JP4411073B2 - ホルミルペプチドレセプター様1レセプターに対するリガンドとして有用な組成物およびその使用法 - Google Patents
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Description
本発明は、ホルミルペプチドレセプター様1レセプターに対するリガンドとして有用な組成物およびその使用法に関する。
ケモカイン(走化性ケモカイン)は、病原との戦場に目印を付ける、Tリンパ球、好中球、およびマクロファージの動員および活性化についての分子ビーコンとして作用する。感染に対する抵抗を担う白色血液細胞である白血球の動員は、ケモカインの濃度に依存する。ケモカインは、多様な生物学的プロセス(白血球の輸送およびホーミング、免疫調節、造血、ならびに新脈管形成が挙げられる)を媒介する小タンパク質(8〜10KD)のスーパーファミリーである。今日までに、24のケモカインレセプターが知られている。ケモカインは、生来の免疫および炎症反応において基礎的な役割を果たしている(Baggioliniら(1994);Baggioliniら(1997);Rollins(1997))。4つのケモカインサブファミリーが、最初の2つの保存されたシステイン残基の間の距離;C、CC、CXC、CX3Cに基づいて記載されている。全ての公知のケモカインは、Gタンパク質共役レセプターおよびGiファミリーの百日咳毒素感受性ヘテロトリマーGタンパク質に属する4つの群の7回膜貫通レセプター;XCR、CCR、CXCR、およびCX3CRを通じてシグナルを伝達する(Murphyら(2000))。細胞外結合現象は、種々の応答(例えば、走化性)を導く特定のシグナル伝達経路を活性化し得る。ケモカイン系において、複数のケモカインが、単一のケモカインレセプターを活性化し得る。例えば、レセプターCCR1は、RANTES(活性化されると、発現される正常T細胞を調節する)、MIP−1α(マクロファージタンパク質)、およびMIP−1βケモカインに結合する。同様に、単一のケモカインが、いくつかのレセプターを活性化し得る(Mantovani(1999))。
本発明者らは、CKβ8−1の短縮改変体CKβ8−1(25−116)が、ホルミルペプチドレセプター様1レセプター(FPRL1)に対する機能的リガンドとしてのその役割を通じて、炎症反応および生来の免疫に関与することを発見した。さらに、本発明者らは、CKβ8−1(25−116)と共に、FPRL1を発現することが知られている両方の細胞において機能的なCKβ8−1の選択的スプライシングを受けたエキソン(SHAAGtideと呼ぶ)、ならびに短縮SAAGtideおよび他のSHAAGtide改変体を発見した。機能的なSHAAGtideは、白血球において、レセプター−リガンド結合の際に、カルシウムフラックスを生じ、そして単球、好中球、成熟樹状細胞(mDC)および未成熟樹状細胞(iDC)を誘引する。
本発明者らは、CKβ8−1短縮改変体である、CKβ8−1(25−116)が、2つの異なるGPCR(ケモカインレセプターCCR1およびホルミルペプチドレセプター様1レセプター(FPRL1))に対する二機能的リガンドであることを発見した。本発明者らはまた、CCR1リガンドとしての活性に加えて、CKβ8−1(25−116)が、単球および好中球をFPRL1に対する機能的リガンドとしてのその役割を介して補充することによって、炎症反応および免疫に関与することを発見した。CKβ8は、細胞(単球、樹状細胞および休止リンパ球を含む)を、OCR1を介して攻撃するが、CKβ8−1(25−116)(SHAAGチド)配列において見出される選択的にスプライシングされたエキソンを欠く。CKβ8の選択的スプライシング形態(116アミノ酸)である、CKβ8−1(1−116)は、CKβ8と同様に、CCR1レセプターに対する機能的リガンドである。しかし、CKβ8−1(1−116)は、SHAAGチド配列を介しては、その機能を発揮しない。
(SHAAGチドを含むSHAAGチドペプチドおよびSHAAGチドポリペプチド)
表1は、SHAAGチドポリペプチド配列(配列番号1)、ならびに特定のSHAAGチド短縮改変体および他の改変体のポリペプチド配列を示す。表2は、SHAAGチドポリヌクレオチド配列(配列番号12)およびSHAAGチド短縮改変体および他の改変体のポリヌクレオチド配列を示す。表3は、ヒトCKβ8−1(25−116)ヌクレオチド配列(配列番号20)を示す。図2は、ヒトCCL23/CKβ8改変体(CKβ(1−99)−配列番号13;CKβ(25−99)−配列番号14;CKβ(1−116)−配列番号15;CKβ(25−116)−配列番号16)の、ヒトCCL15/MIP−1α(配列番号19);CCL3/MIP−1δ(配列番号17)およびロイコタクチン(leukotactin)(配列番号18)との、アミノ酸配列アライアメントを示す。4個の保存的システイン残基が、四角で囲って示され、そして2個のさらなるシステイン(通常は、CCケモカインファミリーにおいて見出されない)は、破線で囲って示される。CCL23/CKβ8−1の選択的スプライシングエキソンが、下線を付けて示される。
