JPH0662666B2 - 不溶蛋白質の可溶化法 - Google Patents
不溶蛋白質の可溶化法Info
- Publication number
- JPH0662666B2 JPH0662666B2 JP216789A JP216789A JPH0662666B2 JP H0662666 B2 JPH0662666 B2 JP H0662666B2 JP 216789 A JP216789 A JP 216789A JP 216789 A JP216789 A JP 216789A JP H0662666 B2 JPH0662666 B2 JP H0662666B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- ion exchanger
- sepharose
- cells
- exchanger
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、培養した細胞から搾出した不溶の蛋白質を安
定化する方法に関する。
定化する方法に関する。
培養した細胞、特に、バクテリア（特に、Escherichia
coli）は、蛋白質、特に、別の器官の分岐された遺伝子
によってコード化される蛋白質の過生産に工業的に利用
される。多くの場合、商業的に興味ある蛋白質の過搾出
は、β−インターフェロンおよびインシュリンの例から
明らかな如く、満足できるよう実施できる。しかしなが
ら、過搾出した蛋白質は不溶であるため、過生産には問
題があると云うことが判った。E.Coliについては、Biot
echnology,5(1987)883-890に概説がなされている。蛋白
質は、電子顕微鏡下で可視の包含体として沈澱する（例
えば、Science 215(1982)687〜689参照）。上記包含体
は、両結合された蛋白質が、蛋白分解前に十分に保護さ
れると云う利点を与える（例えば、EMBO Journal 3(198
4)1429〜1434参照）。しかしながら、可溶なまたは活性
な形の再結合された蛋白質を上記包含体または沈澱物か
ら分離することは、極めて困難である。多くの場合、蛋
白質の溶解には、尿素、ナトリウムドデシルスルフェー
ト（ＳＤＳ）または別の変性剤を使用する。しかしなが
ら、この種の精製を行うと、蛋白質が望ましくなく変性
される。例えば、下記報告参照。Marston(1987)、“The
purification of enkaryotic polypeptides expressed
in Escherichia coli.",DNA Cloning,Vol,111,ed.D.Glo
ver,p.59〜88 IRL Press,Oxford；PNAS,80(1983)906〜9
10またはPNAS,82(1985)2354〜2358。しかしながら、復
元は、活性材料の損失を伴う。何故ならば、復元は、一
般に、完全でないからである。復元が不可能であり、従
って、可溶分を回収できるにすぎず、不溶蛋白質を放棄
しなければならないと云う事例もある。例えば、Biotec
hnology,5(1987)960〜965参照。
coli）は、蛋白質、特に、別の器官の分岐された遺伝子
によってコード化される蛋白質の過生産に工業的に利用
される。多くの場合、商業的に興味ある蛋白質の過搾出
は、β−インターフェロンおよびインシュリンの例から
明らかな如く、満足できるよう実施できる。しかしなが
ら、過搾出した蛋白質は不溶であるため、過生産には問
題があると云うことが判った。E.Coliについては、Biot
echnology,5(1987)883-890に概説がなされている。蛋白
質は、電子顕微鏡下で可視の包含体として沈澱する（例
えば、Science 215(1982)687〜689参照）。上記包含体
は、両結合された蛋白質が、蛋白分解前に十分に保護さ
れると云う利点を与える（例えば、EMBO Journal 3(198
4)1429〜1434参照）。しかしながら、可溶なまたは活性
な形の再結合された蛋白質を上記包含体または沈澱物か
ら分離することは、極めて困難である。多くの場合、蛋
白質の溶解には、尿素、ナトリウムドデシルスルフェー
ト（ＳＤＳ）または別の変性剤を使用する。しかしなが
ら、この種の精製を行うと、蛋白質が望ましくなく変性
される。例えば、下記報告参照。Marston(1987)、“The
purification of enkaryotic polypeptides expressed
