ES2285632T3 - Formulacion acuosa que comprende tfpi y agentes solubilizadores. - Google Patents

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ES2285632T3 ES05076848T ES05076848T ES2285632T3 ES 2285632 T3 ES2285632 T3 ES 2285632T3 ES 05076848 T ES05076848 T ES 05076848T ES 05076848 T ES05076848 T ES 05076848T ES 2285632 T3 ES2285632 T3 ES 2285632T3
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Glenn J. Dorin
Bo H. Arve
Gregory L. Pattison
Robert F. Halenbeck
Kirk Johnson
Bao-Lu Chen
Rajsharan K. Rana
Maninder S. Hora
Hassan Madani
Mark E. Gustafson
Michael Tsang
Gary S. Bild
Gary V. Johnson
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GD Searle LLC
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
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    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors

Abstract

Una formulación acuosa con un pH de 5 a 10 que comprende (a) un inhibidor de la ruta del factor tisular y (b) L-arginina, en la que la concentración de arginina se encuentra entre 200 mM y 300 mM.

Description

Formulación acuosa que comprende TFPI y agentes solubilizadores.
Campo técnico de la invención
La invención se refiere a formulaciones acuosas útiles para el replegamiento, la solubilización, la formulación y la purificación de proteínas. Estas formulaciones son especialmente útiles para proteínas creadas por recombinación genética y producidas en células bacterianas, de levadura u otras células en una forma que presenta una estructura terciaria no nativa.
Antecedentes de la invención
Para comprender bien el proceso completo de la expresión génica es tan importante entender el proceso de plegamiento de la cadena peptídica para obtener una proteína biológicamente activa como entender la síntesis de la secuencia primaria. Las actividades biológicas de las proteínas no sólo dependen de sus secuencias de aminoácidos sino también de las conformaciones discretas de las proteínas en cuestión, y ligeras alteraciones en la integridad conformacional de una proteína pueden destruir su actividad. Tsou y col. (1988) Biochemistry 27:1809-1812.
En las condiciones apropiadas, el replegamiento in vitro de proteínas desnaturalizadas y purificadas para obtener las estructuras secundaria y terciaria nativas es un proceso espontáneo. Para evitar la formación de estructuras estables pero no deseadas es necesario usar las interacciones terciarias (que se forman tarde durante el plegamiento), con su elevado grado de poder selectivo, para seleccionar y estabilizar posteriormente aquellas estructuras locales tempranas que se encuentran en la ruta de plegamiento correcta. Así, la estabilidad finita pero muy baja de las estructuras locales podría ser el mecanismo de "corrección de pruebas" cinético del plegamiento de proteínas. El estado de plegamiento activado con la mayor energía es una forma distorsionada de la proteína nativa, y el paso más lento y limitante de la velocidad de desplegamiento y replegamiento parece próximo al estado nativo en lo que a la estructura ordenada se refiere. Además, el replegamiento de muchas proteínas no es completamente reversible in vitro, y con frecuencia se observan rendimientos de reactivación inferiores al 100%, que se confirman especialmente en los experimentos realizados a una elevada concentración de proteínas, y puede que la agregación competitiva de moléculas proteicas no plegadas o parcialmente replegadas sea la principal razón de la reducida reversibilidad, según describen Fischer y Schmid, (1990) Biochemistry 29:2205-2212.
En el caso de moléculas proteicas suficientemente grandes, la cadena polipeptídica naciente adquiere su estructura tridimensional nativa mediante el ensamblaje modular de microdominios. Se han ensayado variables, que incluyen la temperatura y codisolventes, tales como polioles, urea y cloruro de guanidinio, para determinar su papel en la estabilización y desestabilización de las conformaciones de proteínas. La acción de los codisolventes puede ser el resultado de una unión directa o de las alteraciones de las propiedades físicas del agua, según describen Jaenicke y col. (1991) Biochemistry 30 (13):3147-3161.
Las observaciones experimentales de cómo las proteínas no plegadas se repliegan en sus estructuras tridimensionales nativas contrastan con muchas teorías populares sobre los mecanismos de plegamiento de proteínas. En condiciones que permiten el replegamiento, las moléculas proteicas no plegadas rápidamente forman un equilibrio entre diferentes conformaciones antes de completar el replegamiento. El rápido equilibro previo al plegamiento favorece ciertas conformaciones compactas que presentan energías libres algo menores que las demás conformaciones no plegadas. El paso limitante de la velocidad se produce tarde en la ruta e implica una forma distorsionada de alta energía de la conformación nativa. Parece haber una sola transición a través de la cual se pliegan esencialmente todas las moléculas, según describen Creighton y col. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5082-5086.
Se han usado diversos procedimientos para el replegamiento de proteínas purificadas producidas por recombinación. Por ejemplo, se puede producir la proteasa codificada por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (HIV-I) en Escherichia coli, proporcionando cuerpos de inclusión que albergan la proteasa recombinante de HIV-I, como describen Hui y col. (1993) J. Prot. Chem. 12:323-327. La proteasa de HIV-I purificada se replegó en una enzima activa diluyendo una solución de la proteína en ácido acético al 50% con 25 volúmenes de tampón a pH 5,5. Se descubrió que se obtenía una mayor actividad específica de la proteasa si la proteína purificada se disolvía en ácido acético al 50% a aproximadamente 2 mg/ml y se diluía seguidamente con 25 volúmenes de acetato sódico 0,1 M frío, pH 5,5, que contenía 5% de etilenglicol y 10% de glicerol. La exclusión de glicerol y etilenglicol conducía a una pérdida gradual de la proteína por precipitación. Mediante este procedimiento se obtuvieron aproximadamente 85 mg de la proteasa de HIV-I correctamente plegada por litro de cultivo celular de E. coli y la enzima presentaba una elevada actividad específica.
Otro ejemplo del replegamiento de una proteína recombinante es el aislamiento y el replegamiento de H-ras a partir de cuerpos de inclusión de E. coli, como describen DeLoskey y col. (1994) Arch. Biochem. and Biophys. 311:72-78. En este estudio se variaron durante el replegamiento la concentración de proteínas, la temperatura y la presencia de 10% de glicerol. El rendimiento de H-ras plegada correctamente era máximo cuando la proteína se replegaba a concentraciones inferiores o iguales a 0,1 mg/ml y era independiente de la presencia de 10% de glicerol. El rendimiento era ligeramente mayor a 4ºC que a 25ºC.
Gustafson y col. (1994), Protein Expression and Purification 5:233-241, han descrito el replegamiento del inhibidor de la ruta del factor tisular (conocido también como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor de la ruta extrínseca (EPI) e inhibidor del factor tisular (EFI) y denominado en lo sucesivo "TFPI") producido en un sistema de expresión bacteriano. En este estudio, el alto nivel de expresión de TFPI en E. coli recombinante dio como resultado la acumulación de TFPI en cuerpos de inclusión. La proteína activa se obtuvo por solubilización de los cuerpos de inclusión en urea 8 M, y la purificación de la molécula de longitud completa se realizó mediante cromatografía de intercambio catiónico y renaturalización en urea 6 M. Después, la mezcla replegada se fraccionó para proporcionar un TFPI no glucosilado purificado que, según el ensayo del tiempo de coagulación de protrombina, poseía una actividad biológica in vitro comparable al TFPI purificado de células de mamífero,.
También se ha producido y purificado una forma no glucosilada de TFPI en células de Escherichia coli (E. coli) según se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.212.091, cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia. En la invención descrita en la patente de Estados Unidos nº 5.212.091 se sometieron los cuerpos de inclusión que contenían TFPI a una sulfitolisis para formar S-sulfonato de TFPI, S-sulfonato de TFPI purificado por cromatografía de intercambio aniónico, S-sulfonato de TFPI replegado por intercambio de disulfuro usando cisteína y TFPI activo purificado por cromatografía de intercambio catiónico. La forma de TFPI descrita en la patente de Estados Unidos nº 5.212.091 ha demostrado ser activa en la inhibición del factor Xa bovino y en la inhibición de la coagulación inducida por el factor tisular humano en plasma. En algunos ensayos, el TFPI producido en E. coli ha demostrado ser más activo que el TFPI nativo procedente de células de hepatoma SK. Sin embargo, el TFPI producido en células de E. coli se modifica de manera que aumenta la heterogeneidad de la proteína.
En la técnica existe la necesidad de replegar proteínas producidas por recombinación para aumentar la cantidad de TFPI plegado correctamente durante el proceso de replegamiento. Asimismo existe la necesidad de aumentar la solubilidad del TFPI. Actualmente, los rendimientos de TFPI producido por recombinación son inferiores a los deseados, y en la técnica existe la necesidad de producir TFPI plegado correctamente. Véase, por ejemplo, Gustafson y col. (1994) Protein Expression and Purification 5:233-241.
El TFPI inhibe la cascada de coagulación de al menos dos maneras: impidiendo la formación del complejo factor VIIa/factor tisular y uniéndose al sitio activo del factor Xa. La secuencia primaria de TFPI, deducida de la secuencia de ADNc, indica que la proteína contiene tres dominios inhibidores de enzimas de tipo Kunitz. El primero de estos dominios es requerido para la inhibición del complejo factor VIIa/factor tisular. El segundo dominio de tipo Kunitz es necesario para la inhibición del factor Xa. La función del tercer dominio de tipo Kunitz se desconoce. El TFPI no presenta ninguna actividad enzimática conocida, y se piensa que inhibe sus dianas en las proteasas de manera estequiométrica; concretamente, por unión de un dominio de tipo Kunitz del TFPI al sitio activo de una molécula de proteasa. Se cree que el extremo carboxilo terminal del TFPI desempeña un papel en su localización en la superficie celular a través de la unión a heparina y por interacción con un fosfolípido. El TFPI también se conoce como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor del factor tisular (TFI) e inhibidor de la ruta extrínseca (EPI).
El TFPI maduro presenta una longitud de 276 aminoácidos, con un extremo amino terminal cargado negativamente y un extremo carboxilo terminal cargado positivamente. El TFPI contiene 18 residuos de cisteína y forma 9 puentes disulfuro cuando está plegado correctamente. La secuencia primaria también contiene tres sitios consenso de N-glucosilación Asn-X-Ser/Thr, localizándose los restos de asparagina en las posiciones 145, 195 y 256. El componente de carbohidrato del TFPI maduro representa aproximadamente el 30% de la masa de la proteína. Sin embargo, los datos del mapeo proteolítico y los datos del espectro de masas sugieren que los restos carbohidrato son heterogéneos. También se ha descubierto que el TFPI está fosforilado, en diferentes medidas, en el resto de serina en la posición 2 de la proteína. La fosforilación no parece afectar a la función del TFPI.
El TFPI se ha aislado de plasma humano y de células de tejido humano en cultivo, que incluyen células HepG2, hepáticas de Chang y de hepatoma SK. Se ha expresado TFPI recombinante en células C127 de ratón, células de riñón de hámsters bebés, células de ovario de hámster chino y células de hepatoma humano SK. En modelos animales, el TFPI recombinante procedente de células C127 de ratón demostró inhibir la coagulación inducida por el factor tisular.
Se ha producido y aislado una forma no glucosilada de TFPI recombinante en células de Escherichia coli (E. coli), según se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.212.091. Esta forma de TFPI ha demostrado ser activa en la inhibición del factor Xa bovino y en la inhibición de la coagulación inducida por el factor tisular humano en plasma. Asimismo se han descrito, por ejemplo en Petersen y col., J. Biol. Chem. 18:13344-13351 (1993), procedimientos para la purificación de TFPI a partir del medio de cultivo de células de levadura.
Recientemente se ha identificado otra proteína con un alto grado de identidad estructural con el TFPI. Sprecher y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3353-3357 (1994). La estructura secundaria predicha de esta proteína, denominada TFPI-2, es prácticamente idéntica a la del TFPI, con 3 dominios de tipo Kunitz, 9 enlaces cisteína-cisteína, un extremo amino terminal ácido y una cola carboxilo terminal básica. Los tres dominios de tipo Kunitz de TFPI-2 muestran una identidad de la secuencia primaria de 43%, 35% y 53% con los dominios de tipo Kunitz 1, 2 y 3 de TFPI, respectivamente. El TFPI-2 recombinante inhibe fuertemente la actividad amidolítica del factor VIIa/factor tisular. Por el contrario, el TFPI-2 es un inhibidor débil de la actividad amidolítica del factor Xa.
