JP2003507490A - 膜タンパク質の巻き戻し - Google Patents

膜タンパク質の巻き戻し

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JP2003507490A JP2001518736A JP2001518736A JP2003507490A JP 2003507490 A JP2003507490 A JP 2003507490A JP 2001518736 A JP2001518736 A JP 2001518736A JP 2001518736 A JP2001518736 A JP 2001518736A JP 2003507490 A JP2003507490 A JP 2003507490A
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キエファー ハンス
マイヤー クラウス
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エム・ファズィス ゲーエムベーハー
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Abstract

(57)【要約】 その天然構造に折りたたまれた膜タンパク質または受容体を製造するための方法において、まず、第１界面活性剤内で可溶化されたタンパク質が調製される。その天然型へのタンパク質の折りたたみを誘発するために、第１界面活性剤が第２界面活性剤と交換される。第１界面活性剤についても第２界面活性剤についても実施例が明示される。膜タンパク質、特に受容体、好ましくはＧタンパク質結合受容体系統由来のもの、そして膜タンパク質および受容体の部分配列、相同配列、改変配列および誘導配列を含む群から、その天然構造または活性構造に折りたたまれたタンパク質を製造するための方法であって、−第１界面活性剤内で可溶化されたタンパク質を調製するステップ、−第１界面活性剤を、タンパク質のその天然型または活性型への折りたたみを誘発する第２界面活性剤と交換するステップを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膜タンパク質、特に受容体、好ましくはＧタンパク質結合受容体系
統由来のもの、そして膜タンパク質および受容体の部分配列、相同配列、改変配
列および誘導配列を含む群から、その天然構造または活性構造に折りたたまれた
タンパク質を製造するための方法であって、 −第１界面活性剤内で可溶化されたタンパク質を調製するステップ、 −第１界面活性剤を、タンパク質のその天然型または活性型への折りたたみを誘
発する第２界面活性剤と交換するステップを含むものに関する。
【０００２】
【従来の技術】
膜タンパク質に関してこのような方法がRogl他の論文“Refolding of
Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised
by nickel chelating chromatography”−所収：FEBS Letters 432 (1998) 21〜
26−により公知である。
【０００３】 受容タンパク質を巻き戻すための方法がKiefer他の論文“Expression of an
Olfactory Receptor in Escherechia coli: Purification, Reconstitution,
and Ligand Binding”−所収：Biochemistry 35 (1996) 16077〜16084−により
公知である。
【０００４】 両方の刊行物の根底にある問題として、受容体も属する膜タンパク質は確かに
細菌中の発現ベクターを利用して大量に産生できるのではあるが、しかし産生さ
れたタンパク質が「活性」ではない。つまりこのタンパク質は膜に組込まれるの
でなく、さしあたり変性状態で存在し、界面活性剤交換によって天然構造または
活性構造に折りたたまれ（巻き戻され）ねばならない。「不活性」タンパク質の
凝集体は英語文献のなかで封入体と称されている。
【０００５】 膜タンパク質Toc75、LHCPに関してRogl他が述べている方法では第１界面活性
剤としてＮ−ラウロイルサルコシンが使用され、第２界面活性剤としてTriton
X-100（登録商標）が使用された。陰イオン界面活性剤を中性界面活性剤と交換
することによって、凝集したタンパク質の巻き戻しが得られた。
【０００６】 Kiefer他によれば、Ｇタンパク質結合臭受容器が、ニッケルカラムに結合する
