KR101007308B1 - 계면활성제를 이용한 ｇ 단백질 연결 수용체 단백질정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GPCR(Guanin-Protein-Coupled Receptor)을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물에서 대량 발현된 GPCR을 계면활성제에 대한 용해도 차이를 이용하여 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 계면활성제만을 이용하여 후각 수용체 단백질 및 GPCR을 정제할 수 있고, 상기 정제된 후각 수용체 단백질 및 GPCR을 각각 후각센서 및 GPCR 의약품 연구개발에 활용할 수 있다.

후각 수용체 단백질, G 단백질 연결 수용체, 계면활성제, 정제

Description

계면활성제를 이용한 Ｇ 단백질 연결 수용체 단백질 정제방법{Method for Purifying Guanin-Protein-Coupled Receptor Protein Using Surfactants}

본 발명은 GPCR(Guanin-Protein-Coupled Receptor)을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물에서 대량 발현된 GPCR을 계면활성제에 대한 용해도 차이를 이용하여 정제하는 방법에 관한 것이다.

G 단백질 연결 수용체(Guanin-Protein-Coupled Receptor, GPCR)는 여러 가지 세포 신호 전달을 매개하는 막 단백질로 인간의 생리작용을 매개하는 수용체 중 가장 방대한 그룹을 형성하며 개체 내에서 중요한 역할을 수행한다.

현재 세계적으로 사용 빈도가 높은 상위 20개의 의약품 중 35%가 이러한 GPCR의 활성을 조절하는 의약품으로 거대한 시장을 형성하고 있어, 현대 의약품 연구에 있어서 GPCR은 중요한 연구 대상으로 인식되고 있다.

또한 GPCR에 포함되어 있는 후각 수용체 단백질은 감도와 선택성이 반도체나 고분자를 이용하는 전자코(electric nose)보다 우수하여, 이를 대체할 수 있을 것 으로 기대되는 바이오 후각 바이오센서에 상기 후각 수용체 단백질을 포함하는 GPCR을 적용하는 연구가 진행되고 있다.

그러나, GPCR에 관한 연구에는 하기와 같은 몇가지 문제점이 존재한다.

첫째로는 단백질 발현이 쉽지 않다는 점이다.

지금까지는 후각 수용체 단백질을 포함하는 GPCR을 생산하기 위하여 박테리아나 동물 세포를 포함한 여러 가지 세포에 발현하는 시도들이 있어 왔다. 그러나, GPCR은 막 단백질로 세포에 발현될 때 세포막에 심각한 손상을 가져 오는 것으로 알려져 있다 (Grisshammer, R. et al ., Quarterly reviews of biophysics, 28:315-422, 1995) (도 1).

또한, 저비용으로 짧은 시간에 배양할 수 있는 박테리아에 GPCR 유전자를 도입한 다음 배양하여 GPCR을 대량으로 생산하려는 시도들도 있었다. 그러나, 진핵세포와 원핵세포의 막 단백질 발현 메카니즘이 상이하여 외부 막 단백질 발현시 세포막에 손상을 가져오므로 박테리아의 세포막에 GPCR을 발현하는 것이 극히 어렵다는 문제점이 있다 (Willin, E. and Von Heijne, G., Protein Engineering, 8:693-698, 1995).

이러한 문제점을 해결하고자, 박테리아의 막이 아니라 내포체에 GPCR을 발현시키는 연구가 수행되어, 많은 양의 단백질을 얻을 수 있는 연구결과가 입증된 바있다. 1996년에 후각 수용체 단백질의 일부분을 유전자 수준에서 제거하거나 조작하여 단백질의 소수성을 저하시킴으로써 박테리아 세포막에 영향을 적게 주면서 박테리아 내포체에 과발현시킨 연구결과이다 (Kiefer. H, et al ., Biochemistry, 35: 16077-16084, 1996; Kiefer, H. et al ., Receptors Channels, 35:16077-16084, 1996).

두 번째는 발현된 단백질의 용해 문제이다.