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Se ha demostrado que el TFPI previene la mortalidad en un modelo de babuino de choque séptico letal por Escherichia coli (E. coli). Creasey y col., J. Clin. Invest. 91:2850-2860 (1993). La administración de TFPI a 6 mg/kg de peso corporal poco después de la infusión de una dosis letal de E. coli resultó en la supervivencia de los cinco animales tratados con TFPI, con una mejora significativa de la calidad de vida en comparación con el tiempo medio de supervivencia de 39,9 horas para los cinco animales control. La administración de TFPI también produjo una atenuación significativa de la respuesta de coagulación, de diversas medidas del daño celular y una reducción significativa en la patología observada normalmente en los órganos diana con sepsis por E. coli, que incluyen los riñones, las glándulas adrenales y los pulmones.
Debido a sus propiedades inhibidoras de la coagulación, el TFPI también puede usarse para prevenir la trombosis durante la cirugía microvascular. El documento U.S. 5.276.015, por ejemplo, describe el uso de TFPI en un procedimiento para reducir la trombogenicidad de anastomosis microvasculares en el que el TFPI se administra en el punto de anastomosis microvascular simultáneamente con la reconstrucción microvascular.
El TFPI es una proteína hidrófoba, y como tal presenta una solubilidad muy limitada en soluciones acuosas. Esta solubilidad limitada ha dificultado la preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables de TFPI, especialmente para indicaciones clínicas que se pueden beneficiar de la administración de dosis altas de TFPI. Por lo tanto, en la técnica existe la necesidad de composiciones farmacéuticamente aceptables que contengan concentraciones de TFPI que se puedan administrar a los pacientes en cantidades aceptables.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un análisis de SDS-PAGE teñido con Coomassie de las fracciones del pico de TFPI obtenidas por HIC en fenilsefarosa en el procedimiento de replegamiento.
La Figura 2 es un gráfico de la recuperación de TFPI nativo de la columna de HIC.
La Figura 3 es un gráfico de la recuperación de TFPI nativo de una segunda columna de HIC.
La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos de TFPI.
La Figura 5 muestra la solubilidad de TFPI en diferentes condiciones de pH. Se dializaron aproximadamente 10 mg/ml de TFPI en urea 2 M contra acetato, fosfato, citrato, glicina, L-glutamato y succinato 20 mM en NaCl 150 mM. La concentración del TFPI soluble remanente después de la diálisis se midió por absorbancia UV tras eliminar los precipitados por filtración a través de unidades de filtro de 0,22 mm.
La Figura 6 muestra la solubilidad de TFPI en función de la concentración de citrato y en presencia de fosfato sódico 10 mM a pH 7. La solubilidad de TFPI aumenta a medida que aumenta la concentración de citrato.
La Figura 7 muestra la solubilidad de TFPI en función de la concentración de NaCl. La solubilidad de TFPI aumenta a medida que aumenta la concentración de sal, lo que indica que la sal fomenta la solubilidad de TFPI.
La Figura 8 muestra el efecto del pH sobre la estabilidad del TFPI tratado previamente en fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80. Las muestras de estabilidad que contenían 150 mg/ml de TFPI se incubaron durante 20 días a 40ºC. La constante de velocidad cinética para el TFPI soluble remanente se analizó siguiendo la disminución del pico principal en los cromatogramas de intercambio catiónico.
La Figura 9 muestra el porcentaje de TFPI soluble remanente medido por HPLC de intercambio catiónico (A) y de TFPI activo remanente mediante el ensayo del tiempo de protrombina (B) en función de la concentración de fosfato. La formulación contiene 150 mg/ml de TFPI preparados en NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80 a pH 7 con concentraciones variables de fosfato.
La Figura 10 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida tanto por HPLC de intercambio catiónico (triángulos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (círculos) para 0,5 mg/ml de TFPI formulados en citrato sódico 10 mM, pH 6, y NaCl 150 mM.
La Figura 11 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida tanto por HPLC de intercambio catiónico (símbolos blancos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos negros) para 0,5 mg/ml de TFPI formulados en fosfato sódico 10 mM, pH 6, y NaCl 150 mM (triángulos) o NaCl 500 mM (círculos).
La Figura 12 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC medida tanto por HPLC de intercambio catiónico (símbolos blancos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos negros) para 0,5 mg/ml de TFPI formulados en acetato sódico 10 mM, pH 5,5, que contenía NaCl 150 mM (triángulos) u 8% (p/v) de sacarosa (cuadrados) o 4,5% de manitol (círculos).
La Figura 13 muestra dos geles de SDS no reductores para muestras de formulación de TFPI a pH 4-9 almacenadas durante 0 y 20 días a 40ºC.
La Figura 14 muestra el curso temporal de un replegamiento de TFPIhr facilitado por polifosfato, seguido mediante SDS-PAGE.
La Figura 15 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna S-Sepharose HP usada para purificar el TFPIhr a partir de un replegamiento facilitado por polifosfato.
La Figura 16 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna S-Sepharose HP usada para purificar el TFPIhr a partir de un replegamiento facilitado por polifosfato.
La Figura 17 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna Q-Sepharose HP usada para purificar el TFPIhr a partir de un material combinado de S-Sepharose preparado a partir de un replegamiento facilitado por polifosfato.
La Figura 18 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna Q-Sepharose HP usada para purificar el TFPIhr a partir de un material combinado de S-Sepharose preparado a partir de un replegamiento facilitado por polifosfato.
La Figura 19 muestra el curso temporal de un replegamiento de TFPIhr facilitado por polietilenimina, seguido mediante SDS-PAGE.
La Figura 20 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna S-Sepharose HP usada para purificar el TFPIhr a partir de un replegamiento de polietilenimina.
La Figura 21 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna S-Sepharose HP usada para purificar el TFPIhr a partir de un replegamiento facilitado por polietilenimina.
La Figura 22 muestra la absorbancia a 280 nm durante la carga y la elución de la columna Q-Sepharose usada para purificar el TFPIhr a partir de un material combinado de S-Sepharose preparado a partir de un replegamiento facilitado por polietilenimina.
La Figura 23 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones recogidas durante la elución de la columna Q-Sepharose usada para purificar el TFPIhr a partir de un material combinado de S-Sepharose preparado a partir de un replegamiento facilitado por polietilenimina.
La Figura 24 muestra el análisis de HPLC de intercambio catiónico de un replegamiento de TFPIhr facilitado por 0,4% de polifosfato en ausencia de urea.
La Figura 25 muestra los resultados del análisis de HPLC de intercambio catiónico realizado para evaluar el efecto de diferentes niveles de cisteína en un replegamiento de TFPIhr en Tris 50 mM, 0,4% de polifosfato y en ausencia de urea.
La Figura 26 muestra el efecto de la longitud de cadena del polifosfato en el curso del replegamiento de cuerpos de inclusión de TFPIhr facilitado por polifosfato, seguido por HPLC de intercambio catiónico.
La Figura 27 muestra el efecto de la concentración de polifosfato (vidrio H) en el replegamiento de TFPIhr procedente de cuerpos de inclusión, seguido mediante HPLC de intercambio catiónico.
La Figura 28 muestra el análisis de HPLC de intercambio catiónico del replegamiento de TFPIhr purificado y reducido facilitado por polietilenimina y polifosfato.
Resumen de la invención
Un objeto de la invención es proporcionar formulaciones acuosas de TFPI.
Se ha descubierto ahora que la solubilidad del TFPI depende fuertemente del pH y que, sorprendentemente, los polianiones, tales como citrato, isocitrato y sulfato, ejercen fuertes efectos solubilizadores sobre TFPI. Este hallazgo es sorprendente en vista de la naturaleza hidrófoba del TFPI y el carácter hidrófilo de estos contraiones. Por lo tanto, el citrato, isocitrato, sulfato, así como otros solubilizadores descritos más adelante en la presente memoria, se pueden usar para producir composiciones farmacéuticamente aceptables que presentan concentraciones de TFPI suficientes para la administración a pacientes. Asimismo se ha demostrado que otras moléculas orgánicas pueden actuar de solubilizadores secundarios. Estos solubilizadores secundarios incluyen PEG, sacarosa, manitol y
sorbitol.
En una realización, la invención se refiere a composiciones farmacéuticamente aceptables en las que el TFPI está presente a una concentración superior a 0,2 mg/ml de agentes solubilizadores. Los agentes solubilizadores pueden ser ión acetato, cloruro sódico, ión citrato, ión isocitrato, glicina, glutamato, ión succinato, histidina, imidazol y dodecilsulfato sódico (SDS), así como polímeros cargados. En algunas composiciones, el TFPI puede estar presente a concentraciones superiores a 1 mg/ml y superiores a 10 mg/ml. La composición también puede contener uno o más solubilizadores secundarios. El solubilizador o los solubilizadores secundarios pueden ser polietilenglicol (PEG), sacarosa, manitol o sorbitol. Finalmente, la composición también puede contener fosfato sódico a una concentración superior a 20 mM.
Aunque la solubilidad del TFPI es bastante baja entre pH 5 y 10, se ha descubierto que la L-arginina puede aumentar 100 veces la solubilidad. La solubilidad es muy dependiente de la concentración de arginina, pues 300 mM es aproximadamente 30 veces más eficaz que 200 mM. La urea también es bastante eficaz para solubilizar el TFPI.
Descripción detallada de la invención
Los polímeros poliiónicos, tales como polietilenimina y polifosfato, son capaces de modificar las interacciones iónicas en el interior de las proteínas. El enmascaramiento de ciertas zonas de elevada densidad de carga en el interior de las proteínas usando poliiones puede producir numerosos efectos. La solubilidad de aquellas proteínas cuya solubilidad está reducida debido a la neutralización intra- y/o intermolecular de zonas de cargas opuestas se puede mejorar enmascarando una de las regiones cargadas con policationes o polianiones. Asimismo se pueden modular las barreras que determinan la flexibilidad conformacional y las fuerzas atrayentes o repulsivas específicas que interfieren en el proceso de replegamiento. Las proteínas que requieren desnaturalizantes fuertes, tales como urea o hidrocloruro de guanidina, para solubilizarse y mantener la solubilidad durante las operaciones de purificación se pueden solubilizar y procesar eficazmente usando polianiones.
Muchas proteínas que carecen de una región clara en la que se localizan las cargas en la secuencia primaria pueden mostrar aún así zonas de localización de cargas debido a su estructura secundaria. De este modo, muchas proteínas pueden presentar unas características de solubilidad, replegamiento y purificación modificadas por medio de la interacción con moldes poliméricos cargados. La naturaleza de la modificación dependerá de la estructura específica de la proteína, de la longitud de cadena, de la carga y de la densidad de carga del polímero iónico.
Los autores han caracterizado el replegamiento de TFPI puro en un tampón de replegamiento basado en guanidina o en urea, y los resultados indican que la eficacia y la cinética del replegamiento se pueden mejorar significativamente mediante la adición de polímeros cargados, que incluyen heparina, sulfato de dextrano, polietilenimina (PEI) y polifosfatos. Estos polímeros aumentan la solubilidad de TFPI y potencian el replegamiento a través de interacciones iónicas con el extremo N-terminal o bien con el extremo C-terminal. Además de los aditivos poliméricos, el replegamiento de TFPI puro requiere un tampón redox cisteína/cistina en el que se pueda completar la reacción de replegamiento en un plazo de 48 horas. Los rendimientos del replegamiento dependen fuertemente del pH, de la concentración redox y de los aditivos poliméricos; no obstante, en condiciones de replegamiento óptimas se pueden alcanzar unas eficacias de replegamiento de hasta 60% para el TFPI puro.