間にＮ−ラウロイルサルコシンからジギトニンに界面活性剤交換することによっ
て活性構造に変えられた。
【０００７】 両方の事例において示すことができたように、さしあたり封入体の形で存在す
る凝集したタンパク質はまず、変性する界面活性剤内で可溶化され、次に上記界
面活性剤交換によってその活性構造に変えることができた。この活性構造は相応
する結合測定によって証明された。
【０００８】 膜タンパク質、特に天然型または活性型の受容体には、科学的関心だけでなく
大きな商業的関心も存在する。というのも、膜タンパク質はあらゆる生体膜の構
成成分であり、さまざまな細胞膜にその特異性を付与し、特に物質交換、刺激交
換の主因となるからである。
【０００９】 或る化合物を付属する受容体によって特異的に認識する結果、例えば、目標細
胞がその生理的状態を変えることになる。それゆえに、受容体は医薬品にとって
最も重要な目標分子であり、市販されている全薬剤の約３／４は受容体に作用し
、その大部分はやはり、ヒトゲノム中に数百の代表物質を持ついわゆるＧタンパ
ク質結合受容体に作用する。
【００１０】 このことを背景に、特異抗体、医薬品等を開発するには、膜タンパク質、特に
活性構造または天然構造の受容体を大量に用意することがきわめて望ましい。し
かしこれらのタンパク質は組織中にごく僅かな濃度で存在するだけであるので、
膜タンパク質および受容体の組換え過剰発現系を使用する必要がある。このため
一方で真核細胞（哺乳動物細胞または昆虫細胞）中に機能タンパク質を生成する
ことができるが、しかしこれらの系は高価であり、発現率が低く、このことはや
はり欠点である。細菌発現でも機能タンパク質を得ることができるが、しかしこ
の場合発現率は一般に真核発現の場合よりも一層低い。
【００１１】 このことを背景に、冒頭で触れた両方の刊行物が述べている方法ではタンパク
質が細胞系中に発現され、但しそこでタンパク質は凝集し、つまり機能的に存在
しているのではない。この方法の利点は、ごく大量のタンパク質を製造すること
ができ、Kiefer他が報告しているように、細胞タンパク質の１０％までを、従っ
て他の発現系を使った場合よりも１００〜１００００倍多くのタンパク質を製造
することができることにある。その際に生成される、Rogl他もそれについて報告
している封入体は、次にまず可溶化され、冒頭ですでに述べた界面活性剤交換に
よってその天然構造または活性構造に変えられねばならない。
【００１２】 商業的関心は、当然に、天然に存在するその配列における膜タンパク質および
受容体に向けられるだけではない。むしろ、膜タンパク質および受容体の部分配
列、相同配列、改変配列または誘導配列もこの発明の対象である。というのもそ
れらは、機能性に応じて、膜タンパク質および受容体の構造への洞察だけでなく
、合理的ドラッグデザインへの洞察も可能とするからである。
【００１３】 これに関連して触れておくなら、多くの受容体のＤＮＡ配列は既知であり、こ
のような配列はＥＭＢＬデータバンクに収録されている。これらのＤＮＡ配列は
大抵がイントロンを含んでいないので、コーディング配列はＰＣＲを介してゲノ
ムＤＮＡから、またはＲＴ−ＰＣＲを介してｍＲＮＡから製造することができる
。このＤＮＡは次に相応する発現ベクター内にクローニングすることができる。
【００１４】 しかし翻訳生成物の構造が未知であり、発明対象のタンパク質を十分な量で調
製すると、構造をさらに解明するために結晶化実験等が可能となる。
【００１５】 なお触れておくなら、真核発現した受容体と細菌発現した受容体はグリコシレ
ーションによって区別することができる。つまりＧタンパク質結合受容体がＮ末
端に単数または複数の糖鎖形成部位を有し、これらの部位は小胞体内で、または
後にゴルジ装置内で、オリゴ糖類によって修飾される。それに対して細菌はこれ
らの配列を修飾しない。
【００１６】 タンパク質の一部をＮ−グリコシダーゼＦまたはＮ−グリコシダーゼＡで処理
することによってサッカリド成分は分離することができ、タンパク質が真核細胞
中に発現された場合、この処理前と処理後でＳＤＳゲル上でタンパク質移動距離
の違いを検出することができる。細菌発現タンパク質では移動距離の違いを検出
できない。
【００１７】 冒頭で触れた刊行物に述べられた膜タンパク質もしくは受容タンパク質製造方
法は活性構造をもたらすのではあるが、前記方法は本願発明者達の認識によれば
、収率が低くまた方法の再現性が悪い限りで満足できるものではない。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
このことを背景に本発明の課題は、良好な再現性において活性構造または天然
