ES2208416T3 - Plegado de proteinas de membrana utilizando dos detergentes diferentes. - Google Patents
Plegado de proteinas de membrana utilizando dos detergentes diferentes.Info
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Abstract
Procedimiento para la obtención de proteínas plegadas en su estructura nativa o activa, de la familia de los receptores acoplados a la proteína G, mediante los siguientes pasos: - Preparación de la proteína solubilizada en un primer detergente, y - Cambio del primer detergente por un segundo detergente, el cual induce el plegado de la proteína en su forma nativa o activa, caracterizado porque el segundo detergente se escoge entre los alquilglicosidos (alquilo de 5 a 12 átomos de carbono, también radicales alquilo de cadena ramificada o cíclicos, glicósido = todos los mono y disacáridos), y las alquilfosforilcolinas (alquilo de 10 a 16 átomos de carbono).
Description
Plegado de proteínas de membrana utilizando dos
detergentes diferentes.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de proteínas plegadas en su
estructura nativa o activa, de la familia de los receptores
acoplados a la proteína G, con los pasos siguientes:
- Preparación de la proteína solubilizada en un
primer detergente, y
- Cambio del primer detergente por un segundo
detergente, el cual induce el plegado de la proteína en su forma
nativa o activa.
Para las proteínas de membrana se conoce un
procedimiento de esta clase a partir del artículo "Refolding
of Escherichia coli produced membrane protein
inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography"
("Plegado de los cuerpos de inclusión de proteínas de membrana
obtenidos en la Escherichia coli, inmovilizados mediante
cromatografía de quelación de níquel"), Rogl y col., en FEBS
Letters 432 (1998) 21-26.
Es conocido un procedimiento para el plegado de
proteínas de receptores a partir del artículo "Expression of an
Olfactory Receptor in Escherichia coli: Purification,
Reconstitution, and Ligand Binding" ("Expresión de un receptor
olfativo en la Escherichia coli: Purificación, reconstitución
y unión de ligandos") de Kiefer y col., y en Biochemistry
("Bioquímica"), 35 (1996) 16077-16084.
En ambas publicaciones el problema tiene su
origen en que las proteínas de membrana, a las cuales pertenecen
también los receptores, pueden ser producidas verdaderamente en
grandes cantidades con la ayuda de vectores de expresión en
bacterias, pero sin embargo, la proteína producida no es
"activa". La proteína no se integra efectivamente en la
membrana sino que está presente en primer lugar en estado
desnaturalizado y debe ser (re)plegada mediante un cambio de
detergente en la estructura nativa o activa. Los agregados de
proteína "inactiva" se conocen en la literatura inglesa como
cuerpos de inclusión.
Para las proteínas de membrana Toc75 y LHCP, Rogl
y col., se describe un procedimiento en el cual se ha empleado como
primer disolvente la N-laurilsarcosina y como
segundo detergente el Triton X-100®. Mediante el
cambio del chaotropeno por el detergente suave, se obtuvo un plegado
de la proteína agregada.
Según Kiefer y col., se transformó un receptor
olfativo acoplado a la proteína G, mediante el cambio de detergentes
de la N-laurilsarcosina a la digitonina durante la
unión a una columna de níquel, en la estructura activa.
En ambos casos se pudo demostrar que en primer
lugar, la proteína agregada presente en forma de cuerpos de
inclusión, se solubilizaba en primer lugar en un detergente
desnaturalizador, y a continuación mediante el cambio de detergente
descrito podía transformarse en su estructura activa, lo cual se
verificó mediante las correspondientes mediciones de la unión.
Sobre las proteínas de membrana, en particular en
los receptores en forma nativa o activa, existe no solamente un
interés científico sino también un gran interés comercial puesto que
las proteínas de membrana son componentes de todas las membranas
biológicas y comunican a las diferentes membranas celulares su
especificidad, y son particularmente responsables del intercambio
de materia y estímulos.
El reconocimiento específico de una unión química
mediante el receptor correspondiente tiene p. ej., como consecuencia
el que la célula diana cambia su estado fisiológico. Por ello los
receptores son las moléculas diana más importantes para los
medicamentos, aproximadamente 3/4 de todos los fármacos que se
encuentran en el comercio actúan sobre los receptores, la mayoría de
las veces sobre los llamados receptores acoplados a la proteína G,
los cuales tienen varios cientos de representantes en el genoma
humano.