Los autores de esta invención han descubierto que la adición de glucosaminoglucanos o de polisacáridos sulfatados, tales como, por ejemplo, heparina y sulfato de dextrano, a una solución que contiene una proteína desnaturalizada antes del replegamiento aumenta la cantidad de proteína activa y correctamente plegada cuando la proteína es capaz de unirse al glucosaminoglucano o al polisacárido sulfatado y se somete a condiciones de renaturalización.
Disolución
La tecnología del ADN recombinante ha permitido la expresión a gran escala de muchas proteínas que normalmente no se podían aislar de fuentes naturales en cantidades apreciables. En E. coli y en muchos otros sistemas de expresión, la proteína con frecuencia se expresa en un estado inactivo y desnaturalizado en el que la secuencia primaria de aminoácidos es correcta pero las estructuras secundaria y terciaria y los enlaces disulfuro entre cisteínas no están presentes. La proteína desnaturalizada presente en un cuerpo de inclusión puede presentar una conformación en la que los restos cargados de diferentes partes del esqueleto de aminoácidos que normalmente no están en contacto pueden interactuar y formar fuertes enlaces iónicos entre restos de aminoácidos de carga positiva y de carga negativa. La formación de estos enlaces iónicos puede limitar la hidratación que debe producirse a efectos de la disolución del cuerpo de inclusión. La proteína presente en un cuerpo de inclusión también puede estar complejada con otros componentes celulares, tales como componentes de la membrana y ácido nucleico, lo que también puede limitar el acceso del disolvente (agua) a los restos cargados y normalmente hidratados. Asimismo se observa en el estado no plegado que los restos hidrófobos que normalmente se encuentran encerrados en el interior de una proteína están más expuestos al entorno acuoso polar. Estos hechos pueden colaborar para impedir la disolución de los cuerpos de inclusión en disolventes
distintos de los fuertes agentes caotrópicos, tales como urea o guanidina, o de detergentes, tales como SDS.
Los polímeros cargados, preferentemente en solución acuosa, pueden interferir en y romper las interacciones iónicas no deseadas que se producen dentro de una cadena polipeptídica como la que se encuentra en un cuerpo de inclusión o en otro entorno. Los polímeros cargados pueden contribuir a la rotura de las interacciones iónicas no deseadas y facilitar la solvatación de restos iónicos y polares, fomentando la disolución sin necesidad de usar agentes caotrópicos fuertes o detergentes. La carga, la densidad de carga y el peso molecular (longitud de cadena) del polímero cargado pueden variar en función de la proteína específica. Los polímeros adecuados incluyen: polisacáridos sulfatados, heparinas, sulfato de dextranos, agaropectinas, polisacáridos de ácidos carboxílicos, ácidos algínicos, carboximetilcelulosas, compuestos poliinorgánicos, polifosfatos, poliaminoácidos, poliaspartatos, poliglutamatos, polihistidinas, compuestos poliorgánicos, polisacáridos, DEAE dextranos, aminas poliorgánicas, polietileniminas, polietileniminocelulosas, poliaminas, poliaminoácidos, polilisinas y poliargininas.
Las proteínas con un pI superior a 7 se pueden beneficiar más de interacciones con polímeros de carga negativa puesto que estas proteínas presentarán una carga positiva a pH 7. Las proteínas con pIs inferiores a 7 pueden interactuar más intensamente con polímeros de carga positiva a pH neutro. La alteración del pH de la solución modificará la carga total y la distribución de cargas en cualquier proteína y constituye otra variable a evaluar.
Replegamiento
La tecnología del ADN recombinante ha permitido la expresión a gran escala de muchas proteínas que normalmente no se podían aislar de fuentes naturales en cantidades apreciables. En E. coli y en otros muchos sistemas de expresión, la proteína con frecuencia se expresa en un estado inactivo y desnaturalizado en el que la secuencia primaria de aminoácidos es correcta pero las estructuras secundaria y terciaria y los enlaces disulfuro entre cisteínas no están presentes. La proteína desnaturalizada debe replegarse en la conformación activa correcta, lo que a menudo requiere superar importantes barreras energéticas impuestas por la atracción y repulsión iónicas, por restricciones en la rotación de los enlaces y por otros tipos de tensiones inducidas por la conformación. La atracción iónica específica entre cargas opuestas y/o la repulsión entre cargas iguales puede limitar de manera importante las rutas de replegamiento disponibles para la proteína desnaturalizada y reducir la eficacia del proceso de replegamiento.
Algunas proteínas presentan zonas de carga específicas cuyas interacciones pueden limitar la flexibilidad conformacional o fomentar la agregación. Muchas proteínas carentes de una región clara en la que se localizan las cargas en la secuencia primaria puede mostrar aún así zonas de localización de cargas debido a su estructura secundaria que se encuentra en intermedios de replegamiento, plegamientos incorrectos y proteínas plegadas indebidamente. Las proteínas especialmente adecuadas de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, TFPI, mutantes de TFPI, TFPI-2, activador tisular de plasminógeno, BST, PST. Aunque se cree que estas formulaciones son adecuadas para uso con proteínas en general, las más apropiadas son aquéllas que están plegadas inadecuadamente, agregadas, oligomerizadas o inactivas. Estas serán sobre todo proteínas que presentan al menos un dominio altamente cargado, y posiblemente más, que pueden interactuar. En el caso del TFPI, así como de otras proteínas, interactúan entre sí dos dominios de carga opuesta para impedir el plegamiento correcto y causar la oligomerización y agregación. Asimismo es más probable que se beneficien de los presentes procedimientos las proteínas que poseen muchos enlaces disulfuro. La proteína preferentemente presenta al menos 2 de éstos, y con especial preferencia la proteína presenta al menos 4 ó 6 enlaces disulfuro.
Los polímeros cargados se pueden usar para modificar la carga y la densidad de carga y para reducir o eliminar las limitaciones conformacionales mediadas por iones que puedan derivar en el estado no plegado. La yuxtaposición de grupos cargados que normalmente no se encuentran próximos puede dar como resultado rutas de replegamiento sin salida, de las cuales nunca se podrá recuperar el proceso de replegamiento.
La introducción de cargas positivas o negativas adicionales a través del complejamiento con polímeros cargados puede permitir que el replegamiento se produzca con mayor facilidad por varias razones: en primer lugar, diferentes tipos de distribución de cargas pueden facilitar el proceso de replegamiento; en segundo lugar, la adición del polímero cargado puede potenciar la solubilidad de la proteína no plegada, reduciendo o eliminando la necesidad de usar agentes caotrópicos que ejercen un efecto negativo sobre la conformación de las proteínas.
El polímero cargado que muestra las características preferidas puede variar debido a la estructura, con frecuencia única, asociada con la mayoría de las proteínas. La evaluación del pH isoeléctrico (pI) de la proteína puede servir de punto de partida. A pH neutro, una proteína con un pI inferior a 7 poseerá una carga neta negativa y, por lo tanto, se unirá con mayor probabilidad a un polímero de carga positiva. La proteína con un pI superior a 7 poseerá una carga neta positiva a pH neutro y presentará una mayor tendencia a unirse a un polímero de carga negativa. Sin embargo, está comprobado que las cargas se distribuyen irregularmente por una proteína y que puede producirse una significativa localización de cargas. La posibilidad de que existan concentraciones localizadas de cargas reduce la capacidad de predecir el tipo de polímero cargado que puede ser el más eficaz para cada aplicación. En teoría existe para cada proteína con una distribución de cargas que interactúan y unos requerimientos conformacionales específicos un polímero cargado de composición adecuada en cuanto al peso molecular, la carga y la distribución de cargas que maximiza la eficacia del replegamiento. Asimismo se deberían evaluar otras variables, tales como el pH y la fuerza iónica del disolvente. El cribado inicial debería incluir polietilenimina, DEAE dextrano, sulfato de dextrano y polifosfato de diferentes pesos moleculares y a varias concentraciones. El trabajo con TFPIhr ha demostrado la influencia significativa que pueden tener la longitud de cadena y la concentración de polifosfato en el curso de la reacción de replegamiento de TFPI. Una longitud de cadena relativamente corta (n = 5) produce altos niveles de agregados. La longitud de cadena del polifosfato óptima para replegar el TFPIhr era de aproximadamente 25 unidades repetitivas. Los polifosfatos con una longitud de cadena mayor (n = 75) también daban lugar a más agregados y a menos monómeros plegados adecuadamente.
Formulación
Las proteínas están formadas por cadenas de aminoácidos cuya composición y secuencia exactas constituyen uno de los determinantes de la estructura primaria de la proteína. El determinante de la estructura secundaria de la proteína es el resultado de la orientación conformacional que proporcionan los enlaces entre aminoácidos individuales a la conformación de la proteína. En tercer lugar, la secuencia de aminoácidos específica dirige la formación de estructuras terciarias, tales como hojas \beta y hélices \alpha. La naturaleza tridimensional de la conformación de la proteína a menudo aproxima restos de aminoácidos que normalmente no se encuentran cerca en la secuencia directa de la cadena polipeptídica. La forma funcional de una proteína es generalmente una conformación modestamente estable que se mantiene gracias a una combinación de enlaces disulfuro entre cisteínas, enlaces iónicos e interacciones hidrófobas y de Van der Waals.
En general, la solubilidad de la proteína se puede relacionar con el número de aminoácidos cargados y, en menor medida, con el de aminoácidos polares que componen la proteína. Estos grupos cargados y polares se solvatan con moléculas de agua en la solución acuosa, y esta interacción mantiene la cadena polipeptídica en solución. Los polipéptidos con un número insuficiente de aminoácidos cargados positiva o negativamente pueden presentar una solubilidad acuosa limitada. En algunos casos, los grupos cargados positiva y negativamente presentes en una proteína pueden interactuar entre sí desplazando el agua de solvatación y reduciendo la solubilidad en agua. Muchas proteínas que carecen de una clara región en la que se localizan las cargas en la secuencia primaria pueden mostrar aún así zonas de localización de cargas debido a su estructura secundaria. De este modo, muchas proteínas pueden presentar una solubilidad modificada por interacción con moldes poliméricos cargados. La naturaleza de la modificación dependerá de la estructura específica de la proteína, de la longitud de cadena, de la carga y de la densidad de carga del polímero iónico.
El complejamiento con polímeros cargados con una densidad de carga relativamente alta representa una estrategia para aumentar la densidad de carga de cualquier proteína. Una proteína con un número pequeño de restos cargados positivamente (lisina o arginina) se puede complejar con un polímero de carga negativa, tal como polifosfato. Algunos de los grupos cargados negativamente del polímero interactuarán con los grupos cargados positivamente presentes en la proteína. El resto de los grupos cargados del polímero estarán libres para interactuar con el disolvente, en la mayoría de los casos agua, y aumentar eficazmente la densidad de carga y la solvatación de la proteína. De forma alternativa, se puede usar un polímero de carga positiva, tal como polietilenimina, para el complejamiento con los restos cargados negativamente de la proteína. En algunos casos, ambos tipos de polímeros cargados pueden funcionar con la misma eficacia, y en otros casos puede ser un tipo de carga más eficaz que el otro. La eficacia de un polímero cargado concreto dependerá de la composición de aminoácidos de la proteína, de la distribución de aminoácidos en la proteína, de la conformación de la proteína, de la densidad de carga del polímero cargado, de la longitud de cadena del polímero cargado, del pH de la solución y de otras variables. No obstante, es probable que para una proteína dada se encuentre un polímero de carga complementaria que se una a la proteína y aumente esencialmente la densidad de carga de la proteína y que mejore las características de solubilidad de aquella proteína en un medio
acuoso.
Definiciones
El término "procesamiento" como se usa en la presente memoria se refiere a las etapas implicadas en la purificación y preparación de cantidades farmacéuticamente aceptables de proteínas. El procesamiento puede incluir una o más etapas, tales como solubilización, replegamiento, separación cromatográfica, precipitación y formulación.
Las expresiones "polímero cargado" y "molde polimérico cargado" se refieren a cualquier compuesto formado por un esqueleto de unidades estructurales repetitivas unidas de forma lineal o no lineal, conteniendo algunas de estas unidades repetitivas grupos químicos cargados positiva o negativamente. Las unidades estructurales repetitivas pueden ser de naturaleza polisacarídica, hidrocarbonada, orgánica o inorgánica. Las unidades repetitivas pueden encontrarse entre n = 2 y n = varios millones.