本発明のSHAAGチドペプチドは、表1に列挙される分子を含む。さらにSHAAGチドペプチドおよびヌクレオチドの種々の他の改変体が、標準的な技術を使用して合成され得る。誘導体は、直接的に、または改変もしくは部分的置換によってのいずれかで、ネイティブの化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブの化合物と同一ではないものの類似している構造を有するが、特定の成分または側鎖においてネイティブの化合物とは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成され得るか、または異なる進化起源由来であり得る。
%アミノ酸配列同一性=X/Y 100
ここで、
Xは、配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムの、AとBとのアライメントによって同一の一致として評価された、アミノ酸残基の数であり、そして
Yは、Bにおける全アミノ酸残基数である。
本発明は、異常なFPRL1レセプターまたはFPRL1リガンド活性に関連した障害の危険性がある(もしくは感受性である)かまたはこの障害を有する被験体を処置する、予防方法および治療方法の両方を提供する。例としては、神経変性障害(例えば、アルツハイマー病)が挙げられる。
この疾患または状態は、免疫応答を調節するために、FPRL1レセプターに対するFPRL1リガンドの作用が阻害または促進されるべき、疾患または状態である。
FPRL1レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストは、薬学的組成物へ組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、アゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など(Gannaro(2000))を含む。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および5%ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル(例えば、不揮発性油)もまた、使用され得る。通常の媒体または薬剤が、活性化合物に適合しない場合を除いて、これらの組成物の使用は、意図される。補助活性化合物もまた、組成物へと組み込まれ得る。
1つの局面において、本発明は、パッケージまたは容器中に以下のうちの1つ以上を含むキットを提供する:(1)本発明の生物学的に活性な組成物またはFPRL1アンタゴニスト;(2)薬学的に受容可能なアジュバントまたは賦形剤;(3)投与のための送達手段(vehicle)(例えば、シリンジ);(4)投与のための指示書。成分(1)〜(4)のうちの2つ以上が同じ容器中に見いだされる実施形態もまた、企図される。
SHAAGtides(およびSHAAGtidesを発現するために使用されるSHAAGtideヌクレオチド)は、FPRL1レセプター活性を調節する化合物についてスクリーニングするための方法において試薬として使用され得る。このような化合物は、FPRL1レセプターもしくはFPRL1レセプターリガンドの不十分もしくは過剰な生成、または野生型分子と比較して異常な活性を有するFPRL1レセプターもしくはFPRL1レセプターリガンド形態の生成によって特徴付けられる障害を処置する際に有用であり得る。一般に、このような化合物は、FPRL1レセプター/FPRL1レセプターリガンドが関連する生物学的機能を調節するために使用され得る。
(1)SHAAGtideまたはSHAAGtide配列を含む分子の、FPRL1レセプターへの結合を潜在的に阻害すること;
(2)SHAAGtideまたはFPRL1レセプター分子に結合するSHAAGtide含有分子のCa2+応答の有意な阻害;
(3)制限された非特異的Ca2+応答;あるいは
(4)化学走化性活性の阻害。
本明細書中に記載される診断方法は、異常なFPRL1レセプターまたはFPRL1リガンドの発現または活性に関連する疾患または障害を有するかまたは発症する危険性のある被験体を同定するためにさらに利用され得る。例えば、記載されるアッセイは、神経変性障害のような障害を有するかまたは発症する危険性のある被験体を同定するために使用され得る。代表的には、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてFPRL1レセプターもしくはFPRL1リガンドが検出されるか、または活性がアッセイされる。例えば、試験サンプルは、生物学的流体(例えば、血清)、細胞サンプルまたは組織であり得る。