in Escherichia coli.",DNA Cloning,Vol,111,ed.D.Glo
ver,p.59〜88 IRL Press,Oxford；PNAS,80(1983)906〜9
10またはPNAS,82(1985)2354〜2358。しかしながら、復
元は、活性材料の損失を伴う。何故ならば、復元は、一
般に、完全でないからである。復元が不可能であり、従
って、可溶分を回収できるにすぎず、不溶蛋白質を放棄
しなければならないと云う事例もある。例えば、Biotec
hnology,5(1987)960〜965参照。
さて、培養した細胞から搾出した不溶蛋白質を可溶化す
ると云う目的は、本発明にもとづき、不溶蛋白質をイオ
ン交換体と接触させ、次いで、上記イオン交換体から分
離する方法によって達成される。
ると云う目的は、本発明にもとづき、不溶蛋白質をイオ
ン交換体と接触させ、次いで、上記イオン交換体から分
離する方法によって達成される。
本発明に係る方策の本質的利点は、変性剤は不要であ
り、本発明に係る方法は容易且つ迅速に実施でき、可溶
化された蛋白質がほぼ十分な収率で得られる。
り、本発明に係る方法は容易且つ迅速に実施でき、可溶
化された蛋白質がほぼ十分な収率で得られる。
不溶材料の遠心分離後、蛋白質をイオン交換体に吸着す
ることは公知であるが、この公知の方法の場合は、もち
ろん、可溶蛋白質のみを使用する。例えば、Current Pr
otocols in Molecular Biology,1987,P.10.9.2,N.Y.(Gr
eene Publ.Ass.and Wicey Inter-Science)。この先行技
術は、特定の蛋白質を使用する際に適切なイオン交換体
を選択できる場合に限り、意味を有する。
ることは公知であるが、この公知の方法の場合は、もち
ろん、可溶蛋白質のみを使用する。例えば、Current Pr
otocols in Molecular Biology,1987,P.10.9.2,N.Y.(Gr
eene Publ.Ass.and Wicey Inter-Science)。この先行技
術は、特定の蛋白質を使用する際に適切なイオン交換体
を選択できる場合に限り、意味を有する。
工業的に培養したバクテリア（特に、E.coli）から搾出
した蛋白質に本発明に係る方法を適用することは類推で
きる。しかしながら、本発明に係る方法は、工業的に組
織培養した真核細胞（例えば、昆虫の細胞）から搾出し
た蛋白質にも適用できる。例えば、PNAS,84(1987)5700-
5804またはGenetic Engineering,8(1986)277-298参照。
した蛋白質に本発明に係る方法を適用することは類推で
きる。しかしながら、本発明に係る方法は、工業的に組
織培養した真核細胞（例えば、昆虫の細胞）から搾出し
た蛋白質にも適用できる。例えば、PNAS,84(1987)5700-
5804またはGenetic Engineering,8(1986)277-298参照。
本発明に係る方法を実施する場合、培養液中で、細解さ
れた細胞および細胞片の存在のもとで、不溶蛋白質をイ
オン交換体と接触させることができる。もちろん、細解
された細胞および細胞片を分離した後、不溶蛋白質をイ
オン交換体と接触させることができる。
れた細胞および細胞片の存在のもとで、不溶蛋白質をイ
オン交換体と接触させることができる。もちろん、細解
された細胞および細胞片を分離した後、不溶蛋白質をイ
オン交換体と接触させることができる。
特定の蛋白質に適したイオン交換体を選択する場合、ル
ーチンの適性実験を行うことができる。更に、上述の先
行技術がオリエンテーションに役立つ。イオン交換体
は、有機系マトリックスまたは有機ポリマーまたは多糖
類（例えば、アガロース）であってよい。本発明にもと
づき使用できるイオン交換体の例は、セファロースであ
る。蛋白質の可溶化に普遍的に使用できるイオン交換体
の特殊な例は、Ｑ−セファロースである(PharmaciaのＱ
−Sepharose-Fast-flow)。Ｑ−セファロースは、陽イオ
ン交換体の例である。この種の陽イオン交換体は、塩基
性媒体の場合に使用される。しかしながら、酸性媒体の
場合は、陰イオン交換体を使用することもできる。例と
して、Ｓ−セファロース(PharmaciaのS-Sepharose-Fast
-Flow)を挙げる。
ーチンの適性実験を行うことができる。更に、上述の先
行技術がオリエンテーションに役立つ。イオン交換体