構造のタンパク質の高い収率が達成されるように、発明の属する技術分野で触れ
た方法を改良することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明によればこの課題は、第２界面活性剤が、 −アルキル−Ｎ、Ｎ−ジメチルグリシン（アルキル＝炭素数８〜１６）、 −アルキルグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基または環
状アルキル基も、グリコシド＝すべての単糖類および二糖類）、 −サッカリド・脂肪酸エステル（例えばスクロースモノドデカノアート）、 −アルキルチオグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基また
は環状アルキル基も、グリコシド＝Ｏグリコシド結合の代わりにＳグリコシド結
合を有するすべての単糖類および二糖類）、 −胆汁酸（コール酸塩、デオキシコレート）および誘導体（例えばCHAPS,
CHAPSO）、 −グルカミド（MEGA−８〜１０、HEGA）、 −レシチンおよびリゾレシチン（例えばDHPC，Ｃ１２−リゾレシチン）、 −アルキルホスホリルコリン（アルキル＝炭素数１０〜１６） の群から選択されていることによって解決される。
【００２０】 本発明の根底にある課題がこうして完全に解決される。
【００２１】 つまり本願の発明者達は、公知方法における低い収率と再現性不足が第２界面
活性剤に帰すことができることを認識した。つまり、第２界面活性剤が上記群か
ら選択されていると、意外なことに著しく高い収率と再現可能な結果が得られる
。その際、第２界面活性剤はその最終濃度が臨界ミセル濃度よりも上であること
に注意しなければならない。このｃｍｃ値は水中の両親媒性ミセル形成構造の濃
度を示し、この濃度より上でミセルが生じる。つまりｃｍｃ値は基本的に水中で
の界面活性剤の可溶性を反映する。ｃｍｃ値より上では溶存界面活性剤・単量体
の濃度は一定している。
【００２２】 幾つかの界面活性剤のｃｍｃ値が刊行物“Detergents: An Overview” J. M.
Neugebauer −所収：Methods in Enzymology 182 (1990), p. 239〜253−に記さ
れている。
【００２３】 その際、炭素数１０〜１６の鎖長を持つアルキルホスホリルコリンが第２界面
活性剤として使用されると特別好ましい。本願の発明者達は、特にＧタンパク質
結合受容体の場合この界面活性剤が巻き戻された構造において高いタンパク質収
率をもたらすことを認識した。
【００２４】 発明者達独自の測定によれば、炭素数１２、１３、１４もしくは１６のアルキ
ル基を持つアルキルホスホリルコリンのｃｍｃ値は５００、１５０、５０もしく
は５μＭである。
【００２５】 若干の界面活性剤のみがそもそも膜タンパク質を、または受容体さえ、安定的
に溶解保持することができる事実に照らし、Ｇタンパク質結合受容体に対するそ
の使用がこれまで文献には述べられていないアルキルホスホリルコリンが天然構
造への巻き戻しさえ誘発できることはなお一層意外である。アデノシン受容体に
おいて本発明者達は、第２界面活性剤としてアルキルホスホリルコリンが使用さ
れるとき、巻き戻された受容体が天然結合特性を有することを証明することがで
きた。他の受容体に関しても、上記群から選択される１つの界面活性剤で巻き戻
しを示すことができた。
【００２６】 その際好ましくは、発現ベクターで形質転換された細胞系中にタンパク質が封
入体の形で産生され、タンパク質をコードする遺伝子がこの細胞系内にクローニ
ングされており、タンパク質は好ましくは融合タンパク質の一部であり、界面活
性剤交換前または交換後に融合タンパク質から分離される。
【００２７】 本発明対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の融合タンパク質としての発
現が担体タンパク質なしの直接的発現に比べて有する利点として、これは希望す
るものではあるが発現系とは疎遠なタンパク質をプロテアーゼによる分解から保
護し、一層高い発現レベルをもたらすことができる。特にグルタチオン−Ｓ−転
移酵素（ＧＳＴ）を担体タンパク質として使用することによって、宿主細胞中で
の大量に発現したタンパク質の可溶性が高められ、単離が容易となる。担体タン
パク質はさらに、好適な抗体が存在するとき、融合タンパク質の精製に利用する
ことができる。アフィニティークロマトグラフィー精製法にも同じことが云える
。
【００２８】 その際好ましくはさらに、封入体が精製されて第１界面活性剤の添加によって