세포막 또는 박테리아의 내포체에 발현된 GPCR은 정제를 하거나, 활용할 수 있는 형태로 변형시키기 위해 단백질의 용해가 필수적으로 선행되어야 한다. 그러나 GPCR은 그 구조가 복잡하고 소수성이 강하여 세포막 또는 내포체로부터 용해하기가 어렵다 (Sarramegna, V. et al ., Cellular and Molecular Life Sciences, 63:1149-1164, 2006). 따라서, GPCR의 용해에는 여러 가지 계면 활성제가 이용되는데, 무이온성, 양이온성, 음이온성 등의 여러 가지 다양한 계면활성제가 이용될 수 있다. 이때, GPCR 용해시 계면활성제의 종류와 양에 따라 용해능이 다르게 나타나므로, 알맞은 조건을 잡기가 매우 어렵다(Maire, M. et al ., Biochemica et Biophysica Acta, 1508:86-111, 2000).

세 번째는 정제의 문제이다.

GPCR이 잘 발현되어 성공적으로 용해가 이루어졌다 하더라도 GPCR은 다른 단백질에 비해 구조가 복잡하고 소수성이 강해 뭉침 현상이 쉽게 일어나므로 GPCR을 정제하는 것은 다른 단백질을 정제하는 것보다 어렵다.

기존의 GPCR의 정제는 기본적으로 이미 용해된 상태로 발현되는 다른 단백질의 정제와 비슷하게 정제 컬럼(column)이나 레진(resin)을 이용하는 방법으로 행해져 왔지만, 계면활성제의 종류, 조성, 또는 pH 등에 의해서 매우 민감하게 GPCR의 3차원구조가 달라져 정제가 매우 어려운 실정이다 (Sarramegna, V. et al ., Cellular and Molecular Life Sciences, 63:1149-1164, 2006). 특히 GPCR을 막에 발현시키는 경우에 비해 박테리아의 내포체에 과발현시키는 경우 발현양이 월등히 많은 점을 이용하여 내포체에 GPCR을 발현시켜 서로 뭉쳐 있는 타단백질로부터 GPCR을 용해시킨 후, 정제하는데 성공한 보고가 있지만, 여전히 GPCR 정제에 많은 시간과 비용이 소모되고 있다 (Kiefer, H. et al., Biochemistry, 35:16077-16084, 1996).

이러한 여러 가지 문제들로 인하여 대량으로 고순도의 GPCR을 얻기가 쉽지 않아, 의약품이나 후각 바이오센서 개발 등의 GPCR관련 연구에 어려움이 많은 실정이다.

이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, G 단백질 연결수용체(GPCR)인 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물의 분쇄물을 상기 후각 수용체 단백질을 용해시키지 않는 계면활성제로 1차 처리한 다음, 상기 용해되지 않은 후각 수용체 단백질만을 용해시키는 계면활성제로 2차 처리하여 용해된 형태로 후각 수용체 단백질만을 정제할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 계면활성제를 이용한 GPCR 단백질의 정제방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) GPCR이 과발현된 균체를 분리하여 분쇄한 다음, 상기 GPCR을 포함하는 분쇄물을 분리하는 단계; (b) 상기 GPCR을 포함하는 분쇄물을 제1 계면활성제로 처리하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 용해되지 않은 GPCR을 포함하는 분쇄물을 제2 계면활성제로 처리하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 용해된 GPCR을 수득하는 단계를 포함하는 단백질 정제방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 계면활성제만을 이용하여 후각 수용체 단백질 및 GPCR을 정제할 수 있고, 상기 정제된 후각 수용체 단백질 및 GPCR을 각각 후각센서 및 GPCR 의약품 연구개발에 활용할 수 있다.