Teniendo en cuenta lo expuesto, es muy valioso
para el desarrollo de anticuerpos específicos, de medicamentos,
etc., el poder disponer de grandes cantidades de membranas de
proteínas, en particular de receptores con estructura activa o
nativa. Puesto que estas proteínas sin embargo se encuentran en los
tejidos en muy pequeña concentración, es necesario utilizar un
sistema para la super expresión recombinante de proteínas de
membrana y proteínas de receptores. Para ello, los sistemas para
producir proteína funcional en células eucariotas (células de
mamíferos o insectos), son caros, y la proporción de expresión es
muy pequeña, lo cual es igualmente una desventaja. También en la
expresión bacteriana se puede obtener proteína funcional, pero la
proporción de expresión es por regla general todavía más pequeña que
la expresión en eucariotas.
Con esta base, las publicaciones citadas al
principio, describen procedimientos en los cuales la proteína se
expresa en el interior de las células, en donde se agrega, o sea que
tampoco es funcional. La ventaja de este método reside en que pueden
obtenerse grandes cantidades de proteína, y Kiefer y col., informan
que pueden obtenerse hasta el 10% de la proteína celular y con ello
100-10.000 veces más proteína que con otros sistemas
de expresión. Los cuerpos de inclusión producidos, sobre los cuales
Rogl y col., informan también, deben solubilizarse en primer lugar,
y mediante el cambio de detergentes ya descrito al principio, deben
convertirse en su estructura nativa o activa.
Naturalmente, el interés comercial se dirige no
solamente a las proteínas y receptores de membrana en su secuencia
de estado natural, sino que son también objeto de esta invención las
secuencias parciales, secuencias homólogas, secuencias mutadas o
secuencias derivadas de proteínas y receptores de membrana, puesto
que según la funcionalidad permiten cada una no solamente un vistazo
general a la estructura de las proteínas y receptores de membrana
sino también un racional diseño del medicamento.
A este respecto, debe citarse que la secuencia de
ADN ya es conocida para muchos receptores, y que esta clase de
secuencias pueden obtenerse en el banco de datos EMBL. Puesto que la
mayor parte de estas secuencias de ADN no contienen ningún intrón,
se puede obtener la secuencia de codificación mediante PCR a partir
de ADN genómico o mediante RT-PCR a partir de ARNm.
Este ADN puede clonarse a continuación en un vector de expresión
correspondiente.
Se desconoce sin embargo, la estructura del
producto de traducción, de manera que la preparación de proteínas
objeto de la invención en cantidad suficiente, permite efectuar
experimentos de cristalización, etc., para aclarar más la
estructura.
Debe citarse que los receptores eucarióticos
expresados bacterianamente pueden diferenciarse mediante
glicosilación. Los receptores acoplados a la proteína G poseen
efectivamente en el terminal N uno o más lugares de glicosilación,
los cuales se modifican en el retículo endoplasmático o más tarde en
el aparato de Golgi con un oligosacárido. Las bacterias por el
contrario, no modifican estas secuencias.
Mediante el tratamiento de una parte de la
proteína con N-glicosidasa F o
N-glicosidasa A, puede escindirse el componente
sacárido, de forma que se puede reconocer sobre un gel de SDS un
recorrido bien diferenciado para la proteína antes y después de este
tratamiento cuando la proteína se expresa en células eucariotas. En
la proteína expresada bacterianamente no puede distinguirse ninguna
diferencia en el recorrido.
Aunque los procedimientos descritos en las
publicaciones citadas en el principio, para la obtención de proteína
de membrana o respectivamente proteína de receptores, conducen a
estructuras activas, los procedimientos descritos según conocimiento
del inventor de la presente solicitud de patente además de que no
son satisfactorios, tienen un rendimiento pequeño y el procedimiento
es difícilmente reproducible.
Por todo ello, es un objetivo de la presente
invención el perfeccionar el procedimiento citado al principio para
alcanzar junto a una buena reproducibilidad un gran rendimiento de
proteína en estructura activa o nativa.