は、有機系マトリックスまたは有機ポリマーまたは多糖
類（例えば、アガロース）であってよい。本発明にもと
づき使用できるイオン交換体の例は、セファロースであ
る。蛋白質の可溶化に普遍的に使用できるイオン交換体
の特殊な例は、Ｑ−セファロースである(PharmaciaのＱ
−Sepharose-Fast-flow)。Ｑ−セファロースは、陽イオ
ン交換体の例である。この種の陽イオン交換体は、塩基
性媒体の場合に使用される。しかしながら、酸性媒体の
場合は、陰イオン交換体を使用することもできる。例と
して、Ｓ−セファロース(PharmaciaのS-Sepharose-Fast
-Flow)を挙げる。
特定の蛋白質の過生産のため、例えば、バクテリア細胞
を使用する場合、公知の態様で、例えば、超音波、リゾ
チーメ、浸透衝撃、冷凍／解凍または上記方策の組合せ
によって、細胞を細解できる。蛋白質の保護のため、緩
衝媒体を使用するのが好ましい。大規模で作業する場合
は、細解された細胞および細胞片を分離せずに、緩衝培
養媒体にイオン交換体を加えるのが有利である。粒状の
イオン交換体を使用する場合は、例えば、１〜２ｈｒ
後、上記イオン交換体を培養媒体から濾過または遠心分
離することができる。場合によっては、例えば、塩含有
緩衝液を添加することによって、吸着された蛋白質をイ
オン交換体から分離しなければならない。イオン交換体
と蛋白質含有液状媒体との分離は、同じく、濾過または
遠心分離によって行うことができる。蛋白質含有液状媒
体は、蛋白質回収のため、公知の態様で処理できる。
を使用する場合、公知の態様で、例えば、超音波、リゾ
チーメ、浸透衝撃、冷凍／解凍または上記方策の組合せ
によって、細胞を細解できる。蛋白質の保護のため、緩
衝媒体を使用するのが好ましい。大規模で作業する場合
は、細解された細胞および細胞片を分離せずに、緩衝培
養媒体にイオン交換体を加えるのが有利である。粒状の
イオン交換体を使用する場合は、例えば、１〜２ｈｒ
後、上記イオン交換体を培養媒体から濾過または遠心分
離することができる。場合によっては、例えば、塩含有
緩衝液を添加することによって、吸着された蛋白質をイ
オン交換体から分離しなければならない。イオン交換体
と蛋白質含有液状媒体との分離は、同じく、濾過または
遠心分離によって行うことができる。蛋白質含有液状媒
体は、蛋白質回収のため、公知の態様で処理できる。
８つの実施例および１つの図面を参照して以下に本発明
を詳細に説明する。
を詳細に説明する。
実施例１：ＳＶ４０−Ｔ−抗原誘導体Ｔｈ（ペプチドＴ
ｈ）の可溶化 夜間に培養した、プラミドｐＴｈを含むE.coli細胞（Ｊ
Ｍ１０３）５mlを、37℃のＬ−ブロス媒体100ml中でイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）５mlで４ｈｒ誘導した。次いで、遠心分離機(Sorva
ll Rotor ss34)によって8,000rpmで５min遠心分離し
た。上澄液、即ち、Ｌ−ブロス媒体を排出し、ペレット
を緩衝液Ａ2.5ml中に懸濁させた（緩衝液Ａ：Tris-Hcl
(pH8.0)50mM,Nacl 50mM,EDTA 1mM,DTT 1mM,PMSF 1mMお
よびグリセリン10％）。細胞を細解するため、サスペン
ジョンにリゾチーメ（５mg／m1）を添加し、サンペンジ
ョンを氷上に５min保持し、超音波を３×20sec照射し、
再び氷上に15min保持した。溶解液を同容積のＱ−セフ
ァロース・ファースト・フローに加え、緩衝液中で平衡
させた。次いで、ローテータ上で系を４℃において２ｈ
ｒ振盪し、次いで、5,000rpmにおいて15min.遠心分離し
た。上澄液を放棄した。沈澱物を同容積の緩衝液Ｂに加
えた（緩衝液Ｂ：Nacl 250mMを加えた緩衝液Ａ）。次い
で、ローテータ上で４℃において15min.振盪し、次い
で、5,000rpmで15min.遠心分離した。ＤＮＡ結合アッセ
イにおいて上澄液を使用してＴｈの活性測定を行なっ
た。結果を第１表に示した。
ｈ）の可溶化 夜間に培養した、プラミドｐＴｈを含むE.coli細胞（Ｊ
Ｍ１０３）５mlを、37℃のＬ−ブロス媒体100ml中でイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）５mlで４ｈｒ誘導した。次いで、遠心分離機(Sorva
ll Rotor ss34)によって8,000rpmで５min遠心分離し