ヒト組換えケモカインであるロイコタクチン(leukotactin)、3つの既知のCKβ8改変体であるCKβ8(1−99)、CKβ8(25−99)、CKβ8−1(1−116)、およびCKβ8−1の新規NH2−末端短縮型であるCKβ8−1(25−116)を、R&D Systems(Minneapolis,MN)から入手した。CKβ8−1(25−116)を、安定なヒトCCR1トランスフェクトHEK239細胞における細胞内カルシウム動員を誘発する能力について、他の3つの改変体と比較した。ヒトHEK293−CCR1細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Fugena 6(Roche,IN)を使用して調製した。HEK−293細胞株を、800μg/mlのG−418を補充した、10% FBSを含むDMEM中で維持した。
ヒト組換えケモカイン、ロイコタクチン、MIP−1α、3種類の公知のCKβ8改変体(CKβ8(1〜99)、CKβ8(25〜99)、CKβ8−1(1〜116))およびCKβ8−1の新規NH2末端短縮形態(CKβ8−1(25〜116))を、R&D Systems(Minneapolis、MN)から得た。ヒト単球を、標準的なプロトコルに従い、軟膜(Standford Blood Center、Palo Alto、CA)から作製した。簡単には、PBMCを、標準的な密度勾配遠心法(Ficoll−Paque−Plus、Pharmacia)により単離した。単球を、CD14マイクロビーズ(Miltenyi、Aubum、CA)磁性陽性選択を用いて精製した。ヒト好中球を、Ficoll−Hypaque(Hyclone、CA)での勾配遠心により、健康な個体由来の新しい末梢血から単離した。
交差脱感作試験において、細胞を、ロイコタクチン、次いで、ケモカインCKβ8(1〜99)、CKβ8(25〜99)、CKβ8−1(1〜116)およびCKβ8−1(25〜116)で連続的に刺激した。HEK293−CCR1トランスフェクト体(実施例1におけるように調製した)において、ロイコタクチンは、全ての改変体に対して類似のレセプター脱感作パターンを誘導した。細胞を、100nMのロイコタクチンで前処理した場合、全てのリガンドに対するカルシウムフラックス応答が、完全に阻害された。
CCL23改変体の結合特性を、ヒトCCR1発現細胞において比較した。MIP−1αおよびCCL23改変体CKβ8(1−99)、CKβ8(25−99)、CKβ8−1(1−116)およびCKβ8−1(25−116)が、125I−MIP−1αと競合する能力を、HEK293−CCR1細胞(実施例1におけるように調製した)において調査した。細胞を、非標識ケモカインの存在下で、125I標識したMIP−1α(最終濃度、約0.05nM)と共にインキュベートした(4℃で3時間:25mM HEPES、140mM NaCl、1mM CaCl2、5mM MgCl2、および0.2%BSA、pH7.1に調整)。反応混合物を、細胞回収器(Packard)を用いてPEI処理GF/Bガラスフィルター上に吸引した。フィルターを、2回(25mM HEPES、500mM NaCl、1mM CaCl2、5mM MgCl2、pH7.1に調整)洗浄した。シンチレーション剤(MicroScint−10:35μl)を、乾燥したフィルターに添加し、そしてフィルターを、Packard Topcount scintillation counterにおいて計数した。データを、Prism software(GraphPad Software、San Diego、CA)を用いて解析しおよびプロットした。
移動アッセイを、単球および好中球において実施した。ヒト単球および好中球(実施例2におけるように調製した)を、回収し、そして走化性培地(CM)中に再懸濁した。このCMは、0.1%BSA(Sigma、St.Louis、MO)を添加した、CaCl2(1mM)およびMgSO4(1mM)を含むハンクス緩衝化塩溶液(Gibco、MA)から構成されていた。これらのアッセイを、96ウェルChemoTx(登録商標)マイクロプレート(Neuroprobe、MA)中で実施した。ロイコタクチン、MIP−1αおよびケモカイン(実施例1におけるように調製したCKβ8(1−99)、CKβ8(25−99)、CKβ8−1(1−116)またはCKβ8−1(25−116))を、より下部ウェルに添加し(最終容量29μL)、そして20μLの細胞懸濁液(単球について5×106細胞/mL;好中球について2.5×106細胞/mL)をポリカーボネートフィルター(単球について5μm孔径;好中球について3μm孔径)に添加した。90分間のインキュベート(37℃、100%湿度、5%CO2)後、細胞を、フィルターの上部表面からかき出した。下部チャンバに移動した細胞を、Quant細胞増殖アッセイキット(Molecular Probes、OR)を用いて定量した。
