JPH10185899A - 炎症性サイトカインの発生及び／または活性を刺激する薬品の能力を試験する方法 - Google Patents

炎症性サイトカインの発生及び／または活性を刺激する薬品の能力を試験する方法

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】炎症性サイトカインの発生，及び／又は活性を
刺激する薬品の能力を試験する方法の提供。 【解決手段】炎症性サイトカインが，ヘパリンと結合出
来，皮下投与時に多形核細胞浸潤を特徴とする局部的ふ
くらみを誘引出来、且つ試験管内に多形核細胞機能亢進
を誘引出来る一方同化酵素リポプロテイン・リパーゼの
活性の抑止，悪液質性／ＴＮＦ反応細胞の細胞毒素性の
発生，菌体内酵素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生
殖の刺激または一次チオグリコール酸塩投与マウス大食
細胞による悪液質性／ＴＮＦの発生誘引能力を欠くこと
が出来るようにした炎症性サイトカインの発生及び／ま
たは活性を刺激する薬品の能力を試験する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連ある記事】本出願人は本発明の主題に関係ある多
数の記事の著者または共著者である。これらの記事は米
国特許第4,603,106 号に掲記された記事の補填内容であ
り，先の記事を参考として本明細書に掲記してある。
（１），［本出願人のセラミ及びボイトラーはＪ．マホ
ニー，Ｎ．ラ．トラング及びＰ．テカラの共著者であ
る］『菌体内毒素誘引型ＭＡＷ264.7 細胞で分泌される
悪液毒性，リポプロテイン・リパーゼ消去ホルモンの清
浄化』，Ｊ．ＥＸＰ，ＭＥＤ．161 984 −995 （1985
年５月）；（２）（本出願人がＪ・Ｒ・マホーニー，Ｌ
・ラ・トラング，Ｗ・バイン，Ｙ・イケダとの共著者で
ある）『リポポリサツカリド処理したＲＡＷ 26.47 細
胞が３Ｔ３−Ｌ１細胞内のリポプロテイン・リパーゼを
抑止する神経細胞を発生する。』，Ｊ・ＩＭＭＵＮＯ
Ｌ，134 ．（３），1673−1675（1985年３月）；（３）
本出願人のセラミがＰ・Ｊ・ホテッツ，Ｌ・ラ・トラン
グ，Ａ・Ｓ・ヌエアラムとの共著者である）『腹膜滲出
物細胞からの血液原生動物誘引神経細胞により３Ｔ３−
Ｌ１細胞内とリポプロテイン・リパーゼの抑止』ＰＡＭ
ＡＳＩＴＥ ＩＭＭＵＮＯＬ（オックスフォード）６：
203 （1984年）；（３）本出願人のセヤミ及びボイトラ
ーがＤ・グリーンワルド，Ｊ・Ｄ・ハルムス，Ｍ・チャ
グ・Ｙ，−Ｃ．Ｔタン，Ｊ・マキソン及びＲ・ユレビッ
チとの共著者である。）『腫瘍壊死因子及び大食細胞滲
出因子悪液質性の確認』，ＮＡＴＵＲＥ316 ：552 −55
4 ，（1985年）；（５）本出願人のセラミ及びボイトラ
ーがＦ・Ｍ・トルーチ，Ｂ・ビックマン及びＴ・Ｍ・リ
ンゴルドの共著者である。）『大食細胞因子が脂肪質遺
伝子出現を抑止する。：悪液質のガラス質モデル『ＳＣ
ＩＥＮＣＥ229 ：867 −869 ，（1985年）；（６）本出
願人のセラミ及びボイトラーがＩ・Ｗ・ミルザークの共
著者である）『悪液質性／腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）がネ
ズミを菌体内毒素の致命的作用から保護する。』ＳＣＩ
ＥＮＣＥ229 ：869 −871（1885年）；（７）本出願人
のセラミ，ボイトラー及びＳ・Ｄ・ウオルプがＤ・ダバ
テルス，Ｂ・シェリー，Ｄ・Ｇ・ヘッセ，Ｈ・Ｔ・ヌエ
ン，Ｌ・Ｉ・モルダーワ，Ｃ・Ｆ・ナサン及びＳ・Ｆ・
ローリーとの共著者である）『大食細胞が炎症性及び好
中球機能亢進特性で新規なヘパリン結合蛋白質を滲出さ
せる。）『Ｊ・ＥＸＰ，ＭＥＤ 167 ：570 −581 （19
88年）；（８）本出願人のセラミ及びウオルプがＧ・デ
バテニス，Ｐ・テカンプ・オルソン，Ｋ・エルムセン，
Ｃ・ルーク，Ｃ・ガレゴス，Ｐ・コイト及びＪ・メリウ
エザーの共著者である。）『ネズミ・ノミ大食細胞炎症
性蛋白質（ＭＩＰ）に対するｃＤＮＡのクローニングと
特性化，炎症性特性と機能亢進特性による新規な単運
動』，Ｊ・ＥＳＰ・ＭＥＤ，167 ：1939−1944（1988
年）；及び（９）〔本出願人のセラミとウオルプがＢ・
シャーリー，Ｐ・テカンプ−オルソン，Ｃ・ユヤレゴ
ス，Ｂ・バウアー，Ｄ・デバテリス，Ｆ・マシアルツ及
びＴ・ホイトと共著者である。）（大食細胞炎症性蛋白
質−１の２成分の溶解，これら２成分の１つの成分のク
ローニングと特性，ＭＩＰ−１β』，Ｊ・ＥＦＰ・ＭＥ
Ｄ，（Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ）（1988年）先に掲記した記事
内容は全て本明細書では参考として入れてある。本発明
にいたる研究の資金は部分的には米健康局とロックフェ
ラー財団の授与によった。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は一般に動物の宿主に
対する感染と如き侵入性刺激の効果とその対応する作用
の分析及び治療に関する材料及びその関連ある方法に関
するもので，更に詳細にはこうした侵入性刺激に対する
宿主の反応に関与出来る材料の確認に関するものであ
る。
【０００３】
【従来の技術（発明の経緯）】多くの通常の生理学的及
び生化学的配列上の無秩序が突発性疾患状態におけるの
と同様，バクテリア感染，ビールス感染または原生堵物
感染；腫瘍または菌体内毒素といった各種侵入性刺激に
応答する各種哺乳動物の宿主(mammalian hosts) に観察
されている。例えば，これらの反応には発熱β白血球増
加，リポイド過多血症，食物摂取低減化（無食欲），運
動低減化，消耗（悪液質），及び筋肉，白血球細胞及び
肝臓の新陳代謝における他の一時的異変が含まれる。特
に，トリパ，ゾーマ・ツエツエ・バエで感染した兎の菌
体内毒素の生化学機構を明らかにすることを狙いにして
いる最近の研究では最低の宿主を有する動物が死にかけ
ており，著しいハイパートリグリオエリメディア（hype
rtriglyoeridemia）を示し，極めて低密度のリポプロテ
イン（ＶＬＤＬ）のプラズマを著しく増加させたことに
注目した。Ｃ・Ａ・ルーサー及びＡ・セラミ，ＭＯＬ．
ＣＩＯＣＨＥＭ，ＰＡＲＡＳＩＴＯＮ，１：31−38（19
86年，参照。こと実験的な感染に伴なう著しい消耗素因
に鑑み，ナイパートリグリオエリメディク状態が著しか
った。プラグマＱＬＤＬの増加は周わりの組織のリポプ
ロテイン・リパーゼ（ＬＰＬ）作用の損失によりもたら
された浄化上の穴点に起因したものであることが示され
た。
【０００４】低減化されたＬＰＬ作用が他者により観察
されており，この状態は，人体がショック状態にあった
時存在することに注目されている。Ｅ．Ｂ．マン等の：
肝臓疾患のある患者の抗導素と肝臓のリポイド『ＣＬＩ
Ｎ．ＩＮＶＥＳＴ．24 623以後（1945年）参照。ジョン
・Ｉ・ガリン等の：感染における抗毒素リポイド』，Ｎ
・ＥＮＧＬ．Ｊ．ＭＥＤ．281 1081−1086（1969年11月
13日）；Ｄ・フアースチ等の『兎の抗毒素リポイドに対
する３種類のバクテリア感染の効果』，Ｊ・ＢＡＣＯＥ
ＲＩＡＬβ95 1615 以後（1968年）；Ｓ．Ｅ．グロスバ
ーグ等の『鶏の胎児のウイルス感染に続くリポイド多血
症：新症候群』，ＮＡＴＵＲＥ（ロンドン208 854 以後
（1965年）；ロバート・Ｌ・ヒルシ等の『バクテリア菌
体内毒素を皮下投与した兎におけるリポイド多血症，脂
肪肝及びブルモサルフォフタレイン保持』，Ｊ・ＬＩＰ
ＩＤ．ＭＥＳ．５ 563−568 （1964年）；サカグチ・オ
サム等の『菌体内毒素を投与したマウスにおけるリポイ
ド・新陳代謝の交替』，ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＩＭＭＵ
ＮＯＬ．23（２）71−75（1979年）；Ｒ．Ｆ．カムプシ
ュミットの『菌体内毒素抗性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにお
ける部分的に純粋化された白血球内因性神経細胞の作
用』，Ｊ．ＬＡＢ．ＣＬＩＮ．ＭＥＤ．85 616以後（19
80年）；及びラルフ・Ｆ・カンブシュミットの『白血球
内因性神経細胞』，Ｊ．ＲＥＴ．ＳＯＣ．23(4) 287 −
297 ．（1978年）を参照。
【０００５】更に，感染に対する宿主の反応に含まれる
と思われる『神経細胞』の確認と存在について検討して
いる刊行物を本出願人は知っており，特に，以下の記事
は参考として本明細書にその内容が含まれている。サイ
プ・Ｊ・Ｄ等のＪ．ＥＸＰ．ＭＥＤ，150 ：597 −606
（1979年）；バーニー，Ｃ．Ｃ等，ＬＩＰＴＯＮ，Ｊ．
Ｍ．（Ｅｄ．），ＦＥＶＥＲ：ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮ
ＡＬ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ，ダラス，テキサス州，1879
年４月11−12日，ＸＩＩ＋263 Ｐ，レーバン・プレス：
ニューヨーク，イリノイ，ＩＳＢＮ ０−89004 −451
−１（08877 ），０（０），ｐｐ111 −122 （1980
年）；ダイナレロ・Ｃ・Ａ，『ヒト白血球ピロゲン：レ
ントゲン線免疫の純粋化と発展』，ＰＲＯＣ．ＮＡＳ
Ｌ．ＡＣＡＤ．ＮＣＩ．ＵＳＡ 74（10）4624−3627
（1977年10月）。前掲の記事とカムシュミットによる著
作または共著による記事中で各著者により確認され調査
された因子は全てインターロイキン−１（ＩＬ−１）と
して認定された因子の単一グループ化を含むよう決定さ
れた。この決定についてはチャールズ・Ａ・ジナレロに
よる記事中で文書化されており，感染症の検討，第６
巻，第１号（1984年１月−２月）にて発行してあり，そ
の内容も参考として本明細書中に含まれている。
【０００６】ＬＰＬ作用の同様の欠陥について腸内細菌
類コリ リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の投与後にＣ
３Ｈ／ＣｅＪマウスにおいて本出願人により注目され
た。対比的に，ＬＰＬ作用の損失はＬＰＳに対して遺伝
的に抗性のあるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスでは見られなかっ
た。菌体内毒素誘引ＬＰＬ欠陥に対するこの抗性は２時
間前にＬＰＳを投与した菌体内毒素に反応する動物から
得られたリポイドの投与によって妨げられた。同様に，
抗性は反応するマウスから得られた菌体内毒素刺激を受
けるチオグリコール酸塩誘引腹膜大食細胞から調質薬剤
を注入することにより克服出来た。これらの発見内容に
ついては出願第314,098 号で現在の米国特許第4,603,10
6 号に一層詳細に説明された。その開示内容については
参考として本明細書中に記載してある。
【０００７】前掲の研究は『神経細胞』または複数個の
神経細胞』が存在し且つ動物宿主内にエネルギー貯蔵細
胞の一般的新陳代謝作用に対し著しい効果とあることが
予期されるよう本出願人の信念で促進された。こうした
『神経細胞』は一部の同化酵素の作用にマイナスの効果
をもたらし，例えば宿主が侵入に応答してショックとし
て知られる状態に入る場合その低減化された作用が観察
されることが予期された。その結果，菌体内毒素反応及
び菌体内毒素非反応マウスと同様，菌体内毒素刺激腹膜
マウス滲出物細胞により作成される神経細胞と同化酵素
作用の測定に対する試薬の調査を通じての開発の関係に
ついては参考として本明細書に含まれている先に提出し
放棄した出願第299,932 号に述べられた。
【０００８】このシステムの別の調査について３Ｔ３−
Ｌ１『プレアジポサイト（Preadipncyte）』モデル・シ
ステムと共にされ，『神経細胞』に対する抗体の開発に
関連ある方法，材料及び他の診断方法の対応する開発が
出願第251,290 号にのべられた。これも参考として本明
細書中に含まれているが現在放棄されている。しかる
後，後続と出願第414,098 号，現在の米国特許第4,603,
106 号では本出願人は大食細胞の菌体内毒素刺激から得
られた神経細胞物質が腹膜酵素リポプロテイン・リパー
ゼ，アセチルコ酵素Ａカルボキシラーゼ，脂肪酸シンセ
ターゼを消去する作用を呈し，更に赤染細胞の成長と差
別化を呈することを確立した。
【０００９】開示内容が参考として本明細書に含まれて
いる出願第766,852 号のボイトラー等による記事（１）
及び（４）に記載してある別の研究は結果的に神経細胞
物質と先行技術においてインターロイキン１，インター
ロイキン２として知られている他の因子から識別した多
数の作用を有する別の蛋白質要素が含まれることが発見
された。ボイトラー等及び開示内容が参考として本明細
書中に含まれている特許出願第104,827 号による記事
（ｆ）に記載の別の研究では顕著な作用の側面を示す神
経細胞物質内に付加的な因子（ＭＩＰ−１）の存在を確
立した。
【００１０】その時以来，ＭＩＰ−１が要素のペプチド
内に溶解され，現在，ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βと
称しているこうした２種類のペプチドのＮ−ターミナル
・シーケンスが比較された。従って，本願は新たに発見
されたペプチド分離物，ＭＩＰ−１の作用，これらの分
離物を適用出来る診断用及び治療用の両方に適用するこ
とに向けられている。
【００１１】
【課題を解決するための手段（発明の要約）】本発明の
第１局面によれば，神経細胞物質の新たに発見された分
離物である炎症性サイトキン(cytokine ；サイトカイ
ン) が開示され，生理学的条件下において陰イオン性で
ある純粋な形の蛋白質を含んでいる。本発明の炎症性サ
イトキンは高塩分濃度においてもヘパリンと結合する能
力を有し，皮下投与された時に多形核細胞の浸潤を特徴
とする局部的なな炎症を促進し、試験管内(in vitro;生
体外) での多形核細胞の化学運動性を促進する。然し乍
ら，本発明の炎症性サイトキンは米国特許第4,603,106
号に開示された神経細胞物質から分離された他の因子に