La expresión "polímero de carga positiva" como se usa en la presente memoria se refiere a polímeros que contienen grupos químicos que llevan, pueden llevar o pueden modificarse para llevar una carga positiva, tal como amonio, alquilamonio, dialquilamonio, trialquilamonio y amonio cuaternario.
La expresión "polímero de carga negativa" como se usa en la presente memoria se refiere a polímeros que contienen grupos químicos que llevan, pueden llevar o pueden modificarse para llevar una carga negativa, tal como derivados del ácido fosfórico y de otros ácidos que contienen fósforo, ácido sulfúrico y otros ácidos que contienen azufre, nitrato y otros ácidos que contienen nitrógeno, ácido fórmico y otros ácidos carboxílicos.
El término "polietilenimina" como se usa en la presente memoria se refiere a polímeros formados por unidades repetitivas de etilenimina (H_{3}N^{+}-(CH_{2}-CH_{2}-NH_{2}^{+})_{X}-CH_{2}-CH_{2}-NH_{3}^{+}). El peso molecular puede oscilar entre 5.000 y más de 50.000.
El término "polifosfato" como se usa en la presente memoria se refiere a polímeros formados por unidades repetitivas de ortofosfato unidas por un enlace fosfoanhídrido. El número de unidades repetitivas puede encontrarse entre 2 (pirofosfato) y varios miles. El polifosfato con frecuencia se denomina hexametafosfato sódico (SHMP). Otros nombres comunes incluyen sal de Graham, Calgon, vidrio fosfato, tetrametafosfato sódico y vidrio H.
El término "replegar" como se usa en la presente memoria se refiere a la renaturalización de proteínas. Típicamente, el objetivo del replegamiento es producir una proteína que presente un nivel de actividad superior al que tendría la proteína si se produjera sin etapa de replegamiento. Una molécula proteica plegada es más estable en la conformación que posee la menor energía libre. La mayoría de las proteínas hidrosolubles se pliegan de manera que la mayoría de los aminoácidos hidrófobos se encuentren en la parte interior de la molécula, apartada del agua. Los enlaces débiles que mantienen unida una proteína se pueden romper mediante numerosos tratamientos que causan el desplegamiento, es decir, la desnaturalización, del polipéptido. Una proteína plegada es el producto de varios tipos de interacciones entre los aminoácidos mismos y su entorno, que incluyen enlaces iónicos, interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, enlaces disulfuro y enlaces covalentes.
El término "desnaturalizar" como se usa en la presente memoria se refiere al tratamiento de una proteína o polipéptido por medio del cual se produce la rotura de los enlaces iónicos y covalentes y de las interacciones de Van der Waals que existen en el estado nativo o renaturalizado de la molécula. La desnaturalización de una proteína se puede realizar, por ejemplo, por tratamiento con urea 8 M, agentes reductores tales como mercaptoetanol, calor, pH, temperatura y otros agentes químicos. Los reactivos tales como urea 8 M rompen tanto los enlaces de hidrógeno como los hidrófobos, y si además se añade mercaptoetanol, los puentes disulfuro (S-S) formados entre cisteínas se reducen a dos grupos -S-H. El replegamiento de proteínas que contienen enlaces disulfuro en su estado nativo o replegado también puede implicar la oxidación de los grupos -S-H presentes en los restos de cisteína para que la proteína vuelva a formar los enlaces disulfuro.
El término "glucosaminoglucano" como se usa en la presente memoria se refiere a polisacáridos que contienen restos alternantes de ácido urónico y hexosamina y que normalmente contienen sulfato. La unión de una proteína a un glucosaminoglucano en una reacción como la que se describe en la presente memoria se realiza a través de interacciones iónicas.
La expresión "sulfato de dextrano" como se usa en la presente memoria se refiere a un derivado polianiónico de dextrano con un peso molecular comprendido entre 8.000 y 500.000 daltons. Los dextranos son polímeros de glucosa en los que los restos de glucosa están unidos por enlaces \alpha-1,6.
El término "heparina" como se usa en la presente memoria se refiere a 2 glucosaminoglucanos o heparinoides basados en un disacárido repetitivo (-4DGlcA(p)\beta1, 4GlcNAc\alpha1)_{n} que se someten a una extensa modificación después del ensamblaje. La heparina se almacena junto con histamina en los gránulos de células cebadas y, por lo tanto, se encuentra en la mayoría de los tejidos conectivos. En general, las heparinas presentan cadenas más cortas que la heparina.
El término "HIC" como se usa en la presente memoria se refiere a la cromatografía de interacción hidrófoba que usa una interacción hidrófoba entre la columna y la molécula de interés para separar los polisacáridos sulfatados y otros contaminantes del producto replegado A.
Los polímeros de carga negativa incluyen polisacáridos sulfatados, tales como heparinas, sulfato de dextranos y agaropectinas, así como polisacáridos de ácidos carboxílicos, tales como ácidos asalgínicos y carboximetilcelulosas. Asimismo se incluyen compuestos poliorgánicos, tales como fosfatos. También se pueden usar poliaminoácidos, tales como poliaspartato, poliglutamato y polihistidina.
Los polímeros de carga positiva incluyen polisacáridos tales como DEAE dextrano, aminas poliorgánicas tales como polietileniminas, polietileniminocelulosas y poliaminas, así como los poliaminoácidos polilisina y poliarginina. Se pueden usar combinaciones de polímeros de ambas polaridades de carga. Además se pueden usar copolímeros anfóteros.
Como se usa en la presente memoria, "TFPI" se refiere al inhibidor de la ruta del factor tisular maduro. Como se señaló anteriormente, el TFPI también se conoce en la técnica como inhibidor de la coagulación asociada a lipoproteínas (LACI), inhibidor de la ruta extrínseca (EPI) e inhibidor del factor tisular (TFI). Esta definición abarca los mutantes de TFPI que conservan la actividad biológica del TFPI. La definición abarca igualmente el TFPI que se ha modificado ligeramente para la producción en células bacterianas. Por ejemplo, en Escherichia coli se ha producido un análogo de TFPI que presenta un resto de alanina en el extremo amino terminal del polipéptido de TFPI. Véase el documento U.S. 5.212.091.
Como se usa en la presente memoria, "composición farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición que no anula ni reduce la actividad biológica del TFPI formulado y que no presenta ningún efecto biológico adverso cuando el TFPI formulado se administra a un paciente.
Como se usa en la presente memoria, "paciente" abarca pacientes humanos y veterinarios.
Como se usa en la presente memoria, el término "solubilizador" se refiere a sales, iones, carbohidratos, aminoácidos y otras moléculas orgánicas que, cuando están presentes en solución, aumentan la solubilidad del TFPI a por encima de 0,2 mg/ml. Los solubilizadores también pueden incrementar las concentraciones de TFPI a más de 1 mg/ml y a más de 10 mg/ml. Debe señalarse que los solubilizadores pueden actuar como agentes estabilizadores. Los agentes estabilizadores conservan la actividad unitaria del TFPI durante el almacenamiento y pueden actuar previniendo la formación de agregados o previniendo la degradación de la molécula de TFPI (por ejemplo mediante reacciones catalizadas por ácido).
Como se usa en la presente memoria, la expresión "solubilizadores secundarios" se refiere a sales orgánicas, iones, carbohidratos, aminoácidos y otras moléculas orgánicas que, cuando están presentes en solución junto con un solubilizador, aumentan adicionalmente la solubilidad del TFPI. Los solubilizadores secundarios también pueden tener otros efectos. Por ejemplo, los solubilizadores secundarios pueden ser útiles para ajustar la tonicidad (por ejemplo la isotonicidad).
La secuencia de aminoácidos del TFPI se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.106.833, que se incorpora en la presente memoria por referencia, y en la Figura 4. Los mutantes de TFPI y TFPI-2 se describen en el documento U.S. con el número de serie 08/286.530, que se incorpora en la presente memoria por referencia. Según se describe en el documento U.S. con el número de serie 08/286.530, se pueden preparar mutantes de TFPI y TFPI-2 con una o múltiples mutaciones puntuales y moléculas quiméricas de TFPI y TFPI-2. Por ejemplo, el resto de lisina en el sitio P1 del primer dominio de tipo Kunitz del TFPI se puede sustituir por arginina. Los mutantes que contienen entre una y cinco sustituciones de aminoácidos se pueden preparar mediante una mutagénesis apropiada de la secuencia del vehículo de clonación recombinante que codifica TFPI o TFPI-2. Las técnicas de mutagénesis incluyen sin limitación la mutagénesis de sitio específico. La mutagénesis de sitio específico se puede realizar usando cualquier número de procedimientos conocidos en la técnica. Estas técnicas se describen en Smith (1985) Annual Review of Genetics, 19:423, y en METHODS IN ENZYMOLOGY, 154, parte E (eds.) Wu y Grossman (1987), capítulos 17, 18, 19 y 20, se describen modificaciones de algunas de las técnicas. Un procedimiento preferido para cuando se usa la mutagénesis de sitio específico es una modificación del procedimiento de mutagénesis dirigida Gapped Duplex. El procedimiento general lo describen Kramer y col. en el capítulo 17 de Methods in Enzymology, anteriormente. Otra técnica para generar mutaciones puntuales en una secuencia de ácido nucleico es la PCR solapante. El procedimiento para el uso de la PCR solapante para generar mutaciones puntuales lo describe Higuchi en el capítulo 22 de PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, (eds.) Innis, Gelfand, Sninsky y White
(Academic Press, 1990).
De forma alternativa, se pueden producir proteínas híbridas que contienen el primer dominio de tipo Kunitz de TFPI-2 y el segundo y tercer dominios de tipo Kunitz de TFPI. El experto en la técnica de clonación de ADN en posesión del ADN que codifica TFPI y TFPI-2 será capaz de preparar moléculas de ADN adecuadas para la producción de una proteína quimérica de este tipo usando procedimientos de clonación conocidos. De forma alternativa, se pueden preparar moléculas de ADN sintéticas que codifican todo o parte de cada dominio de tipo Kunitz y secuencias peptídicas que unen los dominios de tipo Kunitz. Como otra alternativa más, también se puede usar la técnica de la PCR solapante para preparar ADN que codifica moléculas quiméricas que contienen secuencias de TFPI y TFPI-2.
El TFPI se puede preparar con sistemas de expresión en levaduras, como se describe en el documento U.S. con el número de serie 08/286.530, que se incorpora en la presente memoria por referencia. Asimismo se han descrito procedimientos para la purificación de TFPI a partir del medio de cultivo de células de levadura, por ejemplo en Petersen y col., J. Biol. Chem. 18:13344-13351 (1993). En estos casos, el TFPI recombinante es secretado por la célula de levadura. El TFPI recuperado mediante estos protocolos con frecuencia también es heterogéneo debido a modificaciones N-terminales, degradación proteolítica y glucosilación variable. Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de producir TFPI maduro que sea auténtico (es decir, que presente la secuencia de aminoácidos N-terminal correcta), de cadena completa y homogéneo.
El TFPI se puede producir en E. coli como se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.212.091, que describe un procedimiento para la producción de TFPI mediante la expresión de una forma no glucosilada de TFPI en un E. coli huésped.