可溶化され、第１界面活性剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、硫酸ドデシル、他
の荷電された界面活性剤または尿素もしくは塩化グアニジニウムの群から、荷電
されまたは荷電されていない界面活性剤と組合せて選択されている。
【００２９】 その際に重要な点として、タンパク質を溶解させるための諸条件は変性であり
、天然構造の形成を可能としない。
【００３０】 その際全体として好ましくは、混合された脂質／界面活性剤ミセルを有する折
りたたみ緩衝液中に第２界面活性剤が存在し、折りたたみ緩衝液は好ましくは第
２界面活性剤と天然起源のリン脂質、好ましくはタンパク質が当然に存在する組
織からの脂質抽出物、とを含む。
【００３１】 この場合利点として、純粋な界面活性剤ミセルを使用するのに比べて天然タン
パク質の収率はなお向上させることができる。受容体が当然に存在する組織から
の脂質抽出物は、類似組成の脂質を使用または混合することによってシミュレー
ションすることもできる。
【００３２】 界面活性剤交換に関して好ましくは、界面活性剤交換は透析法または限外濾過
法によって、もしくはクロマトグラフィー法を介して、または第２界面活性剤を
含む緩衝液に可溶化タンパク質を希釈することによって、行われる。
【００３３】 以上述べた界面活性剤交換法は相互に交換可能であり、取扱い、処理時間およ
び達成可能な収率に関してそれぞれが特殊な利点を提供する。
【００３４】 界面活性剤交換後、タンパク質中になお少なくとも１つの保存されたジスルフ
ィド架橋が形成されねばならないが、これは好ましくは酸化型グルタチオンと還
元型グルタチオンとの混合物を添加することによって行われる。
【００３５】 折りたたまれたタンパク質はさらにプロテオリポソームに組込むことができ、
これらのプロテオリポソームは人工的に製造された小胞であり、機能性に優れた
ユニットをなしている。適切に製造されたこれらのプロテオリポソームを利用し
て、膜タンパク質／受容体で特定のプロセスを適切に調べることができる。
【００３６】 このことを背景に本発明はさらに、上記方法で製造されたタンパク質を有する
プロテオリポソームに関する。
【００３７】 本発明はさらに、その天然構造または活性構造に折りたたまれた上記種類のタ
ンパク質を製造することへの界面活性剤の使用に関し、界面活性剤は、 −アルキル−Ｎ、Ｎ−ジメチルグリシン（アルキル＝炭素数８〜１６）、 −アルキルグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基または環
状アルキル基も、グリコシド＝すべての単糖類および二糖類）、 −サッカリド・脂肪酸エステル（例えばスクロースモノドデカノアート）、 −アルキルチオグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基また
は環状アルキル基も、グリコシド＝Ｏグリコシド結合の代わりにＳグリコシド結
合を有するすべての単糖類および二糖類）、 −胆汁酸（コール酸塩、デオキシコレート）および誘導体（例えばCHAPS,
CHAPSO）、 −グルカミド（MEGA−８〜１０、HEGA）、 −レシチンおよびリゾレシチン（例えばDHPC，Ｃ１２−リゾレシチン）、 −アルキルホスホリルコリン（アルキル＝炭素数１０〜１６） の群から選択されている。
【００３８】 その他の利点は好ましい実施例についての以下の説明から明らかとなる。
【００３９】 前記特徴および以下になお説明する特徴はその都度記載した組合せにおいてだ
けでなく、本発明の枠から逸脱することなく他の組合せや単独でも勿論応用可能
である。
【００４０】
【発明の実施の形態】 本発明は、以下、個々の実施例の説明に基づいて詳しく説明される。
【００４１】 実施例１：受容タンパク質用ｃＤＮＡを用いた発現ベクターの製造 さまざまな受容タンパク質のＤＮＡ配列は、そして膜タンパク質のＤＮＡ配列
も、ＥＭＢＬデータバンクに収録されており、それらは大抵がイントロンを持っ
ていない。つまりプライマーを利用して所要のＤＮＡはＰＣＲを介してゲノム
ＤＮＡから、またはＲＴ−ＰＣＲを介してｍＲＮＡから、製造することができる
。
【００４２】 このＤＮＡは次に、融合タンパク質発現のために構成された発現ベクターにク
ローニングされる。担体タンパク質は例えば、冒頭で触れたKiefer他の論文に述
べられているようなグルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）とすることができ、
この論文では融合タンパク質が受容体ＯＲ５、ＧＳＴから生成された。発現ベク