본 발명은 단백질을 정제하는데 사용되었던 정제 컬럼(column) 또는 레 진(resin)을 사용하지 않고, 계면활성제만을 이용하여 GPCR을 용해시켜 정제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 일 관점에서, (a) GPCR이 과발현된 균체를 분리하여 분쇄한 다음, 상기 GPCR을 포함하는 분쇄물을 분리하는 단계; (b) 상기 GPCR을 포함하는 분쇄물을 제1 계면활성제로 처리하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 용해되지 않은 GPCR을 포함하는 분쇄물을 제2 계면활성제로 처리하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 용해된 GPCR을 수득하는 단계를 포함하는 단백질 정제방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 GPCR이 과발현된 균체는 GPCR을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 수득된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 단백질 발현에 생산성이 우수하고 경제적인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 상기 미생물은 대장균 및 효모일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 계면활성제는 상기 (a)단계의 GPCR을 포함하는 분쇄물 중에서 GPCR 이외의 단백질을 용해시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 계면활성제는 트라이톤X-100(Triton X-100), Chaps, Chapso, 디기토닌(digitonin), NP-40, Tween-20, 유레아(urea) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 제1 계면활성제는 GPCR을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물에 의해 과발현된 GPCR을 정제하는데 있어서, 상기 재조합 미생물의 분쇄물을 분리한 다음, 상기 분쇄물에서 상기 GPCR은 용해시키지 않고, 상기 GPCR을 제외한 다른 단백질을 용해시키는 기능을 수행한다. 이러한 제1 계면활성제의 기능은 GPCR이 GPCR 이외의 단백질에 비해 상기 제1 계면활성제에 대한 용해도가 낮아 용해가 쉽게 되지 않는 특성을 이용한 것이다.

구체적으로, 상기 제1 계면활성제는 상기 재조합 미생물의 분쇄물을 GPCR을 포함하는 불용성 부분(pellet fraction) 및 가용성 부분(soluble fraction)으로 분리하며, 제1 계면활성제에 의해 상기 두 부분으로 분리되는 것은 상기 두 부분의 제1 계면활성제에 대한 용해도 차이에 기인한다는 것은 당업자에게 있어 자명한 사항이라 할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 계면활성제는 상기 (b)단계에서 용해되지 않은 GPCR을 포함하는 분쇄물 중에서 GPCR만을 용해시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 계면활성제는 싸코실(N-lauroyl sarcosine), SDS(sodium dodecyl sulfate), 리소포스페티딜클로린(lysophosphatidylcholine) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.

즉, 상기 제2 계면활성제로 사용될 수 있는 것을 상기에 나열한 바와 같은 강한 이온성 계면활성제나 지질성 계면활성제라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 제2 계면활성제는 상기 제1 계면활성제에 의해 용해되지 않은 GPCR을 포함하는 분쇄물에서 상기 GPCR을 제외한 다른 단백질을 용해시키 지 않고 상기 GPCR은 용해시키는 기능을 수행한다. 이러한 제2 계면활성제의 기능은 GPCR이 GPCR 이외의 단백질에 비해 상기 제2 계면활성제에 대한 용해도가 높아 용해가 쉽게 되는 특성을 이용한 것이다

구체적으로, 상기 제2 계면활성제는 상기 제1 계면활성제에 의해 용해되지 않은 GPCR을 포함하는 분쇄물을 불용성 부분(pellet fraction) 및 GPCR을 포함하는 가용성 부분(soluble fraction)으로 분리하며, 제2 계면활성제에 의해 상기 두 부분으로 분리되는 것은 상기 두 부분의 제2 계면활성제에 대한 용해도 차이에 기인한다는 것은 당업자에게 있어 자명한 사항이라 할 것이다.

한편 본 발명에 따른 GPCR 단백질을 정제하는 방법을 이용하여 후각 수용체 단백질을 정제할 수 있다.

즉, GPCR을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 GPCR을 정제하는 방법과 동일한 방법으로 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 후각 수용체 단백질을 정제하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 방법으로 정제된 후각 수용체 단백질을 후각 바이오센서에 도입하는 것이 가능하다.

본 발명에 따라 정제된 후각 수용체 단백질은 감도와 선택도가 우수한 단백질 기반의 후각 바이오센서 개발을 위한 재료로 사용될 수 있다. 또한, 상기 후각 바이오센서는 유독 물질의 검출, 음식물의 품질관리, 질병 진단 등에 활용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 정제된 GPCR은 의약품 연구의 중요한 기반이 될 수 있 으며, GPCR에 선택적으로 결합하는 물질을 감지하는 단백질 기반의 바이오센서의 재료로도 활용 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 대장균에서 인간 후각 수용체 단백질인 OR2AG1 의 발현

대장균에서 인간 후각 수용체 단백질인 OR2AG1(서열번호 1)을 발현시키기 위하여, 숙주세포로서 대장균을 사용하고, 인간 후각 수용체 유전자 OR2AG1을 발현벡터에 삽입하였다. 이때, 사용된 발현벡터는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-Transferase, GST)를 코딩하고 있어 단백질 발현 여부의 확인 및 정제 과정에 이용할 수 있도록 하였다.