En un aspecto de la invención se repliegan proteínas producidas por recombinación que son capaces de unirse a polímeros de polisacáridos sulfatados, como, por ejemplo, heparina o sulfato de dextrano. La invención proporciona un procedimiento que facilita el replegamiento de un producto proteico desnaturalizado producido por recombinación usando polímeros de polisacáridos sulfatados que actúan de moldes para la proteína que se repliega. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, los inventores creen que las interacciones entre la proteína que se repliega y el molde polimérico pueden minimizar la agregación de las estructuras intermedias del replegamiento y proporcionar un entorno para que la proteína se repliegue en su conformación nativa. El polímero que actúa de molde se puede unir a un dominio o a una región de la proteína para estabilizar la estructura intermedia y permitir que se produzca el plegamiento posterior sin agregación. Los agregados de proteína, si se forman, son generalmente menos activos que la proteína replegada no agregada, y en general dan como resultado un rendimiento global reducido de la proteína activa replegada. La concentración de NaCl se considera importante en las condiciones de replegamiento y se selecciona para alcanzar la eficacia máxima del replegamiento maximizando la interacción entre el polímero molde y la proteína que se repliega. Por ejemplo, los inventores han descubierto que una concentración de NaCl de aproximadamente 0,2 M o inferior fomenta la unión del extremo C-terminal y/o del tercer dominio de Kunitz de TFPI a heparina o a otro polímero polisacarídico sulfatado. Se supone que la unión del polímero a la estructura intermedia facilita la solubilidad de la estructura intermedia y proporciona un entorno para que el resto de la proteína se repliegue reduciendo la agregación de las estructuras intermedias que se repliegan.
Procedimientos generales
El TFPI se puede preparar mediante procedimientos de recombinación como se describe en el documento U.S. 5.212.091, cuya descripción se incorpora en la presente memoria por referencia. Brevemente, se expresa el TFPI en células de Escherichia coli y se aíslan los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI del resto del material celular. Los cuerpos de inclusión se someten a una sulfitolisis, se purifican usando cromatografía de intercambio iónico, se repliegan mediante una reacción de intercambio de disulfuro y el TFPI activo replegado se purifica por cromatografía de intercambio catiónico. El TFPI también se puede producir en levadura como se describe en el documento U.S.S.N 08/286.530 pendiente de tramitación.
La actividad del TFPI se puede medir mediante el ensayo del tiempo de protrombina (ensayo PTT). La bioactividad del TFPI se midió mediante el tiempo de coagulación de la protrombina usando un modelo RA4 Coag-A-Mate de Organon Teknika Corporation (Oklahoma City, OK). En primer lugar se diluyeron muestras de TFPI con un tampón TBSA (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7,5) a una concentración de 9 a 24 \mug/ml. Después se mezclaron en una bandeja para muestras 10 \mul de Varify 1 (plasma normal combinado de Organon Teknika Corp.) con 90 \mul de las muestras de TFPI diluidas y se calentaron a 37ºC en el instrumento. Finalmente se añadió Simplastin Excel (tromboplastina de Organon Teknika Corp.) para iniciar la coagulación. Se midió el retraso en el tiempo de coagulación que se debía a la actividad anticoagulante del TFPI y se convirtió en concentración de TFPI en las muestras medidas por comparación con una curva patrón de TFPI.
La cantidad de TFPI soluble también se puede cuantificar midiendo el área del pico principal en un cromatograma de intercambio catiónico. Se efectuó un análisis por HPLC de las muestras de TFPI usando un sistema Waters 626 LC (Waters Corporation, Milford, MA) equipado con un sistema calentador/refrigerador de muestreo automático Waters 717 plus. La adquisición de datos se realizó mediante un sistema Turbochrom^{TM} de Perkin-Elmer.
En el procedimiento de intercambio catiónico (IEX) se usó una columna de vidrio Mono S HR 5/5 de Pharmacia. La columna se equilibró en 80% de tampón A (solución de acetato sódico trihidrato 20 mM: acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4) y 20% de tampón B (solución de acetato sódico trihidrato 20 mM - cloruro de amonio 1,0 M:acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4). Tras inyectar una muestra se aplicó un gradiente de 20% de tampón B a 85% de tampón B en 21 minutos a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min para eluir el TFPI. Las especies de TFPI eluidas se detectaron midiendo la absorbancia a 214 nm. Se observó que el pico principal (TFPI monomérico) eluía a aproximadamente 18 minutos. La pérdida de TFPI soluble se cuantificó por integración del área restante del pico principal.
Todos los reactivos presentaban una calidad U.S.P. o A.C.S. Los proveedores incluyen J.T. Baker y Sigma Co. (St. Louis, MO).
La presente invención se ilustrará ahora haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que exponen ciertas realizaciones. No obstante, cabe señalar que estas realizaciones son ilustrativas y no deben considerarse de ningún modo restrictivas de la invención.
Ejemplos de referencia Ejemplo 1 Replegamiento del TFPI desnaturalizado
El siguiente ejemplo describe la preparación de soluciones madre, la preparación de la columna de HIC, la recuperación inicial y la purificación del TFPI antes del replegamiento, el replegamiento del TFPI y la recuperación del TFPI activo.
La solución madre de TFPI se preparó a partir de los cuerpos refractarios obtenidos en la expresión de TFPI recombinante en bacterias. Los cuerpos refractarios se solubilizaron a 10 mg/ml en urea 8 M, Tris 50 mM pH 8,5 que contenía DTT 10 mM, y esta solución se aclaró por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos.
La preparación de la columna para la purificación inicial del TFPI solubilizado se realizó con perlas de S-Sepharose mezcladas con urea 7,5 M, Tris 10 mM y fosfato sódico 10 mM (pH 6,5) que contenía DTT 5 mM y EDTA 1 mM. El TFPI solubilizado a una concentración de 5 mg/ml se pasó después por la columna de S-Sepharose y se eluyó con un gradiente de cloruro sódico de 0 a 1 M. El TFPI purificado presentaba una absorbancia de 3,2 a una longitud de onda de 280 nm (que es equivalente a 4,1 mg/ml usando un coeficiente de extinción de 0,78).
La solución madre de sulfato de dextrano se componía de sulfato de dextrano con un peso molecular de 8.000 daltons, disponible en Sigma, artículo número D-4911, preparado a 50 mg/ml (6,25 mM) en Tris 50 mM (pH 8,8), cloruro sódico 0,1 M, y se almacenó a -20 grados centígrados entre un uso y otro.
Cuando se usaba heparina para efectuar el replegamiento, la solución madre de heparina presentaba un peso molecular de 6.000 a 30.000 daltons (con un peso molecular medio de 18.000 daltons) y se preparó como sal sódica, disponible en Sigma Co. (St. Louis, MO), artículo número H-3393, a 60 mg/ml (3,33 mM) en Tris 50 mM (pH 8,8), cloruro sódico 0,1 M, y se almacenó a -20º centígrados entre un uso y otro.
Al TFPI purificado por S-Sepharose se puede añadir bien la solución madre de sulfato de dextrano o bien la solución madre de heparina. El dextrano o la heparina se añadió al TFPI en condiciones desnaturalizantes en urea 6 a 8 M. La solución desnaturalizante que contenía el TFPI se diluyó con los reactivos a 4ºC hasta urea 3 M, Tris 50 mM (pH 8,8), cloruro sódico 0,2 M y 0,5 mg/ml de TFPI y a una concentración final de sulfato de dextrano de 0,6 mg/ml (75 \muM) o una concentración final de heparina de 1,5 mg/ml (83 \muM), dependiendo de cuál de ellos se usaba para facilitar el replegamiento. Se añadió cistina a la solución de replegamiento, a una concentración final igual a la concentración final de DTT. La solución de replegamiento se incubó a 4ºC bajo agitación suave durante 4 a 6 días, preferentemente 5 días.
Para ilustrar este procedimiento se proporciona a continuación un protocolo detallado para el replegamiento de una solución de 5 ml de TFPI en sulfato de dextrano o en heparina.
A 610 \mul de la solución madre de TFPI se añadieron bien 60 \mul de sulfato de dextrano con 65 \mul de Tris 50 mM (pH 8,8) en NaCl 0,1 M o bien 125 \mul de la solución madre de heparina con Tris 50 mM (pH 8,8) o NaCl 0,1 M. La solución de replegamiento se mezcló y se dejó incubar durante 10 minutos en hielo. A continuación se añadieron a la solución de replegamiento 4,2 ml del tampón de replegamiento que contenía urea 2,5 M, Tris 50 mM (pH 8,8) y cloruro sódico 165 mM y se mezcló. Finalmente se añadieron 61 \mul de cistina 50 mM preparada en hidróxido sódico 120 mM, y la solución total se incubó durante 4 días a 4ºC bajo agitación suave. El contenido de sulfhidrilo libre se comprobó con el reactivo de Ellman (denominado también DTNB). Se añadió yodoacetamida 20 mM preparada a 1 M en etanol al 100% para almacenarla a -20ºC.
La columna de interacción hidrófoba (HIC) se preparó a partir de una resina Butyl-650M Tosohaas Toyopearl, con un tamaño de partícula de 40-90, lote nº 014702. La resina butílica se lavó con urea 3 M, sulfato de amonio 1 M, Tris 50 mM, fosfato sódico 10 mM, pH 6,5, y se resuspendió en una suspensión al 50%.
Las muestras de replegamiento almacenadas a -20ºC permanecieron en el tampón de replegamiento normal que contenía urea 3 M, Tris 50 mM, pH 8,8, redox 1-4 mM, 0,5 mg/ml de TFPI y NaCl 0,2-0,6 M, dependiendo de las condiciones. Las muestras replegadas con dextrano o heparina presentaban la sal a 0,2 M, y las muestras sin dextrano o heparina presentaban NaCl 0,6 M.
Las etapas siguientes se realizaron a temperatura ambiente para efectuar la purificación posterior del TFPI replegado. A 300 \mul de muestra replegada se añadió un volumen igual de sulfato de amonio 2 M, urea 3 M, Tris 50 mM y fosfato sódico 10 mM (pH 6,5). A continuación se añadieron a la muestra replegada diluida 100 \mul de perlas Butyl-650M lavadas. La solución con las perlas se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo un suave agitado o mezclado. La mezcla se centrifugó después en una centrífuga Eppendorf durante 5 segundos, se colocó en una rejilla y se dejó reposar durante un minuto para que las perlas se depositaran regularmente en el tubo. El sobrenadante se aspiró con cuidado para no alterar las perlas.
Para lavar las perlas unidas al TFPI se añadió a las perlas 1 ml de tampón de lavado compuesto por sulfato de amonio 1 M, urea 3 M, Tris 50 mM, fosfato sódico 10 mM (pH 6,5) para eliminar los restos de sulfato de dextrano o heparina. La mezcla lavada se volvió a centrifugar en una centrífuga Eppendorf durante 5 segundos y se dejó reposar durante un minuto para que las perlas se depositaran como antes. Se retiró el sobrenadante, y después las perlas se lavaron una última vez con el tampón de lavado, se centrifugaron y se dejaron reposar como antes. Después del lavado y la deposición finales se retiró el sobrenadante con mucho cuidado con una pipeta Pasteur cuya punta se había pasado por una llama.
Para eluir el TFPI replegado se añadieron a la suspensión de perlas 300 \mul de tampón de elución compuesto por urea 3 M, sulfato de amonio 0,1 M, Tris 50 mM y fosfato sódico 10 mM (pH 6,5) y se agitó durante más de 10 minutos. Las perlas se sedimentaron por centrifugación en una centrífuga Eppendorf y se recogió el sobrenadante que contenía el TFPI replegado. Para evitar una contaminación de las perlas con el producto se dejó algo del sobrenadante.
Ejemplo 2 HIC del replegamiento con sulfato de dextrano
La muestra de TFPI se renaturalizó a una concentración de 0,5 mg/ml de TFPI, 0,6 mg/ml de sulfato de dextrano, urea 3,0 M, NaCl 200 mM y Tris 50 mM (pH 5,5). La columna de HIC se preparó a partir de perlas TosoHaas Butyl para HIC, 4,6 mm D/100 mm L, en una suspensión de 1,66 ml. La velocidad de flujo se ajustó a 1,0 ml/min. Antes de cargar la columna de HIC, la muestra se diluyó 2:3 con urea 3,0 M y NH_{4}SO_{4} 3,0 M a un pH final de 5,68; se cargaron 2 ml de muestra. El comienzo del gradiente estaba formado por MES 33 mM/HEPES 33 mM/acetato sódico 33 mM, NH_{4}SO_{4} 1,0 M y urea 3,0 M, pH 6,0; el final del gradiente estaba formado por MES 33 mM/HEPES 33 mM/acetato sódico 33 mM y urea 3,0 M, pH 6,0. El volumen del gradiente ascendió a 5,0 VC. De esta columna se recuperó un 68% de TFPI nativo. Los resultados de este proceso se muestran en la Figura 2.