ターは、融合タンパク質を発現する細胞系に形質転換される。タンパク質は膜に
組込まれるのでなく、少なくとも一部が凝集して封入体の形で細胞質内に存在し
、従って正しく折りたたまれてはいない。
【００４３】 実施例２：発現したタンパク質の単離 下記受容体の１つのｃＤＮＡがin-frameでベクターpGEX2a-c-Hisにクローニン
グされる：アブラザメ（Hai Squalus acanthias）由来のＡＯ−アデノシン受容
体、ヒトアドレナリン性β2受容体、ヒト神経ペプチドＹＹ１−受容体、ヒト神
経ペプチドＹＹ２−受容体、ヒトメラノコルチン−１−受容体、ヒトオキシトシ
ン受容体。このベクターは、Ｔａｃプロモーターの背後に、グルタチオン−Ｓ−
転移酵素およびそれに続くトロンビン切断部位をコードする配列、次にポリリン
カー配列、最後に６つのヒスチジンコドン、そして終了コドンを含む。
【００４４】 ベクターは大腸菌BL21株に形質転換される。タンパク質発現はIPTGの添加によ
って誘発され、細胞はさらに３時間後に得られる。リゾチーム処理と超音波溶解
後に膜と封入体は遠心によって可溶性タンパク質から分離される。
【００４５】 実施例３：タンパク質の可溶化とカラムクロマトグラフィー界面活性剤交換 封入体は１．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンを添加することによって０℃で可
溶化され、緩衝液（０．１％アルキル（Ｃ１４）ホスホリルコリン）で５倍の容
量に希釈される。この溶液にトロンビンを加え、２０℃で１６時間培養し、受容
体がＧＳＴから分離される。次に不溶性細胞構成成分が遠心除去される。
【００４６】 上澄みはNi-NTAアガロース（キアゲン）に加えて４℃で１時間培養され、受容
体がニッケルマトリックスに結合する。その後、ニッケル材料はカラムに移され
、界面活性剤交換のために０．０１％アルキル（Ｃ１４）ホスホリルコリンを第
２界面活性剤として含む緩衝液で洗浄される。これによりＮ−ラウロイルサルコ
シン（第１界面活性剤）と汚染されたタンパク質が除去される。
【００４７】 実施例４：タンパク質の再構成 再構成のために、７０％１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコ
リンと３０％１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルグリセリンとか
らなる脂質混合物が２倍（ｗ：ｗ）の量のドデシルマルトシドと一緒にクロロホ
ルムに溶かされ、真空中で溶媒が除去される。次に実施例３の精製されたタンパ
ク質が加えられ、少なくとも１時間培養される。界面活性剤はポリスチレンカラ
ム（Calbiochem社のCalbiosorb）を介して除去され、次に、取り込まれた受容体
を有するリポソームが生成する（プロテオリポソーム）。
【００４８】 リガンド結合測定によって、受容体が天然構造で存在することを示すことがで
きた。
【００４９】 実施例５：脂質／界面活性剤ミセルを使った界面活性剤交換 下記ストック溶液が調製される： −コレステロール、Sigma C8667、１００ｍｇ／ｍｌ ＣＨＣｌ3 −ヒツジ脳リン脂質、Sigma P4264、１００ｍｇ／ｍｌ ＣＨＣｌ3 −大豆レシチン、Sigma P3644、１００ｍｇ／ｍｌ ＣＨＣｌ3 −アルキル（Ｃ１６）−ホスホリルコリン１００ｍｇを５０ｍｌ瓶内で１〜
２ｍｌのＣＨＣｌ3に溶かす；２８μｇのコレステロールストック溶液、３２μ
ｌのヒツジ脳リン脂質ストック溶液、４０μｌの大豆レシチンストック溶液を添
加；ＣＨＣｌ3を蒸発させ、１５ｍｂａｒ未満で少なくとも３０分乾燥させる；
１ｍｌの水を添加して清澄溶液を得る（界面活性剤ストック溶液、
１００ｍｇ／ｍｌ） −トロンビン、Sigma T4648、１０００ｕ／ｍｌ Ｈ2Ｏ、−２０℃で放置 −サルコシル：Ｈ2Ｏ中に１０％Ｎ−ラウロイルサルコシン、オートクレーブ処
理 −１０ｘＰＢＳ：２００ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍの ＮａＣｌ、
ｐＨ７．０。
【００５０】 ２ｍｌの３％サルコシルがＰＢＳに取り込まれ、氷上で放置される。実施例
２の封入体２ｍｌが添加して振盪され、１分間超音波で処理される。その直後に
１６ｍｌの０．１％界面活性剤ストック溶液がＰＢＳに加えられる。
【００５１】 すでにここで界面活性剤交換が行われ、サルコシルがｃｍｃ値以下に希釈され
る一方、アルキル（Ｃ１６）−ホスホリルコリンの最終濃度はｃｍｃ値よりも上
である。