Según la invención, se consigue el objetivo
propuesto, seleccionando el segundo detergente entre los
alquil-glicósidos (alquilo = radicales alquilo de 5
a 12 átomos de carbono, también radicales alquilo de cadena
ramificada o cíclicos, glicósidos = todos mono y disacáridos), y
las alquil-fosforilcolinas (alquilo = 10 a 16 átomos
de carbono).
De esta manera se consigue completamente el
objetivo fundamental de la invención.
Los inventores de la presente solicitud de
patente han reconocido efectivamente que el pequeño rendimiento y la
escasa reproducibilidad de los procedimientos conocidos son
atribuibles al segundo detergente. Sorprendentemente se obtienen
efectivamente rendimientos claramente mayores y resultados más
reproducibles cuando el segundo detergente se selecciona del grupo
indicado más arriba. Con ello hay que tener en cuenta que el segundo
detergente en su concentración final esté por encima de la
concentración micelar crítica. Este valor cmc indica la
concentración de una estructura amfifila formadora de micelas en
agua, por encima de la cual se forman las micelas. El valor cmc
refleja pues en principio la solubilidad de un detergente en el
agua. Por encima del valor cmc, la concentración de monómero del
disolvente disuelto es constante.
Los valores cmc de algunos detergentes están
descritos en la publicación "Detergents: An Overview"
("Detergentes: una ojeada general"), J.M. Neugebauer in
"Methods in Enzymology" ("Métodos de enzimología"), 182
(1990), páginas 239-253.
Además, se prefiere en particular que como
segundo detergente se emplee la
alquil-fosforilcolina con una longitud de cadena de
10 a 16 átomos de carbono. Los inventores de la presente solicitud
de patente han comprobado que en particular en el caso de receptores
acoplados a la proteínas G, este detergente proporciona un alto
rendimiento en proteína con una estructura plegada.
Según algunas mediciones de los inventores, los
valores cmc para alquil-fosforilcolina con un
radical alquilo de 12, 13, 14 o respectivamente 16 átomos de
carbono, son 500, 150, 50 o respectivamente 5 \muM.
Teniendo en cuenta el hecho de que solamente unos
pocos detergentes están principalmente en posición de mantener
estables las proteínas de membrana o incluso los receptores, es
sorprendente que la alquil-fosforilcolina cuya
utilización para los receptores acoplados a la proteína G no había
sido descrita hasta aquí en la literatura, esté incluso en situación
de inducir un plegado en la estructura nativa. En el caso de un
receptor de adenosina los inventores pudieron comprobar que el
receptor plegado presenta propiedades de unión nativas, si se emplea
la alquil-fosforilcolina como segundo detergente.
También para otros receptores pudo comprobarse el plegado con uno de
los detergentes del grupo citado mas arriba.
A este respecto, se prefiere cuando la proteína
se obtiene en una línea celular transformada con un vector de
expresión en forma de cuerpos de inclusión, en el cual esté clonado
el gen que codifica la proteína, en donde la proteína sea
preferentemente, parte de una proteína de fusión y antes o después
del cambio de detergente se escinda de la proteína de fusión.
La expresión de la secuencia de ADN que codifica
la proteína objeto de la invención como proteína de fusión tiene la
ventaja frente a la expresión directa sin proteína soporte, de que
ésta protege la proteína deseada aunque sea extraña al sistema de
expresión, de la degradación mediante proteasas, y puede conducir a
un alto nivel de expresión. En particular, mediante el empleo de la
glutatión-S-transferasa (GST) como
proteína soporte, aumenta la solubilidad de las proteínas expresadas
en grandes cantidades, en las células anfitrionas y facilita el
aislamiento de las mismas. La proteína soporte puede además
utilizarse para la purificación de las proteínas de fusión, cuando
están presentes anticuerpos apropiados. Lo mismo sirve para el
procedimiento de purificación por cromatografía de afinidad.