También se corrió una segunda columna de HIC. La muestra de TFPI desnaturalizado se diluyó 2:3 con urea 3,0 M, NH_{4}SO_{4} 1,5 M, y se cargaron dos ml. El comienzo del gradiente estaba formado por MES 33 mM/ HEPES 33 mM/ acetato sódico 33 mM, NH_{4}SO_{4} 0,5 M y urea 3,0 M, pH 6,0; el final del gradiente estaba formado por MES 33 mM/ HEPES 33 mM/ acetato sódico 33 mM y urea 3,0 M, pH 6,0. El volumen del gradiente ascendió a 5,0 VC. De esta segunda columna se recuperó un 74% de TFPI nativo. Los resultados de este proceso se muestran en la Figura 3.
Las muestras se analizaron por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, como se ilustra en la Figura 1. En el gel se observan las especies de TFPI activo y plegado correctamente (banda principal).
Ejemplo 3
Se dializaron aproximadamente 10 mg/ml de TFPI en urea 2 M contra una de las siguientes soluciones: Acetato 20 mM, fosfato 20 mM, citrato 20 mM, glicina 20 mM, L-glutamato 20 mM o succinato 20 mM en NaCl 150 mM como se ha descrito anteriormente. Se introdujeron entre 6 y 10 mg/ml de la solución madre de alta concentración de TFPI en tubos de diálisis Spec/Por 7 (PM de exclusión 3.500). La diálisis se realizó a 4ºC o a temperatura ambiente. En el curso de la diálisis, de 12 a 24 h de duración, se efectuaron tres cambios de tampón por solución de proteína en una relación 1 a 50-100. Tras la diálisis, la solución de TFPI se filtró a través de unidades de filtro Costar de 0,22 micrómetros para separar el TFPI precipitado del TFPI soluble. Después se midió la solubilidad del TFPI mediante la absorbancia UV/vis suponiendo una absorbancia de 0,68 (mg/ml)^{-1}cm^{-1} a 278 nm. Las soluciones se prepararon a diferentes valores de pH por titulación con HCl o NaOH.
Una vez completada la diálisis, los precipitados se filtraron a través de unidades de filtro de 0,22 \mum. La concentración del TFPI soluble remanente después de la diálisis se midió determinando la absorbancia UV. La Figura 1 muestra los resultados de estos experimentos. La solubilidad del TFPI aumentó considerablemente en soluciones que contenían acetato 20 mM, fosfato 20 mM, L-glutamato 20 mM y succinato 20 mM a valores de pH inferiores a 7, y en particular a un pH de 4,5 o menor. La solubilidad del TFPI también aumentó sustancialmente en soluciones que contenían glicina 20 mM a un pH superior a 10. La Figura 2 muestra la solubilidad del TFPI en función de la concentración de ión citrato y en presencia de fosfato sódico 10 mM a pH 7. La solubilidad del TFPI aumenta a medida que aumenta la concentración de citrato. La Figura 3 muestra la solubilidad del TFPI en función de la concentración de NaCl a pH 7,0. La solubilidad del TFPI aumenta a medida que aumenta la concentración de sal, lo que indica que la sal fomenta la solubilidad del TFPI.
La solubilidad del TFPI se estudió usando una serie de solubilizadores y solubilizadores secundarios diferentes. La Tabla 1 muestra la solubilidad del TFPI en diferentes soluciones tampón, medida por absorbancia UV tras dializar entre 6 y 10 mg/ml de TFPI contra estas soluciones tampón.
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TABLA 1
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Ejemplo 4
Se ensayó la estabilidad del TFPI almacenado en diferentes condiciones de pH. El TFPI se preparó como anteriormente por diálisis en fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80. Las muestras de estabilidad, que contenían 150 mg/ml de TFPI, se incubaron durante 20 días a 40ºC. La constante de velocidad cinética para el TFPI soluble remanante se analizó siguiendo la disminución del pico principal en los cromatogramas de intercambio catiónico. Como se puede apreciar en la Figura 5, la constante de velocidad de desaparición aumenta a valores de pH superiores a 6,0, lo que indica una mayor agregación en condiciones de pH más elevado.
El TFPI también se formuló a una concentración de 150 mg/ml en NaCl 150 mM y 0,005% (p/v) de polisorbato-80 a pH 7 con concentraciones variables de fosfato. La Figura 5A muestra el porcentaje de TFPI soluble que queda, medido por HPLC de intercambio catiónico. Concentraciones crecientes de ión fosfato en solución dieron como resultado niveles más elevados de TFPI soluble remanente tras la incubación a 40ºC. Niveles más elevados de ión fosfato también dieron como resultado mayores niveles de TFPI activo, según se midió en el ensayo del tiempo de protrombina. Estos resultados se muestran en la Figura 5B.
Asimismo se ensayó la estabilidad del TFPI a una concentración de 0,5 mg/ml formulada en citrato sódico 10 mM, pH 6, y NaCl 150 mM durante un periodo de tiempo de 40 días a 40ºC. Como se aprecia en la Figura 6, la HPLC de intercambio catiónico (triángulos) muestra la presencia de TFPI soluble en cantidades superiores al 60% del inicial, incluso después de la incubación de 40 días. De manera similar, el ensayo del tiempo de protrombina (círculos) muestra la presencia de TFPI activo en cantidades superiores al 60% del inicial, incluso después de la incubación de 40 días.
La Figura 7 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC, medida tanto por HPLC de intercambio catiónico (símbolos blancos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos negros) para 0,5 mg/ml de TFPI formulado en fosfato sódico 10 mM, pH 6, y NaCl 150 mM (triángulos) o NaCl 500 mM (círculos).
La Figura 8 muestra la pérdida de TFPI soluble a 40ºC, medida tanto por HPLC de intercambio catiónico (símbolos blancos) como mediante el ensayo del tiempo de protrombina (símbolos negros) para 0,5 mg/ml de TFPI formulado en acetato sódico 10 mM, pH 5,5, con NaCl 150 mM (triángulos) u 8% (p/v) de sacarosa (cuadrados) o 4,5% (p/v) de manitol (círculos).
La Figura 9 muestra dos geles de SDS no reductores para las muestras de formulación de TFPI en NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM y 0,005% de polisorbato-80 a pH 4-9 almacenadas a 40ºC durante 0 días (inferior) y 20 días (superior). A 0 días no se observa pérdida alguna de TFPI. Sin embargo, después de 20 días se pueden apreciar fragmentos de disociación de TFPI en el intervalo de pH más bajo (es decir, pH 4 y pH 5). Sin vincularse a ninguna teoría en particular, se cree que estos fragmentos pueden ser el resultado de una reacción catalizada por ácido.
Finalmente, la Tabla 2 muestra la semivida del TFPI soluble que queda a 40ºC para diferentes formulaciones. Se formularon 0,5 mg/ml de TFPI en estas condiciones de formulación y se incubaron a 40ºC. Las muestras se retiraron a intervalos de tiempo predeterminados y se examinó la pérdida de TFPI soluble y activo mediante IEX-HPLC y el ensayo del TP. A continuación se calculó la semivida para el TFPI soluble remanente realizando un ajuste exponencial único para los resultados de la IEX-HPLC y el ensayo del TP.
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Ejemplo 5 Elución de TFPI por desplazamiento de resinas cromatográficas usando compuestos poliiónicos
En primer lugar se une el TFPI a una resina en un tampón bajo en sal. A continuación se bombea a través de la columna un tampón que contiene el compuesto poliiónico que se usa para eluir el TFPI por desplazamiento. Este compuesto se une a la resina con más fuerza que el TFPI y desplaza el TFPI. Para una resina de carga positiva (intercambiador aniónico) se usa un compuesto de carga negativa, y para una resina de carga negativa (intercambiador catiónico) se usa un compuesto de carga positiva.
Como material de partida se usó TFPI parcialmente purificado. El TFPI se cargó a 20 mg/ml de resina en urea 6 M, Tris 20 mM, pH 8,0, en una columna rellena con una resina de intercambio aniónico, Q-Sepharose HP. Una vez cargada, la columna se lavó con urea 6 M, Tris 20 mM, pH 9. El TFPI se eluyó con 10 mg/ml de vidrio H (polifosfato) en urea 6 M, Tris 10 mM, pH 9,0.
Ejemplo 6 Elución de TFPI de una resina cromatográfica en un tampón acuoso usando compuestos poliiónicos TABLA 2
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Para una resina de carga positiva se usa un compuesto de carga positiva, y para una resina de carga negativa se usa un compuesto de carga negativa.
El TFPI se cargó en urea 3,5 M, 1 mg/ml de polifosfato, Tris 50 mM, pH 5,9, en una resina de intercambio catiónico, SP Sepharose HP. Una vez cargada, la columna se lavó con un tampón sin urea, 10 mg/ml de polifosfato, fosfato sódico 10 mM, pH 5,0. El TFPI se eluyó con el mismo tampón sin urea a pH 7,5.
Ejemplo 7 Elución selectiva de TFPI de resinas de intercambio iónico usando compuestos poliiónicos
Gracias a los extremos cargados del TFPI se pueden unir a estos extremos compuestos poliiónicos de carga opuesta. Cuando el compuesto poliiónico presenta una mayor fuerza de unión al TFPI que la resina, el TFPI se puede eluir selectivamente de la resina cromatográfica.
Se cargó el TFPI en urea 3,5 M, 1 mg/ml de polifosfato, Tris 50 mM, pH 5,9, en una resina de intercambio catiónico, SP Sepharose HP. Una vez cargada, la columna se lavó con urea 6 M, 1 mg/ml de polifosfato, fosfato sódico 10 mM, pH 5,9. El TFPI se eluyó con un gradiente de hasta 20 mg/ml de polifosfato en 25 volúmenes de columna. El TFPI comienza a eluir a aproximadamente 2-3 mg/ml de polifosfato.
Ejemplo 8
Neutralización de compuestos poliiónicos antes de la separación cromatográfica de TFPI. El TFPI puede interactuar con polímeros cargados. Esta interacción puede impedir la unión y purificación en resinas cromatográficas. Neutralizando el polímero cargado con un polímero de carga opuesta, el TFPI se puede unir a la resina.
El TFPI no se une a Express ión S (Whatman) en un tampón que contiene polifosfato (vidrio H) y no se logra su purificación. Cuando se mezcla PEI con la carga de la columna, el TFPI se une a la resina y el TFPI se puede purificar.
Ejemplo 9 Replegamiento y purificación de TFPI humano recombinante (TFPIhr) usando un proceso de replegamiento facilitado por polifosfato (vidrio H)
Los cuerpos de inclusión, que contenían aproximadamente 40 g de TFPIhr, se descongelaron retirando los envases del congelador de -20ºC e incubándolos en una habitación fría a entre 4 y 10ºC durante aproximadamente 196 horas. Los cuerpos de inclusión descongelados se dispersaron después con un mezclador de alto cizallamiento para reducir la aglomeración que se produce durante la congelación. Los cuerpos de inclusión descongelados se añadieron a 80 l de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 10,5, urea 3 M, que contenía 2 g/l de vidrio H contenidos en un depósito de polietileno de 100 L equipado con un agitador superior. Los contenidos se mezclaron durante aproximadamente 15 minutos y después se midió la absorbancia de la solución a 280 nm. Si la absorbancia era demasiado alta, la mezcla se diluyó con suficiente solución tampón para obtener una absorbancia de 1,0 a 1,1 a 280 nm. La solución se incubó durante 15 a 30 minutos bajo agitación suave y después se añadió suficiente cisteína para dar una concentración de cisteína de 0,1 mM. La L-cisteína sólida se disolvió en aproximadamente 50 ml de agua purificada y se añadió a la mezcla de replegamiento. Se comprobó el pH y, en caso necesario, se ajustó a pH 10,2. La mezcla de replegamiento se incubó durante 96 a 120 horas bajo agitación suave.
