claims (12)
1.
Terapeutiske midler, karakterisert ved at de omfatter mutante hIL-4-proteiner hvori én eller flere av aminosyrene som forekommer naturlig i villtypen i posisjonene 121, 124 eller 125, respektivt blir erstattet av en annen (eller andre) forskjellig(e) aminosyre(r) av de mulige naturlige aminosyrene.
2.
Terapeutiske midler ifølge krav 1,karakterisert ved at i de mutante hIL-4-proteinene blir aminosyren tyrosin, som forekommer naturlig i posisjon 124, erstattet av en annen aminosyre fra de mulige naturlige aminosyrene.
3.
Terapeutiske midler ifølge krav 2,karakterisert ved at i posisjon 124 blir tyrosin erstattet med asparginsyre eller av glysin.
4 .
Terapeutiske midler ifølge krav 1,karakterisert ved at i de mutante hIL-4-proteinene blir aminosyren arginin, som forekommer naturlig i posisjon 121, erstattet av en annen aminosyre fra de mulige naturlige aminosyrene.
5 .
Terapeutiske midler ifølge krav 4, karakterisert ved at i posisjon 121 blir arginin erstattet med asparginsyre eller av glysin.
6.
Mutante hIL-4-proteiner, karakterisert ved at én eller flere av aminosyrene som forekommer naturlig i posisjonene 121 eller 125, og også fakultativt i posisjon 124, respektivt, blir erstattet av en annen aminosyre fra de mulige naturlige aminosyrene.
7.
Mutante hIL-4-proteiner, karakterisert ved at aminosyren tyrosin som forekommer naturlig i posisjon 124, blir erstattet med en annen aminosyre av de mulige naturlige aminosyrene, med unntak av asparginsyre.
8.
Mutante hlL-4-proteiner ifølge krav 7, karakterisert ved at tyrosin blir erstattet av glysin.
9.
Fremgangsmåte for fremstilling av mutante hIL-4-proteiner ifølge ett av kravene 6 til 8, karakterisert ved at
cDNA som omfatter en DNA-region som koder for den modne
regionen av hIL-4, blir utsatt for en målsøkt oligonukleo-tidmutagenese (setedirigert mutagenese) slik at en selektert annen aminosyre av de mulige naturlige aminosyrene blir uttrykt i de(n) ønskede posisjonen(e),
DNA-regionen som koder for den muterte, modne regionen til
hIL-4 settes inn i en ekspresjonsvektor,
hybridvektoren som er blitt dannet blir introdusert inn i E. coli, gjær eller en annen eukaryotisk celle, og
de mutante hIL-4-proteinene blir uttrykt og, hvor dette er
egnet, isolert.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DNA som koder for en initierende metionin, blir inkorporert inn i cDNA som omfatter DNA-regionen som koder for den modne regionen i hIL-4 forut for den sete-dirigerte mutagenesen blir utført.
11..
Fremgangsmåte ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at DNA-regionen som koder for den muterte, modne regionen til hIL-4, kuttes ut fra vektoren som et Ncol/BamHI-fragment.
12.
Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 9 til 11, karakterisert ved at anvendelsen utføres av en temperatur-regulert ekspresjonsvektor, for eksempel pILA502 (uten venst-resides lambda-promoter og polylinker) og/eller av den modi-fiserte E. coli-stammen JM103 (recA-) som vert.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4137333A DE4137333A1 (de) | 1991-11-13 | 1991-11-13 | Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung |
| PCT/EP1992/002614 WO1993010235A1 (de) | 1991-11-13 | 1992-11-13 | Menschliche il-4 mutantenproteine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO941681L NO941681L (no) | 1994-05-06 |
| NO941681D0 NO941681D0 (no) | 1994-05-06 |
| NO312707B1 true NO312707B1 (no) | 2002-06-24 |
Family
ID=6444719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19941681A NO312707B1 (no) | 1991-11-13 | 1994-05-06 | Terapeutiske midler omfattende humane IL-4 mutantproteiner samt fremgangsmåte for fremstilling derav |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5723118A (no) |
| EP (1) | EP0613499B2 (no) |
| JP (2) | JP3470970B2 (no) |
| KR (1) | KR100276410B1 (no) |
| AT (1) | ATE163196T1 (no) |
| AU (1) | AU671960B2 (no) |
| CA (1) | CA2123315C (no) |
| CZ (1) | CZ283467B6 (no) |
| DE (2) | DE4137333A1 (no) |
| DK (1) | DK0613499T4 (no) |
| ES (1) | ES2112340T5 (no) |
| GR (1) | GR3026600T3 (no) |
| HU (1) | HU217326B (no) |
| NO (1) | NO312707B1 (no) |
| SK (1) | SK280114B6 (no) |
| WO (1) | WO1993010235A1 (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4423131A1 (de) * | 1994-07-01 | 1996-01-04 | Bayer Ag | Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4 |
| HUT76369A (en) * | 1994-07-29 | 1997-08-28 | Smithkline Beecham Corp | Novel soluble protein compounds |
| GB9415379D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| US5986059A (en) * | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| US6335426B1 (en) | 1996-06-14 | 2002-01-01 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| CA2256459A1 (en) * | 1996-06-14 | 1997-12-18 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
| US6180108B1 (en) * | 1998-12-10 | 2001-01-30 | Bayer Corporation | Vectors having terminal repeat sequence of Epstein-Barr virus |
| DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
| DE16192152T1 (de) | 2000-05-26 | 2020-08-06 | Immunex Corporation | Verwendung von interleukin-4 rezeptor (il-4r) antikörpern und zusammensetzungen davon |
| GB0105360D0 (en) * | 2001-03-03 | 2001-04-18 | Glaxo Group Ltd | Chimaeric immunogens |