共通している一部の作用に欠けている。
【００１２】特に，本発明の炎症性サイトキンは，同化
酵素リポプロテイン・リパーゼ（ＬＰＬ）の活性を抑止
する能力に欠け，悪液質性(cachectin；カケクチン) ／
ＴＮＦ反応Ｌ929 細胞の菌体内毒素の発生，内毒素耐性
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸腺細胞(thymocytes)の胚子発生(blast
ogenesis) を刺激し、あるいは第一チオグリコール酸塩
から引き出されるマウス・大食細胞(macrophage;マクロ
ファージ) によるカケクチン／ＴＮＦの生成を促進す
る。これら後者の特性は全て本発明の炎症性サイトキン
にはなく，公知のカケクチン／ＴＮＦ及びインターロイ
キン−１（ＩＬ−１で提示され，かくして本発明の炎症
性サイトキンを顕著なものとしている。
【００１３】呈示された確実な作用の中で，ヘパリンと
結合し多形核（ＰＭＮ）細胞の浸潤を特徴とする局部的
な炎症を促進する能力が最も重要であるように思われ
る。従って，本発明の分離体が宿主の侵入に対する反応
のカスケードで作用する正確な役割は定義付けが依然不
明であるが，宿主の侵入に対する移動性と関連がある作
用及び条件の一部分の誘引に参加することは明らかであ
る。従って炎症性サイトキン刺激が促進出来る本発明の
炎症性サイトキンの励起により，刺激性または誘引性で
あり，各種刺激間の確認をし，おそらくはその差違を付
けるよう診断工具としての使用潜在力を有している。
【００１４】本発明の炎症性サイトキンは低塩分バツフ
アー内で約106 ダルトン以上の高分子量を持つ塊を形成
する傾向を以ってドデシル硫酸塩ナトリウム（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）の存在下でポリアクリルアミド・ゲル・電気
泳動上で決定される大略8,000 ダルトンの見かけ分子量
を定める一部のポリペプチド・セグメントを含むよう最
初部分的に確認され、特徴付けされ且つ発見された。特
に，本発明の炎症性サイトキンはゲルろ過で評価すると
２×106 ダルトン以上の粒状物を形成することに注目さ
れた。従って，本明細書の図３に表される如く，予備的
な部分Ｎ−ターミナル・アミノ酸一致シーケンス・デー
タはその時点に先に説明した蛋白質と何んら重要な同質
性を呈しなかった。決定された部分的ペプチド・シーケ
ンスに基づく公知のｃＤＮＡクローニング技法により，
完全に並進されたペプチド・シーケンスが達成された。
このシーケンスは大略８キロ・ダルトンの分子量を有す
ることが判明した。ＭＩＰ−１はクロマトフォーカシン
グにより大略4.6 のｐＩを呈することが示された。
【００１５】本発明の炎症性サイトキンの他の特性には
兎内に発熱を誘因し、且つ試験管内のヒトの好中球に過
酸化物の形成または呼吸バーストを誘引する能力が含ま
れている。これらの特性については本明細書で提示した
データに例示してある。
【００１６】本発明はまた，約8,000 ダルトンのほぼ同
一の見かけ要素分子量でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に対として
移る純粋化された元のＭＩＰ−１の解決法に向けられて
いる。ＳＤＳの存在においてヒドロキシラパタイトにク
ロマトグラフィーを使って２つの要素を成功裡に分離し
た。各要素の部分的Ｎ−ターミナル・シーケンス分析は
２つの蛋白質がそのＮ−ターミナル・シーケンスにおい
て極めて類似し一部のアミノ酸の存在と位置に差がある
ことを明らかにした。特に，ＳＤＳ上の低分子量バンド
に対応する蛋白質（ここで：『ＭＩＰ−１α』と称す
る）は本発明書の図１４Ａに示された部分的なＮ−ター
ミナル・アミノ酸シーケンス(sequence;配列) を有し，
一方，高分子量バンド（『ＭＩＰ−１β』と称する）は
図１４Ｂに示されたＮ−ターミナル・シーケンスを発生
した。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βに対するｃＤＮＡ
はクローン処理され，各ペプチド要素の完全なアミノ酸
シーケンスの予測を可能にし，該当ｃＤＮＡ及び飽和ア
ミノ酸シーケンスは各々図１０及び図１５に表してあ
る。
【００１７】ＭＩＰ−１αに対するｃＤＮＡは7889の予
測された分子量で長さが69個のアミノ酸の飽和蛋白質を
予測している。Ｎ−グリコシレーションに対する見かけ
の箇所は存在しない。ＭＩＰ−１βに対するｃＤＮＡは
これも7832ダルトンの予測された分子量で長さが69個の
アミノ酸の飽和蛋白質を予測している。53ないし55の位
置に１つの潜在的なＮ−グリコシレーション箇所（Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）が存在している。
【００１８】先に説明した如く本発明の炎症性サイトキ
ンは侵入性刺激材を伴なう如き材料で動物の細胞の刺激
を行うことが可能である。特に，各種供給源から得るこ
とが出来る大食細胞のサンプルは米国特許第4,613,106
号に開示された神経細胞物質を作成するよう菌体内毒素
またはトリビノゾーマの如き刺激材料で培養可能であ
る。こうした培養は20時間の時間にわたり発生出来，正
確な時間の限界は培養に対して選択された特定の細胞で
変化する。
【００１９】こうした培養に引続き，媒体は元の神経細
胞物質を含む表面浮遊物を除去すべく遠心分離作用によ
り適当な処理を受ける。神経細胞物質は次にフィルター
処理または沈でん処理を受ける。しかる後元の神経細胞
物質は公知の一連の分離作用を受けそこで炎症性サイト
キンを回収出来る。本発明は通常，適用可能であれば公
知の遺伝子復生技法を含む炎症性サイトキンの準備を行
う別の手段で意図しており，従って，本発明はその範囲
内でこうした合成的準備を対象とする意図がある。
【００２０】先に注記した如く，本発明にはまたβマウ
スで決定された如き以下に記載する且つ図１０及び図１
５に示された飽和アミノ酸シーケンスを表示する先に注
記した作用と特性を組合せて提示する。本発明のサイト
キンの純粋化されたペプチド要素の確認も含まれてい
る。
【００２１】 ＭＩＰ−１α ALA PRO TYR GLY ALA ASP THR PRO THR ALA CYS CYS PHE SER TYR SER ARG LYS ILE PRO ARG GLN PHE ILE VAL ASP TYR PHE GLU THR SER SER LEU CYS SER GLN PRO GLY VAL ILE PHE LEU THR LYS ARG ASN ARG GLN ILE CYS ALA ASP SER LYS GLU THR TRP VAL GLN GLU TYR ILE THR ASP LEU GLU LEU ASN ALA
【００２２】 ＭＩＰ−１β ALA PRO MET GLY SER ASP PRO PRO THR SER CYS CYS PHE SER TYR THR SER ARG GLN LEU HIS ARG SER PHE VAL NET ASP TYR TYR GLU THR SER SER LEU CYS SER LYS PRO ALA VAL VAL PHE LEU THR LYS ARG GLY ARG GLN ILE CYS ALA ASN PRO SER GLU PRO TRP VAL THR GLU TYR MET SER ASP LEU GLU LEU ASN
【００２３】先に述べた如く，前述のシーケンスは公知
の神経細胞因子といずれにも何ら類似性を有しておら
ず，従って本発明の炎症性サイトキンは顕著性のあるこ
とが確立される。前掲のアミノ酸シーケンスの最近の分
離とＭＲＮＡシーケンスの開発で慣用的な組替え遺伝子
技術によるこのサイトキンの再生が容易にされた。
【００２４】本発明には更に本発明の炎症性サイトキン
またはこのサイトキンが影響を及ぼす作用を誘引する能
力を基に突発性または侵入性刺激材を確認する方法が含
まれている。特に，こうした刺激材は，ヘパリンと結合
し，好中球浸潤及び機能亢進により局部的ふくらみを誘
引する神経細胞を誘引する能力により確認出来且つ検出
出来た。この点に関して例えばＲＡＷ264.7 細胞ライン
から得られた大食細胞は制御体として菌体内毒素，ノリ
パノゾーマ等といった多数の公知の刺激材で接種出来，
一方，平行な細胞のサンプルが感染刺激材の所定の位置
から得られた材料の抽出物で接種出来た。全てのサンプ
ルは先に説明した方法に従ってその後培養可能とされ，
しかる後，これも定義付けされた分離技法のシーケンス
に従って処理され，そこで制御サンプルと未知のサンプ
ルから得られる結果的に生じた分離体の試験を比較して
炎症性サイトキンがあればその開発されたサイトキンが
同一であるかまたは類似しているかを決定出来た。
【００２５】代替的に，炎症性サイトキンの改変された
ＭＲＮＡレベルは本明細書で開示されたｃＤＮＡシーケ
ンスを使用する当技術で使用されている技法により検出
出来た。
【００２６】同様の様式で，炎症性サイトキンを模倣し
若しくは反作用するのに有効な潜在的薬剤の集団検診用
分析システムを準備出来る。一例においては，試験薬品
は炎症性サイトキンの生産時にその効果を決定する目的
から刺激された大食細胞サンプルに投与出来る。別の方
法では，炎症性サイトキンは細胞試験システム内に導入
出来，この場合，サイトキンは活性があるとして知られ
ており，予測される薬品はまた，同じ細胞培養液に導入
出来，こと培養液はしかる後予測薬品単独の添加と比較
して炎症性サイトキンの作用上の変化または公知の炎症
性サイトキンの添加される量の効果上の変化を見るため
調査可能である。
【００２７】本発明はまた，本発明の炎症性サイトキン
の作用と存在を測定することにより哺乳動物(mammals)
内の刺激された自発的なまたは突発性の病理学的状態の
存在を決定する方法に関するものである。更に詳細には
炎症性サイトキンの作用はサイトキンの適当にラベル付
けされた量の使用を通じて以後説明する集団検診技法で
直接随時可能である。代替的に，サイトキンは結合パー
トナーまたは抗体を発生させる目的に使用出来，抗体は
逆に炎症性サイトキンが内部に存在するか否かを示し，
こうして媒体が取り出された宿主の状態を評価する目的
からラベル付けされ且つ抗毒素の如き媒体内に導入可能
である。
【００２８】従って，炎症性サイトキン及びこのサイト
キンに対し発生可能な抗体は水素化ホウ素・ナトリウム
による放射性添加，減少または放射性ヨード化によりラ
ベル付けされた炎症性サイトキンに対する抗体を一例と
して使用するレントゲン線免疫集団検診の如き免疫集団
検診を含む，各種診断技法と組合って使用可能である。
【００２９】例示的な免疫集団検診においては，炎症性
サイトキン，この抗体等の制御量は酵素，特定の結合パ
ートナー及び／または放射性元素で準備され且つラベル
付けがされ，次に，侵入を受けていると考えられている
哺乳動物(mammal)の血液サンプル内に導入可能とされ
る。ラベル付けされた材流またはこの結合パートナーが
サンプル内の位置で反応する機会を得た後，結果的に生
ずる質量体は取り付けられたラベルの性質によって変化
する公知の技法により調査される。
【００３０】アイソトープ14Ｃ， 131Ｉ，３Ｈ， 125Ｉ
及び35Ｓの如き放射性ラベルが使用される場合には公知
の現在適用可能な計数方法を利用出来る。ラベルが酵素
である場合には現在利用されているカレリー・メート
ル，スペクトロフォトメトリック，螢光スペクトロフォ
トメトリック又はヤスメトリック法等，当技術で知りえ
ている任意の方法により達成可能である。
【００３１】本発明には炎症性サイトキンの存在する範
囲をの量鶴に分析する試験キットの形態になった状態で
準備可能な分析システムが含まれる。このシステムまた
は試験キットはラベルを炎症性サイトキンに接続する本
明細書で説明した放射性及び／または酵素技法のいずれ
か１つで準備されるラベル付け要素；ラベル付け要素，
その結合パートナー，決定される要素またはその結合パ
ートナーの１つと結合出来る少なくとも１つが自由配位
子または固定配位子である１個以上の付加的な免疫化学
試薬を含むことが出来る。
【００３２】別の実施態様においては本発明は炎症性サ
イトキン，炎症性サイトキンに対する抗体の作用に基ず
き，または同じまたは拮抗作用を有するよう決定される
他の薬剤または薬品に依存する一部の治療法に関するも
のである。第１使用方法は，ふくらみ及び発熱といった
哺乳動物(mammals) 内の炎症サイトキンの作用が表われ
るのを防止することに関連性があり，サイトキンに対す
る抗体，サイトキンの発生及び／または作用を調整出来
る薬剤，宿主内でのふくらみと発熱といった状態と進展
を防止するのに有効な量を以って個別にまたは相互に混
合した状態でサイトキンに対する配位子アォタゴニスト
として作用出来るサイトキンに対する抗体でない薬剤を
含む。
【００３３】更に詳細には本明細書で全体的に説明して
いる治療方法は炎症性サイトカインに対する抗体の有効
量，または本発明の他の局面に従って準備され且つ使用
される薬剤スクリーニング分析により一例として開発さ
れる他の同じ様に有効な薬剤を含むことが出来る製薬成
分の投与によりふくらみ及び発熱を治療する方法を含む
ことが出来よう。この治療方法と別の実施態様は炎症性
サイトカインの存在と作用を最初に検出し，しかる後，
適当な製薬成分を投与することが含まれよう。
【００３４】別の治療方法ではサイトカインの炎症性作
用，特に感染の如き侵入性刺激に応答して好中球の運動
及び移動性を生じさせる能量を利用することを求めてい
る。従って，例えば，組織の外傷が生じた場合に進行す
る感染箇所に投与する適当な組成に準備出来る。こうし
た場合，炎症性サイトカインは滅菌溶液の形態で準備さ
れ，洗浄流体の一部としてまたは製薬組成において局処
経路と非経口軽路の投薬といった直接的投薬により外傷
または傷部分に付けられる。通常，炎症サイトカインは
炎症性サイトカイン自体に対する同じ様式及び同じ目的
にて投薬に適した製薬組成に公式化出来る公知の方法に
より同等に有効な薬剤または薬品を発生させる目的で使
用可能である。
【００３５】従って，本発明の主たる目的は哺乳動物内