Después de aproximadamente 96 h, el proceso de replegamiento se terminó ajustando el pH de la mezcla de replegamiento a pH 5,9 usando ácido acético glacial. Se continuó agitando durante 90 minutos y se comprobó el pH. En caso necesario se añadió más ácido para ajustar el pH a 5,9 +/- 0,1. Se usó un proceso de filtración de dos etapas para eliminar las partículas formadas durante las etapas previas y preparar la mezcla de replegamiento acidificada para la cromatografía en SP-Sepharose HP. Primero se pasó la mezcla de replegamiento acidificada a través de un filtro de profundidad Cuno 60LP (caja de filtro modelo 8ZP1P) usando una bomba peristáltica (diámetro interior del tubo de silicio 0,635 a 0,953 cm).
El sistema de filtración se lavó antes del uso con 8 a 10 l de urea desionizada 6 M. El filtrado se recogió en un depósito de polietileno de 100 l. La contrapresión se mantuvo constante en 137,8 kPa. La velocidad de flujo inicial para un filtro nuevo era de aproximadamente 5 a 6 l por minuto. Los filtros se sustituyeron cuando la velocidad de flujo caía a por debajo de 1 l por minuto, con el fin de mantener la contrapresión en 137,8 kPa. En la segunda etapa de la filtración se usó un cartucho de filtración de 0,45 micrómetros (Sartorius Sartobran pH o equivalente) con un sistema de bombeo peristáltico. Después de la filtración se comprobó el pH y, en caso necesario, se ajustó a pH 5,9.
El replegamiento filtrado y acidificado se cargó en la columna SP Sepharose HP equilibrada a una velocidad de flujo de aproximadamente 80,0 ml/min. La velocidad de flujo se ajustó para efectuar la carga de la mezcla de replegamiento filtrada y acidificada durante la noche. La columna se equilibró en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 5,9, urea 6 M antes de cargarla. Una vez cargada, la columna se lavó con 2 VC de tampón fosfato sódico, pH 5,9, urea 6 M, NaCl 0,3 M antes de realizar la etapa de elución en gradiente. La velocidad de flujo de la columna se aumentó a entre 190 y 200 ml/min para la etapa de lavado y todas las etapas siguientes (velocidad lineal = 47 cm/h). El producto se eluyó de la columna usando un gradiente de sal lineal de NaCl 0,3 a 0,5 M en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 5,9, urea 6 M. El gradiente se generó añadiendo tampón fosfato sódico 20 mM, urea 6 M, NaCl 0,5 M a tampón fosfato sódico 20 mM, urea 6 M, NaCl 0,3 M. El tampón límite se bombeó con una bomba Masterflex (modelo 7553-20) con una cabeza Masterflex (modelo 7015.21) a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml/min, mezclando vigorosamente con un mezclador Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen total del gradiente ascendió a 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los tampones del gradiente ascendió a 5,92 (+/- 0,02). Las fracciones se evaluaron cualitativamente usando SDS-PAGE y se combinaron en base al contenido en SC-59735 plegado correctamente en relación con otros plegamientos incorrectos e impurezas. Después de la combinación, la corriente de proceso se denomina material combinado S.
A continuación se ajustó el pH del material combinado S a pH 8,0 con NaOH 2,5 N. El material combinado S se concentró 2 a 3 veces hasta un volumen de aproximadamente 2 l usando una unidad de ultrafiltración Amicon DC-10L que contenía un cartucho de espiral Amicon YM10 (PM de exclusión de la membrana 10.000). Tras la concentración, el material combinado S concentrado se diafiltró contra 7 volúmenes de tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, urea 6 M. La diafiltración se consideró completada cuando la conductividad del retentato era inferior a 2 mS. El concentrado diafiltrado se drenó de la unidad de ultrafiltración y la unidad se lavó con aproximadamente 1 l de tampón de diafiltración. El lavado se combina con el concentrado para formar la carga Q.
Se rellenó una columna Amicon (diámetro 7,0 cm) con aproximadamente 700 ml de medio Q-Sepharose de alta resolución (Q-Sepharose HP de Pharmacia). La columna se rellenó con etanol al 20% a 137,8 kPa. La altura del lecho después del llenado era de aproximadamente 18 cm. La columna se equilibró con 5 VC de tampón Tris/HCl 0,02 M, pH 8, urea 6 M. El objetivo era cargar 8 a 10 mg de proteína/ml de resina Q Sepharose. La carga Q se aplicó a la columna a una velocidad de flujo de 30 a 35 ml/min (50 cm/h). Una vez cargada, la columna se lavó con aproximadamente 5 VC de tampón Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, urea 6 M, o hasta que la absorbancia a 280 nm volvió al valor inicial. El producto se eluyó usando un gradiente de cloruro sódico de NaCl 0 a 0,15 M en tampón Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, urea 6 M en 25 volúmenes de columna. Los siete primeros volúmenes de columna se recogieron en una sola fracción, a la que siguieron 30 fracciones de 0,25 volúmenes de columna cada una.
Las fracciones se analizaron de forma rutinaria mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y por cromatografía de exclusión molecular. Las fracciones se combinaron en base al contenido en agregados (< 5% por el procedimiento de HPLC SEC MSL 13929) y la evaluación cualitativa por SDS-PAGE para valorar la pureza. Las fracciones se almacenaron congeladas a -20ºC antes de combinarlas.
Se combinaron las fracciones de Q Sepharose aceptables, y el pH del material combinado se ajustó a 7,2 usando HCl 2 M. El material combinado se concentró después aproximadamente 5 veces en un sistema de ultrafiltración Amicon DC-1 que contenía un cartucho S1Y1 Amicon YM-10 (PM de exclusión de la membrana del cartucho de espiral 10.000). El material combinado Q concentrado se diafiltró a continuación contra siete volúmenes de columna de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, urea 2 M. Tras la ultrafiltración se drenó la solución del sistema de ultrafiltración. Se hicieron circular aproximadamente 100 ml de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, urea 2 M a través del sistema de ultrafiltración durante aproximadamente 5 min. La solución de lavado se combinó con el concentrado original y la solución se filtró a través de una unidad de filtración al vacío de 0,45 micrómetros (Nalgene).
Ejemplo 10 Replegamiento y purificación de TFPIhr usando un procedimiento de replegamiento facilitado por polietilenimina (PEI)
Los cuerpos de inclusión, que contenían aproximadamente 40 g de TFPIhr, se descongelaron retirando los envases del congelador de -20ºC e incubándolos en una habitación fría a entre 4 y 10ºC durante aproximadamente 96 horas. Los cuerpos de inclusión descongelados se dispersaron después con un mezclador de alto cizallamiento para reducir la aglomeración que se produce durante la congelación. La suspensión de cuerpos de inclusión se mezcló vigorosamente durante aproximadamente 1 minuto usando un homogeneizador politrón (Brinkman, modelo PT45/80) o hasta que los cuerpos de inclusión se añadieran a 40 l de tampón Tris-HCl 100 mM, pH 9,8, urea 6 M, que contenía NaCl 300 mM y 0,4 g/l de PEI contenidos en un depósito de polietileno de 100 L equipado con un agitador superior. La mezcla se agitó vigorosamente durante 20 a 30 min. Se controló el pH y, en caso necesario, se ajustó a pH 9,8. Se midió la absorbancia de la mezcla de cuerpos de inclusión disueltos a 280 nm, y si la absorbancia era superior a 2,1, la muestra se diluyó con 10 litros de la solución tampón antes descrita para obtener una A280 de 2,0 a 2,1. Se continuó agitando suavemente durante otros 15 a 30 minutos. A continuación, la solución de cuerpos de inclusión disueltos se diluyó con un volumen igual de una solución de urea 1,0 M, NaCl 300 mM. Finalmente, se añadió L-cisteína para dar una concentración final de 0,25 M. La L-cisteína sólida se disolvió en 50 ml de WFI y se añadió en forma de solución al replegamiento diluido. El pH se comprobó y, en caso necesario, se ajustó. El replegamiento continuó bajo agitación suave durante 96 a 120 horas, con comprobaciones periódicas del pH y ajuste a pH 9,8 si era necesario. El progreso del replegamiento se siguió mediante intercambio catiónico en Mono-S y el ensayo del tiempo de
protrombina.
Después de aproximadamente 96 h, el proceso de replegamiento se terminó ajustando el pH del replegamiento a pH 5,9 usando ácido acético glacial. Se continuó agitando durante 90 minutos y se comprobó el pH. En caso necesario se añadió más ácido para ajustar el pH a 5,9 +/- 0,1.
Se usó un proceso de filtración de dos etapas para eliminar las partículas formadas durante las etapas previas y preparar el replegamiento acidificado para la cromatografía en SP-Sepharose HP. Primero se pasó el replegamiento acidificado a través de un filtro de profundidad Cuno 60LP (caja de filtro modelo 8ZPIP) usando una bomba peristáltica (diámetro interior del tubo de silicio 0,635 a 0,953 cm).
El sistema de filtración se lavó antes del uso con 8 a 10 l de urea desionizada 6 M. El filtrado se recogió en un depósito de polietileno de 100 l. La contrapresión se mantuvo constante en 137,8 kPa. La velocidad de flujo inicial para un filtro nuevo era de aproximadamente 5 a 6 l por minuto. Los filtros se sustituyeron cuando la velocidad de flujo caía a por debajo de 1 l por minuto, con el fin de mantener la contrapresión en 137,8 kPa. En la segunda etapa de la filtración se usó un cartucho de filtración de 0,45 micrómetros (Sartorius Sartobran pH o equivalente) con un sistema de bombeo peristáltico. Después de la filtración se comprobó el pH y, en caso necesario, se ajustó a pH 5,9.
El replegamiento filtrado y acidificado se cargó en la columna SP Sepharose HP equilibrada a una velocidad de flujo de aproximadamente 80,0 ml/min. La velocidad de flujo se ajustó para efectuar la carga del replegamiento filtrado y acidificado durante la noche. La columna se lavó después con 5,5 volúmenes de columna de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 5,9, urea 6 M, NaCl 0,3 M. La velocidad de flujo de la columna se aumentó a entre 190 y 200 ml/min para la etapa de lavado y todas las etapas siguientes (velocidad lineal = 47 cm/h). El producto se eluyó de la columna usando un gradiente de sal lineal de NaCl 0,3 a 0,5 M en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 5,9, urea 6 M. El gradiente se generó añadiendo tampón fosfato sódico 20 mM, urea 6 M, NaCl 0,5 M a tampón fosfato sódico 20 mM, urea 6 M, NaCl 0,3 M. El tampón límite se bombeó con una bomba Masterflex (modelo 7553-20) con una cabeza Masterflex (modelo 7015.21) a una velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml/min, mezclando vigorosamente con un mezclador Paratrol A de Parametrics (modelo 250210). El volumen total del gradiente ascendió a 71,0 litros o 13,0 VC. El pH de los tampones del gradiente ascendió a 5,92 (+/- 0,02).
La recogida de las fracciones se inició cuando la conductividad a la entrada de la columna alcanzó 28,0 a 28,5 mS/cm según las mediciones con el conductibilímetro Radiometer en línea. Se recogieron cuarenta fracciones de 500 ml (0,1 VC). Se usó un colector de fracciones Frac-300 de Pharmacia con frascos de polietileno numerados de 500 ml. Una vez finalizada la recogida de fracciones, el resto del gradiente se recogió en forma de material combinado.
Las fracciones se evaluaron por A280, HPLC de exclusión molecular y, adicionalmente, con fines de información, mediante SDS-PAGE, HPLC de fase inversa y el ensayo del TP. Las fracciones se combinaron si cumplían los criterios de combinación según los cuales debían contener 20% o menos de agregados de acuerdo con la HPLC SEC en el proceso. Las fracciones combinadas de SP Sepharose se denominan material combinado S.