A este respecto se prefiere además, cuando los
cuerpos de inclusión se purifican y se solubilizan mediante la
adición del primer detergente, que dicho primer detergente se escoja
del grupo:
N-laurilsarcosina,
dodecilsulfato, otros detergentes con carga o urea o respectivamente
cloruro de guanidinio en combinación con detergentes con carga o sin
carga.
Es importante que las condiciones en las que la
proteína entra en disolución, se desnaturalicen de tal forma que no
sea posible la formación de la estructura nativa.
A este respecto es preferible en conjunto, que el
segundo detergente esté presente en un tampón de plegado con micelas
mixtas de lípido/detergente, de manera que el tampón de plegado
contiene de preferencia el segundo detergente y un fosfolípido de
origen natural, de preferencia un extracto lípido de tejidos, en el
cual la proteína se encuentra de forma natural.
A este respecto existe la ventaja de que en
comparación con el empleo de micelas puras de detergente, el
rendimiento en proteína nativa puede todavía mejorarse. El extracto
lípido de tejido en el cual el receptor se encuentra de forma
natural, se puede también simular utilizando o mezclando los lípidos
con una composición similar.
Con referencia al cambio de detergente es
preferible que éste tenga lugar mediante un procedimiento de
diálisis o ultrafiltración, o respectivamente mediante un
procedimiento cromatográfico o mediante dilución de la proteína
solubilizada en un tampón contenido en el segundo detergente.
Los procedimientos descritos hasta aquí para el
cambio de detergente son intercambiables entre sí y cada uno de
ellos ofrece ventajas específicas respecto a la manipulación, la
duración del procedimiento y el rendimiento alcanzable.
Después del cambio de detergente, debe formarse
en la proteína como mínimo un puente estable de disulfuro, lo cual
se efectúa de preferencia mediante la adición de una mezcla de
glutatión oxidado y reducido.
La proteína plegada puede además incorporarse a
proteoliposomas, los cuales son vesículas obtenidas artificialmente
y que constituyen una unidad funcional. Con ayuda de estos
proteoliposomas obtenidos selectivamente pueden investigarse
selectivamente determinados procesos en las proteínas/receptores de
membrana.
Otras ventajas se desprenden de la siguiente
descripción de ejemplos de ejecución preferiods.
La invención se aclara a continuación con más
detalle con ayuda de la descripción de ejemplos individuales.
Las secuencias de ADN para diversas proteínas de
receptores y también proteínas de membrana se obtienen del banco de
datos EMBL, y por regla general no presentan ningún intrón. Puede
obtenerse también el ADN necesario con ayuda de cebadores mediante
una PCR a partir de ADN genómico o mediante una
RT-PCR a partir de ARNm.
Este ADN se clona a continuación en un vector de
expresión el cual ha sido construido para la expresión de una
proteína de fusión. La proteína soporte de esta proteína de fusión
puede ser por ejemplo la
glutatión-S-transferasa (GST), como
se describe en el artículo citado al principio de Kiefer y col., en
donde se ha generado una proteína de fusión a partir del receptor
OR5 y GST. El vector de expresión se transforma dentro de una línea
celular, la cual expresa la proteína de fusión. La proteína no se
incorpora con ello a la membrana, sino que está agregada por lo
menos en parte en forma de cuerpos de inclusión en el citoplasma,
con lo cual no se pliega correctamente.
El ADNc de uno de los siguientes receptores se
clona en el marco del vector
pGEX2a-c-His: receptor
AO-adenosina del Hai Squalus acanthias, receptor
humano beta-2-adrenérgico, receptor
humano neuropéptido YY1, receptor humano neuropéptido YY2, receptor
humano melanocortin-1, receptor humano oxitocin.
Este vector contiene la secuencia detrás del promotor Tac, la cual
codifica la glutatión-S-transferasa
y el siguiente sitio de escisión de trombina, a continuación una
secuencia de múltiples eslabones y finalmente seis codones de
histidina y un codon de finalización.
Los vectores se transforman en la cepa BL 21 de
E. coli. La expresión de la proteína se induce mediante la
adición de IPTG y las células se siembran después de otras tres
horas. Después del tratamiento con lisozimas y desintegración con
ultrasonidos, se separan las membranas y los cuerpos de inclusión de
la proteínas solubles mediante centrifugación.