た。上澄液、即ち、Ｌ−ブロス媒体を排出し、ペレット
を緩衝液Ａ2.5ml中に懸濁させた（緩衝液Ａ：Tris-Hcl
(pH8.0)50mM,Nacl 50mM,EDTA 1mM,DTT 1mM,PMSF 1mMお
よびグリセリン10％）。細胞を細解するため、サスペン
ジョンにリゾチーメ（５mg／m1）を添加し、サンペンジ
ョンを氷上に５min保持し、超音波を３×20sec照射し、
再び氷上に15min保持した。溶解液を同容積のＱ−セフ
ァロース・ファースト・フローに加え、緩衝液中で平衡
させた。次いで、ローテータ上で系を４℃において２ｈ
ｒ振盪し、次いで、5,000rpmにおいて15min.遠心分離し
た。上澄液を放棄した。沈澱物を同容積の緩衝液Ｂに加
えた（緩衝液Ｂ：Nacl 250mMを加えた緩衝液Ａ）。次い
で、ローテータ上で４℃において15min.振盪し、次い
で、5,000rpmで15min.遠心分離した。ＤＮＡ結合アッセ
イにおいて上澄液を使用してＴｈの活性測定を行なっ
た。結果を第１表に示した。
実施例２：ＳＶ４０−Ｔ−抗原（Ｔｈ）の可溶化 実施例１と同様に操作した。但し、本実施例では、細胞
細解後、４℃において15min.遠心分離し、上澄液および
緩衝液Ａに再懸濁させた沈澱物をイオン交換体で処理し
た。復元した蛋白質の活性を実施例１と同様に確認した
（第２表参照）。
細解後、４℃において15min.遠心分離し、上澄液および
緩衝液Ａに再懸濁させた沈澱物をイオン交換体で処理し
た。復元した蛋白質の活性を実施例１と同様に確認した
（第２表参照）。
実施例３：インターロイキン−２（ＩＬ−２）の可溶化 実施例１と同様に操作した。但し、本実施例の場合は、
ＳＶ４０−Ｔ−抗原の代わりに、プラスミドptac４を含
むE.coli細胞によって調製したＩＬ−２を可溶化した。
実施例１とは異なり、緩衝液Ｂ中のＮａＣｌ濃度を500m
Mに上昇した。可溶化したＩＬ−２の活性をＴ細胞成長
テストによって確認した（第３表参照）。
ＳＶ４０−Ｔ−抗原の代わりに、プラスミドptac４を含
むE.coli細胞によって調製したＩＬ−２を可溶化した。
実施例１とは異なり、緩衝液Ｂ中のＮａＣｌ濃度を500m
Mに上昇した。可溶化したＩＬ−２の活性をＴ細胞成長
テストによって確認した（第３表参照）。
実施例４：インターロイキン２（ＩＬ−２）の可溶化 実施例３と同様に操作した。但し、本実施例の場合は、
細胞細解後、４℃において15min.遠心分離し、上澄液お
よび緩衝液Ａに再懸濁させた沈澱物をイオン交換体で処
理した。可溶化した蛋白質の活動度を実施例３と同様に
確認した（第４表参照）。
細胞細解後、４℃において15min.遠心分離し、上澄液お
よび緩衝液Ａに再懸濁させた沈澱物をイオン交換体で処
理した。可溶化した蛋白質の活動度を実施例３と同様に
確認した（第４表参照）。
実施例５：ｖ−ｍｙｂの可溶化 E.coli HB101によって(trp監視下で；pvm2028)生成させ
たオンコ蛋白質v-mvbの包含体をＳ−セファロース−フ
ァースト−フロー（Ｓ−セファロース−ＦＦ）によって
可溶化した。この場合、陰イオン交換体の吸着は認めら
れなかった。
たオンコ蛋白質v-mvbの包含体をＳ−セファロース−フ
ァースト−フロー（Ｓ−セファロース−ＦＦ）によって
可溶化した。この場合、陰イオン交換体の吸着は認めら
れなかった。
実施例６；Ｔ２６０の可溶化 実施例５と同様に、Ｔ−抗原−ペプチドＴ２０６(Journ
al of Virology,June 1988,P.1999-2006参照）の包含体
をＳ−セファロースを可溶化した。
al of Virology,June 1988,P.1999-2006参照）の包含体
をＳ−セファロースを可溶化した。
実施例７および８：３ｄrifの可溶化 実施例１と同様、新種のリファンピシンの抵抗力の基本
をなす膜蛋白質（３ｄrif）の包含体をＱ−セファロー
スおよびフェニルセファロースで可溶化した。３ｄrif
については、P.HeinrichによるMunich大学の学位論文(1
987年)106頁以降に記載されている。
をなす膜蛋白質（３ｄrif）の包含体をＱ−セファロー
スおよびフェニルセファロースで可溶化した。３ｄrif
については、P.HeinrichによるMunich大学の学位論文(1
987年)106頁以降に記載されている。
略号リスト ＩＰＴＧ＝イソプロピル−β−Ｄ−チオラクトピラノシ