CKβ8−1(25−116)の機能的活性を、ヒトFPRL1−L1.2トランスフェクト体およびネイティブのL1.2細胞において調査した。L1.2細胞におけるホルミルペプチド様レセプター1(FPRL1)の安定した発現を、以下のように得た。FPRL1をコードする全長cDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、未分化HL−60細胞から単離したゲノムDNAからクローニングした。ポリメラーゼ連鎖反応産物を、標準的な分子クローニング手順を用いてpcDNA3.1(Invitrogen、Carlsbad、CA)へとクローニングし、そして完全に配列決定して同一性を確認した。20μgのFPRL1/pcDNA3.1構築物を、BsmI(New England Biolabs、Beverly、MA)での消化により直線状にし、そして以下のようにマウスB細胞株L1.2をトランスフェクトするために用いた。2500万の細胞を、2回洗浄し、そして0.8mlのPBS中に再懸濁した。これらの細胞を、直鎖状FPRL/pcDNA3.1構築物DNAと共に室温で10分間、インキュベートし、そして0.4cmキュベットに移し、そして250V、960μFでシングルエレクトロポレーションパルスを印加した。エレクトロポレートした細胞を、室温で10分間、インキュベートし、そして10%FCSを補充したRPMI中の37℃の培養物中に移した。ジェネチシン(G418)を、トランスフェクションの48時間後に800μg/mlの最終濃度まで添加し、そしてこれらの細胞を、96ウェルプレートに、25,000細胞/ウェルでプレートした。薬物選択下、2〜3週間後、安定なジェネテシン耐性FPLR1発現細胞を、それらが1〜1000nMの濃度のSHAAGtideまたはCKβ8−1に応答してCa++を移動させる能力について評価した。
FPRL1へのCKβ8−1(25−116)の結合を、CKβ8−1(25−116)が、ヒトFPRL1−L1.2トランスフェクト体およびヒト単球から125Iで標識されたWKYMVm(125Iで標識されたTrp−Lys−Tyr−Met−Val−D−Met−NH2、Perkin Elmer Life Science(Boston、MA))を置換する能力を測定することにより決定した。細胞を、漸増濃度の標識していないWKYMVmまたはCKβ8−1(25−116)の存在下で、0.01nMの125I−WKYMVmと共に、4℃で、3時間、インキュベートした。各々の相互作用についてのIC50を、Prismソフトウェア(GraphPad Software)を用いることによる、データの非線形最小二乗曲線フィッティングから導いた。
ヒト組換えCKβ8−1(25−116)ケモカインを、R&D Systems(Minneapolis、MN)から得た。ペプチドSHAAGtide(配列番号1および配列番号6)ならびにコントロールタンパク質(配列番号1の逆配列)を合成し、そしてSambrookら、1989、およびAusubelら、1999に記載される従来技術を用いてHPLCで精製した。
L1.2細胞中のヒトFPRL1の安定な発現は、実施例6のとおりに得られた。カルシウムフラックス試験を、実施例1に記載された方法を使用してトランスフェクト体で行なった。ケモカイン(CKβ8(1−99)、CKβ8(25−99)、CKβ8−1(1−116)およびCKβ8−1(25−116)を、実施例1のとおりに調製した。Wペプチド1および2を、実施例6のとおりに得た。さらに、以下のSHAAGtide配列および短縮改変体(実施例8のとおりに調製される)を試験した:
CCXP1 配列番号1
CCXP2 配列番号2
CCXP3 配列番号3
CCXP4 配列番号4
CCXP5 配列番号5
CCXP6 配列番号6
CCXP7 配列番号7
CCXP8 配列番号8
CCXP9 配列番号9
CCXP10 配列番号10。
FPRL1−L1.2細胞上のケモカイン(CKβ8(1−99)およびCKβ8(25−99)、SHAAGtides(配列番号1および配列番号2)およびWペプチド1および2(実施例6のとおりに得られる)の走化性活性を、移動アッセイで決定した。このケモカインを実施例1のとおりに調製した。SHAAGtide配列(配列番号1および配列番号2)を、実施例8のとおりに調製した。FPRL1−L1.2細胞を、実施例6のとおりに調製した。
ケモカイン:CKβ8(1−99)、CKβ8(25−99)、CKβ8 (1−116)およびCKβ8(25−116);Wペプチド1および2ならびにSHAAGtide配列(配列番号1および配列番号2)のヒト単球および好中球上の走化性活性を、移動アッセイにおいて決定した。上記のペプチドを、前出の実施例のとおりに調製した。この移動アッセイを、実施例5に記載されるプロトコルを使用して、96ウエルのCHEMOTX(登録商標)マイクロプレート(Neuroprobe)で実施した。SHAAGtide(配列番号1)およびCKb8−1(25−116)は、好中球および単球の両方の移動を生じた。