Los cuerpos de inclusión se solubilizan mediante
la adición de N-lauroilsarcosina 1,5% a 0ºC y con un
tampón (0,1% de alquil(de 14 átomos de
carbono)fosforilcolina) en un volumen de dilución cinco veces
mayor. A esta solución se añade trombina y se incuba 16 horas a
20ºC, para separar el receptor del GST. A continuación se separan
por centrifugación los componentes insolubles de la célula.
El sobrenadante se añade sobre
Ni-NTA-agarosa (Qiagen) y se incuba
durante 1 hora a 4ºC, con lo que el receptor se une a la matriz de
níquel. A continuación se pasa el material de níquel a una columna y
se lava para el cambio de detergente con un tampón, el cual contiene
un 0,01% de alquil(14 átomos de
carbono)fosforilcolina) como segundo detergente. Con ello se
separan la N-lauroilsarcosina (primer detergente) y
las proteínas contaminadas.
Para la reconstitución se disuelve una mezcla de
lípidos, compuesta de 70% de
1-palmitoil-2-oleilfosfatidil-colina
y 30% de
1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilglicerina,
juntamente con el doble de cantidad (p:p) de dodecilmaltosida en
cloroformo y se elimina el disolvente al vacío. A ello se añade la
proteína purificada del ejemplo 3 y se incuba por lo menos durante 1
hora. El detergente se separa mediante una columna de poliestireno
(Calbiosorb de Calbiochem), después de lo cual se forman los
liposomas con los receptores incorporados (proteoliposomas).
Mediante mediciones de la unión con ligandos,
puede confirmarse que el receptor se halla en la estructura
nativa.
Se prepararon las siguientes disoluciones
madre:
- -
- Colesterol, Sigma C8667, 100 mg/ml en CHCl_{3}
- -
- Fosfolípido de cerebro de oveja, Sigma P4264, 100 mg/ml en CHCl_{3}
- -
- Lecitina de habas de lecitina, Sigma P3644, 100 mg/ml en CHCl_{3}
- -
- 100 mg de alquil (16 átomos de carbono)-fosforilcolina en frascos de 50 ml, se disuelven en 1-2 ml de CHCl_{3}; se añaden 28 \mug de solución madre de colesterol, 32 \mul de solución madre de fosfolípido de cerebro de oveja, 40 \mul de solución madre de lecitina de habas de soja; se separa el CHCl_{3} por evaporación y se seca por lo menos durante 30 minutos a menos de 15 mbars; se añade 1 ml de agua para obtener una solución transparente (solución madre de detergente, 100 mg/ml).
- -
- Trombina, Sigma T4648, 1.000 u/ml en H_{2}O, almacenada a -20ºC
- -
- Sarcosil: 10% de N-lauroilsarcosina en H_{2}O, esterilizada en autoclave.
- -
- 10 x PBS: Fosfato de sodio 200 mM, NaCl 1,5M, pH 7,0
Se toman 2 ml de Sarcosil 3% en PBS, y se
mantienen en hielo. Se añaden 2 ml de cuerpos de inclusión del
ejemplo 2 y se agitan y se tratan durante un minuto con
ultrasonidos. Inmediatamente después, se añaden 16 ml de solución
madre de detergente 0,1% en PBS.
Ya aquí tiene lugar un intercambio de
detergentes, Sarcosil se diluye por debajo del valor cmc, y durante
la concentración final del alquil(16 átomos de
carbono)fosforil-colina está por encima del
valor cmc.
Después de añadir 15 u de trombina se mantiene la
solución a 20ºC durante la noche, para escindir la proteína de
fusión.
A continuación, se centrífuga la solución durante
30 minutos a 4ºC con 40.000 rpm y se separa el sobrenadante.
Al sobrenadante se añaden 20 ml de imidazol de
una solución madre 1M (pH 7,0). Esta solución se añade al
correspondiente material de columna purificado
Ni-NTA superfluido (Quiagen), y se agita suavemente
en un recipiente enfriado (4-8ºC) durante una hora
para evitar la sedimentación del material. De esta forma se une la
proteína del receptor al material de la columna.