の侵入刺激に対する宿主応答と関連ある一部の特性と作
用を呈する純粋化された形態の炎症性サイトカインを提
供することにある。
【００３６】本発明の他の目的は炎症性サイトカインの
準備方法を提供することにある。
【００３７】本発明の他の目的は感染の如き刺激性，自
発性または突発性病理状態の存在が考えられる哺乳動物
内の炎症性サイトカインの存在を検出する方法を提供す
ることにある。
【００３８】本発明の他の目的は哺乳動物内の炎症性サ
イトカインの作用を模倣するかまたはマイナスの影響と
戦うのに潜在的に有効な薬品，薬剤等といった物質のス
クリーニング方法及び関連ある分析システムを提供する
ことにある。
【００３９】本発明の更に他の目的はこうした存在また
は作用の結論を変えるべく炎症性サイトカインの量また
は作用を制御する哺乳動物の治療方法を提供することに
ある。
【００４０】本発明の更に他の目的は刺激性，自発性ま
たは突発性病理状態のマイナスの効果を治療し又は防止
するよう炎症性サイトカインの量または作用を促進させ
る哺乳動物の治療方法を提供することにある。
【００４１】本発明の更に他の目的は炎症性サイトカイ
ン又はその結合パートナーを含むそれに基づき若しくは
炎症性サイトカインの作成を制御し又は炎症性サイトカ
インの作用を模倣するか又はそれに逆う薬剤または薬品
に基づく治療方法で使用する製薬組成を提供することに
ある。
【００４２】他の諸目的と諸利点については以下と例示
的図面を参照することで以下に続く説明を検討すること
から当技術の熟知者には明らかとなろう。
【００４３】
【発明の実施の形態】本発明の主要局面において本発明
はバクテリア，ウイルス，一部の腫瘍，プロトゾアの如
き侵入性刺激及び菌体内毒素または突発性状態を特徴的
に伴なう本明細書で説明した刺激剤の如き材料で刺激さ
れる大食細胞または大食細胞ライン内に存在しまたはそ
れにより隠されることが判明している炎症性サイトカイ
ンまたは大食細胞炎症性蛋白質，ＭＩＰ−１として以後
説明する特徴の因子の分離と確認に関するものである。
本発明はまた，ＭＩＰ−１をその成分ペプシド，ＭＩＰ
−１α及びＭＩＰ−１βに分解することに関する。米国
特許第4,603,106 号に開示された神経細胞物質に関連し
て，前者の神経細胞物質の要素として決定された本発明
の炎症性サイトカインは，刺激されたまたは自発性の病
理状態における哺乳動物と反応を表わすふくらみといっ
た一部の状態を哺乳動物の組織内に進撤させることが出
来るようである。
【００４４】特に，炎症性サイトカインは皮下投与時に
多形核細胞浸潤を特徴とする局部的炎症を誘引出来る。
また，サイトカインは侵入性刺激に対して哺乳動物の宿
主により移動に含まれるサイトカインの影響を表わす試
験管内の多形核細胞の機能亢進を生ずる。本発明の炎症
性サイトカインによりもたらされる完全且つ正確な役割
は不明瞭であるが，先に確認された他の因子及び更に解
決すべき因子と関連付けてこのサイトカインは宿主の免
疫システムと他の肉体組織及び器官の間の連絡システム
の一部として機能することが理論付けられている。
【００４５】ヘパリンと結合する本発明の炎症性サイト
カインの能力はサイトカインがＦＧＦまたはＰＤＧＦの
如き一部のヘパリン結合成茶因子に対応するとの考えを
生ぜしめた。然し乍ら，炎症性サイトカインが滑らかな
筋肉細胞に対して有糸分裂したいことを示すデータはこ
れら公知の成長因子とは異なることを示唆している。従
ってこの時点で明らかなことは本発明のサイトカインが
刺激に対してと同様，宿主の応答の一部分として知られ
ている炎症性応答の進展に参画することである。
【００４６】先に示した如く，本発明の炎症性サイトカ
インは約4.6 の等電位点（ｐＩ）を有する蛋白質を含む
ことが確認されている。炎症性サイトカインは大略 8,0
00ダルトンのほぼ同一のサブユニット分子量を有する対
として分離可能であり，以後の事例に記載されている分
離状態に導いた調査の結果により評価される如く，２×
106 ダルトン以上の各種分子量を有するマルチマーを形
成出来る。これらの調査はまた，Ｎ−ターミナル・ペプ
チド・シーケンスを確認し，しかる後，公知の遺伝子復
生技法により開発されたフル・シーケンスが，本発明の
炎症性サイトカインの特定のペプチド・シーケンスが他
の公知の神経細胞因子のシーケンスとは異なることを確
認している。従って，本発明の炎症性サイトカインと先
行技術の公知の神経細胞因子の間の構造上及び機能上の
相違点が事例で記載されたデータにより確認された如く
存在している。
【００４７】更に詳細には，本発明の炎症性サイトカイ
ンは先に概説したものと関連して他の一部の特性を有し
ているので，高塩分濃度，例えば大略0.7 Ｍにおいてヘ
パリンと結合出来る。本発明の炎症性サイトカインの別
の特徴は生理学的条件下で陰イオン性であることにあ
る。このサイトカインはまた，同化酵素リポプロテイン
・リパーゼ（ＬＰＬ）の抑止，悪液質性／ＴＮＦ反応Ｌ
929 細胞の細胞毒素性の発生，菌体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／
ＨｅＪ酵素の芽胞生殖の刺激または一次チオグリコール
酸塩投与マウス大食細胞による悪液質性／ＴＮＦの発生
を誘引することが出来ない点が欠けるこれらの作用にお
いて顕著性がある。これら後者の作用は全て一般的特徴
と作用でこれらを刺激に対する宿主の反応に関与するも
のとして確認した他の公知の大食細胞誘導神経細胞因子
により分割されたものである。これは従って本発明の炎
症性サイトカインを公知の因子とは異なるものとし，本
明細書に示されたｃＤＮＡ及び蛋白質とシーケンス・デ
ータと関連して本発明の炎症性サイトンキが実際に他の
大食細胞誘導神経細胞因子とは異なることを確認してい
る。
【００４８】本発明による炎症性サイトカインは本明細
書の事例にて記載された如くマウス内で分離され，分析
された。事例で記載した実験の完了後に行われた炎症性
サイトカインの顕著なポリペプチドに対するメッセージ
のクローニングとｃＤＮＡのシーケンシングの別の研究
結果，ペプチドのＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの完全
なシーケンスが解明され，それらのシーケンスについて
各々本明細書の図１０及び図１５に表わしてある。従っ
て精製された炎症性蛋白質が各々69のアミノ酸の２個の
シーケンスにより定められることが決定された。
【００４９】ｃＤＮＡライブラリーが菌体内細胞刺激Ｒ
ＡＷ264.7 細胞から準備され，ＭＩＰ−１の：『主要』
部分Ｎ−ターミナル・アミノ酸シーケンスを基に２個の
合成多形核プールを使ってスクリーン処理された。こう
してクローン処理されたｃＤＮＡは現在ＭＩＰ−１αと
して知られているペプチド鎖に対応して示してある。Ｍ
ＩＰ−１βに対するｃＤＮＡは同様の方法を使ってクロ
ーン処理されたが，使用される多形核プールは７個のア
ミノ酸残基の３個がＭＩＰ−１αの対応する残基と異な
っている分子の一部分から得られた。
【００５０】ＭＩＰ−１αに対するｃＤＮＡは予測され
る分子量7889を有する長さが69個のアミノ酸の飽和蛋白
質を予測している。Ｎ−グリコシレーションに対する見
かけの箇所は存在しない。ＭＩＰ−１βに対するｃＤＮ
Ａは位置53−55において１つの潜在的Ｎ−グリコシレー
ション箇所（Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）が存在する予測
された分子量7832ダルトンを有する長さが69個のアミノ
酸の飽和蛋白質も予測している。ＭＩＰ−１βはＭＩＰ
−１αより僅かに大きい分子としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
に移動するので，これがグリコシレート化されることが
出来る。Ｎ結合されたグリコレーションに対するＡｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ，Ｔｈｒ信号内の位置Ｘにおけるプロリン
は結果的にその箇所において与えられれるまたは与えら
れたいグリコシレーションにないことが知られている。
これは後者グリコシレート化される場合ＭＩＰ−１αと
ＭＩＰ−１βの間の分子量の差が比較的小さいことによ
る。
【００５１】この開示された蛋白質の組替え形態を表わ
すめ現在実験が行われている。マウスのＭＩＰ−１はヒ
トの好中球に作用するので，ヒトの炎症性サイトカイン
ＭＨＰ−１はおそらくマウスのＭＩＰ−１に類似してい
る。本明細書で開示された如く炎症性サイトカインのこ
の作用は好中球を該当箇所に与えるのを促進するため組
織の感染箇所に炎症性サイトカインを投与することで組
込むことが出来る。
【００５２】炎症性サイトカインの遺伝子再生には当技
術で良く知られている組替え技術の多くの一般的原理が
含まれており，従って，こうした技術と詳細な定義は不
必要であると思われるので，本明細書では示されていな
い。然し乍ら，本発明は公知の組替え技術も使って本発
明の炎症性サイトカインの準備特に図１０及び図１５に
記載されたアミノ酸シーケンスを有する材料を処理す
る。炎症性サイトカインの準備については本明細書の先
の方で簡単に説明されたが，これは侵入性刺激の如き刺
激材料で各種細胞の任意の細胞を培養開始することによ
り２つの局面にて実施出来ることが確認されている。特
に，細胞ラインＲＡＷ264.7 は炎症性サイトカインを分
類出来る神経細胞物質の生成を開始する目的に利用可能
である。ネズミ大食細胞ラインＲＡＷ264.7 は分析と精
製を可能にするのに充分な量にて炎症性サイトカインの
分離を容易にした。通常，炎症性サイトカインがしかる
後分離される材料（神経細胞物質）または炎症性サイト
カイン及びその構成ペプチドを発生させる他の細胞ライ
ンまたは他の供給源は本明細書で意図されており，本発
明は従って制限されない。従って，遺伝子再生といった
別の手段は本明細書では本発明に従って意図されてい
る。
【００５３】先に説明した如く，炎症性サイトカイン，
その成分たるペプチド，その結合パートナーまたはサイ
トカインに擬病または拮抗作用を与えるかまたはその生
成を制御する他の配位子または薬剤は組織感染または他
の病理的配列無秩序と治療のためのこれらの疾病とある
患者に各種手段によって投与するのに有効な適当なキャ
リアーと強度で製薬組成にて準備出来る。各種投与技法
が利用可能であり，その中で，軟膏内にまたは手術用及
び，手術用スポンジ，包帯，ガーゼ，パッド等と如き他
の局処的添附物上といった局処的付与がある。また，こ
うした組成は，体の負傷領域，カテーテル挿入術等の如
き部分を洗浄するのに使用される洗浄流体を送出するこ
とを含む皮下投与，静脈内投与及び腹膜腔内投与といっ
た非経口技法により投与出来る。炎症性サイトカイン及
び／または前述した関係ある薬剤と平均量が変化出来，
特に，有資格医師またはベテランの推薦及び予測を基に
すべきである。
【００５４】前述し且つ先に示した如く，炎症性サイト
カインの作成と作用を調整する抗体及び薬品は或る治療
適用を有することが出来且つ従って炎症及び発熱といっ
た炎症性サイトカインの作用に貢献し得る効果を処理す
る目的で利用可能である。特に，炎症性サイトカイン
は，例えば，溶解したマウスひ臓リンバ細胞及び骨髄細
胞腫を利用する混成技法といった公知の技法により各種
哺乳動物内に抗体自体を作り出す目的で使用出来る。従
って，結果的に生ずる抗体は適当な製薬組成にて準備出
来，望ましくない状態を防いだりまたは処理するため投
与出来る。こうした製薬成分を考慮に入れている投与の
正確な量，投与間隔及び投与方法は医療技術で公知の内
容に従って変化し且つ有資格医師またはベテランの特定
の処方に従って変化する。
【００５５】本発明はまた，本発明の炎症性サイトカイ
ンにより影響を受ける作用を引き出す能力を参照して侵
入性刺激の存在を決定する方法を含む各種診断適用に関
するものである。先に述べた如く，炎症性サイトカイン
は各種公知の技法により抗体自体を作成する目的で使用
出来，こうした抗体は疑わしい哺乳動物内に炎症性サイ
トカインの存在を試験する際に利用出来且つ利用出来
る。
【００５６】炎症性サイトカインのペプチドに対する抗
体は良く知られている国成技法を含む標準的方法により
作り出され且つ分離される。便宜上，炎症性サイトカイ
ンに対する抗体は本明細書ではＢｂ１と称し，他の種に
て作り出された抗体はＡｂ２と称する。
【００５７】哺乳動物内での炎症性サイトカイン作用の
存在はこうした決定に適用可能な通常の病理学的方法に
より確認出来る。多数の有用な方法が知られている。特
に有用なこうした３種類の方法では検出可能ラベルにて
ラベル付けされた炎症性サイトカイン，検出可能ラベル
が付けられた抗体Ａｂ１または検出可能ラベルが付けら
れた抗体Ａｂ２を利用している。これらの方法はアスタ
リスクが粒子にラベル付けされたことを示し，『Ｃｙ
ｔ』が炎症性サイトカインを表わしている以下の式にて
要約出来る。
【００５８】 Ａ． Ｃｙｔ＊ ＋ Ａｂ１ ＝ Ｃｙｔ＊Ａｂ１ Ｂ． Ｃｙｔ ＋ Ａｂ＊ ＝ ＣｙｔＡｂ１＊ Ｃ． Ｃｙｔ ＋ Ａｂ１ ＋ Ａｂ２＊ ＝ Ｃｙｔ
Ａｂ１Ａｂ２＊
【００５９】方法及びその適用については全て当技術の
熟知者にはなじみであり，本明細書には例示的なものと
して示され，本発明の範囲内で利用出来る方法を制限し
ないものである。『競合する』方法である方法Ａは米国
特許第3,654,080 号及び同第3,750,652 号に述べられて
いる。『サンドイッチ』法である方法Ｃは米国特許第3
1,006号及び同第4,016,043 号に述べてある。『ダブル
抗体』または『ＣＡＳＰ』法でいった他の方法が知られ
ている。
【００６０】各事例において，炎症性サイトカインは１
個以上の抗体または結合パートナーと共に複合体を形成
しこの複合体の１つの要素に検出可能ラベルが付けられ
る。複合体が形成され，所望ならばその量はラベルの検
出に適用可能な公知の方法により決定出来る。
【００６１】Ａｂ２の特性はＡｂ１と反応する点にある
ことが前掲の内容から理解されよう。これは或る哺乳動
物の種内にて成育した抗体がＡｂ２の如き抗体を生育さ
せる抗原として他の種内にて使用されたことによる。例
えば，Ａｂ２は抗原として兎の抗体を使用している羊内
で生育出来る。従って，Ａｂ２は羊内で生育される抗兎
抗体となる。この説明と特許請求の範囲の目的上，Ａｂ
２は一次または抗炎症性サイトカインと称し，Ａｂ２は
二次または抗Ｂｂ１抗体と称する。
【００６２】これらの研究に対し最も普通に採用される
ラベルは放射性元素，酵素，紫外線に露された際螢光を
発する薬品及び他のものである。
【００６３】多数の螢光材料が知られており，ラベルと
して使用出来る。これらには例えばムルオレシン，ロザ
ミン及びアウラミンが含まれる。特別の検出材料は，羊
内で準備されてイソチオシアン酸塩を通じてフルオレシ
ンと結合する抗兎抗体である。
【００６４】炎症性サイトカインのペプチドまたはその
結合パートナーは放射性元素または酵素をラベル付けす
ることも出来る。放射性ラベルは現在利用可能な計数方
法のいずれかの方法で検出出来る。好ましいアイソトー
プは14Ｃ， 231Ｉ，３Ｈ， 125Ｉ及び35Ｓから選択出来
る。
【００６５】酵素ラベルも同様に有用であり，これは現
在利用される比色計法，分光光度計法，螢光分光光度計
法またはガス計量法のいずれかにより検出出来る。酵素
は，カルボジ・イミド，ジイソシアネート，グルタアル
デヒゾ等といった架橋分子との反応によりその選択され
た粒子と結合される。それらの方法において使用出来る
多くの酵素が知られており，利用可能である。好適なも
のは，ペルオキシダーズ（過酸化酵素），β−グルクロ
ニダーゼ，β−Ｄ−グルコシターゼ，β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ，ウレアーゼ，グルコース・オキシダーゼ・プ
ラス・ペロオキシダーゼ（グルコース酸化酵素と過酸化
酵素），ガラクトーゼオキシダース・プラス・ペルオキ
シダース（ガラクトース酸化酵素と過酸化酵素）及びア
ルカリン・フォスファターゼ（アルカリ性リン酸酵素）
である。別のラベル付け材料と方法を開示するため一例
として米国特許第3,654,090 号；同第3,850,752 号及び
同第4,016,043 号を参照する。
【００６６】本発明に従って開発され且つ利用される特
別の分析システムは受容体分析として知られている。受
容体分析の場合，分析すべき材料に適当なラベル付けが
され，次にラベル付けされた材料とラベル付けされない
材料両者の或る量により或る細胞試験コロニーが培養さ
れ，しかる後，そのラベル付けされた材料が細胞受容体
に結合する度合を決定すべく結合研究が行われる。この
様にして，両方と材料同志の適合性の違いが確認出来
る。
【００６７】従って，炎症性サイトカインの或る精製さ
れた量が放射性ラベル付けをされ，しかる後，例えば最
近分化された好中球を使って結合研究が実施されよう。
次に，ラベル付けされた炎症性サイトカインとラベル付
けされない炎症性サイトカインの各種量を含有する溶液
が準備され，次に未知サンプルが接種され，しかる後培
養される。次に，結果的に生ずる細胞の単層が洗浄さ
れ，溶解され，次に，５％の標準誤差を生むような充分
な時間長さにわたってガンマ計数器内で計数される。こ
れらのデータは次にスカッチャード分析を受け，しかる
後材料の作用に関する観察と結論を引き出すことが出来
る。前掲のプロトコルは例示的なものであるが，これは
分析される材料の細胞結合能力が顕著な特性として作用
出来る場合に受容体分析を実施出来且つ利用出来る様式
を例示している。
【００６８】本発明の別の実施態様においては，疑わし
い哺乳動物内での炎症性サイトカインの存在または不在
を決定する目的から医療専門家による使用に適した商用
試験キットが準備出来る。例えば，こうしたキットの或
る種類には炎症性サイトカインまたはその結合パートナ
ーから選択された例えばそれに固有の抗体等選択された
或るラベルの付けられる要素及び勿論，例えば『競合す
る』，『サンドイッチ』，『ＣＡＲＰ』等の各方法から
選択された方法に従っての処方が少なくとも含まれよ
う。これらのキットにはまた，バッファー，安定浸潤と
いった周辺と配位子も含まれよう。
【００６９】従って，侵入性刺激に対する哺乳動物の宿
主の反応を示す目的から （ａ）本発明の炎症性サイトカインまたはこの特定の結
合パートナーを検出可能ラベルに直接的または間接的に
付けることにより得られる少なくとも１つのラベル付け
された免疫化学的に反応する成分の所定の量； （ｂ）他の配位子； （ｃ）前記キットの使用指示 から成る試験キットを準備出来る。
【００７０】更に詳細には，診断用試験キットは， （ａ）一般に免疫溶剤を作成すべく固体相に限定されま
たは別の方式で各々適当なタグまたは複数個とこうした
最終製品等（またはその結合パートナー）に限定された
前述の如き炎症性サイトカイン（または結合パートナ
ー），の既知量； （ｂ）必要があれば，他の配位子；及び （ｃ）前記試験キットの使用指示 を含むことが出来る。
【００７１】別の改変例においては，所定のプロトコル
に従って作動する（例えば，『競合』，『サンドイッ
チ』，『ダブル抗体』等）前述した目的のため準備され
且つ使用出来る試験キットが， （ａ）炎症性サイトカインを検出可能ラベルに結合する
ことで得られたラベル付けされる要素； （ｂ）（ｉ）ラベル付けされた要素（ａ）と結合出来る
配位子； （ii）ラベル付けされた要素，ａ）の結合パートナーと
結合出来る配位子；（iii)決定すべき要素の少なくとも
１つの要素と結合出来る配位子；（iv）決定すべき要素
と少なくとも１つの要素の結合パートナーの少なくとも
１つのパートナーと結合出来る配位子；及びから成るグ
ループから選択される配位子または固定配位子を少なく
とも１つの試薬としている１種以上の付加的な免疫化学
的試薬；及び （ｃ）炎症性サイトカインとこの特定の結合パートナー
の間の免疫化学的反応の１種以上の成分の検出及び／ま
たは決定に対するプロトコルの性能に関する指示から成
っている。
【００７２】前掲の内容によれば，炎症性サイトカイン
の合成，リリースまたは作用を調整するのに有効な潜在
的薬剤をスクリーニングする分析システムも準備出来
る。第１方法においては，炎症性サイトカインの生成に
際し試験薬剤の効果を決定する目的からこれを刺激され
た大食細胞サンプルに投与出来た。別の方法において
は，炎症性サイトカインは好中球の如き細胞試験システ
ム内に導入出来，予想される薬剤はまた細胞培養液内に
導入出来，その培養液はしかる後，この予想される薬剤
単独の追加からまたは既知炎症サイトカインの追加量の
効果から生ずる炎症性サイトカインの作用上の変化を観
察すべく調べることが出来る。
【００７３】図８Ａ及び図８Ｂに示された飽和アミノ酸
シーケンスは本発明で有用な蛋白質の例示的なものに過
ぎず，図８Ａ及び図８Ｂに記載されたものと比較して実
質上同等または改変された作用を有する同様のシーケン
スもこうした蛋白質となる。これらの改変例は，例え
ば，箇所指示された突然変異を通じて得られる改変の如
く考えられ，またはＭＩＰ−１方法である宿主内の突然
変異を通じて得られる改変は不慮のものである。先に定
めた如く，ＭＩＰ−１同様の作用が保持される限り，こ
れらの改変は全て本発明に含まれる。従って，本明細書
で使用されているＭＨＰ−１と『炎症性サイトカイン』
という用語の定義は図８Ａ及び図８Ｂに個別にまたは組
合って示されたものと実質上等しいアミノ酸シーケンス
を有するペプチド要素を備えた蛋白質を特に含む。
【００７４】同様に，『刺激性』という用語とその複数
形は負傷に起因する状態と同様感染といった刺激性事象
及び例えば細胞性または新陳代謝異常または他の原因に
よる突発性または自発性状態に適用される。
【００７５】先に示した如く，以下の事例は，本発明の
炎症性サイトカインの分類と確認，本発明の炎症性サイ
トカインと本出願人及び当技術の他者により先に確認さ
れた因子の間の作用上と相違点と類似点を定めている作
用について注記した観察内容の詳細を記載している。通
常，以後説明する特定の材料と技法は例示的に過ぎず，
変わり得るので以下の内容は例示的なものとし本発明を
制限しないものである。
【００７６】
【実施例】本発明の炎症性サイトカインを確認し且つ更
に特徴付ける目的で以下の実験が実施された。最初，神
経細胞物質が培養され，炎症性サイトカインが分離さ
れ，次にその構造が決定され，しかる後，その作用を明
らかにし，可能であれば他の公知の大食細胞誘導因子に
よる確認をする努力において試験のバッテリーが行われ
た。
【００７７】材料と方法 材料 カリフォルニア州エメリービルのチャイロン社か
ら精製組替えヒト悪液質性／ＴＮＦを入手した。精製さ
れた組替えヒトＩＬ−１αはＰ・ロメデウコ博士（ホフ
マン・ラロッチェ，ナットレー，ニュージャージー州）
の気前の良いギフトであった。薬品は全て商業的供給者
から入手出来る最高級のものであった。
【００７８】動物 Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスはチャールズ
・リバー（キングストン，ニューヨーク）から入手し
た。菌体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪひずみを持つマウス
をジャクソン・ラボラトリーズ（バー・ハーバー，Ｍ
Ｅ）から入手した。
【００７９】細胞培養液 マウス大食細胞ラインＲＡＷ
264.7 及び悪液質性／ＴＮＦ反応細胞ラインＬ929 をア
メリカン・タイプ培養液コワクション（ロックビル，Ｍ
Ｄ）から入手し，各々ＲＰＭＩ1640またはダルデッコの
改変ＭＥＭ〔（ＤＭＥＭ）ＧＩＢＣＯ，グランドアイラ
ンド，ＮＹ〕内に維持した。両方の媒体には20ｍＭヘパ
ス及び10％ヘタルボビン抗毒素（ナイクローン，ローガ
ン，ＵＴ）を補填した。刺激を受けるＲＡＷ264.7 表面
浮遊物の作成のため，細胞をそれが流動する迄ＲＰＭＩ
プラス10％のヘタルボビン抗毒素内の1500mm組織培養液
皿（フアルコン）那で成長させた。細胞をハンクの残留
塩分溶液内で５回洗浄し，培体をリポポリサッカリド
（ＬＰＳ Ｗ，Ｅ・コリ0127；Ｂ８，ディスコ，デトロ
イト，ＭＩ）の１μｇ／ｍｌを補填した抗毒素の無いＲ
ＰＭと置換した。細胞を37℃にて16−18時間培養し，表
面浮遊物を0.22μｍのフィルターでフィルター処理し
た。
【００８０】ＭＩＰ−１の精製 表面浮遊物の神経細胞
物質１にたいし５リットルを10,000ダルトン分子量のキ
テトオフを有するＤＣ２中空ファイバー濃縮化システム
（アミコン社，レキシントン，ＭＡ）内で16−40倍に濃
縮し，同一装置を使って20ｍＭトリス・バッファー，ｐ
Ｈ8.0 の６リットルに対しフィルター処理した。エクチ
ルョリコサイドを濃縮化され付加された表面浮遊物に１
％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度迄加え，混合物を20ｍＭトリス
・バッファー，ｐＨ8.0 で従前に平衡化されたモノＱ10
／10〔陰イオン交換（ファーマシア，ローウエイ，Ｎ
Ｊ）〕に適用し，高速蛋白質液体クロマトグラフィー
（ＦＰＬＣ，ファーマシア）装置に接続した。溶離のた
め同じビッファー内で０ないし１Ｍ ＮａＣｌの114 ｍ
ｌ（総容積）の直線状勾配（及び２ｍｌ／分の流量）を
使用した。
【００８１】各部分のサンプルを還元状態下において10
−15％または−18％直線状勾配スラグ・ゲル内にドデシ
ル硫化物ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を含有する変
性システム内のポリアクリルアミドゲル電気泳動に露し
た。分子量基準（ＢＲＬ社，ベツフイーダ，ＭＤ）を平
行して使用した。ＭＩＰ−１を含有する部分が悪液質性
／ＴＮＦと同じ領域内で溶離し，大略8000と分子量の特
性対として容易に認識された。
【００８２】（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀色シミとして評
価される）部分を含むピークのＭＩｐ−１がプールさ
れ，濃縮され，100 ｍＭ酢酸アンモニアで従前に平衡化
された高性能ゲルろ過カラム（スーパーローズ12：フア
ーマシア）上で分留された。ＭＩＰ−１がカラムの空隙
容積内に回収されＮＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀色シミで判定
すると純度85％以上であった。この様にして精製された
ＭＩＰ−１は大略0.2 ｎｇ ＬＰＳ／μｇ ＭＩＰ−１
を含有した。
【００８３】ヘパリン・クロマトグラフィ― ヘパリン
と結合するＭＩＰ−１の能力も分析するためヘパリン活
用セフアローズ（フアーマシア）を使用した。ゲル８ｍ
ｌを充填したＣ／1020カラム（フアーマシア）をＦＰＬ
Ｃ装置に付け，20ｍＭ，トリス，ｐＨ8.0 で平衡化し
た。12倍に濃縮しフィルター処理したＲＡＷ264.7 表面
浮遊物（前と同様）の２ｍｌをカムラに適用し，同じバ
ツフアー内に０ないし２Ｍ ＮａＣｌの直線状勾配を溶
離のため使用した。
【００８４】クロマトフオ―カツシング モノＱクロマ
トグラフィーからの部分を含むピークＭＩＰ−１の８μ
ｇが25ｍＭビス／トリス＋10％ビテイン（Ｗ／Ｖ），ｐ
Ｈ7.1 内で平衡化され，同じバツフアー内で従前に平衡
化されたモノＰカムラに適用された。蛋白質が10％のビ
テイン（ｐＨ4.0 ）を有するポリバツフアー74（フアー
マシア）二重蒸溜水１：10）の直線状勾配で溶離した。
結果的に７にたいし４の降下するｐＨ勾配が得られた。
【００８５】蛋白質分析 標準的なものとしてＢＳＡ
（バイオラッド，リッチモンド，ＣＡ）を使用する分析
装置（ブラッドフォード，Ｍ．ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨ．
72：248 −254 （1976年））により蛋白質含有量を測定
した。
【００８６】菌体内毒素分析 メーカー側の指示に従っ
てクロモジェニック・リミダス分析（ホワイトテーカー
Ｍ．Ａ．バイオ・プロダクツ，ウオーカーズヒルＭ）を
使用して決定した。
【００８７】蛋白質シ―ケンシング ロックフェラー大
学蛋白質シーケンシング設備を使って精製ＭＩＰ−１を
シーケンス処理した。コンピューター・プログラムｄ−
ＦＡＳＴ−Ｐを使って均質なアミノ酸シーケンスを求め
てデイホフ蛋白質シーケンス・バンクを調査した。
【００８８】生体内(in vivo) の炎症性作用 多形核白
血球（ＰＭＮ）浸潤がグランシタイン，Ｒ．Ｄ．等，Ｊ
・ＣＬＩＮ・ＩＮＶＥＳＴ・77：1020−1027（1986年）
によりフートパッド投与を利用して評価された。要約す
ると，雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（６−12週間）をフエ
ノバルビタール（25ｍｇ／kg体重ｉ・ｐ）で軽く麻酔し
た。10-10 モルＮ−フオルミルメチオニルロイシルフエ
ニルアラニン（ｆＭＬＰ）を含有する0.05ｍｌの皮下フ
ツトパツド投与；組替えヒトＩＬ−１α組替えヒト悪液
質性／ＴＮＦの10,100又は1000ｎｇ；又は0.1 ％のフエ
タールボビン抗毒素を有するＲＰＭＩ1640内のマウスＭ
ＩＰ−１，前と同様精製）の1,10,100又は1000ｎｇを受
取るよう動物をランダムにした。0.1 ％のフエタルボビ
ン抗毒素を有するＲＰＭＩ1640単独で制御体として作用
した。多くの場合マウスは片方の足の裏に試験物質を受
入れ，対向する横の足に制御体キャリアーを受入れた。
他の場合にはランダム化されたブロック・デザインが採
用された。マウスは投与に引続き４時間拷問を受け，４
肢が10％バツフアー・ホルマリン内に固定された。４肢
が石灰質除去され，パラフィン内に埋設され，足の裏の
薄い部分がヘマトキシリンとイオジンで汚された。
【００８９】試験管内のＰＭＮ移動分析 ヘパリン処理
された静脈血を健康なボランティアから入手した。細変
分析により判定された95％ＰＭＮ以上を含有する白血球
がヌイコルーハイペーク密度勾配遠心及びデクストラン
沈澱により分離された（クレンプナー，ＭＳ等，Ｊ．Ｃ
ＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ 64：969 −1002（1974年））。
残留エリスロサイトがヒポトニック・サリンと共にヤイ
シスで除去された。細胞はゲイの残留塩分溶液（ＧＢＳ
Ｓ，ｐＨ7.4 ）及び２％ボビン抗毒素アルブミン（ＢＳ
Ａ）内にて2.5 ×106 細胞／ｍｌの最終濃度迄再懸濁さ
れた。
【００９０】試験管内の機能亢進がボイデンの説明した
技法（ボイデン，Ｓ．Ｖ．Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．115 ：
353 −466 （1962年））の改変を使って分析された。め
くら容器室の底壁には試験化合物即ちｆＭＬＰ（10
-8Ｍ），ＭＩＰ−１またはバツファ単独を含有するダツ
ファーの25μｌが充填され上部容器には1.1 ×104 ＰＭ
Ｎを含有するＧＢＳＳ／ＢＲＡの35μｌが充填された。
２個と容器は孔寸法が３μｍのセルロース・ナイトレー
ト膜で分離された。（ＳＭ 11302 ，サルトリアス，ウ
エストベリー，ＣＴ）室は湿気を与えた５％ＣＯ２−95
室内空気室内で45分間，37℃にて培養された。前述した
プロトコルに従って膜を除去し，汚染した。（ヘッセ，
Ｄ．Ｇ．等，Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．73：1078−
1085（1984年））膜内に移動するＰＭＮの個数が自動オ
プトマックス・イメージング・システム（オプトマック
ス社，ホリス，ＮＨ）を使って130 μＭ迄各10μＭ毎に
計数された。各膜に対し移動が３個のランザムに選択さ
れたフイルドにて数量化され各サンプルが３回試験され
た。ＧＢＳＳ単独（０％）及び正のｆＭＬＰ制御（100
％）と対比的に機能亢進が（％で表わされた）膜内へ移
動された平均距離として定められた。
【００９１】機能亢進データは制御機能亢進応答の％
（平均±平均（ＳＥＭ）の標準誤差）として表わされ
る。ＨＩＰ−１に対する応答を室の帝壁内のＢＢＳＳ単
独のものに対するものと比較するため変数の一方分析
（ＡＮＯＶＡ）が使用された。
【００９２】過酸化水素リリ―スの誘引 固有のヒトＰ
ＭＮ又はモノサイトからＨ２Ｏ２のリリースを刺激する
ＭＩＰ−１の能力が最近詳細に述べられた方法で試験さ
れた（Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．Ｆ．1987年，ＪＣＬＩＮ．Ｉ
ＮＶＥＳＴ（ｉｎ ｐｒｅｓｓ））要約すると，ＰＭＮ
とヘパリン処理又はクエン酸塩処理した血液内の単細胞
白血球がノイトロフイル・アイソレーション・メデイア
ム（バッカード・インスツルメント社，ドーナーズ・グ
ローブ，ＩＬ）内で分離され，洗浄され，フェタル・ボ
ビン抗毒素が従前に被覆され過剰に洗浄された底部が平
らな直径６mmのポリツチレン組織培養溶液器内で容器あ
たり1.5 ×104 ＰＭＮ又は２×105 単核細胞にて別々に
ブレート処理された。分析混合物は2.4 ｎＭスコポレテ
イン，0.5 μｇホースラディッシュ・ペロキシダース，
１ｍＭアジド・ナトリウム及び指示試薬を37℃にてグル
コースを有するクレブス・リンガーリン酸塩バツファー
の0.13ｍｌの最終容積内に含有した。Ｈ２Ｏ２による酸
化に起因するスコポレテインの螢光性の損失がプレート
読取り螢光計内に15分又は30分の間隔にて記録されマイ
クロ・コンピューターにより ｎＭ Ｈ２Ｏ２に変換さ
れた（デ・ラ・ハルプ，Ｊ等，Ｊ．ＩＭＭＵＮ．ＭＥＴ
ＨＯＤＳ78：323 ：336 （1985年））
【００９３】ＩＬ−１及び悪液質性／ＴＮＦバイオ分析
先に説明した如くフイトヘマグリチニンの適量存在下
にて芽胞生殖を行うようＣ３Ｈ／ＨｅＪ酵素を刺激する
能力によりＩＬ−１作用に対しＭＩＰ−１が分析され
た。〔モルドウオーター，Ｌ．Ｌ等Ｊ．ＩＭＭＵＮ．13
8 ：4270−3274（1987年）〕
【００９４】悪液質性／ＴＮＦ作用がアクチノマイシン
Ｄ処理されたＬ929 マウス線維母細胞を殺す能力によっ
て分析された。〔オクトローブ，ＪＭ．等αＰＲＯＣ．
ＳＯＣ．ＥＸＰ．ＢＩＯＬ．ＭＥＤ． 160 ：354 −35
8 （1979年）〕。１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを含
有しＭＩＰ−１の増量を図るＤＭＥ媒体内の86ウエル・
プレート（ファルコン）の各ウエル内に大略50,000のＬ
929 細胞がプレート処理された。14−16時間後，色原体
（３−（4.5 −ジメチルチアゾール２−Ｙ１）−２，５
−ジフエニルテトラゾリユム・ブロマイド（ＭＴＴ））
が添加され，細胞は更に４時間培養された。公知の方法
〔モスマンＴ．Ｊ．ＩＭＭＵＮ，ＭＥＴＨＯＤＳ 65：
55−63（1985年）〕の改変によりこの時間中に色原体を
低減化するよう細胞の能力により細胞の生活能力が評価
された。媒体が吸引され，細胞がイソブロパノール内で
0.04Ｎ塩化水素酸により分離された。１容積の二重蒸溜
水を添加した後，色原体の減少範囲が，自動ＤＬＩＳＡ
−プレート・リーダーを使用してＯ．Ｄ．570 ／690 の
プレートを読むことにより測定され，組替えヒト悪液質
性／ＴＮＦの場合と同様に得られた標準的な細胞毒素性
曲線と比較された。
【００９５】前述した如く，３Ｔ３−Ｌ１細胞上のリポ
プロテイン・リパーゼの消去により悪液質性／ＴＮＦも
分析された〔ボイトラー，Ｂ．等，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ
161 ：984 −995 （1985年）〕。大食細胞の１次培養
液内に悪液質性／ＴＮＦを誘引するＭＩＰ−１の能力は
チオグリコレート・ブロス（ＤＩＦＣＯ）２ｍｌのｉｐ
投与で大食細胞を刺激し腹膜洗浄により細胞を４ないし
６日間回収することにより評価された。細胞は洗浄さ
れ，抗毒素の無いＲＰＭＩ内で再懸濁され，24ウエルの
組織培養プレート内で106 細胞／ウエルにてプレート処
理された。試験物質．ＬＰＳ，0.0001−１μｇ／ｍｌ；
ＭＩＰ−１，１μｇ／ｍｌ）が添加され，細胞は37℃に
て28時間培養された。細胞の無い表面浮遊物が集められ
前述の如くＬ829 細胞上の細胞内毒素により悪液質性／
ＴＮＦ作用の分析がなされた。
【００９６】ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの精製 ス
ーパーローズ12上で高性埜ゲルろ過クロマトグラフィー
からの部分を含有するＭＩＰ−１がプールされ，ＰＭ−
10膜を使ってかく乱細胞内で濃縮化され（アミコン社，
ヂンバースβＭＡ）0.01Ｍリン酸塩ナトリウム・バツフ
ァー，ｐＨ6.4 に対しろ過された。次に，ＭＩＰ−１の
２つの成分が公知の方法に従ってＳＤＳ−ヒドロキシル
アパタイト・クロマトグラフィーにより溶解された〔モ
スＢ及びＥ．Ｎ．ローゼンブラム．Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨ
ＥＭ，247 ：5194，（1972年）〕要約すると，１％ＳＤ
Ｓ及び１％メルカプトエタノールを含有する0.01Ｍリン
酸塩ナトリウム・バツファー，ｐＨ6.4内でＭＩＰ−１
の500 μｇの割切れる値が平衡化され，沸騰水中に２分
間置かれた。サンプルは0.1 ％ＳＤＳ及び1.0 ｍＭＤＴ
Ｔ（バツファーＡ）を有する0.01Ｍリン酸塩ナトリウム
・バツファー（ｐＨ6.4 ）で直ちに10倍に希釈され，バ
ツファーＡ内にて予め平衡化されたヒドロキシルアパタ
イト・カラム（バイオ・ゲルＨＰＨＴ，バイオ・ラッ
ド，リッチモンドβＣＡ）に直接適用された。0.1 ％Ｓ
ＤＳ及び1.0 ｍＭＤＴＴを含有する0.01Ｍないし0.25Ｍ
リン酸塩ナトリウム・バツファー（ｐＨ6.4 ）から25ｍ
ｌの直線状勾配が溶離に対して使用された。
【００９７】蛋白質シ―ケンシング ＭＩＰ−１α及び
ＭＩＰ−１βのＮ−ターミナル・アミノ酸シーケンス分
析が適用されたバイオ・システムズ・ガス相シーケンサ
ーで行われた。デイホフ蛋白質シーケンス・バンクでｄ
−ＦＡＳＴ−Ｐコンピューター・プログラムを使って均
質アミノ酸シーケンスの調査が行われた。
【００９８】水治療プロット ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ
−１βの水治療プロットが公知アルゴリズムの改変によ
って演算された。〔ホップ，Ｔ．Ｐ．及びＫ．Ｒ．ウッ
ズＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ
78：3824（1981年）〕
【００９９】ｃＤＮＡライブラリ―の構築 ＬＰＳ刺激
ＲＡＷ264.7 細胞からｃＤＮＡライブラリーが先に述べ
た如く得られた〔Ｇ．デバテリス，Ｐ．テカンプ・オル
ソン，Ｓ．Ｄ．ウオルプ，Ｋ．ヘルムセン，Ｃ．ロイ
ク，Ｃ．ガレゴス，Ｄ．コイト，ＳＤ．メリーウエザー
及びＡ．セラミ，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．167 ：1939−19
44（1988年）〕。要約すると，ＲＡＷ264.7 細胞の合流
単層がＨＢＳＳ内で５回洗浄され，1.0 μｇ／ｍｌ Ｌ
ＰＳを含有する抗毒素の無いＲＰＭＩ1640培養媒体で被
覆された。37℃で２時間にわたり培養した後，全ＲＮＡ
が６Ｍチオシアン酸塩グアニジン内に抽出された〔ウル
ユツチ，Ａ．Ｊシャイン，Ｊ．チルグウイン，Ｒ．ピク
テツト，Ｅ．テイツシャー，Ｗ．Ｊ．ルツター及びＨ．
Ｍグッドマン，ＳＣＩＥＮＣＥ186 ：1313（1977
年）〕。次に，ポリ（Ａ）＋ＲＮＡが公知の方法の改変
に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィ
ーの２サイクルにより分離された〔マニイチス，Ｔ．
Ｅ．Ｆ．フリッチュ及びＪ．サムブロック，『分子クロ
ーニング ラボラトリー・マニュアル』コールド・スプ
リング・ハーバー−ラボラノリー，コペルド・スプリン
グ・ハーバー，ＮＹ．ｐ197 （1982年）〕。公知の方法
に従って二重ストランド型ｃＤＮＡがポリ（Ａ）＋選択
されたＲＮＡから準備された。〔ガブラー，Ｕ．及び
Ｂ．Ｊ．ホフマン，ＧＥＮＥ．25：263 （1983年）〕内
部ＥｃｏＲ１箇所がメチル処理され，Ｅｃｏ Ｒ１リン
カーが添加され，ｃＤＮＡがバクテリア細胞ラヨダｇｔ
10のＥｃｏ Ｒ１箇所内に挿入された（ヒュン，Ｔ．
Ｖ，Ｒ．Ａ．ヤング及びＲ．Ｗ．デービス，ＤＮＡクロ
ーニング：実際的アプローチ，Ｄ．Ｍ．グローブス等．
ＩＲＬプレス，オックスフォード．149 （1985年）。
【０１００】プロ―ブ・プ―ルの構築 『主要』シーケ
ンスに対応する２個のオリゴノヌクレオチド・プローブ
・プールが部分アミノ・ターミナル・シーケンスのアミ
ノ酸＃22−30に対してＤＮＡ３：301 （1984年）のワー
ナー・Ｂ．Ｄ，Ｍ．Ｅ．ワーナー，Ｇ．Ａ．カーンズ，
Ｌ．ク，Ｓ．ブラウン・シマー及びＭ．Ｓ．ウルディに
従って合成された。ポリペプチドのこの部分はシーケン
スの残りの部分と対比した場合コードン・ディクショナ
リー内にその低い変質があるので選択された。結果的に
生ずるプローブ・プールは長さが26のヌクレオチードの
２個の512 倍変質プールである。
【０１０１】ＭＩＰ−１βの部分的Ｎ−ターミナル・シ
ーケンスのアミノ酸２−８に対応するオリゴヌクレオチ
ードはＤＮＡ．３：401 （1984年）のワーナー，Ｂ．
Ｄ．Ｍ．Ｅ．ワーナー，Ｇ．Ａ．カーンズ，Ｌ．ク，
Ｓ．ブラウン・シマー及びＭ．Ｓ．ウルデイアの改変に
て述べられた如く合成された。この特定のシーケンスは
ＭＩＰ−１αとＭＩＰ−１βシーケンスの間の最低の見
かけの一致の領域であることから選択された。
【０１０２】ライブラリーのスクリーニング：ＭＨＰ−
１αに関して，ライブラリーの低密度ブレート．５×10
3 ｐｆｕ／プレート）のニトロセルロース・フィルター
・リフトが32ｐ−ＡＴＰ（ニューイングランド・ニュー
スリア，ボストン，ＭＡ）でラベル付けされた５’−ｅ
ｎｄであった合成プローブ・プールを使ってハイブリッ
ド化された。ハイブリッド化に続いて，リフトはウッド
等（10）の方法を使って洗浄された。数回のスクリーニ
ング後，18個の組替え細胞クローンが分離されＤＮＡ分
離に対しヂルクで生長された。
【０１０３】ＭＩＰ−１βに関して，プレート化ライブ
ラリー．（４×105 プレート）の二重ニトロセルロース
・フィルター・リヌトが，４×ＳＳＣ，２×デンハルト
溶液，40ｍＭリン酸塩ナトリウム・ダツファー，ｐＨ7.
0 ，0.3 ｍｇ／ｍｌのソニケート化サルモン・スパーム
ＤＮＡ，0.1 ％ＳＤＳ及び32ｐ−ＡＴＰ ５’ｅｎｄラ
ベル付け合成オリゴヌクレオチード・プローブ・プール
の2.5 −５×104 ｃｑｍ／ｍｌ／変質内にて42℃にて一
晩でハイブリッド化された。ハイブリッド化に続き，フ
ィルターが洗浄され，最終的な洗浄は中程度のきびしさ
の下に行われ，２×ＳＳＣ，0.1 ％ＳＤＳ，50℃にて行
われた。二重フィルター上で正のプレート低密度ブレー
トとスクリーニングの第２ラウンドを受けた。この様に
して２個の独立した正の細胞クローンが別の分析のため
ＤＮＡの準備されたものから分離された。
【０１０４】ＤＮＡシーケンス分析 分析すべきｃＤＮ
ＡインサートはＨ13細胞ベクトル内にサブ・クローン処
理され，ＤＮＡシーケンシングがサンガー等のジデオキ
シ鎖ターミネーション法により行われた。〔Ｆ．サンガ
ー及びＳ．ニッケレン，Ｒ．クールソン，ＰＲＯＣ．Ｎ
ＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．74：5463（19
77年）〕
【０１０５】ブロット・ハイブリッド化分析 公知の方
法の適合により北側ブロットのハイブリッド化が行われ
た〔レーラフ，Ｈ．Ｄ．ダイアモンド，Ｊ．Ｍ．ウオズ
ーニ及びＨ．ボイトカー，ＢＩＪＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．
16：4743（1977年）〕ＬＰＳ刺激された且つ非刺激ＲＡ
Ｗ264.7 の総ＲＮＡの細胞は1.2 ％アガローズ・ゲルを
通じて電気泳動され，ニトロセルロース・フィルターに
移送された。
【０１０６】一次延長 合成オリゴノヌクレオチード・
プライマーが〔γ−32ｐ〕ＡＴＰ（3000Ｃｉ／ｍモル，
アメリカン社，アーリントン・ハイツ，ＩＬ）及びＴ４
ポリヌクレオチード・キナーゼを使ってｅｎｄラベル付
けされた。プライマー延長法は公知方法の改変であっ
た。〔ウオーカー，Ｍ，Ｄ．Ｔ．ケドルンド，Ａ．Ｍ．
ボーレツト及びＷ．Ｊ．ルツターＮＡＴＵＲＥ ＬＯＮ
Ｄ．306 ：557 （1983年）〕。
【０１０７】結果 ＭＩＰ−１の精製 刺激されたＲＡＷ264.7 細胞がモノ
Ｑ（陰イオン交換）クロマトグラフイーにより部分化さ
れた場合，ＭＩＰ−１は銀色シミ付け（図１）後のＮＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ上の約8000ザルトンの顕著な対として表わ
れた。ＨＩＰ−１は部分または悪液質性／ＴＮＦの２個
内で再生可能に溶離され，銀色シミ付けにより判定され
たものと大略同じ量発生された。
【０１０８】クロマトフオーカツシングは，モノＱ精製
されたＭＩＰ−１が悪液質性／ＴＮＦより僅かに高い酸
性ｐＨにて溶離した。これは4.6 のｐＩ（図示せず）に
対応した。
【０１０９】ＭＨＰ−１を更に精製する目的から粒状化
する利点が得られた。ＭＨＰ−１の粒状化は原材料の濃
縮中及びモノＱ（データ図示せず）上のろ過または分化
前に発生することが観察された。リン酸塩バツファー処
理されたサリン内のゲルろ過により分化された場合，Ｍ
ＩＰ−１は大略20000 ダルトンから空隙容積内の溶離す
る材料（≧２×106 ザルトン：データ図示せず）にわた
る各種分子量のマルチマーを形成した。1001Ｍ酢酸アン
モニアにおいて，この傾向は拡大され，大部分の蛋白質
が高分子量部分（図２，で溶離した。これらの状態下に
おいて，ＮＤＳ−ＫＡＧＥ及び銀色シミ付けにより判定
された85％純度以上のＭＩＰ−１が得られた。
【０１１０】精製されたＭＨＰ−１（図３）の部分的な
Ｎ−ターミナル・アミノ酸シーケンス・データは単一の
主要シーケンスを示したが，２個の別々のバッチのシー
ケンスはＮ−ターミナル領域に多数の特定位置に固有の
マイナー・アミノ酸を示した。このシーケンス・データ
のコンピュータ・ベース分析は先に述べた蛋白質のいず
れとも充分な均質性を明らかにしなかった。
【０１１１】ヘパリンに対するＭＩＰ−１の一致性 Ｍ
ＩＰ−１の精製中に，ヘパリン（図４）に対する一致性
が注目された。12倍に濃縮されたＲＡＷ264.7 表面浮遊
物の２ｍ１がカラムに付けられ０ないし２Ｍ ＮａＣ１
の直線状勾配で溶離されるとＭＨＰ−１はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ，銀色シミ付け，大略0.7 にて溶離することで検出
可能な２個の主要蛋白質の１つであった。
【０１１２】生物学的作用の決定 20μｇ／ｍ１の高い
濃度において，精製ＭＨＰ−１はＣ３Ｈ／ＨｅＪ酵素の
芽胞生殖を刺激しなかった。一方，組替えヒトＩＬ−１
は10ｐｇ／ｍｌ（データ図示せず）程度の低さの濃度で
この分析では活性があった。同様に，精製されたＭＩＰ
−１は１μｇ／ｍｌの濃度においてもアクチノマイシン
Ｄの存在下でＬ929 を殺さず，一方，組替えヒト悪液質
性／ＴＮＦは15ｐｇ／ｍｌ（データ図示せず）程度の低
い値の濃度で殺すことが出来なかった。更に，精製され
たＭＩＰ−１は３Ｔ３−Ｌ１細胞（データ図示せず）内
にリポプロテイン・リパーゼのダウン・レギュレーショ
ンを誘引しなかった。１μｇ／ｍｌにおいて，精製ＭＨ
Ｐ−１は10μｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（データ図示せ
ず）の存在下で一次チオグリコレル酸塩侵入マウス大食
細胞により悪液質性／ＴＮＦ生成を誘引しなかった。
【０１１３】前述したＩＬ−１−及び悪液質性／ＴＮＦ
状作用は次いで，ＭＨＰ−１はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの
足の裏に皮下投与した際４時間で局部的ふくらみの反応
を誘引した。ＭＩＰ−１の100 ｎｇが投与された時生じ
た最大のふくらみは主としてＰＭＮ白血球浸潤（図５，
写真Ａ）を特長とした。制御応答のキャリア投与に関す
るものを写真Ｂに示す。ＭＩＰ−１で見られる好中球浸
潤の度合はｆＭＬＰの10-10 モルが投与された場合程顕
著ではなかった（図５，写真Ｃ）然し乍ら，好中球浸潤
の度合は組替え悪液質性／ＴＮＦの10ｎｇで観察された
ものと対比出来た。組替えヒトＩＬ−１はこれらの薬剤
（データ図示せず）の投与時に４時間において何んら炎
症酔反応を出さなかった。
【０１１４】ＨＩＰ−１は試験管内のヒト好中球内に機
能亢進を誘引した。パーセントが負とＧＢＳＳ（０％）
と正のｆＭＬＰ 10-8Ｍ制御体）（100 ％）に対し相対
的に移動が増加する際提供される。100 ｎｇ／ｍｌに等
しいまたはこれ以上の濃度において，ＨＩＰ−１は好中
球移動における著しい増加ももたらした。（ＡＮＯＶＡ
によりｐ＜0.01）ポリマイシンＢの含有（10μｇ／ｍ
ｌ）はＭＩＰ−１誘引機能亢進に何んら効果がなかっ
た。更に，こと分析では，10−1000ｎｇ／ｍｌの濃度に
おけるＬＰＳは活性がなかった（データ図示せず）。
【０１１５】ｒＩＬ−１αでない組替え悪液質性／ＴＮ
Ｆは細胞が抗毒素または余剰細胞マトリックス蛋白質で
被覆された表面に付着されることも条件に，遅延した著
しく高い呼吸突発をヒトＰＭＮ内にトリガーさせる（ナ
サン，Ｃ．Ｆ．1987，Ｊ．ＣＬＩＮＩＮＶＥＳＴ（ｉｎ
ｐｒｅｓｓ）。同様に，≧１μｇ／ｍｌにおけるＭＩ
Ｐ−１は４回の実験でＨ２Ｊ２を解放すべく接着ＰＭＮ
をトリガーした。実験と中の１つを図７に図示する。平
行培養液内で試験された悪液質性／ＴＮＦと比較して，
ＭＩＰ−１に対する反応は更に遅延され（悪液質性／Ｔ
ＮＦにつき60分のラグ対15のラグ），最大の保持割合は
低かった（悪液質性／ＴＮＦについて10 6 ＰＭＮあたり
1.2 ｎモル／分対3.0 及びＰＭＡに対して2.1 ）。然し
乍ら，反応持続時間は長かった（悪液質性／ＴＮＦに対
して１時間と比較して2.5 時間）そのため解放されたＨ
２Ｏ２の総量は同様であった。ＭＩＰ−１はヘパリンと
結合するので，ヘパリン処理された血液よりむしろクエ
ン酸処理から分離されるＰＭＮでも実験が行われ，同様
の結果が得られた。（図示せざる）ＭＩＰ−１または悪
液質性／ＯＮＦ（ナサーン，Ｃ．Ｆ．1987，Ｊ．ＣＬＩ
Ｎ．ＩＮＶＥＳＴ．（ｉｎ ｐｒｅｓｓ））もＨＨ２Ｏ
２の単細胞からの解放トリガーをしなかった。
【０１１６】検討 先に示したデータは，炎症性サイトカインＭＩＰ−１が
先に説明した蛋白質に対し著しいシーケンス一致を有し
ていたいが，悪液質性／ＴＮＦ及びＩＬ−１の如き炎症
性神経細胞の典型的な重なる特性の金部の特性を共有し
ている。
【０１１７】ＭＩＰ−１はその関連ある物理的特性を基
にして分離された。先に示した如く，ＭＩＰ−１はＳＤ
Ｓ−ＫＡＧＥ上の約8000ダルトンの対として移動する
が，これはゲルろ過により判定された場合２×106 ダル
トンを越える高分子量の粒状物を容易に形成する。部紛
的アミノ酸シーケンス・データは多数の位置において
『ハイナー』置換にて１つの：主要』シーケンスを示
す。
【０１１８】蛋白質が陰イオン性である条件下において
ヘパリンにＭＩＰ−１が結合することが特定の相互作用
を示唆している。これは更に，ＭＩＰ−１が高塩分濃度
においてヘパリンと結合する２個と主要大食細胞隠ぺい
蛋白質の１つであるという観察により強調される。ＭＩ
Ｐ−１は大食細胞，マスト細胞及び好中球の炎症性浸潤
の調整にあたって或る役割を果たすことが出来る。ＭＩ
Ｐ−１は浸潤中にベースメント膜プロテオグリカンと反
応出来る。
【０１１９】本願で呈示した発見内容は悪液質性／ＴＮ
ＦまたはＭＩＰ−１が炎症性反応を誘引出来るとする示
唆に一致している。悪液質性／ＴＭＦは好中球機能亢進
を誘引するよう先に示された。（ヒガリ，Ｉ．Ｓ．等，
1987，ＢＬＯＯＤ（ｉｎ ｐｒｅｓｓ）；ミング，Ｗ．
Ｊ等，Ｊ．ＩＭＭＵＮ．238 ：1469−2474（1887））他
に作用（シャラビー，Ｍ．Ｒ．，Ｊ．ＩＭＭＵＮ．135
：1069−2073（1985）；及び辻本，Ｍ等 ＢＩＯＣ
Ｈ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮα137：109
4−1100（1986））。本発明の研究では，ＭＩＰ−１は
また，好中球機能亢進を誘引出来ることが示された。他
に，本発明で使用された投与量では悪液質性／ＳＮＦ及
びＭＩＰ−１が各々生体内(in vivo) の炎症と同様の度
合を示した。他の文献では組替えＩＬ−１が生体内(in
vivo) で炎症性反応を誘引出来ることを示したが（グラ
シュタイン，Ｒ．Ｄ．，等，Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳ
Ｔ77：1020−1027（1986）），本発明ではこうした効果
は見出されなかった。本発明で使用された組替えヒトＩ
Ｌ−１αは刊行されている実験で使用されたマウスＩＬ
−１αよりこの点で活性の劣ることがある。（グランシ
ュタイン，Ｒ．Ｄ，等，Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ7
7：1020−1027（1986））
【０１２０】使用される投与量においてＬ929 細胞内毒
素性分析により検出される悪液質性／ＴＮＦ放射性がな
かったので，ＭＩＰ−１の効果が投与的にその悪液質性
／ＴＮＦの汚染に起因することはあり得ない。更に，Ｍ
ＨＰ−１は悪液質性／ＴＮＦを生成する一次チオグリコ
ール酸塩侵入大食細胞を誘引しなかった。菌体内毒素の
汚染は機能亢進効果の説明には無関係とされ，機能亢進
はポリミキシンＢの存在によって影響されなかった。Ｌ
ＰＳ自体はＭＨＰ−１分析で存在したものより高い濃度
において，機能亢進効果を呈しなかった。
【０１２１】ＭＨＰ−１により誘引された炎症は菌体内
毒素汚染の低いレベル（0.2 ｎｇＬＰＳ／μｇ ＭＩＰ
−１）での準備薬にて菌体内毒素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪひ
ずみがマウス内に観察された。
【０１２２】先に説明した如く，元のハウスＭＩＰ−１
は大略8000ダルトンのサブユニット分子量とほぼ同じ値
の対として分離されている。２個のＭＩＰ−０はＳＤＳ
−ＰＡＧＥにより或る程度分離されるが，その電気泳動
の移動性が類似しているので指薬的ＳＤＳ−ＫＡＧＥは
精製の非実際的手段として使われた。元のＭＩＰ−１
（対）はＮＤＳ−ヒドロキシルアパタイト・クロマトグ
ラフィーにさらされた。この技術は同様の電気泳動移動
性の蛋白質サブユニットを成功裡に分離させる目的で使
用された〔Ｂ．モス及びＥ．Ｎ．ローゼンブラム，ＪＢ
ＩＯＬ．ＣＨＥＭ．247 ：5194（1972）〕。図１３から
理解出来る如く，ＳＤＳの存在下でヒドロキシルアパタ
イト・カラム上の元のＭＩＰ−１の分化に続いて２個の
顕著な蛋白質ピークが観察される。最初のピークは0.24
Ｍリン酸塩ナトリウムにおいて溶離し，第２ピークは0.