Claims (24)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、および配列番号8からなる群より選択される配列からなる、単離されたタンパク質またはポリペプチド。
- FPRL1レセプター活性を調節する、請求項1に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド。
- 非SHAAGtideポリペプチドが請求項1に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチドに融合された、融合タンパク質。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のタンパク質またはポリペプチドを含む、FPRL1レセプター活性を調節するための組成物。
- 対象における免疫応答を増強する、請求項4に記載の組成物。
- 免疫応答が、抗体仲介性の免疫応答である、請求項5に記載の組成物。
- 免疫応答が、細胞仲介性の免疫応答である、請求項5に記載の組成物。
- 請求項1に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチドおよび抗原を含む薬学的組成物。
- FPRL1レセプター活性を調節するための、請求項8に記載の薬学的組成物。
- 対象における炎症性疾患を治療するための、請求項8または9に記載の薬学的組成物。
- 対象における免疫応答を増強するための、請求項8または9に記載の薬学的組成物。
- 組成物が徐放処方物中に存在する、請求項8ないし11のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 請求項1に記載の単離されたタンパク質またはポリペプチド、
薬学的に受容可能なキャリア、および
シリンジ
を含む、薬学的組成物を含むキット。 - 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、および配列番号8からなる群より選択される配列からなるタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号24、配列番号25、および配列番号27からなる群より選択される配列からなる、請求項14に記載の単離された核酸。
- 請求項14に記載の核酸に相補的な配列を有する、単離された核酸。
- 請求項14に記載の単離された核酸を外因的に発現する細胞を含む組成物。
- FPRL1の生物学的活性のモジュレーターを同定する方法であって:
(a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、および配列番号8からなる群より選択される配列からなるタンパク質またはポリペプチドの存在下で、FPRL1レセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させ;および
(b)候補化合物の存在下でFPRL1レセプターの生物学的活性の調節を検出する;
ことを含み、ここでFPRL1レセプターの生物学的活性の調節が観察された場合は、候補化合物がFPRL1レセプター活性のモジュレーターであることを示す、前記方法。 - 候補化合物が、抗体、ペプチド、核酸、または低分子である、請求項18に記載の方法。
- 細胞が、好中球、単球、Tリンパ球または樹状細胞である、請求項18または19に記載の方法。
- 細胞が、FPRL1レセプターで安定にトランスフェクトされている、請求項18ないし20のいずれか1項に記載の方法。
- FPRL1レセプターの生物学的活性が、走化性、細胞増殖、カルシウム動員およびカルシウムフラックス、または炎症性応答である、請求項18ないし21のいずれか1項に記載の方法。
- FPRL1レセプターへの結合のモジュレーターを同定する方法であって:
(a)標識された、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、配列番号6、および配列番号8からなる群より選択される配列からなるタンパク質またはポリペプチドの存在下で、FPRL1レセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させ;および
(b)候補化合物の存在下での、当該タンパク質またはポリペプチドのFPRL1レセプターとの結合のレベルと、候補化合物の不在下での、当該タンパク質またはポリペプチドのFPRL1レセプターとの結合のレベルを比較する;
ことを含み、ここで結合の減少は当該候補化合物が結合のインヒビターであり、結合の増加は当該候補化合物が結合のエンハンサーであることを示す、前記方法。 - 標識が、フルオロフォア、化学発光剤、放射性同位体標識、および酵素、またはそれらの組み合わせ、からなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
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