| EP1314739A1 (en) * | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
| EP1382614A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-21 | Bayer HealthCare AG | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
| US7635754B2 (en) * | 2004-09-22 | 2009-12-22 | Aerovance, Inc. | Interleukin-9 and interleukin-4 chimeric antagonist muteins and methods of using same |
| US20070009479A1 (en) * | 2005-06-17 | 2007-01-11 | Aerovance, Inc. | Methods for treating dermatitis using mutant human IL-4 compositions |
| BRPI0713484A2 (pt) * | 2006-06-21 | 2012-11-06 | Apogenix Gmbh | expressão diferencial de citocina em cáncer humano |
| AU2007271349A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Apogenix Gmbh | Human IL-4 muteins in combination with chemotherapeutics or pro-apoptotic agents in cancer therapy |
| EP2596802A1 (en) | 2011-11-23 | 2013-05-29 | PLS-Design GmbH | Pharmaceutical composition for treatment of allergic reactions |
| EP2674168A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-18 | PLS-Design GmbH | Modulation of effector T cell responses by local depletion of complement component C3 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5041381A (en) * | 1986-07-03 | 1991-08-20 | Schering Corporation | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
| US5017691A (en) * | 1986-07-03 | 1991-05-21 | Schering Corporation | Mammalian interleukin-4 |
| ES2058490T3 (es) * | 1988-02-02 | 1994-11-01 | Schering Biotech Corp | Metodo de reducir respuestas de inmunoglobulina e. |
| US5188827A (en) * | 1989-12-18 | 1993-02-23 | Schering Corporation | Use of interleukin-4- for lowering blood-cholesterol levels |
-
1991
- 1991-11-13 DE DE4137333A patent/DE4137333A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-11-13 DK DK92923502T patent/DK0613499T4/da active
- 1992-11-13 SK SK554-94A patent/SK280114B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-11-13 ES ES92923502T patent/ES2112340T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 CZ CZ941185A patent/CZ283467B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-11-13 AU AU29282/92A patent/AU671960B2/en not_active Expired
- 1992-11-13 KR KR1019940701592A patent/KR100276410B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-11-13 JP JP50897393A patent/JP3470970B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-11-13 EP EP92923502A patent/EP0613499B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 HU HU9401369A patent/HU217326B/hu unknown
- 1992-11-13 WO PCT/EP1992/002614 patent/WO1993010235A1/de active IP Right Grant
- 1992-11-13 CA CA002123315A patent/CA2123315C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 DE DE59209196T patent/DE59209196D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 US US08/232,289 patent/US5723118A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 AT AT92923502T patent/ATE163196T1/de active
-
1994
- 1994-05-06 NO NO19941681A patent/NO312707B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-10 GR GR980400796T patent/GR3026600T3/el unknown
-
2002
- 2002-09-30 JP JP2002287074A patent/JP2003174894A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT66826A (en) | 1995-01-30 |
| DK0613499T4 (da) | 2005-04-18 |
| AU2928292A (en) | 1993-06-15 |
| GR3026600T3 (en) | 1998-07-31 |
| CZ283467B6 (cs) | 1998-04-15 |
| CZ118594A3 (en) | 1994-12-15 |
| CA2123315A1 (en) | 1993-05-27 |
| NO941681L (no) | 1994-05-06 |
| NO941681D0 (no) | 1994-05-06 |
| HU217326B (hu) | 1999-12-28 |
| JPH07501522A (ja) | 1995-02-16 |
| EP0613499B1 (de) | 1998-02-11 |
| SK280114B6 (sk) | 1999-08-06 |
| ES2112340T5 (es) | 2005-10-16 |
| JP3470970B2 (ja) | 2003-11-25 |
| CA2123315C (en) | 2003-06-17 |
| DE59209196D1 (de) | 1998-03-19 |
| HU9401369D0 (en) | 1994-08-29 |
| SK55494A3 (en) | 1994-12-07 |
| ATE163196T1 (de) | 1998-02-15 |
| JP2003174894A (ja) | 2003-06-24 |
| US5723118A (en) | 1998-03-03 |
| EP0613499A1 (de) | 1994-09-07 |
| WO1993010235A1 (de) | 1993-05-27 |
| DE4137333A1 (de) | 1993-05-19 |
| KR100276410B1 (ko) | 2000-12-15 |
| DK0613499T3 (da) | 1998-09-23 |
| EP0613499B2 (de) | 2005-03-30 |
| ES2112340T3 (es) | 1998-04-01 |
| AU671960B2 (en) | 1996-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO312707B1 (no) | Terapeutiske midler omfattende humane IL-4 mutantproteiner samt fremgangsmåte for fremstilling derav | |
| EP0790255B1 (en) | Monoclonal antibodies directed to the cytotoxic lymphocyte maturation factor | |
| JP4423313B2 (ja) | ナチュラルキラー刺激因子 | |
| Atamas et al. | An alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation. | |
| EP0817847B1 (en) | Il-17 receptor | |
| US6455262B1 (en) | Receptor polypeptides and their production and uses | |
| EP1173484B1 (en) | Treatment of fibrosis by antagonism of il-13 and il-13 receptor chains | |
| US6683046B1 (en) | Purification and characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor and monoclonal antibodies thereto | |
| US6433142B1 (en) | Megakaryocyte stimulating factors | |
| JPH07508179A (ja) | ヒトインターロイキン−１３ | |
| AU8767698A (en) | Novel orphan receptor | |
| JP4278710B2 (ja) | リンパ球化学誘引因子およびその用途 | |
| US5338833A (en) | Carboxy terminal IL-6 muteins | |
| JP3652365B6 (ja) | ナチュラルキラー刺激因子 | |
| IL | In Activated Mast Cells, IL-1 Up-Regulates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |