ES2280764T3 - Procedimiento de purificacion de interleucina-4 y sus muteinas. - Google Patents
Procedimiento de purificacion de interleucina-4 y sus muteinas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2280764T3 ES2280764T3 ES03738109T ES03738109T ES2280764T3 ES 2280764 T3 ES2280764 T3 ES 2280764T3 ES 03738109 T ES03738109 T ES 03738109T ES 03738109 T ES03738109 T ES 03738109T ES 2280764 T3 ES2280764 T3 ES 2280764T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- buffer
- interleukin
- inclusion bodies
- acid
- refolding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/5406—IL-4
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un procedimiento para preparación de interleucina-4 o muteínas de interleucina-4 por expresión recombinante que comprende (a) expresión en cuerpos de inclusión, (b) fragmentación de las células y separación los cuerpos de inclusión, (c) lavado de los cuerpos de inclusión así obtenidos, (d) solubilización de los cuerpos de inclusión por desnaturalización, (e) renaturalización del producto de expresión y (f) purificación del producto de expresión caracterizado porque los cuerpos de inclusión se lavan (c) con un tampón que contiene un detergente que solubiliza eficazmente lípidos unidos a la superficie del cuerpo de inclusión o los lípidos contenidos en fragmentos de pared celular y la renaturalización (e) se realiza en presencia de chaperonas artificiales.
Description
Procedimiento de purificación de
interleucina-4 y sus muteínas.
La presente invención se refiere generalmente a
un procedimiento para purificar interleucina-4 o
variantes relacionadas de un medio de cultivo de Escherichia
coli, en el que la interleucina-4 y sus
derivados se expresan como agregados de proteínas insolubles,
denominados cuerpos de inclusión.
La interleucina humana-4
(hIL-4) es un polipéptido de 15.000 dalton con un pI
básico de 10,5 aproximadamente y la IL-4 murina
(mIL-4) es un polipéptido de 13.600 dalton con un pI
neutro de 6,5. La interleucina-4 pertenece a una
familia de citocinas que incluyen y coordinan la proliferación, la
maduración, la supervivencia y la diferenciación de células
linfoides y mieloides (Callard R, Gearing A (1994): The cytokine
facts book. Academic Press, London, San Diego). Se han descrito
antagonistas completos, agonistas parciales y selectivos de
hIL-4 y mIL-4 por Sebald y
Grunewald y col. (Sebald W (1998): patente de Estados Unidos
5.723.118 (WO-93/10.235). Fecha de patente 3 de
marzo de 1998; Grunewald SM, Kunzmann S, Schnarr B, Ezernieks J,
Sebald W, Duschl A (1997): The Journal of Biological Chemistry
272(3):1480-1483; Shanafelt A y col. (1997):
patente de EE.UU. WO-97/47.744. Fecha de patente 14
de junio de 1996). Recientemente se han descrito muteínas de
IL-4 humana que conducen a rendimientos de
plegamiento mejorados (Domingues H, Peters J, Schneider KH, Apeler
H, Sebald W, Oschkinat H, Serrano L (2000): J. Biotechnol.
84:217-230).
El ADNc de hIL-4 se ha expresado
en E. coli como cuerpos de inclusión insolubles (Kastelein
RA, van Kimmenade A (1987): solicitud de patente europea
EP-0.301.835/A1, fecha de patente 29 de julio de
1987; van Kimmenade A, Bond MW, Schumacher JH, Laquoi C, Kastelein
RA (1988) Eur. J. Biochem. 173:109-114; Jayaram B,
Bevos R, Guisez Y, Fiers W (1989) Gene 79:345-354);
Batchikova NV y col. (1992) Bioorganitscheskaya Chimiya
18:660-670. Se ha demostrado que la
IL-4 humana recombinante que posee un alto nivel de
actividad biológica puede aislarse a partir de esta fuente. Sin
embargo, las tasas de expresión, los rendimientos globales de
purificación y los rendimientos de replegamiento no son suficientes
para uso comercial de estos sistemas.
El uso clínico de la IL-4 humana
activa o variantes relacionadas requiere un material de alta pureza
que no esté contaminado por constituyentes celulares o
contaminantes del sistema de expresión respectivo. En consecuencia,
existe una necesidad para purificación de IL-4
activa o muteínas relacionadas a partir de sistemas de expresión de
E. coli (Apeler H, Wehlmann H (1999) Plasmids, their
construction y their use in the manufacture of
Interleukin-4 and Interleukin-4
muteins. Solicitud de patente europea EP 00100229.6. Fecha de
patente 7 de enero de 1999) con altos rendimientos y alta
pureza.
La producción de grandes cantidades de
polipéptidos biológicamente activos con origen humano mediante
técnicas de ADN recombinante se ha convertido en el procedimiento
de elección, ya que las proteínas heterólogas pueden expresarse en
cantidades suficientes en bacterias recombinantes y otras células
huésped.
Esta invención se refiere a purificación de
cuerpos de inclusión insolubles que contienen altas cantidades de
IL-4 o sus variantes y purificación adicional de la
molécula solubilizada en un polipéptido de alta pureza,
biológicamente activo y correctamente plegado.
Las sustancias biofarmacéuticas de ingeniería
genética se purifican normalmente a partir de sobrenadante de
cultivo sin células que contiene una variedad de contaminantes de
células huésped como, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas de
células huésped, endotoxinas, lípidos, polisacáridos, etc. Existe
una necesidad en la técnica de un procedimiento eficaz para
purificar selectivamente interleucina-4 o sus
muteínas a partir de otras moléculas, en particular de las que
están muy estrechamente relacionadas y son difíciles de separar
como isoformas de disulfuro, derivados que contienen
desapareamientos de aminoácidos, formas oxidadas y moléculas
formiladas.
La purificación de
interleucina-4 a partir de células de E. coli
que expresan la proteína objeto en una forma insoluble agregada,
denominada "cuerpos de inclusión", fue descrita primero por
Kastelein y van Kimmenade (Kastelein RA, van Kimmenade A (1987):
solicitud de patente europea EP-0.301.835/A1, fecha
de patente 29 de julio de 1987). Se fragmentaron por sonicación las
células obtenidas de fermentación de densidad celular baja y,
después de centrifugado, se disolvió el sedimento remanente en HCl
de guanidinio 5 M que contenía glutationa oxidada y reducida. Se
obtuvo el replegamiento mediante dilución 10 veces hasta una
concentración final de proteínas de 250 mg/l. A continuación se
eliminó el precipitado formado por centrifugado y se dializó de
nuevo el sobrenadante frente a solución salina de tampón de
fosfato. De nuevo fue necesaria centrifugado para eliminar el nuevo
precipitado. A continuación, se usó ultrafiltración para concentrar
la proteína a 8 g/l, formando así de nuevo precipitados.
Finalmente, se cromatografió la interleucina-4
replegada y concentrada sólo en una resina de exclusión de tamaño.
En el citado artículo se han descrito también ensayos para
determinación de la actividad biológica de la interleucina
humana-4. Claramente, el replegamiento y las etapas
subsiguientes adolecen de una intensa precipitación y las etapas de
cromatografía implicadas pueden no separar isoformas estrechamente
relacionadas. Por otra parte, la interleucina-4
purificada se contaminó por especies oxidadas y otros productos
relacionados. Van Kimmenade y col. no dieron cifras en lo que
respecta al contenido de endotoxinas y proteínas de células huésped
del producto final. Sin embargo, es de común conocimiento que la
ultrafiltración y la filtración por gel no conducen a factores de
alta depuración con respecto a los ácidos nucleicos, endotoxinas y
proteínas de células huésped. Por ello, no puede esperarse que el
producto produzca una calidad farmacéuticamente aceptable.
La IL-4 murina se ha aislado a
partir de Escherichia coli a partir de cuerpos de inclusión
por Levine y col. (Levine AD, Rangwala SH, Horn NA, Peel MA,
Matthews BK, Leimgruber RM, Manning LA, Bishop BF, Olins PO (1995):
J. Biol. Chem. 270(13):7445-7452). El
procedimiento implica una etapa de replegamiento y dos etapas
posteriores cromatográficas (intercambio catiónico, filtración por
gel). Sin embargo, la IL-4 murina, contenida en una
extensión N-terminal así como diferentes isoformas.
La eliminación de impurezas de células huésped como endotoxinas o
ácidos nucleicos no fue descrita por Levine y col. Por ello, el
procedimiento no es capaz de diferenciar suficientemente entre
estos contaminantes y no es aplicable a la purificación de
IL-4 humana de calidad farmacéutica o sus muteínas
de cuerpos de inclusión de E. coli.
En consecuencia, un objetivo de esta invención
es proporcionar un procedimiento mejorado para aislamiento de una
interleucina-4 o sus muteínas, replegamiento
eficiente de interleucina-4 o sus muteínas para
formar puentes de disulfuro y separación de
interleucina-4 de sus isoformas, derivados y
contaminantes de células huésped estrechamente relacionados por
medio de cromatografía y filtración.
Otro objeto es proporcionar un procedimiento
para purificar interleucina-4 que tiene como
resultado una mejora considerable en su homogeneidad.
La invención proporciona un procedimiento para
la preparación de interleucina-4 o muteínas de
interleucina-4 por expresión recombinante que
comprende (a) expresión en cuerpos de inclusión, (b) fragmentación
de las células y separación de los cuerpos de inclusión, (c) lavado
de los cuerpos de inclusión así obtenidos, (d) solubilización de
los cuerpos de inclusión por desnaturalización (e) renaturalización
del producto de expresión y (f) purificación del producto de
expresión caracterizado porque los cuerpos de inclusión se lavan (c)
con un tampón que contiene un detergente que solubiliza eficazmente
los lípidos ligados a la superficie del cuerpo de inclusión o los
lípidos contenidos en fragmentos de paredes celulares y la
renaturalización (e) se realiza en presencia de chaperonas
artificiales.
La recuperación de proteína es generalmente de
más del 90%.
El aislamiento de interleucina-4
recombinante implica la separación de la proteína de una diversidad
de diferentes contaminantes de células huésped. Cada etapa del
procedimiento implica tampones especiales que permiten que tenga
lugar una separación suficiente. La presencia de varias variantes de
interleucina-4, que normalmente se copurifican
usando medios cromatográficos convencionales, necesita etapas y
condiciones de cromatografía final especiales. Estas especies
consisten principalmente en confórmeros de disulfuro de
interleucina-4 o sus muteínas, variantes de
sulfóxido de metionina, variantes con residuos de
formal-metionina parcialmente recortadas en el
término N, variantes con aminoácidos mal incorporados y todas las
clases de permutaciones de estas variaciones que sean posibles.
En la presente invención, se identifican
condiciones para separar favorablemente
interleucina-4 o sus muteínas de estas y otras
variantes relacionadas estrechamente relacionadas. Usando este
procedimiento, pueden aislarse interleucina-4
recombinante y sus muteínas en alta pureza y rendimientos
comercialmente atractivos.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"IL-4" se refiere a
interleucina-4 de cualquier especie, incluyendo
bovina, ovina, porcina, equina, avícola, de ratón, rata y
preferentemente humana, en secuencia nativa o en forma de variante,
y de cualquier fuente, ya sea natural, sintética o producida por
recombinación. Preferentemente, la IL-4 se produce
por medios recombinantes. En un procedimiento preferido, la
IL-4 se clona y su ADN se expresa, por ejemplo,
mediante el procedimiento descrito en Apeler y Wehlmann, 1999
(Apeler H, Wehlmann H (1999) Plasmids, their construction and their
use in the manufacture of Interleukin-4 and
Interleukin-4 muteins. Solicitud de patente europea
EP 00.100.129.6. Fecha de patente 7 de enero de 1999.
Las variantes de IL-preferidas
son las descritas en la patente de EE.UU. 5.723.118
(WO-93/10.235) publicada el 13 de marzo de
1998.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste los
cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados
ácido-base. El tampón para el aspecto de
replegamiento de esta invención tiene un intervalo de pH de
aproximadamente 6 a 9, preferentemente de 6,5 a 8. Los ejemplos de
tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo son
citrato-NaOH, tampones GOOD como
TRIS-HCl o trietanolamina-HCl, y,
preferentemente, tampones de fosfatos.
El tampón para el aspecto de cromatografía de
hidroxiapatito cerámico de esta invención tiene un intervalo de pH
de 5 a 9 aproximadamente, preferentemente de 6 a 8. Los ejemplos de
tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo son
preferentemente tampones de fosfatos. Si la elución no se realiza
mediante un aumento lineal de concentración de fosfato, se añade
una sal, preferentemente NaCl o KCl, al tampón en una concentración
comprendida entre 5 mM y el límite de solubilidad de la sal.
El tampón para el aspecto de cromatografía de
afinidad a quelatos metálicos de esta invención tiene un intervalo
de pH de 6 a 9, preferentemente de 7 a 8. Los ejemplos de tampones
que controlarán el pH dentro de este intervalo son fosfato y otros
componentes no quelantes (denominados tampones no GOOD como, por
ejemplo, glicina-NaOH,
N-etilmorfolino-HCl o
2-amino-2-metil-1,3-propanodiol-HCl.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"reactivos modificadores" se refiere a un reactivo de
apareamiento iónico usado para cromatografía de fase inversa como,
por ejemplo, ácido trifluoroacético, sales de amonio, sales de
fosfato, ácido acético y NaCl.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
la frase "sal de fosfato" se refiere a una sal que tiene un
catión, preferentemente de elementos metálicos alcalinotérreos o
alcalinos o un catión amonio, y que tiene un anión fosfato. Los
ejemplos de dichas sales incluyen fosfato de sodio, fosfato de
calcio, fosfato de amonio, fosfato de magnesio y fosfato de
potasio. Las sales más preferidas en la presente memoria descriptiva
son fosfato de sodio y de potasio.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
"alcoholes" y "disolventes alcohólicos" se entienden en el
sentido de la terminología usada comúnmente para alcohol,
preferentemente alcoholes con de 1 a 10 átomos de carbono, más
preferentemente metanol, etanol, isopropanol, n- o
t-propanol, así como glicerol, propilenglicol,
etilenglicol, polipropilenglicol y polietilenglicol, y con la máxima
preferencia etanol o isopropanol. Dichos disolventes son
disolventes que, cuando se añaden a solución acuosa, aumentan la
hidrofobicidad de la solución reduciendo la polaridad de la
solución.
Los "disolventes apróticos polares" son
moléculas tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO), dimetilformamida
(DMF), N-metilpirrolidona (NMP), tetrahidrofurano
(THF), dioxano, acetonitrilo (ACN), etc., que pueden usarse en
lugar del o además del alcohol. El disolvente aprótico polar más
preferido en la presente memoria descriptiva es acetonitrilo.
El procedimiento en la presente memoria
descriptiva implica primero purificación de
interleucina-4 no nativa de células huésped
procariotas en un tampón de aislamiento adecuado mediante cualquier
técnica apropiada como agregados insolubles, denominados "cuerpos
de inclusión". Dichas técnicas apropiadas son, por ejemplo,
exposición de las células a un tampón de fuerza iónica adecuada
para solubilizar la mayoría de las proteínas huésped, pero en el
que la interleucina-4 agregada es sustancialmente
insoluble, y fragmentación de las células de manera que se liberen
los cuerpos de inclusión y se hagan disponibles para recuperación,
por ejemplo, mediante centrifugado o microfiltración. Esta técnica
es bien conocida, y se describe, por ejemplo, en la patente de
EE.UU. 4.511.503.
Brevemente, las células se suspenden en el
tampón (normalmente a pH de 5 a 9, preferentemente a pH de 6 a 8,
usando una fuerza iónica de aproximadamente 0,01 a 2 M,
preferentemente de 0,1 a 0,2 M). Cualquier sal adecuada, incluyendo
cloruro de sodio, es útil para mantener un valor suficiente de
fuerza iónica. Las células, mientras están suspendidas en este
tampón, se fragmentan a continuación por lisis usando técnicas
empleadas comúnmente como, por ejemplo, procedimientos mecánicos,
por ejemplo, prensa de Manton-Gaulin, prensa
francesa homogeneizador de Bran & Lübbe o microfluidizador, o
un oscilador sónico, o mediante procedimientos químicos o
enzimáticos empleando lisozima, o por cualquier combinación de estos
procedimientos.
Después de fragmentar las células, se centrifuga
normalmente la suspensión para sedimentar los cuerpos de inclusión.
En una forma de realización, esta etapa se efectúa a aproximadamente
500 a 15.000 x g, preferentemente a aproximadamente 12.000 x g, en
una centrífuga estándar durante un tiempo suficiente que depende del
volumen y el diseño de la centrífuga, habitualmente de 10 a 30
minutos aproximadamente. El sedimento resultante contiene
sustancialmente todos los cuerpos de inclusión, pero en el caso de
que la fragmentación no se completara, también se sedimentan
fragmentos de pared celular y células no fragmentadas. La
terminación de la fragmentación celular puede ensayarse mediante
resuspensión del sedimento en un pequeño volumen de tampón de
fragmentación y ensayo de esta suspensión con un microscopio de
contraste de fase, mediante difracción láser (por ejemplo,
Mastersizer 2000) o mediante determinación de la proteína soluble
total por medio de procedimientos de tinción según procedimientos
bien conocidos (por ejemplo, Bradford y col. (1976): Anal. Biochem.
72:248-254). La presencia de células fragmentadas o
células enteras o la incompletitud de la proteína soluble liberada
indica que se necesita fragmentación adicional. La suspensión se
vuelve a centrifugar y se recupera el sedimento, se vuelve a
suspender y se analiza.
El intervalo de pH de un tampón de lavado
adecuado de cuerpos de inclusión está normalmente entre pH 7 y 10,
preferentemente entre pH 8 y 9. Los ejemplos de tampones que
proporcionarán un pH dentro de este último intervalo incluyen
glicina, CAPSO (ácido
3-[ciclohexilamino]-2-hidroxi-1-propano-sulfónico),
AMP
(2-amino-2-metil-1-propanol),
CAPS (ácido
3-[ciclohexilamino]-1-propano-sulfónico),
CHES (ácido
2-(N-ciclohexilamino]-etano-sulfónico)
y TRIS-HCl (clorhidrato de
tris-[hidroximetil]aminometano). El tampón preferido en la
presente memoria descriptiva es TRIS-HCl,
preferentemente en concentraciones de 50 a 500 nM, más
preferentemente de 100 a 200 mM, a un pH de aproximadamente 7 a
10, preferentemente aproximadamente de 8 a 9. Las sustancias
adicionales incluidas en el tampón de lavado son sustancias
quelantes como, por ejemplo, iones Ca^{2+} de formación de
complejo de ácido etilendiamintetraacético (EDTA), ácido
etilenglicol-O,O'-bis-(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA), ácido nitriloacético (NTA) o ácido
trans-1,2-diaminociclohexan-N,N,N',N'-tetraacético
(CDTA) que se conoce que son lipopolisacáridos (LPS) puente en la
pared celular exterior de E. coli (Witholt y col. (1976):
Biochim. Biophys. Acta 443(3):534-544). Por
otra parte, en el tampón de lavado debe incluirse un detergente
adecuado, que solubilice eficazmente lípidos unidos a la superficie
del cuerpo de inclusión o los lípidos contenidos en fragmentos de
pared celular, como detergentes no iónicos (por ejemplo, Triton
X-100, serie Tween, dodecilmaltósido etc.),
tensioactivos iónicos (por ejemplo, SDS, CTAC, CTAB, ácido cólico y
sus derivados) o, con la máxima preferencia, detergentes de iones
bipolares (por ejemplo, serie Zwittergent, CHAPS, CHAPSO,
desoxicolato). La concentración de estos tensioactivos debe ser
suficientemente alta para garantizar la formación de micelas de
detergente y micelas de lípido-detergente y depende
de la concentración micelar crítica (CMC) del tensioactivo
respectivo. Preferentemente, la concentración del tensioactivo en el
tampón de lavado debe ser muy superior, con la máxima preferencia
dos veces superior, al valor de CMC. Con la máxima preferencia,
puede usarse Zwittergent 3-14 a concentraciones de
entre el 0,01% y el 5%, preferentemente entre el 0,1% y el 1%, para
solubilizar eficazmente lípidos asociados con cuerpos de inclusión o
fragmentos de pared celular. Adicionalmente, pueden incluirse sales
como, por ejemplo, NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4} en el tampón de
lavado para aumentar la eficacia de la eliminación de proteínas de
membrana exterior, aunque esto puede tener como resultado una
pérdida de recuperación de interleucina-4 (pérdida
del 10 al 40%) dependiendo del detergente usado. Por otra parte,
pueden incluirse mercaptanos como, por ejemplo, ditiotreitol,
mercaptoetanol o cisteína en el tampón de lavado a concentraciones
de 0,1 a 10 mM preferentemente de 0,1 a 1 mM, para reducir dichos
puentes de cistina covalentes presentes en el cuerpo de inclusión.
Los ácidos nucleicos pueden representar hasta el 0,5% del contenido
en proteínas en cuerpos de inclusión (Valax y Georgiou (1993):
Biotechnol. Prog. 9(5):539-547) y, por
tanto, pueden incluirse ARNasa o, preferentemente, ADNasa en el
tampón de lavado. Al tampón de lavado pueden añadirse también otras
sustancias caotrópicas como, por ejemplo, urea a concentraciones de
0,5 a 8 M, preferentemente de 2 a 4 M, o clorhidrato de guanidinio a
concentraciones de 0,5 a 4 M, preferentemente de 2 a 4 M.
Adicionalmente, puede ser necesaria purificación
adicional de los cuerpos de inclusión por microfiltración de flujo
cruzado para eliminar los residuos celulares con una densidad en el
intervalo de los cuerpos de inclusión, así como impurezas de
células huésped solubles como endotoxinas, ácidos nucleicos,
proteínas o contaminantes de bajo peso molecular. Para este fin,
pueden usarse membranas con límites de exclusión de 0,1 \mum a
0,65 \mum, preferentemente 0,22 y 0,45 \mum, con la máxima
preferencia 0,45 \mum. Los materiales de membrana adecuados
incluyen membranas de polisulfona y polietersulfona con o sin
modificaciones de superficie, membranas de teflón (PVDF), membranas
de nailon, membranas de PTFE y, preferentemente, membranas de
celulosa o acetato de celulosa y sus derivados. Los dispositivos
adecuados incluyen sistemas de fibra hueca con fibras rectas o
arrolladas, unidades de filtración de membrana dinámica, en las que
una membrana gira para reducir al mínimo el desarrollo de una capa
de membrana, unidades de filtración de membranas de vibración, en
las que la formación de una capa de membrana se reduce al mínimo
por la influencia de sistemas de casete de vibración sin pantalla
(canal abierto), y, con la máxima preferencia, sistemas de casete
equipados con pantallas de diferentes tipos de diseño. Por ejemplo,
puede usarse una casete de canal superancho Hydrosart con un corte
de 0,45 \mum (solicitud de patente PCT/01/04.634, solicitud de
patente alemana DE-100.22.258-A1).
El tampón de lavado usado para microfiltración de flujo cruzado es
el mismo mencionado anterior-
mente.
mente.
Después de recoger el sedimento lavado de
cuerpos de inclusión de la centrífuga o del sistema de
microfiltración de flujo cruzado, el material puede almacenarse
durante periodos de tiempo extendidos congelándolo en gas líquido
como, por ejemplo, nitrógeno o dióxido de carbono líquido. Para este
fin, se dispone comercialmente de varias técnicas (por ejemplo,
Messer Griesheim, Krefeld, Alemania; Integrated Biosystems, Benice,
EE.UU.). La suspensión de cuerpos de inclusión se bombea con una
corriente constante en un vaso agitado que contiene nitrógeno
líquido o dióxido de carbono líquido. Al contacto de la suspensión
de cuerpos de inclusión con el gas líquido las gotitas se congelan
inmediatamente. Finalmente, los sedimentos congelados de cuerpos de
inclusión pueden eliminarse del vaso mediante un tamiz y guardarse
a una temperatura por debajo del punto eutéctico.
Una vez obtenido el sistema de criosedimento, se
repliega adecuadamente la interleucina-4 en una
conformación activa según se describe más adelante.
Los criosedimentos de cuerpos de inclusión que
contienen interleucina-4 no activa se descongelan
rápidamente y a continuación se solubilizan los cuerpos de
inclusión en tampón alcalino mediante la adición de un detergente
aniónico o catiónico adecuado o una sal caotrópica como, por
ejemplo, urea, KSCN, Nal, MgCl_{2} o, con la máxima preferencia,
sales de guanidinio. Los ejemplos de detergentes son, por ejemplo,
dodecilsulfato de sodio, tetradecilsulfato de sodio,
laurilsarcosina, ácido cólico y sus derivados, ácido taurocólico y
sus derivados y ácido terc-octilfenil
propanosulfónico (TOPPS) (tensioactivos aniónicos) o cloruro o
bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio
y bromuro de tetradeciltrimetilamonio (tensioactivos catiónicos),
que solubilizan eficazmente cuerpos de inclusión a concentraciones
bajas del 0,1% al 10%, preferentemente del 0,5%. La incubación
tiene lugar en condiciones de concentración de cuerpos de inclusión,
tiempo de incubación y temperatura de incubación que permitirán la
solubilización de la interleucina-4 se produzca en
el tampón alcalino.
La medida del grado de solubilización de la
interleucina-4 en el tampón se efectúa adecuadamente
mediante determinación de turbidez, analizando el fraccionamiento
de interleucina-4 entre el sobrenadante y el
sedimento después de centrifugado de alta velocidad (12.000 x g, 30
min) en SDS-PAGE, mediante ensayo de proteínas
(ensayo BCA (Pierce)), o por RP-HPLC.
El intervalo de pH del tampón alcalino para
solubilización es normalmente al menos aproximadamente 8, estando el
intervalo preferido aproximadamente entre 7 y 10. Los ejemplos de
tampones que proporcionarán un pH dentro de este último intervalo
incluyen glicina, CAPSO (ácido
3-[ciclohexIlamino]-2-hidroxi-1-propano-sulfónico),
AMP
(2-amino-2-metil-1-propanol),
CAPS (ácido
3-[ciclo-hexilamino]-1-propano-sulfónico),
CHES (ácido
2-[N-ciclohexilamino]-etano-sulfónico)
y TRIS-HCl (clorhidrato de
tris-[hidroximetil]aminometano). El tampón preferido en la
presente memoria descriptiva es TRIS-HCl,
preferentemente a concentraciones de 200 mM, a un pH de
aproximadamente 7 a 10, preferentemente aproximadamente de 8 a
9.
La concentración de
interleucina-4 en la solución tamponada para
solubilización debe ser tal que la interleucina-4 se
solubilice sustancialmente y se desnaturalice completamente. Es
deseable producir una solución de proteína solubilizada más
concentrada antes de replegamiento para mantener las concentraciones
residuales del agente caotrópico o el detergente lo más bajas
posible. Así, la concentración preferida de
interleucina-4 es al menos 10 g/l, con un intervalo
más preferido de 20 a 30 g/l. Después de solubilización, los grupos
cisteína-SH pueden bien reducirse por la adición de
un agente reductor de sulfhidrilo como mercaptoetanol, ditiotreitol
(DTT) o L-cisteína o derivarse químicamente por la
adición de sulfito y un agente oxidante como, por ejemplo,
yodosobenzoato o, preferentemente, tetrationato (Kella y Kinsella
(1985): J. Biochem. Biophys. Methods 11:251-263;
Kella y col. (1988): J. Prot. Chem. 7:535-548).
Por ejemplo, la interleucina-4
puede solubilizarse en clorhidrato de guanidinio 8 M a una
concentración de 10 g/l, sulfitolizarse por la adición de sulfito y
tetrationato en exceso molar de 50 y 100 veces, dializarse y
diafiltrarse frente a tampón de solubilización que contiene
clorhidrato de guanidinio 4 M para eliminar el exceso de reactivos
de derivación, diluirse a, por ejemplo, 50 mg/l para plegamiento.
Para diálisis, pueden usarse bolsas con un corte de 3.500 Dalton
(por ejemplo, Spectrapor). Para diafiltración, pueden usarse
membranas de ultrafiltración con corte en el intervalo de 3 a 10
kD, preferentemente de 5 a 10 kD. Los materiales de membrana
adecuados incluyen membranas de polisulfona y polietersulfona con o
sin modificaciones de superficie, y, preferentemente, membranas de
celulosa o acetato de celulosa y sus derivados. Los dispositivos
adecuados incluyen sistemas de fibra hueca con fibras rectas o
arrolladas, sistemas de casete sin pantalla (canal abierto), y, con
la máxima preferencia, sistemas de casete equipados con pantallas de
diferentes tipos de diseño. Por ejemplo, puede usarse una membrana
de canal de pantalla de Hydrosart 10 kD (Sartorius, Göttingen,
Alemania).
Después de solubilizar la
interleucina-4 y obtenerla químicamente según se
describe anteriormente, la molécula puede purificarse
adicionalmente antes de renaturalización mediante cromatografía de
afinidad a quelatos metálicos inmovilizada (IMAC), por
cromatografía de afinidad en un ligando sintético inmovilizado o por
cromatografía de fase inversa de presión media
(RP-HPLC). Estas etapas cromatográficas pueden
usarse alternativamente en la etapa de ultrafiltración de flujo
cruzado que se describe anteriormente.
En el caso de IMAC, el cuerpo de inclusión de
interleucina-4 solubilizada (ver anteriormente) se
diluye con tampón para obtener una concentración final de
clorhidrato de guanidinio no inferior a 3 M. Por debajo de 3 M, las
moléculas de la interleucina-4 tienden a precipitar.
El tampón preferido para solubilización y la purificación adicional
por IMAC es, por ejemplo, fosfato, pero puede usarse también en su
lugar tamponamiento con componentes no quelantes (denominados
tampones no GOOD) dentro del intervalo preferido de pH de 6 a 9,
con la máxima preferencia pH de 7 a 8, como, por ejemplo,
glicina-NaOH,
N-etilmorfolino-HCl o
2-amino-2-metil-1,3-propandiol-HCl.
La IMAC puede realizarse en los dos modos de
operación, en lecho empaquetado o en lecho expandido
(STREAMLINE-IMAC). Aunque la
interleucina-4 nativa contiene varios residuos de
histidina en motivos de hélice \alpha
(His(59)-X-X
X-Asp), cadena \beta
(His(1)-X-Cis,
His(75)-X-His) y giro \beta
(His(1)-X-X-Asp),
y se conoce por la bibliografía que la
interleucina-4 nativa está unida a IMAC (Naveh y
col. (1991): patente de EE.UU. 5.034.133, Schering Cooperation) es
sorprendente que la interleucina-4 desnaturalizada
en guanidina se una también a resinas IMAC. Los iones metálicos
adecuados para unión de la interleucina-4 no nativa
(clorhidrato de guanidinio 4 M, tampón de fosfato, con la máxima
preferencia pH 7), ordenados por fuerza de unión decreciente, son Cu
> Ni > Co > Zn. Preferentemente, se usan iones de Ni para
unirse selectivamente a interleucina-4 no nativa. La
capacidad de unión dinámica de resinas IMAC es aproximadamente de
10 a 12 g de resina de proteína/L. El modo de operación de lecho
expandido permite la combinación de purificación de proteínas y la
eliminación de fragmentos residuales de pared celular y otros
contaminantes no proteináceos. La elución de
interleucina-4 no nativa unida a la resina IMAC
cargada con iones metálicos apropiados puede conseguirse mediante un
gradiente lineal o escalonado de un agente de desplazamiento
adecuado como, por ejemplo, histidina, histamina, otros agentes de
desplazamiento conocidos por la bibliografía para IMAC o, con la
máxima preferencia, mediante imidazol a concentraciones de 10 mM a
1.000 mM, preferentemente de 10 a 100 mM, con la máxima preferencia
de 10 a 50 mM de imidazol. Se combina el producto que contiene
fracciones. La pureza de interleucina-4 no nativa
después de IMAC es generalmente aproximadamente del 90% según se
valora mediante análisis SDS-PAGE (tinción de
Coomassie) y la recuperación media de
interleucina-4 es superior al 80%.
Posteriormente, la
interleucina-4 se renaturaliza para formar su
conformación biológicamente activa, en presencia de chaperonas
artificiales. Existen varias rutas para replegar
interleucina-4 y formar los puentes de disulfuro
correctos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La renaturalización de proteínas unidas a una
resina de cromatografía es un procedimiento establecido (Las y col.
(1984): documento US-5.739.281, fecha de publicación
14/04/1998; documento WO-94/18.227, fecha de
publicación 18/08/1994, Denzyme, Dinamarca). Un inconveniente
importante del replegamiento asistido por matriz de intercambio
iónico usado comúnmente es la unión multipunto de la proteína a la
resina, lo que da como resultado una baja flexibilidad de la
proteína, que puede interferir con la formación de la estructura
tridimensional correcta. Además, la interleucina-4
precipita cuantitativamente en la resina llevando al bloqueo de la
columna, si la concentración del caotropo varía según la patente
publicada por Las y col. (ver anteriormente).
Como la interleucina-4
desnaturalizada con guanidina mostró unirse a resinas de quelatos
metálicos, lo que con la máxima probabilidad se debe a un punto de
unión monopunto u omnipunto de interleucina-4 a la
resina, es posible el replegamiento asistido por IMAC. Después de
que la interleucina-4 se una a una matriz como, por
ejemplo, sefarosa quelante FF o, preferentemente,
STREAMLINE-IMAC (las dos de Pharmacia), se aplican
un gradiente decreciente adecuado de clorhidrato de guanidinio y un
sistema de redistribución redox adecuado para permitir que la
interleucina-4 se repliegue en su forma
biológicamente activa. Las formas de gradiente pueden ser
gradientes linealmente decrecientes o, preferentemente, un gradiente
decreciente con un perfil en diente de sierra. En el último tipo de
gradiente, una disminución lineal se sigue de un aumento menor y
acusado por etapas en caotropo, seguido de nuevo por una disminución
lineal. Los sistemas de redistribución redox son adecuadamente, por
ejemplo, sistemas basados en glutationa, sistemas de cisteína o
sistemas de 2-mercaptoimidazol. Otros mercaptanos
tienden a interferir con el metal unido a la resina. La proporción
entre formas oxidadas y reducidas de la glutationa preferida pueden
variar en un intervalo de 1:50 a 50:1, preferentemente 40:1.
Usando el sistema de replegamiento asistido por
matriz basado en IMAC, la interleucina-4 puede
replegarse en su conformación biológicamente activa según se
determina mediante medida de la afinidad de
interleucina-4 con la cadena a del receptor de
interleucina-4 (IL-4R\alpha) según
se describe en Shen y col. (1996): European Journal of Biochemistry
240(1):252-261, Wang y col. (1997):
Proceedings of the national academy of sciences of the United
States 94(5):1657-1662). Las constantes de
asociación (k_{on}: 4,67 E+07 [M^{-1} s^{-1}]) y disociación
(k_{off}: 3,81 E-11 [M^{-1}]) que reflejan la
afinidad de unión eran comparables al material estándar de
referencia (k_{on}: 4,14 E+07 [M^{-1} s^{-1}]; k_{off}: 4,68
E-11 [M^{-1}]).
Antes de diálisis o diafiltración frente a
tampón de replegamiento, pueden diluirse los cuerpos de inclusión
solubilizados y, preferentemente, sulfitolizados con tampón de
dilución (por ejemplo, clorhidrato de guanidinio 4 M, clorhidrato
de arginina 0,6 M, por ejemplo, tampón de fosfato 50 mM, pH 7) para
ajustar la concentración de proteínas a entre 0,01 g/l y 0,5 g/l,
preferentemente entre 0,05 g/l y 0,3 g/l, con la máxima preferencia
entre 0,2 g/l y 0,3 g/l. A continuación se elimina el grupo
protector de sulfito mediante la adición de un mercaptano como, por
ejemplo, \beta-mercaptoetanol, glutationa
reducida, 2-mercaptoimidazol, o, preferentemente,
cisteína. La diálisis se realiza usando bolsas de diálisis con un
corte entre 3,5 kD y 10 kD. Se añadió a entre 0,1 y 1,5 M,
preferentemente a entre 0,4 y 1 M, un intercambio de tampón doble
frente a un volumen de 20 veces de tampón de replegamiento que
contenía arginina. Puede usarse diafiltración en vez de diálisis en
caso de replegamiento a gran escala. Para este fin, se emplea una
membrana adecuada con un corte preferido de 1 a 30 kD, con la
máxima preferencia de 5 a 10 kD. Las membranas de ultrafiltración
adecuadas para este procedimiento son, por ejemplo,
polietersulfona, polisulfona, celulasa y, con la máxima preferencia,
derivados de acetato de celulosa. La diafiltración se realiza
frente a 4 volúmenes de tampón de replegamiento (ver
anteriormente).
Los rendimientos de replegamiento relativos a
proteína soluble son generalmente superiores al 80%.
En este caso, pueden usarse alternativamente
diferentes modos de operación:
a) Reducción de interleucina-4
desnaturalizada en presencia de un agente caotrópico
b) Reducción de interleucina-4
después de dilución
c) Reducción de interleucina-4
durante dilución
Se encontró que el modo de operación define el
rendimiento final de interleucina-4 plegada
correctamente y la recuperación final de proteína total. Por otra
parte, el clorhidrato de cisteína y la base de cisteína dan
aproximadamente los mismos rendimientos de replegamiento. La
concentración de cisteína está preferentemente entre 0,1 mM y 10
mM, más preferentemente entre 0,4 mM y 2 mM. La concentración
inicial de proteínas es tal que la proporción entre confórmero
plegado correctamente y mal plegado se elevará al máximo, según se
determina mediante RP-HPLC o ensayo BiaCore. La
concentración preferida de interleucina-4, que
produce el máximo rendimiento de confórmelo plegado correctamente,
está en el intervalo de aproximadamente 10 mg/l a 1 g/l,
preferentemente entre 50 mg/l y 500 mg/l, más preferentemente entre
250 mg/l y 400 mg/l. El procedimiento 3c produce las máximas
cantidades de interleucina-4 plegada correctamente
(generalmente, del 30 al 35% aproximadamente) y la más alta
recuperación de proteína total (generalmente, del 100%
aproximadamente).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los sistemas de chaperonas artificiales se han
descrito para el replegamiento de un intervalo de enzimas (Gellman
y col. (1994): patente de EE.UU. 5.563.057, fecha de presentación,
octubre de 1994, Res. Foundation; Sivakama y col. (1999): FEBS
Letts. 443(2):215-219). Se ha escogido un
agente de formación de complejo detergente adecuado con la
interleucina-4 no plegada, un agente de
"eliminación" adecuado que elimina el detergente de complejo
proteína-detergente en una segunda etapa y un
sistema redox (ver anteriormente) a concentraciones óptimas para
conseguir el replegamiento de interleucina-4. Los
detergentes adecuados comprenden detergentes iónicos, no iónicos o
de iones bipolares. Según se menciona anteriormente, los cuerpos de
inclusión de interleucina-4 pueden solubilizarse
eficazmente en un intervalo de detergentes, que pueden emplearse
también durante replegamiento con un sistema de chaperonas
artificiales. Si se usan sales de guanidinio para solubilización de
los cuerpos de inclusión, no pueden usarse detergentes aniónicos
como, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, debido a la
precipitación de sales de guanidinio-alquilo.
Los detergentes preferidos son detergentes
catiónicos y de iones bipolares, siendo más preferidos los
detergentes de iones bipolares, y siendo incluso más preferidos
CHAPS, CHAPSO, Zwittergent 3-8 a Zwittergent
3-16 y, con la máxima preferencia, Zwittergent
3-14. Las concentraciones preferidas, que
solubilizan eficazmente interleucina-4 no nativa,
se sitúan en o por encima de la CMC del detergente respectivo. Por
ejemplo, el Zwittergent 3-14 (CMC 0,2 a 0,4 mM)
solubiliza interleucina-4 no nativa a entre 0,1 y 10
mM, más preferentemente a entre 0,5 y 5 mM, con la máxima
preferencia entre 1 y 4 mM.
Un agente de "eliminación" adecuado es
cualquier compuesto que efectúe la concentración micelar crítica
(CMC) del detergente, influyendo así en las interacciones
detergente-proteína. Preferentemente, estos
compuestos muestran características anfífilas, exponiendo con ello
partes hidrófilas e hidrófobas en una molécula. Preferentemente, en
dicho sistema de chaperonas artificiales pueden emplearse dextrinas
cíclicas como, por ejemplo, \chi- o, preferentemente, \alpha-,
\beta-ciclodextrina, o dextrinas lineales como,
por ejemplo, dextrina-15,
dextrina-20 o, preferentemente,
dextrina-10.
Adicionalmente, al sistema de chaperonas
artificiales pueden añadirse otros compuestos que afectan al
comportamiento de agregación de la interleucina-4
durante el replegamiento. Los compuestos adecuados son
preferentemente sales a concentraciones entre 10 mM y el límite de
solubilidad de la sal respectiva como, por ejemplo, NaCl, KCl,
Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, MgCl_{2}, Kl,
KSCN, sales de guanidinio, urea o sus derivados. Otros compuestos
adecuados incluyen aminoácidos como, por ejemplo, arginina o
leucina, betaínas o sulfobetaínas,
poli(etilen)glicoles o alcoholes de bajo peso
molecular. En el caso de los aminoácidos, las betaínas y las
sulfobetaínas, el intervalo de concentraciones preferido está entre
0,05 y 1 M. Pueden añadirse
poli(etilen)-glicoles a concentraciones
entre 0,1 mM y 10 mM, preferentemente entre 0,5 y 1 mM.
La concentración de proteínas está en el
intervalo de 0,01 a 1 g/l, preferentemente de 0,1 a 0,5 g/l.
El replegamiento se efectúa normalmente a
aproximadamente +0°C a 45°C, preferentemente de 20 a 40°C
aproximadamente, más preferentemente de 23 a 37°C aproximadamente,
más preferentemente incluso de 25 a 30°C aproximadamente durante al
menos una hora aproximadamente.
En el caso de usar la
interleucina-4 solubilizada reducida como un
material de partida para replegamiento, se arrastra una fuente de
oxígeno como aire o gas oxígeno o se introduce por cualquier otro
medio en el tampón de replegamiento de manera que efectúe
oxidación. El oxígeno puede estar presente en el tampón de
replegamiento en cualquier punto en el tiempo, incluyendo antes de
que se añada interleucina-4 o cualquier otro
reactivo al tampón de replegamiento.
La cantidad de fuente de oxígeno introducida
dependerá, por ejemplo, del tipo de vaso utilizado, la concentración
de interleucina-4, el tipo de fuente de oxígeno, el
tipo y la cantidad de metales pesados presentes, el tipo y la
cantidad de agente reductor presente, si lo hubiere, y el tipo y la
cantidad de agentes caotrópicos residuales, así como el pH del
tampón de replegamiento. Generalmente, el oxígeno se introducirá
pasivamente (por ejemplo, como aire en espacio delantero) usando un
agitador. Alternativamente, el aire puede introducirse a través de
un aspersor. La cantidad de oxígeno presente en el tampón de
replegamiento debe ser suficiente para permitir la oxidación de
cisteína-residuos de interleucina-4
en preferentemente de 1 a 48 horas aproximadamente, más
preferentemente de 1 a 24 horas aproximadamente, con la máxima
preferencia de 1 a 18 horas aproximadamente. Para un replegamiento
a gran escala se requiere un ritmo de aspersión de oxígeno
superior.
En el caso de usar la
interleucina-4 sulfitolizada solubilizada como
material de partida para replegamiento, puede añadirse un agente
quelante metálico adecuado como, por ejemplo, ácido
etilendiamintetraacético (EDTA), ácido
etilenglicol-O,O'-bis-(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA), ácido nitriloacético (NTA) o ácido
trans-1,2-diamino-ciclohexan-N,N,N',N'-tetraacético
(CDTA) al tampón de replegamiento para suprimir reacciones de
oxidación no deseadas. En este caso, no se necesita suministro de
oxígeno para la oxidación de cisteínas para formar puentes de
disulfuro.
Para minimizar la agregación de
interleucina-4, pueden añadirse otros compuestos que
afectan al comportamiento de agregación de
interleucina-4 durante replegamiento al tampón de
replegamiento. Los compuestos adecuados y/o la combinación de
compuestos se describen en una invención separada (Peters J (2001):
solicitud de patente europea EP-01.127.373.7, fecha
de prioridad 22 de noviembre de 2001).
Después de replegar la
interleucina-4, los procedimientos siguientes,
individualmente o en cualquier combinación, son ilustrativos de
cualquier procedimiento de purificación adecuado para obtener mayor
pureza: columnas de fraccionamiento de afinidad, quelato metálico,
intercambio iónico o hidroxiapatito; precipitación; ultrafiltración;
cromatografía de fase inversa de baja, media o alta presión en una
resina de intercambio iónico como S-Sefarosa FF,
SP-Sefarosa FF, CM-Sefarosa FF,
Fuente 30 S, Fuente 15 S, Mono S (Pharmacia), EMD Fractogel S (E.
Merck), Hyper-D CM, Hyper D S (Biosepra), Macroprep
High-S (BioRad), Toyopearl 650-S
(TosoHaas); cromatografía sobre resinas de hidroxiapatito como
hidroxiapatito Ultragel (Biosepra), hidroxiapatito cerámico
(BioRad), hidroxiapatito (Merck); SDS-PAGE;
filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75, Superdex 75, Superdex 200 (Pharmacia), Biosec
(E. Merck); cromatografía sobre resinas de fase inversa basadas en
sílice con ligandos C4, C8 o C18, por ejemplo, Vydac C8, Vydac C18,
YMC C4, Bakerbond C18, Zorbax C18; cromatografía sobre resinas de
fase inversa basadas en polímero (copolímero de poliestireno
divinilbenceno) como Fuente 15 RPC, Fuente 30 RPC (Pharmacia),
Amberchrome CG-1000, Amberchrome
CG-300 HR, Amberchrome CG-300 SD
(TosoHaas), resinas RPC e poro pequeño o medio o grande
(Polymer-Labs), PRP-3 (Hamilton)
En una forma de realización preferida, la
reserva de replegamiento se ajusta en pH a entre 2,5 y 8
aproximadamente, preferentemente entre 3 y 5, más preferentemente
3, se aclara por filtración profunda y se carga directamente en una
columna de fase inversa de baja presión. Preferentemente, el tampón
de carga contiene aproximadamente del 0,1% al 1% de ácido como
ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido trifluoroacético, ácido
acético o, más preferentemente, ácido fosfórico. El tampón de
elución comprende preferentemente aproximadamente del 50 al 100%
(v/v), preferentemente del 70 al 80%, de un disolvente aprótico
polar o alcohólico y aproximadamente del 0,1% al 1% de ácido como
ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido trifluoroacético, ácido
acético o, con la máxima preferencia, ácido fosfórico.
Preferentemente, el disolvente es metanol, etanol, isopropanol, 1-
o 2-propanol, t-butanol,
dimetilsulfóxido, dimetilformamida,
N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, dioxano o
acetonitrilo. Más preferentemente todavía, el disolvente es
etanol.
A continuación se lava la columna con un tampón
a pH preferentemente de 3 aproximadamente para eliminar las
impurezas no ligadas, y se eluye la interleucina-4
con un gradiente lineal o porcentaje creciente del tampón de
elución. Más preferentemente, el gradiente consiste en una etapa
(tampón de elución al 20%) y una parte linealmente creciente
(tampón de elución del 20 al 90%).
La reserva de la afinidad o IMAC o,
preferentemente, la columna de fase inversa de media presión se
ajusta a pH de 5,5 a 9, preferentemente a pH de 6 a 8, más
preferentemente de 6,5 a 7,5, se filtra en profundidad y se aplica
preferentemente en una columna de hidroxiapatito como hidroxiapatito
de Ultrogel, hidroxiapatito convencional o, más preferentemente,
hidroxiapatito cerámico. Después de lavado con tampón de partida,
que preferentemente es un tampón de fosfato, se eluye la columna
con un gradiente creciente de fosfato. El tampón de elución
contiene fosfato de 300 a 1.000 mM, preferentemente de 500 a 800 mM,
más preferentemente 500 mM. La primera parte del gradiente implica
una elución escalonada (tampón de elución al 18%) y la segunda parte
un aumento lineal de hasta el 60% de tampón de elución. Finalmente,
se lava la columna con tampón de elución al 100%.
En una forma de realización preferida de la
invención, la reserva después de someterse a cromatografía de fase
inversa de media presión se aplica directamente en una resina de
intercambio catiónico polimérico con ligando de ácido sulfúrico o
ligando de sulfopropilo (por ejemplo, Fuente S, TosoHaas TSK
SP-5PW-HR, Polymer Labs
PL-SCX, Biorad Macroprep S, Perkin Elmer Poros HS,
Biosepra Hyper D S o resinas equivalentes). Se lava la columna con
tampón de fosfato diluido (pH 3) y se eluye el producto aplicando un
gradiente de cloruro de sodio (hasta 1 M) en el mismo tampón.
Empezando con una reserva de parcialmente
purificada, como las mencionadas anteriormente, se carga la mezcla
de interleucina-4 y sus variantes en una columna de
cromatografía líquida de fase inversa. El disolvente de carga es
preferentemente un ácido diluido como ácido clorhídrico, ácido
sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético o, con la máxima
preferencia, ácido trifluoroacético. Preferentemente, la columna se
carga con un medio que tiene un diámetro de partícula de 5 a 40
\mum aproximadamente, más preferentemente de 10 a 20 \mum
aproximadamente, y un tamaño de poro de 100 a 5.000 \ring{A}
aproximadamente. En caso de medios de fase inversa sobre sílice,
puede usarse una cadena lateral de alquilo C4, C8 o C18. Más
preferentemente, se emplean medios de fase inversa sintéticos
basados en copolímeros de
poliestireno-divinilbenceno.
La cantidad de interleucina-4
cargada en la columna es generalmente de 0,01 a 40 g de proteína/L
de resina aproximadamente, más preferentemente de 0,02 a 20 g de
proteína/L de resina aproximadamente, y con la máxima preferencia
de 1 a 12 g de proteína/L. En la segunda etapa del procedimiento de
la presente memoria descriptiva, la interleucina-4
se eluye a partir de la columna a un pH de aproximadamente 2 a 7,
preferentemente de aproximadamente 2 a 4. El tampón de elución
comprende preferentemente aproximadamente del 50 al 100% (v/v),
preferentemente del 70 al 80% de disolvente aprótico apolar o
alcohólico y aproximadamente del 0,1% al 1% de ácido como ácido
clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético o, más
preferentemente, ácido trifluoroacético. Preferentemente, el
disolvente es metanol, etanol, isopropanol, 1- o
2-propanol, t-butanol,
dimetilsulfóxido, dimetilformamida,
N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, dioxina o
acetonitrilo. Más preferentemente, el disolvente es etanol.
A continuación se lava la columna con un tampón
a un pH preferido de 3 para eliminar impurezas no ligadas, y se
eluye la interleucina con un gradiente lineal o un porcentaje
creciente del tampón de elución. El gradiente consiste en una etapa
(tampón de elución al 20%) y una parte creciente linealmente (tampón
de elución del 20 al 90%).
La temperatura de la elución es generalmente
aproximadamente de 20 a 60°C, aunque pueden emplearse temperaturas
superiores o inferiores. Preferentemente, la temperatura se mantiene
a aproximadamente entre 20 y 30°C.
Después de que se eluya de la columna la
interleucina-4, se formula adecuadamente en la
composición farmacéutica como sigue. Se ajusta el eluato en pH a
entre pH 3 y 8, más preferentemente entre 3 y 5 aproximadamente y
se diafiltra través de una membrana de ultrafiltración adecuada como
polietersulfona, polisulfona, celulosa y, más preferentemente,
acetato de celulosa y sus derivados. La concentración de proteína se
ajusta durante la concentración final del volumen de retenido a
entre 1 y 60 g/l, aproximadamente, preferentemente entre 5 y 20 g/l
aproximadamente. El tampón de formulación consiste en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que es no tóxico para
los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y
que es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por
ejemplo, la formulación no incluye agentes de oxidación y otros
compuestos que son conocidos como perjudiciales para los
polipéptidos. La formulación final puede ser un líquido o un sólido
liofilizado.
La interleucina-4 que se usará
para administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se
consigue fácilmente por filtración a través de membranas de
filtración estéril (por ejemplo, membranas de corte de 0,2
micrómetros). Las composiciones de interleucina-4
terapéutica se colocan generalmente en un recipiente que tiene un
orificio de acceso estéril, por ejemplo, un vial o frasco de
solución intravenosa equipado con un tapón horadable mediante una
aguja de inyección hipodérmica.
La interleucina-4 se guardará
comúnmente en recipientes monodosis o multidosis como, por ejemplo,
ampollas o viales sellados herméticamente, como una solución acuosa
o como una formulación liofilizada reconstitución. Como ejemplo de
formulación liofilizada, los viales de 5 mL se rellenan con 1 mL de
solución acuosa filtrada en estéril de
interleucina-4 (20 mg/ml), y la mezcla resultante se
liofiliza usando un programa de liofilización apropiado. A
continuación se prepara la solución de infusión mediante
reconstitución de la interleucina-4 liofilizada
usando agua bacteriostática para inyección.
Se lavan 50 g en húmedo de células de E.
coli que contienen cuerpos de inclusión de IL-4
en 250 mL de tampón de fragmentación (tampón
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, EDTA 5 mM) y se centrifuga
(8.000 g, 15 min). Se resuspende el sedimento celular en 250 mL de
tampón de fragmentación y se añaden 12 mg de lisozima (\sim1 mg de
lisozima/g células, peso en seco) y se incuba durante 30 min a
temperatura ambiente. A continuación se homogeneiza la suspensión
pretratada en un homogeneizador de escala de laboratorio (por
ejemplo, Stansted, Bran & Lübbe, Manton Gaulin) a una velocidad
de flujo de 60 a 70 mL/min y una presión de homogeneización de 500 a
1.000 bar (3 a 5 ciclos). Se monitoriza la eficacia de
fragmentación por los medios mencionados en la sección de
descripción. Normalmente, se fragmenta más del 85% de las
células.
Se centrifuga la suspensión de células
fragmentadas (Ejemplo 1) que contiene cuerpos de inclusión de
IL-4 liberados (8.000 g, 15 min) y se resuspende el
sedimento de cuerpos de inclusión en 250 mL de tampón de lavado IB
(tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, EDTA 5 mM,
Zwittergent 3-14 al 0,1%). Se repite este
procedimiento de lavado otras tres a cinco veces. Se recogen los IB
lavados mediante centrifugado (ver anteriormente).
Adicionalmente, los cuerpos de inclusión que
contienen IL-4 pueden lavarse por microfiltración de
flujo cruzado. Para este fin, puede usarse un dispositivo de flujo
cruzado adecuado equipado con una membrana de canal de pantalla de
microfiltración adecuada (por ejemplo, Hydrosart, 0,45 \mu,
Sartorius AG, Göttingen), membrana de canal ancho (Sartorius AG,
Göttingen; Pall, Eschborn) o un módulo de fibra hueca arrollada
(Millipore GmbH, Eschborn). Los cuerpos de inclusión purificados
son puros en >80% según valoración por
SDS-PAGE.
Se resuspenden los IB lavados (Ejemplo 2) en 125
mL de tampón de solubilización (guanidina-HCl 7 M,
EDTA 5 mM, Tris-HCl 0,2 M, pH 7). Se realiza
sulfitólisis de los puentes de disulfuro añadiendo 4 g de sulfito de
sodio (240 min de incubación a temperatura ambiente con agitación)
y 1,3 g de tetrationato de potasio (30 min de incubación a
temperatura ambiente con agitación). Después de sulfitólisis, se
elimina el material insoluble por centrifugado (8.000 g, 15 min) y
se elimina el exceso de sulfito y tetrationato por diafiltración
frente a GuHCl-tampón de diálisis
(guanidina-HCl 4 M, EDTA 5 mM, fosfato 50 mM, pH 7)
usando una membrana de ultrafiltración adecuada (por ejemplo,
Hydrosart 10 kD, Sartorius, Göttingen).
La cromatografía de afinidad a quelatos
metálicos (IMAC) de IL-4 S-sulfonada
(Ejemplo 3) puede realizarse en una columna STREAMLINE (Amersham
Biosciences, Suecia) y un gel apropiado (por ejemplo, gel
STREAMLINE-IMAC; Amersham Biosciences, Suecia). Se
ajusta el volumen de gel a 3 L en el modo de operación empaquetado.
Se fija la presión máxima a 1 bar. Se ajustan las velocidades de
flujo a 150 cm/h en modo empaquetado y 300 cm/h en modo de
operación expandido. Se realiza la cromatografía en tampón A de IMAC
(guanidina-HCl 4 M, hidrogenofosfato de disodio 50
mM, NaCl 0,5 M, pH 7,0). La capacidad dinámica de unión del gel
STREAMLINE-IMAC es de aproximadamente 10 g de
proteína/L de gel. Para elución de IL-4, se usa
tampón B de IMAC (guanidina-HCl 4 M,
hidrogenofosfato de disodio 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 50 mM, pH
7,0). La eliminación de los iones de níquel se realiza usando
tampón C de IMAC (guanidina-HCl 4 M, NaCl 0,5 M,
EDTA 50 mM, pH 7,0). Se carga STREAMLINE-IMAC con
iones de níquel antes de unión de IL-4 (8,5 g/l
acetato de níquel tetrahidratado en agua destilada). Se combina el
producto que contiene fracciones de reserva de imidazol para
producir una pureza de producto de aproximadamente el 90% según
valoración por análisis SDS PAGE (tinción de Coomassie). La
recuperación media de IL-4 es generalmente superior
al 80%.
El replegamiento de IL-4
sulfitolizada puede realizarse usando diferentes procedimientos:
Antes de replegamiento por diálisis frente a
tampón de replegamiento, se diluyen los cuerpos de inclusión
solubilizados y sulfitolizados (Ejemplo 3) con
GuHCl-tampón de dilución
(guanidina-HCl 4 M, arginina-HCl 0,6
M, tampón de fosfato 50 mM, pH 7) 7,5 veces produciendo un volumen
final de 1,8 L y una concentración de proteínas de 0,2 a 0,3 g/l. A
continuación se elimina el grupo protector de sulfito añadiendo 1,21
g/l de L-cisteína (2,2 g, 30 min, agitación). La
renaturalización se realiza mediante diálisis doble (16 h y 6 h)
frente a 36 L de tampón de replegamiento (tampón de fosfato 50 mM,
pH 6,5, arginina-HCl 0,6 M) a 10°C. El volumen del
dialisato filtrado (Sartobran 300 0,22 \mu, Sartorius, Göttingen)
es 1,87 L. El rendimiento de replegamiento relativo a la proteína
soluble es generalmente superior al 80%. Se obtuvo un rendimiento de
replegamiento de 30 a 40 mg/l de IL-4 R121D Y124D
plegada correctamente.
La diálisis a gran escala puede realizarse
usando depósitos de acero inoxidable diseñados especialmente. Los
dos depósitos (aprox. 300 L de volumen cada uno) se conectaron
mediante una bomba. Una segunda bomba suministraba el tampón al
depósito de almacenamiento de tampón. La entrada de los depósitos se
situaba en el fondo, mientras que la salida estaba situada en el
lado superior. Se usaron dos barras de acero inoxidable dentro de
los depósitos para colgar las bolsas de diálisis en la solución de
tampón flotando en el depósito. Se almacenó el volumen global de
tampón en un depósito de 1.200 L agitado y se bombeó continuamente a
través de los dos depósitos. El tampón se mantuvo a 10°C. Se
monitorizaron la temperatura y el rendimiento de la bomba en línea
durante las 96 horas de renaturalización.
La IL-4 desnaturalizada y
sulfitolizada (Ejemplo 3) se diluye en una concentración final de
proteínas de 200 mg/l (ensayo de Bradford). Posteriormente, se
añade L-cisteína para una concentración final de 15
mM (1,8 g/l, aproximadamente 180 veces en exceso en comparación con
los residuos de cisteína). Se llenan con suspensión de proteínas en
bolsas de diálisis (aprox. 1 m) que se cierran usando pinzas de
plástico. Se cuelgan las bolsas de diálisis en depósitos de acero
inoxidable equipados con entradas y salidas para el tampón y las
barras metálicas para fijar las bolsas de diálisis. El replegamiento
se realiza mediante diálisis frente al volumen de 20 veces (1.250
L) de la IL-4 diluida desnaturalizada y modificada
químicamente usando tampón de diálisis (NaCl 120 mM, KCl 2 mM,
dihidrogenofosfato de sodio 3 mM, hidrogenofosfato de disodio 7 mM,
pH 7,1). Después de 2 días de diálisis, se intercambia el tampón y
se continúa con la diálisis durante 48 horas más. El rendimiento de
replegamiento relativo a la proteína soluble es generalmente
superior al 80%. Se obtiene un rendimiento de replegamiento de 30 a
40 mg/l de IL-4 R121D Y124D plegada
correctamente.
El replegamiento por diafiltración se realiza
usando una membrana de corte de 5 a 10 kD (por ejemplo,. Hydrosart
10 kD, Sartorius, Alemania o canal de pantalla Omega 5 kD, Filtron,
Alemania). La IL-4 sulfitolizada (Ejemplo 3),
disuelta en un tampón de fosfato o Tris-HCl 50 mM
(pH 7) que contiene clorhidrato de guanidinio 4 M (GuHCl), se
aplica al sistema de diafiltración. La eliminación de GuHCl se
realiza por diafiltración frente a 6 volúmenes de tampón de
replegamiento que contienen fosfato o TRIS-HCl 50 mM
(pH 7) y L-arginina 0,6 M. El rendimiento de
replegamiento relativo a proteína soluble es generalmente superior
al 80%. Para detalles relativos a la IL-4 de tipo
silvestre y diferentes muteínas, consúltese Domingues y col. (2000):
J. Biotechnol. 84:217-230.
En este caso, pueden usarse alternativamente
diferentes modos de operación:
a) Reducción de IL-4
desnaturalizada y sus muteínas en presencia de un agente caotrópico,
por ejemplo, clorhidrato de guanidinio
b) Reducción de IL-4 y sus
muteínas después de dilución
c) Reducción de IL-4 y sus
muteínas durante dilución
Se encontró que el modo de operación define el
rendimiento final de IL-4 plegada correctamente y la
recuperación final de proteína total. Por otra parte, el
clorhidrato de L-cisteína y la base de
L-cisteína dan aproximadamente los mismos
rendimientos de replegamiento. El procedimiento 3c produce las
cantidades más altas de IL-4 plegada correctamente
(generalmente del 10 al 35%, dependiendo de la muteína respectiva) y
la más alta recuperación de proteína total (aprox. el 100%).
El procedimiento de replegamiento 3c se realiza
diluyendo la IL-4 S-sulfonada (ver
Ejemplo 3) en un tampón de replegamiento consistente en
L-arginina-HCl 0,6 M, pH 7,5,
L-cisteína 0,4 a 2,4 mM dependiendo de la
concentración de proteínas) y EDTA 1 mM a una concentración de
proteínas final de 50 a 250 mg/l. La mezcla de replegamiento se
agita suavemente a temperatura ambiente y se vigila la cinética de
replegamiento mediante análisis RP4-HPLC de
muestras extraídas en intervalos de tiempo. Después de 24 horas, se
completa la reacción de replegamiento y se prosigue con el
procedimiento.
La IL-4
S-sulfonada preparada según se describe en el
Ejemplo 1, el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3 puede replegarse mejor
empleando chaperonas artificiales por dilución en el siguiente
tampón de replegamiento: fosfato 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM,
Zwittergent 3-14 2 mM, L-cisteína
1,2 mM, L-arginina 0,2 M o L-lisina
0,4 M o sulfato de sodio o amonio 0,4 M. La concentración final de
proteínas puede variar entre 10 y 1.000 mg/l, preferentemente entre
50 y 500 mg/l. Se permite que tenga lugar la formación del complejo
proteína-detergente durante 3 h. Posteriormente, se
añade \beta-ciclodextrina a la mezcla de
replegamiento para dar una proporción molar de
\beta-ciclodextrina/detergente de 6 (12 mM). La
reacción de replegamiento se termina 4 h después la adición de
\beta-CD (tiempo de replegamiento total: 7 a 8
h). Se monitoriza la renaturalización mediante
RP4-HPLC según se describe en el Ejemplo 9. La
recuperación total de proteína soluble es superior al 85%. El
rendimiento de replegamiento total es de aprox. el 18%. Se obtiene
un rendimiento de replegamiento de 45 mg/l de IL-4
R121D Y124D plegada correctamente.
El volumen relativamente alto producido durante
el replegamiento de la IL-4 debe concentrarse
durante las etapas de procedimiento adicionales. En principio, esto
puede conseguirse por ultrafiltración o por cromatografía. Para
ambas técnicas se ofrecen ejemplos en las secciones siguientes.
Se realiza concentración de IL-4
replegada usando un dispositivo de filtración adecuado equipado con
una membrana de ultrafiltración (corte: 5 a 10 kD) como, por
ejemplo, Hydrosart 10 kD (Sartorius, Göttingen) u Omega 5 kD
(Filtron, Alemania). Después de reducción de volumen a una
concentración final de proteínas de aproximadamente 300 mg/l, a
continuación se diafiltra la solución del producto frente a 4
volúmenes de tampón de replegamiento (ver ejemplo 5.1). La
recuperación de proteína es generalmente del 90% o superior.
Se empaqueta una columna (por ejemplo, volumen
de lecho 100 mL) con unas resinas de fase inversa con base de
polímero como, por ejemplo, Fuente 30 RPC (Amersham Biosciences,
Suecia), CG-1000s (TosoHaas, Alemania) u otra
resina RPC de polímero de poro grande equivalente (por ejemplo,
Polymer Labs de poro grande, tamaño de partículas de 10 a 25 \mu
o 50 a 75 \mu, hasta un tamaño de poro de 4.000 \ring{A}). La
columna se equilibra con tampón A (ácido al 0,1%, como ácido
trifluoroacético o H_{3}PO_{3}). Después de cargar la columna
con la mezcla de replegamiento de filtración profunda (por ejemplo,
recuperación cuantitativa en cascada de IL-4 Seitz
Bio 40/20) y lavado, se eluye el producto usando un gradiente
lineal de etanol (1 volumen de columna del 20 al 50% de eluyente B,
7 volúmenes de columna del 50 al 80% de eluyente B) u otro
disolvente orgánico adecuado. Se analizan las fracciones que
contienen el producto mediante HPLC de fase inversa analítica y se
ponen en reserva según una pureza de más del 50% con respecto a la
isoforma plegada correctamente. La recuperación de
IL-4 en la reserva principal es normalmente tan
buena como el 88%. La pureza de IL-4 en la reserva
principal es generalmente de >50% según valoración por
RP4-HPLC analítica.
Ejemplo
7a
Después de dilución (1:5 con agua destilada) de
la reserva principal preparada según el Ejemplo 6b, se ajusta el pH
a 6,5 (\pm0,5) con una sal de fosfato básico (por ejemplo,
K_{2}HPO_{4}). Se filtra la solución resultante a través de un
filtro de profundidad (por ejemplo, Seitz Bio40/20) con recuperación
cuantitativa de IL-4. Si el material de partida se
preparó según el Ejemplo 6a, se ajusta la conductividad de la
solución con tampón de fosfato 5 mM (pH 6,5 (\pm0,5)) a <5
mS/cm. Se bombea la solución a través de una columna empaquetada
hidroxiapatito cerámico (14 cm \Phi x 10,5 cm de altura; CHA
tipo-I, BioRad, Alemania) equilibrada previamente
con el tampón de fosfato anterior a una velocidad de flujo de 200
cm/h. Se lava la proteína no ligada a través de la columna con
aproximadamente 3 volúmenes de columna de tampón de fosfato 5 mM (pH
6,5 (\pm0,5)), hasta que la señal OD280 alcanza la línea de base.
El producto se eluye a una velocidad de flujo de 200 cm/h usando un
gradiente lineal de fosfato (20 volúmenes de columna). Se recogen
fracciones de 1 L y las que contienen IL-4 se
identifican mediante RP4-HPLC analítica y se
combinan. La recuperación de IL-4 en la reserva
principal es normalmente tan buena como el 85%. La pureza de
IL-4 en la reserva CHA es >70% según valoración
por RP4-HPLC analítica.
Ejemplo
7b
Se ajusta la conductividad de la solución activa
en reserva de IL-4 preparada según el Ejemplo o con
agua desionizada a <5 mS/cm. Se bombea la solución a través de
una columna empaquetada con Fuente 15 S (Amersham Biosciences,
tamaño de partícula 15 \mu; dimensión de columna: 14 cm \Phi x
10 cm de altura) equilibrada previamente con 20 mM de tampón de
fosfato (pH 3) a una velocidad de flujo de 200 cm/h. Se lava la
proteína no ligada a través de la columna con aproximadamente 3
volúmenes de columna de tampón de fosfato 20 mM (pH 3), hasta que
la señal OD280 alcanza la línea de base. El producto se eluye a una
velocidad de flujo de 200 cm/h usando un gradiente de NaCl lineal
(20 volúmenes de columna). Se recogen fracciones de 1 L y las que
contienen IL-4 se identifican mediante
RP4-HPLC analítica y se combinan. La recuperación de
IL-4 en la reserva principal es normalmente tan
buena como el 75%. La pureza de IL-4 en la reserva
de intercambio catiónico es >70% según valoración por
RP4-HPLC analítica.
Se filtra la reserva activa de
IL-4 del Ejemplo 7a o del Ejemplo 7b (por ejemplo,
Sartobran 300, 0,22 \mu) y se aplica en una columna de Fuente 15
RPC (Amersham Biosciences, tamaño de partícula 15 \mum; dimensión
de columnas: 3,2 cm x 12 cm) equilibrada previamente con tampón A de
HPLC (TFA al 0,1%/agua). Posteriormente, se eluye el material no
ligado (3 volúmenes de columna) y se usa un gradiente (etanol al
16%, 0,1 VC, etanol al 16-40%, 3 VC, etanol al
40-64%, 7 VC) para eluir IL-4 a una
velocidad de flujo de 225 cm/L. Las fracciones (10 mL) se diluyen
apropiadamente con tampón A de HPLC y se analiza la proteína plegada
correctamente usando RP4-HPLC analítica. La
recuperación de IL-4 en la reserva principal es
normalmente tan buena como el 87%. La pureza de IL-4
en la reserva de RPC es generalmente >80% según valoración por
RP4-HPLC analítica.
Todos los ensayos usados para determinar las
fracciones que contienen IL-4 plegada correctamente
y sus muteínas son convencionales. Para absorbancia UV en medida de
280 nm de IL-4 purificada, una Unidad de Densidad
Óptica (DO) A_{280} es equivalente a 1,6 mg por análisis de
composición de aminoácidos y a 2,0 mg por procedimiento de Lowry.
Dependiendo de las sustituciones de aminoácidos, han de aplicarse
diferentes factores para las diferentes muteínas. El procedimiento
de Lowry es descrito por Lowry y col. (1951) J. Biol. Chem.
193:265-275. La RP4-HPLC analítica
se realiza en una columna de YMC iso-butilo C4 (5
\mu, 200 \ring{A}, 4,6 x 250 mm) a una velocidad de flujo de
1,0 ml/min. La longitud de onda de detección es 210 nm. El tampón A
es TFA al 0,1%, el tampón B es TFA al 0,1% con acetonitrilo al 70%.
El gradiente se realiza como sigue: 0 a 2 min, B al 40%; 2 a 19,5
min, B al 40-85%; 19,5 a 20 min, B al
85-100%; 20 a 21 min, B al 100%; 21 a 22 min, B al
100-40%; 22 a 25 min, B al 40% (reequilibrio). Otras
luteínas de IL-4 muestran un comportamiento de
elución ligeramente diferente. Dependiendo de las sustituciones de
aminoácidos, las luteínas de IL-4 puede fluir antes
o después en comparación con la IL-4 de tipo
silvestre.
Empleando los procedimientos descritos en los
ejemplos 1, 2, 3, 4, 5.1, 6a, 7a y 8, se prepararon los productos
finales de IL-4 R121D Y124D y se caracterizaron
bioquímicamente. Los análisis de secuencia en terminales C y N, así
como los análisis de aminoácidos, revelaron la identidad de la
molécula. La homogeneidad media expresada como % de
PTH-metionina en el primer ciclo fue del 94%. Se
empleó espectroscopia de desorción por láser asistida por matriz
(MALDI) para determinar la masa molecular. Se determinó la masa
molecular media de la muteína de IL-4 R121D Y124D a
14,995 Dalton (STD: \pm3, n = 7), que está en buena concordancia
con la masa molecular predicha (14,998 Dalton) y la precisión del
procedimiento MALDI. Se usó cromatografía líquida de alta presión de
fase inversa (resina C18) (RP18-HPLC) como un
procedimiento de alta resolución para determinar la paridad del
producto final, que fue del 90%. La cromatografía por permeación de
gel se realizó usando una resina Superdex-75
(Amersham Biosciences, Suecia) y NaCl 0,6 M en tampón de fosfato
diluido a pH neutro. La cantidad de dímeros/oligómeros estuvo muy
por debajo del 1% y la cantidad de productos de degradación menores
estuvo por debajo del límite de detección (0,04%). El contenido de
endotoxinas se determinó según el ensayo LAL de farmacopea. El
contenido de endotoxinas medio fue de 0,24 UE/mg (STD: \pm0,34, n
= 10). El contenido de ADN cromosómico de los productos finales
estuvo por debajo del límite de detección (8 pg de ADN/mg de
proteína) del ensayo ADN Umbral (Molecular Devices, EE.UU.). La
actividad antagonista completa de los preparados de
IL-4 R121D Y124D obtenidos del procedimiento #1 se
mostró in vivo (Shanafelt AB, Forte CP, Kasper JJ, Sánchez
Pescador L, Wetzel M, Gundel R, Greve JM (1998): Proc. Natl. Acad
Sci. USA 95 (16):9454-9458; Morton M, Harris P, Xu
J, Gorina S, Roczniak S, Fitch N, Crundel R (1999): Am. J. Respir.
Crit. Care Med. 159 (3. Supl.):A660 y Harris P, Lindell D, Fitch N,
Gundel R (1999): Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159 (3.
Supl.):A230) e in vitro empleando tanto el ensayo de unión a
receptores (Shen y col. (1996): Europ. J. Biochem.
240:252-261, Wang y col. (1997): Proc. Natl. Acad.
Sci. US 94:1657-1662) como los ensayos de cultivo de
células indicadoras de luciferasa. El valor de k_{on} fue 4,3 E+07
[M^{-1} s^{-1}] y el de k_{off} fue 4,9 E-11
[M^{-1}]. El valor de Cl50 de IL-4 R121D Y124D fue
6 nM.
Empleando los procedimientos descritos en los
ejemplos 1, 2, 3, 5,3c, 6b, 7a, y 8, los productos finales de
IL-4 R121D Y124D se prepararon y caracterizaron
también bioquímicamente. El análisis de secuencias en terminales C
y N, así como el análisis de aminoácidos, reveló la identidad de la
molécula. La homogeneidad media expresada como %-PTH metionina en
el primer ciclo fue del 94,6%. Se empleó espectroscopia de desorción
por láser asistida por matriz (MALDI) para determinar la masa
molecular. Se determinó la masa molecular media de la muteína de
IL-4 R121D Y124D a 14,999 Dalton (STD: \pm6, n =
11), que está en buena concordancia con la masa molecular predicha
(14,998 Dalton) y la precisión del procedimiento MALDI. Se usó
cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (resina C18)
(RP18-HPLC) como un procedimiento de alta resolución
para determinar la paridad del producto final, que fue del 92%. La
cromatografía por permeación de gel se realizó usando una resina
Superdex-75 (Amersham Biosciences, Suecia) y NaCl
0,6 M en tampón de fosfato diluido a pH neutro. La cantidad de
dímeros/oligómeros estuvo muy por debajo del 0,2% y la cantidad de
productos de degradación menores estuvo por debajo del límite de
detección (0,04%). El contenido de endotoxinas se determinó según el
ensayo LAL de farmacopea. El contenido de endotoxinas medio fue de
0,03 UE/mg (STD: \pm0,013, n = 11). El contenido de ADN
cromosómico de los productos finales estuvo por debajo del límite
de detección (8 pg de ADN/mg de proteína) del ensayo ADN Umbral
(Molecular Devices, EE.UU.). La actividad antagonista completa de
los preparados de IL-4 R121D Y124D obtenidos del
procedimiento #2 se determinó tanto mediante el ensayo de unión a
receptores (Shen y col. (1996): Europ. J. Biochem.
240:252-261, Wang y col. (1997): Proc. Natl. Acad.
Sci. US 94:1657-1662) como los ensayos de cultivo de
células indicadoras de luciferasa. El valor de k_{on} fue 4,1
E+07 [M^{-1} s^{-1}] y el de k_{off} fue 4,7
E-11 [M^{-1}]. El valor de CI50 de
IL-4 R121D Y124D fue 4 nM.
La línea celular de genes indicadores, células
D2 a 49, se estableció por introducción estable de gen l\mu/Luc.
en células BL-2, línea celular de linfoma de
Burkitt. Las células D2 a 49 se cultivaron en medio RPMI 1640
suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Hyclone, Utah,
EE.UU.), 100 \mug/ml de estreptomicina (Gibco BRL, Nueva York,
EE.UU.), 100 Ul/ml de penicilina (Gibco BRL, Nueva York, EE.UU.) y
800 \mug/ml de G418 (Gibco BRL, Nueva York, EE.UU.). Las células
D2 a 49 se subcultivaron cada 3 a 4 días. Para inducción de
luciferasa, se pusieron 100 \mul de la suspensión celular a una
densidad de 3 x 10^{6} células/ml en un pocillo de una placa de
96 pocillos y se cultivó con o sin IL-4 humana
recombinante durante 24 horas a menos que se indique lo
contrario.
El nivel de luciferasa se midió sobre la base
del principio de que la mezcla de luciferina con ATP produce una
señal luminiscente de tipo destello como respuesta a la luciferasa.
En resumen, después de un cultivo de células D2 a 49 según
condiciones experimentales especificadas, se añadió solución
LucLite^{TM} (Packard, Connecticut, EE.UU.) a una suspensión
celular. La intensidad de la luminiscencia producida se midió
inmediatamente por un contador de centelleo y luminiscencia en
microplaca, TopCount^{TM} (Packard, Connecticut, EE.UU.).
\newpage
Se compraron comercialmente el kit LucLite
(Packard, Connecticut EE.UU.), luciferasa (Sigma, Missouri,
EE.UU.), IL-2 (Genzyme, Cambridge, EE.UU.), IL-5 (Pepro Tech EC Ltd., Londres, RU), IL-6 (Genzyme), IL-13 (Serotec, Oxford, RU), IFN-(Genzyme) y dimetilsulfóxido (Sigma).
EE.UU.), IL-2 (Genzyme, Cambridge, EE.UU.), IL-5 (Pepro Tech EC Ltd., Londres, RU), IL-6 (Genzyme), IL-13 (Serotec, Oxford, RU), IFN-(Genzyme) y dimetilsulfóxido (Sigma).
(Sólo con fines de
ilustración)
Se lavan 360 g en húmedo de células de E.
coli que contienen cuerpos de inclusión de IL-4
Q116D Y119D en 1.800 mL de tampón de fragmentación (tampón
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, EDTA 5 mM) y se centrifuga
(8.000 g, 15 min). Se resuspende el sedimento celular en 1.800 mL
de tampón de fragmentación y se añaden 86 mg de lisozima (\sim1
mg de lisozima/g células, peso en seco) y se incuba durante 30 min a
temperatura ambiente. Se añaden 7,2 g de MgCl_{2} (x 6 H_{2}O)
y se disuelve con agitación. Posteriormente, se añaden 18 \muL de
suspensión de benzonasa (Merck, Darmstadt; 0,25 U/ml) y se agita la
suspensión durante otros 30 min a temperatura ambiente. Se
centrifuga la suspensión a 8.000 x g durante 15 minutos y se vuelve
a suspender el sedimento en 1.800 mL de agua destilada (choque
osmótico). Se monitoriza la eficacia de fragmentación por los medios
mencionados en la sección de descripción. Normalmente, se fragmenta
más del 85% de las células.
Los cuerpos de inclusión liberados se purifican
adicionalmente mediante etapas repetitivas de centrifugado y lavado
(tres veces) que implican centrifugado a 8.000 x g durante 15
minutos y resuspensión en tampón de lavado
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, Zwittergent
3-14 al 0,1%).
Se vuelven a suspender 180 g (peso en seco) de
IB lavadas en 180 mL de tampón de solubilización
(guanidina-HCl 7 M, EDTA 5 mM,
Tris-HCl 0,2 M, pH 7). Se determina el contenido
total de proteínas usando el ensayo BCA (Pierce) a 2,2 g.
Se realiza sulfitólisis de los puentes de
disulfuro añadiendo 4 g de sulfito de sodio (240 min de incubación
a temperatura ambiente) y 1,3 g de tetrationato de potasio (30 min
de incubación a temperatura ambiente). Después de sulfitólisis, se
elimina el material insoluble por centrifugado (8.000 g, 15 min) y
se elimina el exceso de sulfito y tetrationato por diafiltración
frente a GuHCl-tampón de diálisis (4 M
guanidina-HCl], EDTA 5 mM, fosfato 50 mM, pH 7)
usando una membrana de ultrafiltración adecuada (por ejemplo,
Hydrosart 10 kD, Sartorius, Göttingen). Se determina el contenido
de proteína total usando el ensayo BCA (Pierce) a 1,6 g
(rendimiento de la etapa 73%). Se determinó la pureza de la
mIL-4 Q116D Y119D S-sulfonada por
RP4-HPLC analítica al 25% (porcentaje de área
máxima).
El replegamiento se realiza diluyendo la
mIL-4 Q116D Y119D S-sulfonada (88
mL) en 6,35 L de tampón de replegamiento consistente en
L-arginina-HCl 0,6 M, pH 7,5,
L-cisteína 0,8 mM (dependiendo de la concentración
de proteínas) y EDTA 1 mM para una concentración final de proteínas
de 250 mg/l. La mezcla de replegamiento se agita suavemente a
temperatura ambiente y se monitoriza la cinética de replegamiento
mediante análisis de RP4-HPLC de muestras extraídas
en intervalos de tiempo. Después de 24 horas, la reacción de
replegamiento está completa y se procesa adicionalmente. Se forman
300 mg de mIL-4 Q116D Y119D plegada correctamente
sin derivar (rendimiento de replegamiento total 19%) y la
recuperación total de proteínas es de 1,6 g (rendimiento de etapa
del 100%)
La mezcla de replegamiento se ajusta a pH 3
mediante la adición de HCl al 25% y se filtra a través de un filtro
de profundidad (por ejemplo, Seitz Bio40/20) con recuperación
cuantitativa. A continuación se aplica la filtración a una columna
de fase inversa empaquetada previamente con Amberchrome
CG-1000s (Tosohaas), que se ha equilibrado con
ácido fosfórico al 0,1%. Se carga la resina hasta una capacidad de
14 g de proteína/L de resina a una velocidad de flujo de 150 cm/h.
Se lava la columna con 3 volúmenes de columna (VC) de ácido
fosfórico al 0,1%. A continuación, se lavan los 5 VC de eluyente al
20% B (ácido fosfórico al 0,1%, etanol al 80%) a través de la
columna. Posteriormente, se aplica un gradiente lineal de eluyente B
a entre el 20% y el 90% en 7 VC. Se recogen fracciones del 25% del
volumen de la columna y se analiza mIL-4 Q116D Y119D
mediante RP4-HPLC. Aquellas fracciones que
contienen producto con más del 20% de pureza se acumulan en reserva
para dar la reserva principal. En total, se encuentran 288 mg de
mIL-4 Q116D Y119D plegada correctamente no derivada
en la reserva principal (rendimiento de etapa del 96%).
La reserva principal se ajusta a pH 6,0 mediante
la adición de K_{2}HPO_{4} (1 M) y se filtra en profundidad
(por ejemplo, Seitz Bio40/20) con recuperación cuantitativa.
La purificación intermedia se realiza en una
columna empaquetada con hidroxiapatito cerámico (Tipo I, tamaño de
partícula 80 \mu, BioRad) equilibrado previamente con tampón de
fosfato 5 mM (pH 6) a una velocidad de flujo de 200 cm/h. Se carga
la columna hasta una capacidad de 10 g de proteína/L de resina. La
proteína no ligada a través de la columna con aproximadamente 3
volúmenes de columna de tampón de fosfato 5 mM (pH 6), hasta que la
señal que la señal OD280 alcanza la línea de base. El producto se
eluye a una velocidad de flujo de 200 cm/h usando un gradiente
lineal de fosfato 0,5 M (20 volúmenes de columna). El tamaño de
fracción es el 25% del volumen de la columna. Las fracciones que
contienen mIL-4 Q116D Y119D a una pureza de >50%
(porcentaje de área máxima) se identifican mediante
RP4-HPLC analítica y se combinan. La pureza de
mIL-4 Q116D Y119D en la reserva de CHA es >70%
según valoración por RP4-HPLC analítica. Se obtiene
un rendimiento de etapa de 247 mg de mIL-4 Q116D
Y119D en la fracción principal (86%).
Se filtra la reserva principal de CHA (por
ejemplo, Sartobran 300, 0,22 \mu) y se aplica en una columna de
Fuente 15 RPC (Amersham Biosciences, tamaño de partícula 15 \mum)
previamente equilibrada con tampón A de HPLC (TFA al 0,1%/agua).
Posteriormente, se eluye el material no ligado (3 volúmenes de
columna) y se usa un gradiente (etanol al 16%, 0,1 VC, etanol al
16-40%, 3 VC, etanol al 40-64%, 7
VC) para fluir IL-4 a una velocidad de flujo de 225
cm/L. Las fracciones (10 mL) se diluyen apropiadamente con tampón A
de HPLC y se analiza la proteína plegada correctamente usando
RP4-HPLC analítica. La pureza de
mIL-4 Q116D Y119D en la reserva RPC es >84%
según valoración por RP4-HPLC analítica. Se obtiene
un rendimiento de etapa de 225 mg de mIL-4 Q116D
Y119D en la fracción principal (91%). El rendimiento global final
de mIL-4 Q116D Y119D purificada correspondiente a
la entrada de proteína inicial total (2,2 g) es así del 10%.
La reserva principal RPC final se diluye con
agua, se filtra en condiciones estériles a través de un filtro de
0,22 \mu, se reparte alícuotamente y se liofiliza. El producto se
almacena estable a <-18°C durante más de 24 meses.
El análisis proteinquímico de la
mIL-4 Q116D Y119D final se realizó empleando
procedimientos estándar según se describe en la bibliografía. La
identidad se confirmó por secuenciación N-terminal
de los primeros 15 residuos de aminoácidos. La pureza fue del 95%
de PTH-metionina en el primer ciclo. Se encontró
menos del 0,5% de norleucina mal incorporada por análisis de
aminoácidos. El ensayo in vitro de las constantes de unión de
mIL-4 Q116D Y119D (BiaCore) reveló la estructura
tridimensional correcta (k_{off}: 1,69 x 10^{-3} [s^{-1}],
k_{on}: 4,34 x 10^{6} [M^{-1} s^{-1}], n - 9; referencia
mIL-4: k_{off}: 0,89 x 10^{-3} [s^{-1}],
k_{on}: 7,51 x 10^{6} [M^{-1} s^{-1}], n = 6). La
funcionalidad biológica de la luteína de mIL-4 Q116D
Y119D se mostró también in vivo (Nelde A, Grunewald S,
Bröcker FB, Sebald W, Duschl A (2002): Allergy, en imprenta).
El contenido de endotoxinas determinado por
ensayo LAL de farmacopea fue <0,03 UE/mg de proteína.
Claims (8)
1. Un procedimiento para preparación de
interleucina-4 o muteínas de
interleucina-4 por expresión recombinante que
comprende (a) expresión en cuerpos de inclusión, (b) fragmentación
de las células y separación los cuerpos de inclusión, (c) lavado de
los cuerpos de inclusión así obtenidos, (d) solubilización de los
cuerpos de inclusión por desnaturalización, (e) renaturalización del
producto de expresión y (f) purificación del producto de expresión
caracterizado porque los cuerpos de inclusión se lavan (c)
con un tampón que contiene un detergente que solubiliza eficazmente
lípidos unidos a la superficie del cuerpo de inclusión o los lípidos
contenidos en fragmentos de pared celular y la renaturalización (e)
se realiza en presencia de chaperonas artificiales.
2. Un procedimiento según la
reivindicación 1 en el que el detergente para lavado de los cuerpos
de inclusión es un detergente no iónico, un tensioactivo iónico o
un detergente de ion bipolar.
3. Un procedimiento según la
reivindicación 1 en el que el detergente es un detergente de ion
bipolar seleccionado entre el grupo CHAPS, CHAPSO, desoxicolato y
la serie de iones bipolares
(N-alquil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato).
4. Un procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 en el que el tampón de lavado para los
cuerpos de inclusión es un tampón que mantiene el pH entre 7 y
10.
5. Un procedimiento según cualquiera de
la reivindicaciones 1 a 4 en el que el tampón de lavado contiene
adicionalmente una sustancia quelante.
6. Un procedimiento según la
reivindicación 5 en el que la sustancia quelante se selecciona entre
el grupo ácido etilendiamintetraacético (EDTA), ácido
etilenglicol-O,O'bis-(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA), ácido nitriloacético (NTA) o ácido
trans-1,2-diamino-ciclohexan-N,N,N',N'-tetraacético
(CDTA).
7. Un procedimiento según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 en el que la proteína recombinante es
interleucina-4 R121D Y124D.
8. El procedimiento según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9 en el que la purificación (f) se
realiza por cromatografía.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02015589A EP1382614A1 (en) | 2002-07-15 | 2002-07-15 | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
| EP02015589 | 2002-07-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2280764T3 true ES2280764T3 (es) | 2007-09-16 |
Family
ID=29762614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03738109T Expired - Lifetime ES2280764T3 (es) | 2002-07-15 | 2003-07-02 | Procedimiento de purificacion de interleucina-4 y sus muteinas. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20060134690A1 (es) |
| EP (2) | EP1382614A1 (es) |
| JP (2) | JP2006506332A (es) |
| AT (1) | ATE352566T1 (es) |
| AU (1) | AU2003244635A1 (es) |
| DE (1) | DE60311470T2 (es) |
| ES (1) | ES2280764T3 (es) |
| WO (1) | WO2004007549A1 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1382614A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-21 | Bayer HealthCare AG | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
| US8189621B2 (en) | 2006-05-12 | 2012-05-29 | Microsoft Corporation | Stack signaling to application with lack of requested bandwidth |
| US8144793B2 (en) | 2006-12-12 | 2012-03-27 | Microsoft Corporation | Cognitive multi-user OFDMA |
| US8241697B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-14 | Abbott Point Of Care Inc. | Formation of immobilized biological layers for sensing |
| US8268604B2 (en) * | 2007-12-20 | 2012-09-18 | Abbott Point Of Care Inc. | Compositions for forming immobilized biological layers for sensing |
| KR101113495B1 (ko) | 2008-01-23 | 2012-02-29 | 한미홀딩스 주식회사 | 인간 인터페론 베타의 정제방법 |
| WO2010105227A1 (en) * | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Aerovance, Inc. | Methods of renaturation of recombinant proteins |
| WO2010128141A1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-11-11 | Novo Nordisk Health Care Ag | Stable pharmaceutical compositions of peptide derivatized using an oxime linker |
| CN103068369A (zh) * | 2010-08-30 | 2013-04-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 产生四连蛋白-载脂蛋白a-i颗粒的方法，由此获得的脂质颗粒及其应用 |
| KR20130047749A (ko) * | 2010-08-30 | 2013-05-08 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 테트라넥틴-아포지단백질 a-i 지질 입자의 제조 방법, 지질 입자 및 이의 용도 |
| CN103320447A (zh) * | 2013-05-20 | 2013-09-25 | 深圳市亚太兴实业有限公司 | 重组人白介素4基因、含重组人白介素4基因的工程菌发酵方法 |
| CN108753753B (zh) * | 2018-05-28 | 2022-04-22 | 中国林业科学研究院林业研究所 | Lrr受体激酶-pxy的纯化方法 |
| CN114599665A (zh) | 2019-08-16 | 2022-06-07 | 应用分子转运公司 | 组合物、制剂及白细胞介素产生和纯化 |
| CN116874552B (zh) * | 2023-09-08 | 2023-12-08 | 成都华任康生物科技有限公司 | 一种目标蛋白的纯化方法及其试剂盒和相关应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4137333A1 (de) * | 1991-11-13 | 1993-05-19 | W Prof Dr Sebald | Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung |
| DK0686162T3 (da) * | 1993-02-04 | 2003-09-22 | Borean Pharma As | Forbedret fremgangsmåde til refoldning af proteiner |
| US5563057A (en) * | 1994-10-31 | 1996-10-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for refolding misfolded enzymes with detergent and cyclodextrin |
| JP3344618B2 (ja) * | 1997-06-20 | 2002-11-11 | 株式会社エイチ・エス・ピー研究所 | シャペロン発現プラスミド |
| US5932102A (en) * | 1998-01-12 | 1999-08-03 | Schering Corporation | Immobilized metal, affinity chromatography |
| EP1382614A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-21 | Bayer HealthCare AG | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
-
2002
- 2002-07-15 EP EP02015589A patent/EP1382614A1/en not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-07-02 JP JP2004520457A patent/JP2006506332A/ja active Pending
- 2003-07-02 EP EP03738109A patent/EP1523500B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-02 ES ES03738109T patent/ES2280764T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-02 DE DE60311470T patent/DE60311470T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-02 AT AT03738109T patent/ATE352566T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-07-02 AU AU2003244635A patent/AU2003244635A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-02 US US10/520,883 patent/US20060134690A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-02 WO PCT/EP2003/007022 patent/WO2004007549A1/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-11-12 US US12/945,829 patent/US20110060128A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-24 JP JP2010288204A patent/JP2011088922A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20060134690A1 (en) | 2006-06-22 |
| AU2003244635A1 (en) | 2004-02-02 |
| EP1382614A1 (en) | 2004-01-21 |
| JP2011088922A (ja) | 2011-05-06 |
| WO2004007549A1 (en) | 2004-01-22 |
| DE60311470T2 (de) | 2007-10-31 |
| JP2006506332A (ja) | 2006-02-23 |
| DE60311470D1 (de) | 2007-03-15 |
| ATE352566T1 (de) | 2007-02-15 |
| EP1523500B1 (en) | 2007-01-24 |
| US20110060128A1 (en) | 2011-03-10 |
| EP1523500A1 (en) | 2005-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2280764T3 (es) | Procedimiento de purificacion de interleucina-4 y sus muteinas. | |
| ES2550363T3 (es) | Derivados truncados de GLP-1 y su uso terapéutico | |
| ES2280857T3 (es) | Replegado de polipeptidos. | |
| JP6038248B2 (ja) | プロリン／アラニンランダムコイルポリペプチドの生合成およびその使用 | |
| ES2672770T3 (es) | Derivados del péptido-1 similar al glucagón y su uso farmacéutico | |
| ES2334127T3 (es) | Produccion de il-21 en huespedes procariotas. | |
| ES2468318T3 (es) | FSH recombinante que incluye sialilaci�n en alfa 2,3- y alfa 2,6 | |
| EP2369005A1 (en) | Biological active proteins having increased in vivo and/or in vitro stability | |
| ES2863278T3 (es) | Proteínas terapéuticas biespecíficas para la reparación de tejidos | |
| ES2611453T3 (es) | Procedimiento para obtener G-CSF humano recombinante biológicamente activo | |
| MX2011000847A (es) | Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo. | |
| PT94754B (pt) | Processo de obtencao de inibidor de factor de necrose tumoral e de isolamento de genes que codificam o referido inibidor | |
| ES2870802T3 (es) | Métodos de replegado de proteínas a elevado pH | |
| CN110494164B (zh) | 一种靶向治疗TNF-α相关疾病的人抗体制剂 | |
| JP2023538807A (ja) | 補体因子ｃ３の阻害剤及びそれらの医学的使用 | |
| CN112041330A (zh) | 坎普他汀类似物及其医学用途 | |
| BRPI0718491A2 (pt) | Conjugados poliméricos do box-a da hmgb1 e variantes do box-a da hmbg1 | |
| JPH07509691A (ja) | 安定なポリペプチド組成物 | |
| ES2208416T3 (es) | Plegado de proteinas de membrana utilizando dos detergentes diferentes. | |
| JP2005503139A (ja) | 炎症性及び線維症性疾患治療用の精製組み換えヒトウテログロビンの製造方法 | |
| Alam et al. | Expression and purification of a mutant human growth hormone that is resistant to proteolytic cleavage by thrombin, plasmin and human plasma in vitro | |
| ES2357888T3 (es) | Procedimiento para renaturaliación de proteínas recombinantes que contienen disulfuro a altas concentraciones proteicas en prresencia de aminas. | |
| EP3872084A1 (en) | Epi-x4 based peptides and derivatives thereof | |
| EP1542730B1 (en) | Modified therapeutic agents | |
| JP2018508580A (ja) | ペグ化ｉｌ−１１の組成物および方法 |