인간 후각 수용체 단백질 OR2AG1은 바나나향의 식품첨가제로 사용되는 아밀부티레이트(amylbutyrate)와 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 것이다 (Neuhaus, M. et al ., Chemical Senses, 31:445-452, 2006).

대장균으로 E. coli BL21(DE3)을 사용하였으며, 배지는 암피실린(ampicilin)을 선택표지(selection marker)로 첨가한 LB(Luria-Bertani)배지를 사용하였다.

대장균에서 단백질을 발현시키기 위해 pDEST15 (Invitrogen. Co., USA)를 발현벡터로 사용하였다. 여기서 도 2에 나타난 바와 같이, pDEST15 벡터는 T7 프로모터를 사용하며 발현되는 단백질의 N-말단에 GST가 함께 발현되도록 만들어진 벡터이다.

재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 37℃에서 배양하여 흡광도가 0.5가 되었을 때 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 최종농도 0.1mM로 처리하여 4시간 동안 발현을 유도하였다. 초음파분쇄(sonication)와 원심분리를 통해 세포의 분쇄물을 분리하였으며 GST와 함께 발현된 인간 후각 수용체 단백질 OR2AG1을 SDS-PAGE와 Western blotting으로 확인하였다. 이때, 실험군으로 OR2AG1 단백질이 발현된 대장균의 분쇄물과 대조군으로 IPTG를 첨가하지 않아 수용체 단백질의 발현을 유도하지 않은 대장균의 분쇄물을 비교하였다.

SDS-PAGE 수행 후 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하여 확인한 결과, 도 3의 (a)에 나타난 바와 같이, 실험군의 경우 약53KDa 크기의 과발현된 단일체 수용체 단백질이 관찰되었고 단일체 뿐 아니라 2중 결합체의 후각수용체 단백질이 관찰되었다. 반면 대조군의 경우 같은 위치에서 단백질이 관찰되지 않았다.

상기 도 3의 (a)의 SDS-PAGE를 GST 항체를 이용하여 GST와 함께 발현된 단백질을 Western blot으로 가시화하여 확인한 결과, 도 3의 (b)에 나타난 바와 같이, 실험군에서는 약 53KDa 크기의 단일체 수용체 단백질 밴드가 관찰되었고 2중결합체 이상의 다중결합체 형태의 후각 수용체 단백질 역시 관찰되었다. 반면 대조군의 경우 같은 위치에서 밴드가 관찰되지 않았다.

결국, 인간 후각 수용체 단백질이 대장균의 분쇄물로 많은 양이 과 발현 될 수 있음을 알 수 있었다. 후각 수용체를 포함하는 모든 GPCR은 대장균에서의 발현시 세포막을 공격하여 세포 성장을 방해하고 세포 사멸을 일으키기 때문에 대장균에서의 GPCR 발현이 매우 어려운 것으로 알려져 있으며 발현 여부나 발현 양, 그리고 발현되는 위치 등을 예측하기 불가능한 것으로 알려져 있다(Drew, D. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1610:3-10, 2006). 따라서 pDEST15 벡터가 인간 후각 수용체의 발현에 어떤 영향을 미치는지 알 수 없다. 그러나 pDEST15 벡터를 사용하면 후각 수용체 단백질 발현 시 대장균의 막에 대한 공격이 적어 세포 사멸이 적은 것으로 추측된다. 본 실시예와 같이 대장균에서 인간 후각 수용체 단백질이 온전한 형태로 과 발현된 보고는 현재까지 없다.

실시예 2: 대장균에서 발현된 OR2AG1 인간 후각 수용체 단백질의 용해

실시예 1에서 대장균의 분쇄물에 과발현된 OR2AG1 인간 후각 수용체 단백질에 대한 여러 가지 계면활성제의 용해능을 알아보았다. 분쇄물을 용해하는데 널리 사용되는 계면활성제인 찹소(chapso), 찹스(chaps), 트라이톤 X-100(Triton X-100), 디지토닌(digitonin), 싸코실(N-lauroyl sarcosine), 트윈 20(tween-20) 및 유레아(urea)의 8종류를 사용하였다.