27Ｍリン酸塩ナトリウムで溶離する。Ｎターミナル・ア
ミノ酸とカラム分化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は，第１ピ
ークがここでＭＩＰ−１αとして参照したＭＩＰ−１の
低分子量バンドに対応し，一方，第２ピークがＭＩＰ−
１βとして参照した高分子量バンドに対応することを明
らかにした。この技術を使って，各要素はＮターミナル
・アミノ酸シーケンス分析に対し純粋な形態（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで判定した＞95％）で得られた。
【０１２３】マウスＭＩＰ−１αの分子量構造を刺激す
る目的でＭＩＰ−１αに対するシーケンス・コーディン
グを含むｃＤＮＡクローンが分離された。第１段階にし
て，マウス大食細飽ラインＲＡＷ264.7 がＬＰＳにより
刺激された。ＬＰＳ刺激後ＲＡＷ164.7 細胞はＭＨＰ−
１αの供給源となることが示されたので，ＭＩＰ−１α
ｍＲＮＡはこれらのＬＰＳ誘引細胞内で刺激されるも
のと予測される。
【０１２４】ラムダ・オリゴ・ｄＴ−クロマトグラフィ
ーの２サイクルにより総ＲＡＮからポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
が準備され，ｃＤＮＡライブラリーがラムダｇｔ10内に
構築された。クローニッグ効率はポリ（Ａ）＋ＲＡＮの
106 クローン／μｇであった。ライブラリーは増幅さ
れ，組替えブレートと60％以上で1000ｐｂ以上のインサ
ートを含むよう示された。精製されたＭＩＰ−１の一致
する部分的ＮＨ２ターミナル・アミノ酸シーケンスに基
づいた２個の合成コリゴノヌクレオチド・プールを使用
してライブラリーの低密度プレーティングのニノロセル
ロース・フィルター・ユフトがスクリーォ処理された。
Ｒ．Ｄウオルプ，Ｇデバテルス，Ｂ．シェリー，Ｂ．ド
イトラー，Ｄ．Ｇ．ヘッセ，ＨＴヌエン，Ｌ．Ｌ．モル
ドワー，Ｃ．Ｆ．ナサーン，Ｓ．Ｆ．ローレイ及びＡ．
セラミ，Ｊ．ＥＸＰ，ＭＥＤ．167：570 （1987）。各
プールは長さが26のツクレオチドの512 倍と遺伝子プー
ルで構成された。（図９）
【０１２５】初期ライブラリー・スクリーニング後に，
正のプレートが新鮮なバクテリア・ローン上にストリー
クされ，２次スクリーニングが差動プレート・ハイヅリ
ッド化により行われた。２次ストリークのレブリカ・リ
フトは32ｐラベル付けされたプール＃１またはプール＃
２にハイブリッド化された。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ドの溶融温度（Ｔ）は実験式Ｔ＝16.6（１ｏｇ［Ｎａ
＋］＋0.41（％［Ｇ＋Ｃ］）＋81.5−500 ／均質ｂｐ数
で概算出来るので，プローブ・プールの１つが26−ｂｐ
均質を基にしたハイブリッドの異なる溶融温度を過ぎて
効果的に消去された。Ａ−Ｔ対Ｇ−Ｃベース対の好適溶
融を無くすテトラメチルアンモニウム塩化物洗浄技術を
使用することにより（Ｗ．ウッド，Ｉ．Ｊ．ジシシャ
ー，Ｌ．Ａ．ラスキー及びＲ．Ｍ．ローン，ＫＲＯＣ．
ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＶＳＡ．82：1585．198
5，）溶融温度（Ｔｍ）は単にハイブリッドの長さに依
存することになる。
【０１２６】差動ハイブリッド化数回の後，ブローブ・
プール＃１はＭＨＰ−１αに対する最大にきびしい条件
下でハイブリッド化する104 以外の18個の組替え細胞ク
ローンを発生した。プレートは全て精製され，ＤＮＡが
各々から準備された。組替え細胞クローン52が最大ｃＤ
ＮＡ Ｅｃｏ−ＲＩインサートの約750 ｂｐのものを含
み，別の特性に対して選択された。部分的に重なるクロ
ーン32の相互の５’シーケンスの262 ｂｐと同様ｃＤＮ
Ａクローン52の完全なヌクレオチド・シーケンスが決定
され，図１０に示す。後でのクローニングにて分離され
た後者のクローンはクローン52より小さいＥｃｏ ＲＩ
インサートを有したが，大きい５’ｅｎｄ部分，従って
小さいポリ（Ａ）テールを有してした。763 ｂｐのＭＩ
Ｐ−１αヌクレオチド・シーケンスはヌクレオチド２か
ら始まる単一オープン・リーデイング・フレームも予測
している。位置１から始まる飽和蛋白質シーケンスは長
さが69のアミノ酸であり，精製されたＭＨＰ−１蛋白質
のＮＨ２ターミナル分析により定められる『主要』シー
ケンスを含む（Ｓ．Ｄ．ウオルプ，Ｇ．デビッテルス，
Ｂ．シェリー，ＢボイトラーβＤ．Ｇ．ヘッセ，Ｈ．
Ｔ．ヌエン，Ｌ．Ｌ．モルダワー，Ｃ．Ｆ．ナサーン，
Ｓ．Ｆ．ローレイ及びＡ．セラミ，Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥ
Ｄ．167 :570 （1987））
【０１２７】シーケンス内に存在する第１メチオニンが
位置23に見出される。これは以下の観察に基ずいたＭＩ
Ｐ−１αに対する開始メチオニンに要求される。推定さ
れるプレシーケンス（−23ないし−１）の構造上と分析
は，典型的な信号シーケンス（即ち，α−ヘリックス及
び疎水性コア）の特性を有している。（Ｄ．パールマン
及びＨ．Ｏ．ハルボルソン，Ｊ．ＮＯＬＥ．ＢＩＯＬ，
167:391 （1983））予測される開始ＡＳＧは相対的位置
−３にプリンを有し，このプリンは変換限界効率上に固
有の効果を有するよう示してある。（Ｍ．コザスク，Ｃ
ＥＬＬ．44：283 （1986）更に，699 ベルテブレートｍ
ＲＮＡの変換開始箇所の周わりのＡ，Ｃ，ＴＧの調査
で，97％が位置−３においてプリンも有し，61％がその
位置でＡを有していた（Ｍ．コザック，ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ，15：8125（1987））
【０１２８】ｃＤＮＡクローンから欠ける５’シーケン
スの量を決定するため１次延長分析も行われた。ラベル
付けされたオリゴノヌクレオチド・プライマー（図１
６）がＬＰＳ刺激されたＲＡＷ264.7 ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａにハイブリッド化され，逆のトランスクリターゼで長
くされた。ハイブリッド化後，98±２のヌクレオチドの
延長プライマーが得られた（データ図示せず）。25のヌ
クレオチドのプライマー長さとシーケンス５’を差し引
いた後，本出願人が以前決定した（61のヌクレオチド）
もので，公知のシーケンスは完全長さのｃＤＮＡに満た
ない10−14ヌクレオチドであると結論付けることが出来
る。イン・フレームＡＵＧがこのクローン処理された領
域内に存在することは可能であるが，346 のシーケンス
・ベルテブレートｍＲＮＡの14のみが長さ19ヌクレオチ
ド以下の５’ノンコーディング・シーケンスを有するこ
とは相当あり得ないように思われる。（Ｍ．コザック，
ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ15：7125（1987，
従って，５’未変換シーケンスは今日迄シーケンス処理
されたベルテブレート５’の大部分と10−100 ヌクレオ
チド長さ内にある約82のヌクレオチドであると予測出来
る。
【０１２９】提案されたプレＭＩＰ−１αは92アミノ酸
ある。Ｎ−リンクされたグリコシーレーションに対する
Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ，Ｔｈｒ箇所は分子内にない。７個
のシステイン，ブレシーケンス内に４個の又飽和シーケ
ンス内に４個ある。プレＭＩＰ−１αのコドン使用は他
の66のシーケンス飽和マウス細胞に対し決定されたもの
と同じである。最初，ペプチドはｄ−ファスト−Ｐ・プ
ログラム・均質サーチによりその時点に定められた蛋白
質に重要なシーケンスを有していなかった。同様にＤＮ
Ａシーケンスは負の結果と細胞バンクのシーケンスが比
較された。
【０１３０】３’の非変換領域にはｂｐ711 ないし716
において単一と一致したポリアデニリレーション箇所が
ある。公知のサイトカイン一致３’非変換シーケンスに
は１つのミスマッチがある４個のシーケンスもある。
又，３’一非変換一致サイトカイン・シーケンス（ＴＡ
ＴＴ）ｎが存在している。ｎ＝２で１つのミスマッチが
許される場合これらのシーケンスの４つのシーケンスが
見出された。カブト等により定められたシーケンスとリ
ーブス等により定められたシーケンスの間にこれら３つ
にオーバーラップがある。
【０１３１】ＭＩＰ−１は誘引可能な蛋白質であるの
で，ＲＡＷ264.7 細胞ＤＮＡ内の北ブロット・ハイブリ
ッド化によりマウスＭＩＰ−１αの表現を研究された。
図１１に示される如く，ＬＰＳ誘引細胞からの総ＭＮＡ
は800 ｂｐの予測サイズで正のハイブリッド化バンドを
呈し，一方，非誘引細胞からの総ＲＮＡはその箇所また
は他の箇所にて正の信号の極めて小さい値を示した。こ
れら同じ細胞（図１２）内の菌体内銅素によるマウスＭ
ＩＰ−１αｍＲＮＡの誘引の時間研究において，マウス
ＭＩＰ−１αはＬＰＳ刺激と８−16時間の，ＬＰＳ刺激
後のピークで検出された。この時間経過はその個々プラ
スミヌドプローブが同じブロッドにハイブリッド化され
た際ＯＮＦ−α／悪液質性またはＩＬ−１α ｍＲＮＡ
が表われるもとと異なっている。
【０１３２】フトゲンに応答してヒトトンシラー・リン
ポサイトにより発生されるｍＲＮＡが報告された。デイ
ホフ蛋白質データ・ベースまたはジェネバンク遺伝子シ
ーケンス・データ・べースにはシーケンスはリストされ
ていないが，その蛋白質とマウスＭＩＰ−１αの間には
75.3％のアミノ酸シーケンスがある。これらの蛋白質の
関係は知られていない。
【０１３３】Ｎターミナル・シーケンス分析でＭＩＰ−
１（ここではＭＩＰ−１βと称する）の高分子量要素の
結果を図１４Ｂに示す。元の一致Ｎ−ターミナル・アミ
ノ酸シーケンス内の位置３及び７に観察される『マイナ
ー』残留物はＭＨＰ−１βとＭＩＰ−１αの間のアミノ
酸シーケンス差に対応している。第14Ｃ図において，元
のＮ−ターミナル・アミノ酸一致シーケンスを比較のた
め与えてある。
【０１３４】ＭＩＰ−１βに対するコーディング・シー
ケンスを含むｃＤＮＡクローンが分離され特性化され
た。これを達成するためｃＤＮＡライブラリーでＬＰＳ
刺激されたＲＡＷ264.7 細胞のものが準備された。ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーン処理するため使用される
オリゴノヌクレオチド・プローブ・プールがを図１４Ｂ
にアンダーラインされたシーケンスに対し発生された。
これら７個のＭＩＰ−１βアミノ酸の３個はＭＩＰ−１
αの対応するシーケンスは異なっている。ライブラリー
をスクリーニング処理するため利用されるプローブ・プ
ールは であった。第３位置選択（＊）はクローン処理されたマ
ウス細胞に対し報告されたコドン使用を基にされた。
【０１３５】ラベル付けされたブローブ・プールを利用
するコードン使用に基づき，ライブラリーは中程度のス
トリッジエンシーの条件下でスクリーン処理された。２
つの独立したクローンがスクリーン処理された４×105
組替え細胞プレート外で分離された。分離されたクロー
ンのＤＮＡシーケンシング時に，Ｓｅｒ５コドンの第３
位置に対するＣの選択は正確にＴであり，かくして実際
のＭＩＰ−１βシーケンスにプローブ・プール・シーケ
ンスのいずれかを完全に一致させることにならない。従
って，ライブラリー内のＭＩＰ−１βシーケンス表示は
前掲のプローブ・プールによりハイブリッド化を基に予
測される。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの比較可能領
域に固有のユニークなオリゴノヌクレオチド・プローブ
の後続のスクリーニング処理はＭＩＰ−１αシーケンス
より５倍以下に余剰になっていることを示す。
【０１３６】プレート精製化に続き，２個の正の組替え
細胞からのインサートＤＮＡ（＝700 ｂｐ）がＭＩＰ−
１α ｃＤＮＡプローブに対しクロス・ハイブリッド化
して示された。インサートｃＤＮＡは各組替細胞数から
分離され，完全なヌクレオチドシーケンスが決定された
ｍ13内にクローン化された。２個のヌクレオチド・シー
ケンスは５’非変換シーケンスの長さのみが異なってい
る。長いヌクレオチド・シーケンスを図１５に示す。
【０１３７】ＭＩＰ−１αは650 ベース対である。（こ
れはプライマー延長により分析は完全なｃＤＮＡシーケ
ンスより短い11−12ヌクレオチド程度である。）ＭＩＰ
−１βのヌクレオチド・シーケンスはイン・フレーム停
止コードン後にシーケンス（ヌクレオチド＋62ないし＋
64）の５’端部に遭遇する第１ＴＡＧコードンから始ま
る単１オーブンリーディングを含む。このコードンによ
り指定されたメチオニンはαヘユックスと中央に位置付
けられた疎水性領域を含む特性を備えた単一シーケンス
（残留−23及び−１）を定める。このＡＴＧコードンを
包囲するシーケンスは高いオイカリオトの多数のｍＲＮ
Ａで共有される一致シーケンスに合致する。
【０１３８】ＴＧＡターミネーション・トリペットは開
始コードンの下流側の91のコードンに位置付けてある。
ＭＩＰ−１βの３’非変換領域は315 ヌクレオチドで構
成され，多くのエイカリオチックｍＲＮＡ内のポリアデ
ニレーションの箇所に先行するネキサヌクレオチドＡＡ
ＴＡＡＡ（ヌクレオチド＋283 ないし＋288 ）を含む。
【０１３９】多くの刺激性蛋白質の特性である公知の非
変換サイトカイン３’一致シーケンス（ＴＴＡＴＴＴＡ
Ｔ）と正確に一致するヌクレオチド＋174 〜＋181 に単
一シーケンスが存在する。その他，この一致シーケンス
（ヌクレオチド＋165 ないし＋175 及びヌクレオチド＋