【００５２】 １５ｕのトロンビンを添加後、融合タンパク質を分離するために溶液は２０℃
に一夜保たれる。
【００５３】 その後、溶液は４℃で３０分間、４００００ｒｐｍで遠心され、上澄みが取り
除かれる。
【００５４】 この上澄みに１Ｍストック溶液（ｐＨ７．０）から２０ｍＭイミダゾールが添
加される。この溶液は適宜に精製されたカラム材料Ni-NTA superflow （キアゲ
ン）に添加され、材料の沈殿を防止するために低温室（４〜８℃）内で１時間マ
イルドに回転させられる。こうして受容タンパク質がカラム材料に結合する。
【００５５】 次にカラム材料が２０００ｒｐｍで１時間遠心され、上澄みは残りの上澄みが
ベッド容積に一致するまで除去される。Ni-NTAアガロースが取り込まれ、カラム
に加えられる。毎分２ｍｌの流量において４０ｍｌの０．０１％界面活性剤スト
ック溶液でＰＢＳ内で洗浄され、これにより、ｃｍｃ値に注意しながら他の界面
活性剤交換が行われる。
【００５６】 カラムは次に１０ｍｌのＰＢＳ／０．０１％界面活性剤ストック溶液
／０．３Ｍイミダゾールで溶出され、２８０ｎｍで吸収する画分が集められる。
【００５７】 その後、４℃で２リットルのＰＢＳに対して透析が４時間行われ、１００ｘス
トック溶液から１ｍＭ ＧＳＨ／０．１ｍＭ ＧＳＳＧが水に添加される。
【００５８】 溶液は次に４℃で４８時間放置され、その後、フロー透析によってアデノシン
結合が検出可能であった。つまり受容体は天然型で存在した。
【００５９】 実施例６：タンパク質を精製することなく界面活性剤交換によるアドレナリン
性β2受容体の巻き戻し 実施例２のアドレナリン性β2受容体を含有した封入体が１．５％Ｎ−ラウロ
イルサルコシンを添加することによって０℃で可溶化され、１０倍の容量の
０．１％ドデシル−β−Ｄ−マルトシド溶液で２０ｍＭ Ｎａ−マロン酸緩衝液
ｐＨ６．０に希釈される。次にトロンビン（タンパク質１ミリグラム当り５０ユ
ニット）が添加され、２０℃で１時間培養される。遠心後、実施例４におけると
同様に脂質膜上に上澄みが加えられ、プロテオリポソーム内でタンパク質が再構
成される。
【００６０】 成功した巻き戻しはアドレナリン性β受容体（分子プローブのBODIPY-TMR-
CGP 12177）の蛍光リガンドの結合を測定することによって検出される。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 膜タンパク質、特に受容体、好ましくはＧタンパク質結合受
    容体系統由来のもの、そして膜タンパク質および受容体の部分配列、相同配列、
    改変配列および誘導配列を含む群から、その天然構造または活性構造に折りたた
    まれたタンパク質を製造するための方法であって、 −第１界面活性剤内で可溶化されたタンパク質を調製するステップ、 −第１界面活性剤を、タンパク質のその天然型または活性型への折りたたみを誘
    発する第２界面活性剤と交換するステップを含み、 第２界面活性剤が、 −アルキル−Ｎ、Ｎ−ジメチルグリシン（アルキル＝炭素数８〜１６）、 −アルキルグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基または環
    状アルキル基も、グリコシド＝すべての単糖類および二糖類）、 −サッカリド・脂肪酸エステル（例えばスクロースモノドデカノアート）、 −アルキルチオグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基また
    は環状アルキル基も、グリコシド＝Ｏグリコシド結合の代わりにＳグリコシド結
    合を持つすべての単糖類および二糖類）、 −胆汁酸（コール酸塩、デオキシコレート）および誘導体（例えばCHAPS,
    CHAPSO）、 −グルカミド（MEGA−８〜１０、HEGA）、 −レシチンおよびリゾレシチン（例えばDHPC，Ｃ１２−リゾレシチン）、 −アルキルホスホリルコリン（アルキル＝炭素数１０〜１６） の群から選択されていることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 混合された脂質／界面活性剤ミセルを有する折りたたみ緩衝
    液中に第２界面活性剤があることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 折りたたみ緩衝液が第２界面活性剤と天然起源のリン脂質、
    好ましくはタンパク質が当然に存在する組織からの脂質抽出物、とを含むことを