ド ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸 ＤＴＴ＝ジチオトレイトール ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル ｃｐｍ＝counts per min 生体材料リスト E.coli JM103 Nucleic Acids Res.,9(1981)309-321参
照 E.coli HB101 J.Mol.Biol.,4(1969)459-472参照 CL3-T（細胞） Biochemistry,22(1983)251-255参照 PVM2028（プラスミド） EMBO J.,6(1987)2719-2725参
照 PTh（プラスミド） J.Virol.,62(1988)1999-2006参照 ｔｒｐ 通常の販売プロモータ
ド ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸 ＤＴＴ＝ジチオトレイトール ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル ｃｐｍ＝counts per min 生体材料リスト E.coli JM103 Nucleic Acids Res.,9(1981)309-321参
照 E.coli HB101 J.Mol.Biol.,4(1969)459-472参照 CL3-T（細胞） Biochemistry,22(1983)251-255参照 PVM2028（プラスミド） EMBO J.,6(1987)2719-2725参
照 PTh（プラスミド） J.Virol.,62(1988)1999-2006参照 ｔｒｐ 通常の販売プロモータ
第１図は、ｐＴｈの環状プラスミドのマップである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エイヴリル・アーサー ドイツ連邦共和国 ミュンヘン 40、レー メルシュトラーセ 25
Claims (8)
- 【請求項１】培養した細胞から搾出した不溶の蛋白質を
可溶化する方法において、不溶蛋白質をイオン交換体と
接触させ、次いで、イオン交換体から分離することを特
徴とする方法。 - 【請求項２】E.Coliから搾出した蛋白質を可溶化するこ
とを特徴とする請求項第１項記載の方法。 - 【請求項３】培養液中で細解された細胞および細胞片の
存在のもとで蛋白質をイオン交換体と接触させることを
特徴とする請求項第１項または第２項記載の方法。 - 【請求項４】細解された細胞および細胞片を分離した
後、蛋白質をイオン交換体と接触させることを特徴とす
る請求項第１項または第２項記載の方法。 - 【請求項５】球形のイオン交換体を使用することを特徴
とする請求項第１〜４項の１つに記載の方法。 - 【請求項６】イオン交換体は、陰イオン交換体であるＱ
−セファロースであることを特徴とする請求項１〜５項
の１つに記載の方法。 - 【請求項７】イオン交換体は、陽イオン交換体であるＳ
−セファロースであることを特徴とする請求項１〜６項
の１つに記載の方法。 - 【請求項８】溶離によってイオン交換体から蛋白質を分
離することを特徴とする請求項１〜７項の１つに記載の
方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3802045.9 | 1988-01-25 | ||
| DE3802045 | 1988-01-25 | ||
| EP88115908.1 | 1988-09-27 | ||
| EP88115908A EP0325691B1 (de) | 1988-01-25 | 1988-09-27 | Verfahren zur Solubilisierung von unlöslichem Protein |
| EP3802045.9 | 1988-09-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01233299A JPH01233299A (ja) | 1989-09-19 |
| JPH0662666B2 true JPH0662666B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=25864237