OR2AG1 인간 후각 수용체 단백질이 과발현된 분쇄물에 상기 8종류의 계면활성제를 2%의 농도가 되게 각각 첨가하고, 4℃에 1시간 동안 처리한 후 원심분리로 계면활성제에 용해되지 않은 불용성 부분을 각각 분리하였다.

분리된 불용성 부분과 계면활성제에 의해 용해된 부분을 각각 SDS-PAGE와 Western blotting을 수행함으로서 단백질 용해 여부를 확인하였다.

SDS-PAGE에 의해 단백질 용해 여부를 확인한 결과, 도 4의 (a)에 나타난 바와 같이, 싸코실(N-lauroyl sarcosine)로 처리한 경우를 제외한 나머지 7가지 경우 에서 인간 후각 수용체 단백질이 용해되지 않은 채 불용성 부분에 남아있는 것으로 관찰되었다. 따라서 싸코실(N-lauroyl sarcosine)이 과발현된 인간 후각 수용체 단백질에 대한 용해능이 우수한 것으로 나타났다.

또한, 싸코실(N-lauroyl sarcosine)로 처리한 경우를 제외한 나머지 7가지 경우의 불용성 부분을 도 3의 (a)와 비교했을 때, GST와 함께 발현된 OR2AG1 밴드가 더 선명하게 관찰되었다. 이는 계면활성제들이 과발현된 OR2AG1을 용해하지는 못하지만 대장균이 원래 가지고 있는 다른 단백질을 용해시켜 불용성 부분에서 제거하여 상대적으로 GST와 함께 발현된 OR2AG1의 밴드가 선명해진 것이다.

한편, 싸코실(N-lauroyl sarcosine)을 제외한 계면활성제 중 트라이톤 X-100(Triton X-100)이 불용성 부분에 있는 본래 대장균이 가지고 있는 단백질에 대한 용해능이 가장 우수한 것으로 관찰되었다.

SDS-PAGE에 의해 단백질 용해 여부를 확인한 결과, 도 4의 (b)에 나타난 바와 같이, 도 4의 (a)와 동일하게 싸코실(N-lauroyl sarcosine)이 과발현된 인간 후각 수용체 단백질에 대한 용해능이 우수하고 나머지 7가지 계면활성제는 용해시키지 못하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 대장균에서 발현된 OR2AG1 인간 후각 수용체 단백질의 계면활성제를 이용한 정제

실시예 2에서 확인한 OR2AG1이 과발현된 불용성 부분을 2% 트라이톤 X-100(Triton X-100)과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 원심분리하여 불용성 부분과 용해된 부분을 분리하였다.

그 후, 상기 불용성 부분을 다시 0.5%의 싸코실(N-lauroyl sarcosine)로 상온에서 1시간 동안 원심분리하여 불용성 부분과 용해된 부분을 분리하였다.

그 결과, 도 5 에 나타난 바와 같이, 불용성 부분을 트라이톤 X-100(Triton X-100)으로 처리하고 원심분리 한 후에, 불용성 부분에서 GST와 함께 발현된 OR2AG1의 밴드가 관찰되었다. 이로부터 트라이톤 X-100(Triton X-100)이 OR2AG1을 용해시키지 못했다는 것을 알 수 있었다.

대장균이 원래 가지고 있던 다른 단백질이 용해되고 제거되어 비교적 깨끗한 단일 밴드가 관찰되었다. 이를 최대한 OR2AG1만 녹일 수 있도록 0.5%의 약한 싸코실(N-lauroyl sarcosine)로 처리하고 원심분리로 분리하면 순수한 OR2AG1만이 용해되어 분리될 수 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.

도 1은 후각 수용체 단백질이 박테리아의 세포막에 발현되어 있는 형태를 나타낸 것이다.

도 2는 발현벡터인 pDEST15에 코딩된 GST tag와 벡터에 삽입된 인간 후각 수용체 유전자 OR2AG1을 나타낸 것이다.