A continuación se ajustó el pH del material combinado S a pH 8,0 con NaOH 2,5 N. El material combinado S se concentró 2 a 3 veces a aproximadamente 2 l usando una unidad de ultrafiltración Amicon DC-10L que contenía un cartucho de espiral Amicon YM10 (PM de exclusión de la membrana 10.000). Tras la concentración, el material combinado S concentrado se diafiltró contra 7 volúmenes de tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, urea 6 M. La diafiltración se consideró completada cuando la conductividad del retentato era inferior a 2 mS. El concentrado diafiltrado se drenó de la unidad de ultrafiltración y la unidad se lavó con aproximadamente 1 l de tampón de diafiltración. El lavado se combinó con el concentrado para formar la carga Q.
Se rellenó una columna Amicon (diámetro 7,0 cm) con aproximadamente 700 ml de medio Q-Sepharose de alta resolución (Q-Sepharose HP de Pharmacia). La columna se rellenó con etanol al 20% a 137,8 kPa. La altura del lecho después del llenado era de aproximadamente 18 cm. La columna se equilibró con 5 VC de tampón Tris/HCl 0,02 M, pH 8, urea 6 M. El objetivo era cargar 8 a 10 mg de proteína/ml de resina Q Sepharose. La carga Q se aplicó a la columna a una velocidad de flujo de 30 a 35 ml/min (50 cm/h). Una vez cargada, la columna se lavó con aproximadamente 5 VC de tampón Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, urea 6 M, o hasta que la absorbancia a 280 nm volvió al valor inicial. El producto se eluyó usando un gradiente de cloruro sódico de NaCl 0 a 0,15 M en tampón Tris/HCl 20 mM, pH 8,0, urea 6 M en 25 volúmenes de columna. Los siete primeros volúmenes de columna se recogieron en una sola fracción, a la que siguieron 30 fracciones de 0,25 volúmenes de columna cada una.
Las fracciones se analizaron de forma rutinaria mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y por cromatografía de exclusión molecular. Las fracciones se combinaron en base al contenido en agregados (5% por HPLC SEC) y la evaluación cualitativa por SDS-PAGE para valorar la pureza. Las fracciones se almacenaron congeladas a -20ºC antes de combinarlas.
Las fracciones de Q Sepharose que había que combinar se descongelaron por incubación a entre 2 y 8ºC, se combinaron y el pH del material combinado se ajustó a 7,2 usando HCl 2 M. El material combinado se concentró después aproximadamente 5 veces en un sistema de ultrafiltración Amicon DC-1 que contenía un cartucho S1Y1 Amicon YM-10 (PM de exclusión de la membrana del cartucho de espiral 10.000). El material combinado Q concentrado se diafiltró a continuación contra siete volúmenes de columna de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, urea 2 M. Tras la ultrafiltración se drenó la solución del sistema de ultrafiltración. Se hicieron circular aproximadamente 100 ml de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, urea 2 M a través del sistema de ultrafiltración durante aproximadamente 5 min. La solución de lavado se combinó con el concentrado original y se filtró a través de una unidad de filtración al vacío de 0,45 micrómetros (Nalgene).
Ejemplo 11 Solubilización, replegamiento y purificación de TFPIhr a partir de cuerpos de inclusión usando polifosfato en ausencia de agentes caotrópicos tales como urea (GDS 5327089,92)
Se disolvieron aproximadamente 2 g de TFPIhr (suspensión de cuerpos de inclusión de 43 ml que contenía 46 mg/ml de TFPIhr) mezclándolos en 4 l de tampón Tris 50 mM, pH 10,5, que contenía 4 g/l de polifosfato (vidrio H, FMC Corporation) a entre 2 y 8ºC. Se añadió suficiente cisteína y cistina para obtener soluciones 0,1 mM y 0,05 mM respectivamente. El pH se mantuvo a pH 10,5 con NaOH 1 N. La solución de replegamiento se incubó durante 72 a 96 h a entre 2 y 8ºC bajo agitación suave.
A continuación, el replegamiento se ajustó a pH 6 usando ácido acético glacial y después se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Se aplicó una alícuota del replegamiento filtrado a una columna de SP-Sepharose HP (Pharmacia) de 200 ml previamente equilibrada en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6, 0,4% de vidrio H. Una vez cargada, la columna se lavó con 4 volúmenes de columna de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6, 0,4% de vidrio H. La columna se eluyó usando un gradiente de pH lineal de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6, 0,4% de vidrio H a tampón Tris 50 mM, pH 8, 0,4% de vidrio H. Las fracciones se recogieron y se analizaron por SDS-PAGE. De este modo se pudo replegar y purificar TFPIhr relativamente puro.
Ejemplo 12 Solubilidad mejorada del TFPIhr en agua mediante la formación de un complejo entre TFPI y polifosfato (GDS 5327046-47)
Se descongelaron aproximadamente 10 g de TFPIhr purificado en aproximadamente 1 litro de tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, urea 2 M, cloruro sódico 125 mM por incubación a entre 2 y 8ºC durante 18 a 36 h. Se añadió suficiente urea seca para obtener una solución de urea 6 M. La solución se filtró después a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Se disolvieron cinco g de vidrio polifosfato (vidrio H, FMC) en 50 ml de urea 6 M ajustada a pH 7 con NaOH 1 N y se añadieron a la solución de proteína. A continuación, la solución se concentró por ultrafiltración hasta un volumen de aproximadamente 400 ml (25 mg/ml) usando una membrana de 0,093 metros cuadrados (Amicon S1Y3) y se diafiltró contra 10 volúmenes (aproximadamente 4 litros) de agua purificada para eliminar los restos de urea. Tras la diafiltración, la solución se concentró a aproximadamente 250 ml y se retiró de la unidad de ultrafiltración. La unidad de ultrafiltración se lavó con aproximadamente 150 ml de agua purificada y el lavado se añadió al concentrado de proteína. El concentrado de proteína final contenía casi 10 g de proteína en 400 ml de agua (aproximadamente 24 mg/ml de proteína). La solubilidad normal del TFPIhr en agua es inferior a 0,5 mg/ml.
Ejemplo 13 Uso de polímeros catiónicos para eliminar contaminantes de E. coli de lisados celulares y cuerpos refractarios con TFPI
El uso de polímeros catiónicos para precipitar y eliminar contaminantes de E. coli de estructuras intermedias del TFPI bruto (lisados, cuerpos refractarios) puede mejorar significativamente las operaciones posteriores del proceso (replegamiento, cromatografía, etc.). En un cribado aleatorio de polímeros catiónicos se identificaron candidatos que precipitaban selectivamente contaminantes bacterianos mientras que dejaban el TFPI en solución. Específicamente, el polímero Betz 624 precipitó cantidades sustanciales de contaminantes bacterianos mientras dejaba el TFPI en solución en un entorno acuoso.
El material de partida usado para un experimento de cribado de polímeros consistía en los cuerpos refractarios de TFPI solubilizados (en hidrocloruro de guanidina 3,5 M, cloruro sódico 2 M, Tris 50 mM, ditiotreitol 50 mM, pH 7,1). Este material se diluyó 10 veces en una solución al 0,5% de diferentes polímeros. Los precipitados de este experimento se analizaron por SDS-PAGE en cuanto a la presencia de TFPI. El polímero Betz 624 precipitó cantidades sustanciales de contaminantes pero no TFPI, y dio como resultado una solución acuosa transparente.
Ejemplo 14
El uso de una extracción acuosa bifásica con un sistema de polietilenglicol (PEG), polifosfato y urea ofrece ventajas de procesamiento para la purificación de TFPI. Los sistemas acuosos bifásicos típicos se componen de dos sistemas poliméricos (por ejemplo PEG y dextrano) o de un polímero y una sal (por ejemplo PEG y sulfato). El sistema descrito en la presente memoria presenta ventajas en cuanto a que la longitud de cadena del polifosfato se puede optimizar para la separación, es poco costoso y es específico en la eliminación de contaminantes problemáticos de los cuerpos refractarios de TFPI que se sabe interfieren con el replegamiento y la cromatografía (polifosfato nativo y metales divalentes asociados).
Los cuerpos refractarios de TFPI se solubilizaron en urea 7 M, CAPS 10 mM, 1% de monotioglicerol, pH 10. Se añadieron polifosfato y PEG de diferentes longitudes de cadena para formar dos fases. En la separación de fases el TFPI se distribuyó en la fase superior rica en PEG, dejando los polifosfatos y los contaminantes asociados en la fase inferior. La separación se efectúa tanto en base a la longitud de cadena del PEG como en base a la del polifosfato y se puede optimizar variando ambas.
Ejemplo 15 Replegamiento del activador de plasminógeno tisular recombinante (t-PA) procedente de cuerpos de inclusión de E. coli facilitado por polímeros cargados
Se añaden cinco gramos (peso húmedo) de cuerpos de inclusión que contienen aproximadamente 2 gramos del activador de plasminógeno tisular recombinante a aproximadamente 1 litro de tampón Tris 50 mM, pH 10,8, 0,5% de vidrio H que contiene glutatión reducido (GSH) 1 mM y disulfuro de glutatión (GSSG) 0,2 mM. La mezcla se agita a conciencia durante 2 a 3 minutos usando un homogeneizador politrón (Brinkman) para dispersar bien los cuerpos de inclusión. La mezcla se incuba durante 15 minutos bajo agitación usando un agitador superior mientras se mantiene el pH a entre 10,5 y 10,9 con NaOH 1 N. Después, la mezcla se agita suavemente durante 48 a 72 horas a entre 2 y 8ºC.
Ejemplo 16 Replegamiento de somatotropina bovina procedente de cuerpos de inclusión de E. coli facilitado por polímeros cargados
Se añaden diez gramos (peso húmedo) de cuerpos de inclusión que contienen 5 gramos de somatotropina bovina a aproximadamente 1 litro de tampón Tris 50 mM, pH 10,5, 1% de vidrio H. La mezcla se agita a conciencia durante 2 a 3 minutos usando un homogeneizador politrón (Brinkman) para dispersar bien los cuerpos de inclusión. La mezcla se incuba durante 15 minutos bajo agitación usando un agitador superior mientras se mantiene el pH a entre 10,4 y 10,6 con NaOH 1 N. Se añade cisteína sólida (121 mg) para obtener en la reacción cisteína 1 mM, y la reacción de replegamiento se mezcla durante 48 a 72 horas.

Claims (18)

1. Una formulación acuosa con un pH de 5 a 10 que comprende (a) un inhibidor de la ruta del factor tisular y (b) L-arginina, en la que la concentración de arginina se encuentra entre 200 mM y 300 mM.
2. La formulación de la reivindicación 1, en la que la concentración de arginina es de 300 mM.
3. Una formulación acuosa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un agente solubilizador seleccionado del grupo constituido por: un ión acetato; un ión sulfato; cloruro sódico; un ión citrato; un ión isocitrato; glicina; glutamato; un ión succinato; histidina; imidazol; dodecilsulfato sódico (SDS); o un polímero cargado.
4. La formulación de la reivindicación 3, en la que el agente solubilizador se selecciona del grupo constituido por: un ión citrato; un ión isocitrato; o un ión sulfato.
5. La formulación de la reivindicación 4, en la que el agente solubilizador es citrato y en la que la concentración de citrato está entre 10 mM y 20 mM.
6. La formulación de la reivindicación 5, en la que la concentración de citrato es de 20 mM.
7. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que el pH de la composición es inferior a pH 7,0 y el agente solubilizador no es glicina.
8. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que la concentración del inhibidor de la ruta del factor tisular es superior a 0,2 mg/ml.
9. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que la formulación incluye un tampón.
10. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular es (i) TFPI, (ii) un mutante de TFPI que incluye una o múltiples mutaciones puntuales o (iii) una molécula quimérica de TFPI.
11. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular presenta un resto de alanina en el extremo amino terminal.
12. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular contiene 18 restos de cisteína y 9 puentes disulfuro.
13. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular contiene tres sitios consenso de N-glucosilación Asn-X-Ser/Thr.
14. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular tiene un extremo carboxilo terminal cargado positivamente.
15. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular no está glucosilado.
16. La formulación de la reivindicación 15, en la que el inhibidor de la ruta del factor tisular se purifica a partir de un huésped Escherichia coli.
17. La formulación de cualquier reivindicación precedente, en la que la formulación es hipertónica.
18. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la formulación es isotónica.
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