A continuación se centrifuga el material de la
columna durante un minuto a 2.000 rpm y se separa el sobrenadante de
manera que el sobrenadante que queda corresponda al volumen del
fondo. Se incorpora Ni-NTA agarosa y se añade a una
columna. Con una velocidad de flujo de 2 ml/minuto se lava con 40 ml
de una solución madre de detergente 0,01% en PBS, con lo cual se
logra otro intercambio de detergente con sujeción a los valores
cmc.
La columna se eluye a continuación con 10 ml de
PBS / solución madre de detergente 0,01% / imidazol 0,3M, y se
juntan las fracciones que absorben a 280 nm.
A continuación, tiene lugar durante cuatro horas
una diálisis frente a 2 litros de PBS a 4ºC, así como la adición de
GSH 1mM / GSSG 0,1 mM a partir de una solución madre 100 x en
agua.
La solución se almacenó a continuación durante 48
horas a 4ºC, después de lo cual se pudo comprobar mediante diálisis
de fluidos la unión de la adenosina, y que el receptor estaba
presente en forma nativa.
Los cuerpos de inclusión conteniendo el receptor
beta-2-adrenergeno del ejemplo 2, se
solubilizan mediante la adición de lauroilsarcosina 1,5% a 0ºC, y se
diluye con 10 veces el volumen de una solución de
dodecil-\beta-D-maltosido
0,1% en tampón de malonato de Na 20 mM de pH 6,0. A continuación se
añade trombina (50 unidades por milígramo de proteína) y se incuba
durante una hora a 20ºC. Después de la centrífugación se añade el
sobrenadante a una película de lípido como en el ejemplo 4 y se
reconstituye la proteína en proteoliposomas.
El éxito del plegado se comprueba mediante la
medición de la unión de ligandos fluorescentes del receptor
beta-adrenergeno
(BODIPY-TMR-CGP 12177 de Molecular
Probes).
Claims (14)
1. Procedimiento para la obtención de proteínas
plegadas en su estructura nativa o activa, de la familia de los
receptores acoplados a la proteína G, mediante los siguientes
pasos:
- Preparación de la proteína solubilizada en un
primer detergente, e
- Cambio del primer detergente por un segundo
detergente, el cual induce el plegado de la proteína en su forma
nativa o activa,
caracterizado porque el segundo detergente
se escoge entre los alquilglicosidos (alquilo de 5 a 12 átomos de
carbono, también radicales alquilo de cadena ramificada o cíclicos,
glicósido = todos los mono y disacáridos), y las
alquilfosforilcolinas (alquilo de 10 a 16 átomos de carbono).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el segundo detergente se encuentra en un
tampón de plegado con micelas mixtas de lípido/detergente.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el tampón de plegado contiene el segundo
detergente y el fosfolípido de procedencia natural, de preferencia
un extracto lípido de tejidos, en el cual la proteína se encuentra
de forma natural.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el cambio de detergentes tiene lugar
mediante diálisis o ultrafiltración.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el cambio de detergentes tiene lugar
mediante un procedimiento cromatográfico.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el cambio de detergentes tiene lugar
mediante dilución de la proteína solubilizada en un tampón que
contiene el segundo detergente.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque después de
efectuar el cambio de detergentes en la proteína, se forma por lo
menos un puente estable de disulfuro, de preferencia mediante la
adición de una mezcla de glutatión oxidado y reducido.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la proteína
plegada se incorpora a proteoliposomas.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la proteína en
forma de cuerpos de inclusión se produce en una línea celular
transformada con un vector de expresión, en el cual está clonado un
gen que codifica la proteína.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la proteína es
parte de una proteína de fusión y antes o después del intercambio de
detergentes es escindida de la proteína de fusión.
11. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque los cuerpos de inclusión se purifican y
se solubilizan mediante la adición del primer detergente.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el primer
detergente se escoge del grupo de la
N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato, otros
detergentes con carga o urea o respectivamente cloruro de guanidinio
en combinación con detergentes con carga o sin carga.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el segundo
detergente se emplea por encima de la concentración micelar
crítica.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque como segundo
detergente se emplea alquil-fosforilcolina con una
longitud de cadena de 10 a 16 átomos de carbono.
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