185 ないし＋192 ）に対し単一の不一致を有する２個の
付加的なシーケンスがある。
【０１４０】位置１から始まる元の蛋白質シーケンスは
長さが69のアミノ酸である。ｃＤＮＡクローンから決定
された飽和蛋白質の分子量はＳＤＳ−ＤＡＧＥ予測され
る分子量と一致する7832ダルトンである。クローン処理
されたＤＮＡから予測されるアミノ酸シーケンスは精製
された元のＭＩＰ−１βのＮ−ターミナル・アミノ酸シ
ーケンシングから得られる最初の13アミノ酸と一致す
る。
【０１４１】ＨＩＰ−１βはアミノ酸53ないし55（Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）における飽和蛋白質に存在する単
一のＮリンクされたグリコシレーション箇所を備えてい
る。元のＭＩＰ−１が実際にこの位置においてグリコシ
レート化されるか否か決定されていないが，Ｎリンクさ
れたグリコシレーションに対する一致Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅ
ｒ，Ｔｈｒ信号内の位置Ｘにおけるブロリンが結果的に
その箇所で与えられまたはグリコシレーションされな
い。
【０１４２】２個の蛋白質の予測される極性プロフィー
ルを予測しているＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βに対す
る水留プロットを図１６に示す。ＭＨＰ−１α及びＭＩ
Ｐ−１β内の局部的極性が驚くべきことに類似している
ことが図１６から明らかである。
【０１４３】ハウスＨＩＰ−１β ｃＤＮＡの全体的ヌ
クレオチド・シーケンスがＭＩＰ−１α ｃＤＮＡシー
ケンスと同様，ジエネ・バンク・ヌクレオチド・データ
・ベース内のシーケンス（ローデント，プライメート，
他の哺乳動物，及び他のベルテブレート・ライブラリ
ー）と比較された。ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−１α ｃ
ＤＮＡは56.7％で同一である。ジエネバンクで見出され
た唯一の重要な均質はそのｍＲＮＡがだ液プロモーター
ＰＭＡまたはカイトヘマグルチンで刺激されたことを基
にＴ細胞リンポサイトｃＤＮＡライブラリーから分離さ
れたヒトＬＤ78ｃＤＮＡであった。マウスＭＩＰ−１β
はヒトＬＤ78ｃＤＮＡに重なる592 ヌクレオチド内で6
7.1％の一致を示し，マウスＭＩＰ−１αは更に高い均
質を示し，746 で６ヌクレオチドのオーバーラップが示
された。
【０１４４】予測されたＭＩＰ−１βのアミノ酸シーケ
ンスがｐ−ファスト−Ｄコンピューター一致アルゴリズ
ムを使ってデイホフ・データーベース内のシーケンスに
対する一致性が試験され，驚くべき高い均質性が見出さ
れた。然し乍ら，ＰＤＧＦ，ＩＬ−１または二重ストラ
ンドＲＮＡで誘引出来るマウス・サイトカイン（ＪＥ）
に対するマウスＭＩＰ−１β，マウスＭＩＰ−１α，ヒ
トＬＤ78の予測される蛋白質シーケンスとマウスＴ細胞
励起蛋白質）ＴＣＡ３）との比較はこれらの蛋白質が著
しく均質であることを示している。ＭＩＰ−１βの減少
されたアミノ酸シーケンスはＭＩＰ−１αに対し59.8
％，ＬＤ78，ＪＥ，ＴＣＡ３に対し各々予測されるアミ
ノ酸シーケンスに58.7％，38.9％及び31.9％の一致が見
られる。これら全てのシーケンスに共通するのは飽和ペ
プチド・シーケンスの各シーケンスにおける４個の保存
された遺伝子の存在である。おもしろいことに，マウス
ＭＨＰ−αの予測されたアミノ酸シーケンスはマウスＭ
ＨＰ−１β（59.8％一致）の予測アミノ酸シーケンスに
対する場合よりヒトＬＤ78（75.4％の一致）のものより
一層均質である。従って，これらの蛋白質は炎症性及び
／または刺激反応に含まれるペプチドのグループを定め
るシーケンス上の同一性を共用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図面代用写真はＲＡＷ264.7 細胞の表面浮遊物
から炎症性サイトカインの準備，回収を行うグラフと電
気泳動ゲルのオシロ波形を組合せて表わす。ＲＡＷ264.
7 からの濃縮，ろ過された表面浮遊物の分別モノＱで行
われた。表面浮遊物．神経細胞物質，２リットルが20倍
に濃縮され，20ｍＭトリＨＣ１，ｐＨ8.0 の６リットル
に対してろ過された。濃縮された表面面浮遊物がモノＱ
に適用され同じバツファー内で０ないし１ＭのＮａＣ１
の直線勾配で洗別された。ＭＩＰ−１（＊）は大略0.37
ＭＮａＣ１にて悪液質派性／ＴＮＦ（＊＊）の僅かに前
に洗別された。インサートは示された部分からの50μ１
が適用された10−15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】図面代用写真は本発明の炎症性サイトカインの
別のゲル分離と精製をグラフと電気泳動ゲルのオシロ波
形を組合せて示す。モノＱからの部分をピークＭＩＰ−
１が 200μ１に濃縮され100 ｍＭ酢酸アンモニアでスー
パーローズ12カラム均衡に適用された。ＭＩＰ−１
（＊）はボイド容積内で溶離され，悪液性／ＴＮＦ（＊
＊）から充分に分離された。インサートは示された部分
からの50μ１割り切れる値が適用された10−18％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥを示す。ダッガーはマーカーとして使用され
た精製ＭＩＰ−１を示す。
【図３】本発明の炎症性サイトカインの最初の31個の位
置の一致した部分アミノ酸シーケンスを表わす。カッコ
内の残基は『マイナー』残基が材料の異なるバッチで異
なるシーケンスにて再生可能的に得られた位置を示す。
【図４】図面代用写真は本発明の炎症性サイトカインを
ヘパリンに結合し溶離するグラフと電気泳動ゲルのオシ
ロ波形を組合せて示す。12倍に濃縮しろ過したＬＰＳ刺
激したＲＡＷ264.7 表面浮遊物の２ｍｌをヘパリンセフ
アローズ・カラムに適用し，0.02Ｍ ノリＨＣｌバツフ
ァー，ｐＨ7.8 内で０たいし２Ｍ ＮａＣｌの直線勾配
にて溶離した。２つの主要ピークが観察された。ＭＩＰ
−１（＊）は0.6−0.75Ｍ ＮａＣｌに対応する第２ピ
ークにて溶離した。インサートは示された部分からの50
μ１割切れる値が適用された10−18％アクリルアミド階
調度ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図５】Ａ乃至Ｄの図面代用写真は制御体と悪液質性／
ＳＮＦの対比投与と共に本発明の炎症サイトカインの皮
下投与に続き４時間固定したＣ３Ｈ／ＨｅＪフートパッ
ドの生物の形態を示す。組織がバツファー処理されたホ
ルマリン内に固定され，ヘマトキシリン・イオージョン
で汚染された。倍率は400 倍である。写真Ａ−通常のヒ
ストロジーを表わすシャム投与写真Ｂ−100 ｎｇ ＭＩ
Ｐ−１：好中球及びハスト細胞の中程度の浸潤 写真Ｃ
−100 ｎｇ悪液質性／ＴＮＦ：好中球の中程度の浸潤
写真Ｄ−10-10 モルｆＭＬＰ：ヌオーカル・ネクロシス
による過剰浸潤
【図６】本発明の炎症性サイトカインによる好中球機能
亢進の誘引に対する試験結果をグラフ的に表わす。デー
タは５回の実験の制御移動応答の平均％を表わす。値は
ゲイの基本塩分溶液の負の制御（０％）及び10-8Ｍ ｆ
ＭＬＰ正の制御（100 ％）に対する好中球移動の％増加
として表わしてある。＊＝％の機能亢進応答対ＧＢＳＳ
単独での著しい増加を示すＭＩＰ−１の濃度（ＡＮＯＶ
Ａによるｐ＜0.01）
【図７】ヒトの好中球（ＰＭＮ’Ｓ）によるＨ２Ｏ２解
放を刺激するため炎症性サイトカインの能力に対する試
験結果をグラフ的に示す。抗毒素被覆マキクロ・テスト
板容器内で培養したヒトＰＭＮ’Ｓが時間０においてＰ
ＭＡ（100 ｎｇ／ｍｌ）（●），組替え悪液質性／ＴＮ
Ｆ（10ｍｇ／ｍｌ）（△），ＭＩＰ−１（1000ｎｇ／ｍ
ｌ）（○）またはバツファー単独（制御）の等容積
（▲）で処理した。Ｈ ２Ｊ２リリースは次の4.5 時間
（悪液質性／ＴＮＦに対し２時間）にわたり監視され
た。値は４回の同様の実験の１つにおける３倍に対し平
均値±ＳＥＭである。
【図８】Ａはネズミの細胞から最初に回収したＭＩＰ−
１αのｃＤＮＡで表わした飽和アミノ酸シーケンスを表
わす。Ｂはネズミの細胞から最初に回収したＭＩＰ−１
βのｃＤＮＡで表わした飽和アミノ酸シーケンスを表わ
す。
【図９】ＭＩＰ−１αのｃＤＮＡクローニングで示され
る512 倍の衰退プローブ・プールを示す。ベース下側の
アスタリスクは２個のプローブ・プールの間の一定のベ
ース変化を示す。
【図１０】ＭＩＰ−１αに対するｃＤＮＡクローンの完
全な好中球シーケンスを表わす。アンダーラインが付け
られたシーケンスは主たる延長実験で使用された多形核
の補合シーケンスを示す。プリカーソル・ペプチドの予
測された並進分子量は10,346である。位置１から始まる
飽和ペプチド・シーケンスは長さが69のアミノ酸であり
憂測分子量は7889である。
【図１１】図面代用写真はＲＡＷ264.7 細胞からの合計
ＲＮＡの北側のシミである変換されたネズミの大食細胞
ラインのＸ線写真である。この細胞は２μｇ／ｍｌで抗
毒素の無い媒体内で６時間にわたりＬＰＳにて刺激され
た。制御細胞はＬＰＳの添加されない抗毒素の無い媒体
として６時間与えられた。各レーン内にロードされたＲ
ＮＡの合計量を図面に示す。
【図１２】図面代用写真はＬＰＳによるＲＡＷ264.7 ｍ
ＲＮＡ誘引のＸ線写真で時間経過研究を表わす。時間経
過は時間数で測定してある。３個のプローブは全てα−
〔32ｐ〕ｄＣＴＰでラベル付けされたプラスミッドｃＤ
ＮＡクローンであった。
【図１３】ＳＤＳ−ヒドロキシルアパタイト・クロマト
グラフィーによるＭＩＰ−１の成分ペプチドへの分解を
グラフ的に示す。ＭＩＰ−１（500 μｇ）が前述と如く
ＳＤＳ−ヒドロキシルアパタイトに適用され分割され
た。0.5 ｍｌの部分が集められ，ＳＤＳ−ＫＡＧＥで分
析されブラケットで示される如くプールされた。（１＝
ＭＩＰ−１α；２＝ＭＩＰ−１β）
【図１４】Ｎ−ターミナル・アミノ酸シーケンスを示す
る（Ａ（精製ＭＩＰ−１αのＮ−ターミナル・アミノ酸
シーケンス；（Ｂ）精製ＭＩＰ−１βのＮ−ターミナル
・アミノ酸シーケンス，アンダーラインした残基（２−
β）は多形核プローブ・プールを作る目的に使用され
た。（Ｃ）精製された元のＭＩＰ−１に対し報告された
元のＮ−ターミナル・アミノ酸一致シーケンス。マイナ
ー残基に対応するアミノ酸残基がカッコ内に示してあ
る。
【図１５】ＭＩＰ−１βに対するｃＤＮＡクローンの完
全なニュークレオタイド・シーケンスを示す。予測され
た変換分子量は10,169ダルトンである。位置１から始ま
る飽和蛋白質シーケンスは長さが69のアミノ酸であり，
7832ダルトンの予測分子量を有している。
【図１６】ホッブとウッドの計算式を適合させることに
より計算されたＭＩＰ−１α（−−−）及びＭＨＰ−１
β（−−−）の長さに沿った概算されている局部的水治
療をグラフ的に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ ＺＮＡ Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ステファン ディ． ウルプ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10044, ニューヨーク エイピーティ． 436, メイン ストリート 625

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 炎症性サイトカインを含む生長媒体内に
    受容体を有する試験細胞のコロニーを培養し，試験用薬
    品を加え，しかる後試験細胞の前記コロニー上の前記受
    容体による前記薬品の反応を測定することから成る哺乳
    動物体内の細胞に対する炎症性サイトカインの前記受容
    体と反応出来る炎症性サイトカインの発生及び／または
    活性を刺激する薬品の能力を試験する方法であって，前
    記炎症性サイトカインが，ヘパリンと結合出来，皮下投
    与時に多形核細胞浸潤を特徴とする局部的ふくらみを誘
    引出来、且つ試験管内に多形核細胞機能亢進を誘引出来
    る一方同化酵素リポプロテイン・リパーゼの活性の抑
    止，悪液質性／ＴＮＦ反応細胞の細胞毒素性の発生，菌
    体内酵素抵抗Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ胸線細胞の芽胞生殖の刺激
    または一次チオグリコール酸塩投与マウス大食細胞によ
    る悪液質性／ＴＮＦの発生誘引能力を欠くことが出来る
    ようにした方法。
  2. 【請求項２】 前記炎症性サイトカインが生理学的条件
    下において陰イオン性であり，高塩分濃度においてヘパ
    リンと結合し，低塩分バツファー内で約106 ダルトン以
    上の高分子量の塊を形成する傾向がある請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 前記炎症性サイトカインが兎内に発熱を
    誘引出来且つ試験管内のヒトの好中球内に過酸化物生成
    または呼吸突発を誘引出来る請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記炎症性サイトカインが侵入刺激剤を
    伴なう如き刺激材料で培養出来る動物の細胞から得られ
    る請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 炎症性サイトカインがクロナール復成に
    より発生される細胞から得られる請求項１記載の方法。
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