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP216789A Expired - Lifetime JPH0662666B2 (ja) | 1988-01-25 | 1989-01-10 | 不溶蛋白質の可溶化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0662666B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0529086B1 (en) * | 1991-02-26 | 1999-05-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for purifying human bcdf |
| JPH11514334A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-12-07 | チロン コーポレーション | タンパク質の可溶化、精製、および再生の方法 |
-
1989
- 1989-01-10 JP JP216789A patent/JPH0662666B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01233299A (ja) | 1989-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06102034B2 (ja) | タンパク質の生産方法 | |
| US7253259B2 (en) | Protein containing serum albumin domain | |
| EP0112849B1 (en) | A process for the preparation of chymosin | |
| JPS62502615A (ja) | タンパク質の生産方法 | |
| JPH082313B2 (ja) | 不溶性封入体からの蛋白質の精製および活性化 | |
| JP3662020B2 (ja) | コラゲナーゼを精製する方法 | |
| EP2739642B1 (en) | Method for removing a lytic enzyme from a heterogeneous mixture | |
| EP0646594B1 (en) | Protein purification method | |
| JPH0521118B2 (ja) | ||
| JP2023502335A (ja) | スプリットインテインシステムを使用したタンパク質精製 | |
| US5340926A (en) | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate | |
| JP2534587B2 (ja) | 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法 | |
| EP2145896A2 (en) | Recovery of a heat shock protein | |
| JPH0662666B2 (ja) | 不溶蛋白質の可溶化法 | |
| US11124539B2 (en) | Chromatography resin, production and use thereof | |
| US5332805A (en) | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate | |
| US5051497A (en) | Method for the solubilization of an otherwise insoluble protein | |
| JP2002541155A5 (ja) | ||
| WO2000059927A1 (en) | Purification of biological preparations | |
| US6406892B1 (en) | Acetate-free purification of plasmid DNA on hydroxyapatite | |
| CN113637698A (zh) | 一种串联双促溶标签及其应用 | |
| CN1033184A (zh) | 一种选择性切割融合蛋白质的方法 | |
| JPH05336986A (ja) | タンパク質の再賦活化剤 | |
| WO1989011648A1 (en) | Process for separation and recovery of charged molecules | |
| JPS62209097A (ja) | 組換えヒトインタリユーキン−１αの精製法 |