도 3은 인간 후각 수용체 유전자 OR2AG1이 삽입된 pDEST15 벡터에 의해 형질 전환된 박테리아에서 과발현된 OR2AG1을 나타낸 SDS-PAGE 결과(a) 및 Western blot 결과(b)를 나타낸 것이다.

도 4는 박테리아에서 과발현된 인간 후각 수용체 유전자 OR2AG1을 여러 가지 계면활성제를 이용하여 용해시킨 SDS-PAGE 결과(a) 및 Western blot 결과(b)를 나타낸 것이다.

도 5는 박테리아에서 과발현된 인간 후각 수용체 단백질 OR2AG1이 2가지의 계면활성제, 즉, 트라이톤 X-100(Triton X-100)와 싸코실(N-Lauroyl Sarcosine)을 이용하여 정제되었음을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Method for Purifying Guanin-Protein-Coupled Receptor Protein Using Surfactans <130> P08-B034 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 951 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagctct ggaacttcac cttgggaagt ggcttcattt tggtggggat tctgaatgac 60 agtgggtctc ctgaactgct ctgtgctaca attacaatcc tatacttgtt ggccctgatc 120 agcaatggcc tactgctcct ggctatcacc atggaagccc ggctccacat gcccatgtac 180 ctcctgcttg ggcagctctc tctcatggac ctcctgttca catctgttgt cactcccaag 240 gcccttgcgg actttctgcg cagagaaaac accatctcct ttggaggctg tgcccttcag 300 atgttcctgg cactgacaat gggtggtgct gaggacctcc tactggcctt catggcctat 360 gacaggtatg tggccatttg tcatcctctg acatacatga ccctcatgag ctcaagagcc 420 tgctggctca tggtggccac gtcctggatc ctggcatccc taagtgccct aatatatacc 480 gtgtatacca tgcactatcc cttctgcagg gcccaggaga tcaggcatct tctctgtgag 540 atcccacact tgctgaaggt ggcctgtgct gatacctcca gatatgagct catggtatat 600 gtgatgggtg tgaccttcct gattccctct cttgctgcta tactggcctc ctatacacaa 660 attctactca ctgtgctcca tatgccatca aatgagggga ggaagaaagc ccttgtcacc 720 tgctcttccc acctgactgt ggttgggatg ttctatggag ctgccacatt catgtatgtc 780 ttgcccagtt ccttccacag caccagacaa gacaacatca tctctgtttt ctacacaatt 840 gtcactccag ccctgaatcc actcatctac agcctgagga ataaggaggt catgcgggcc 900 ttgaggaggg tcctgggaaa atacatgctg ccagcacact ccacgctcta g 951

Claims (7)

1. 다음을 포함하는, 계면활성제를 이용한 후각 수용체 단백질의 정제방법:

   (a) 후각 수용체 단백질이 과발현된 균체를 분리하여 분쇄한 다음, 상기 후각 수용체 단백질을 포함하는 분쇄물을 분리하는 단계;

   (b) 상기 후각 수용체 단백질을 포함하는 분쇄물을 트라이톤X-100(Triton X-100), Chaps, Chapso, 디기토닌(digitonin), NP-40, Tween-20, 유레아(urea) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 제1 계면활성제로 처리하는 단계;

   (c) 상기 (b)단계에서 용해되지 않은 후각 수용체 단백질을 포함하는 분쇄물을 싸코실(N-lauroyl sarcosine), SDS (sodium dodecyl sulfate) 및 리소포스페티딜클로린(lysophosphatidylcholine)로 구성된 군에서 선택되는 제2 계면활성제로 처리하는 단계; 및

   (d) 상기 (c)단계에서 용해된 후각 수용체 단백질을 수득하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 후각 수용체 단백질이 과발현된 균체는 후각 수용체 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 제1 계면활성제는 상기 (a)단계의 후각 수용체 단백질을 포함하는 분쇄물 중에서 후각 수용체 단백질 이외의 단백질을 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 제2 계면활성제는 상기 (b)단계에서 용해되지 않은 후각 수용체 단백질을 포함하는 분쇄물 중에서 후각 수용체 단백질만을 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 삭제

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