    特徴とする、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 界面活性剤交換が透析法または限外濾過法によって行われる
    ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 界面活性剤交換がクロマトグラフィー法を介して行われるこ
    とを特徴とする、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 第２界面活性剤を含む緩衝液に可溶化タンパク質を希釈する
    ことによって界面活性剤交換が行われることを特徴とする、請求項１記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 界面活性剤交換後、好ましくは酸化型グルタチオンと還元型
    グルタチオンとの混合物を添加することによって、タンパク質中に少なくとも
    １つの保存されたジスルフィド架橋が形成されることを特徴とする、請求項１〜
    ６のいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 折りたたまれたタンパク質がプロテオリポソームに組込まれ
    ることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 発現ベクターで形質転換された細胞系中にタンパク質が封入
    体の形で産生され、タンパク質をコードする遺伝子がこの細胞系内にクローニン
    グされていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 タンパク質が融合タンパク質の一部であり、界面活性剤交
    換前または交換後に融合タンパク質から分離されることを特徴とする、請求項
    １〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 封入体が精製され、第１界面活性剤の添加によって可溶化
    されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 Ｎ−ラウロイルサルコシン、硫酸ドデシル、他の荷電され
    た界面活性剤または尿素もしくは塩化グアニジニウムの群から、荷電されまたは
    荷電されていない界面活性剤と組合せて、第１界面活性剤が選択されていること
    を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 第２界面活性剤が臨界ミセル濃度よりも上で使用されるこ
    とを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 炭素数１０〜１６の鎖長を持つアルキルホスホリルコリン
    が第２界面活性剤として使用されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれ
    か１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法によって製造さ
    れたタンパク質を有するプロテオリポソーム。
  16. 【請求項１６】 膜タンパク質、特に受容体、好ましくはＧタンパク質結合
    受容体系統由来のもの、そして膜タンパク質および受容体の部分配列、相同配列
    、改変配列および誘導配列を含む群から、その天然構造または活性構造に折りた
    たまれたタンパク質を製造することへの界面活性剤の使用において、界面活性剤
    が、 −アルキル−Ｎ、Ｎ−ジメチルグリシン（アルキル＝炭素数８〜１６）、 −アルキルグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基または環
    状アルキル基も、グリコシド＝すべての単糖類および二糖類）、 −サッカリド・脂肪酸エステル（例えばスクロースモノドデカノアート）、 −アルキルチオグリコシド（アルキル＝炭素数５〜１２、分枝鎖アルキル基また
    は環状アルキル基も、グリコシド＝Ｏグリコシド結合の代わりにＳグリコシド結
    合を有するすべての単糖類および二糖類）、 −胆汁酸（コール酸塩、デオキシコレート）および誘導体（例えばCHAPS,
    CHAPSO）、 −グルカミド（MEGA−８〜１０、HEGA）、 −レシチンおよびリゾレシチン（例えばＤＨＰＣ，Ｃ１２−リゾレシチン）、 −アルキルホスホリルコリン（アルキル＝炭素数１０〜１６） の群から選択されていることを特徴とする使用。
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