ES2257642T3

ES2257642T3 - Procedimiento para la purificacion de proteinas expresadas bacterialmente.

Info

Publication number: ES2257642T3
Application number: ES03100064T
Authority: ES
Inventors: Luciano Capponi; Mara Rossi
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2004-01-19
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2023-01-15
Also published as: IL176763A; NO20063280L; AU2004313698A1; EP1439191B1; CY1105285T1; JP2007537150A; SI1439191T1; DK1439191T3; JP4865569B2; CA2552790C; IL176763A0; EP1439191A1; WO2005068500A1; ATE322506T1; DE60304435D1; PT1439191E; DE60304435T2; AU2004313698B2; CA2552790A1

Abstract

Procedimiento para la recuperación de una quimioquina expresada en células hospedadoras procariotas en forma de cuerpos de inclusión, y su subsiguiente purificación, caracterizado porque interpone una etapa de Cromatografía de Fase Inversa entre la etapa de solubilización de las proteínas agregadas en los cuerpos de inclusión/desnaturalización y la etapa de renaturalización/replegamiento.

Description

Procedimiento para la purificación de proteínas expresadas bacterialmente.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para la purificación de proteínas expresadas en células procariotas.

Antecedentes de la invención

La tecnología de ADN recombinante hace posible la producción de grandes cantidades de proteínas deseadas. Las bacterias representan una fuente particularmente adecuada para la producción de proteínas recombinantes con fines de purificación. Se les puede cultivar en muy grandes cantidades bajo condiciones bien definidas, y su degradación es relativamente sencilla para la extracción de las proteínas. De manera muy importante, las técnicas de clonación molecular permiten alcanzar altos niveles de expresión en bacterias de prácticamente cualquier proteína de cualquier organismo, bacteriano o no. Desgraciadamente, las proteínas expresadas en bacterias son, a menudo, difíciles de purificar debido a su tendencia a precipitar en el interior de la célula. La proteína precipitada forma cuerpos de inclusión: estructuras densas y granulares que se distribuyen por todo el citoplasma. La formación de cuerpos de inclusión es especialmente frecuente en el caso de proteínas no bacterianas, aunque incluso las proteínas bacterianas nativas exhiben una tendencia a la agregación cuando se expresan en niveles muy elevados. No se sabe exactamente cómo se forman, pero se piensa que la proteína presenta un plegamiento parcial o incorrecto. La principal desventaja de los cuerpos de inclusión es que la extracción de la proteína de interés requiere el empleo de agentes desnaturalizantes. Esto puede causar problemas cuando se debe obtener una proteína plegada nativa, porque los métodos de replegamiento no siempre tienen 100% de eficacia, y pueden ser difíciles de mejorar.

La ventaja de los cuerpos de inclusión es que, por lo general, permiten niveles más altos de expresión, y se pueden separar fácilmente de una gran proporción de proteínas citoplásmicas bacterianas por centrifugación, ofreciendo, de esta forma, una eficaz etapa de purificación.

Para la lisis bacteriana de E. coli están disponibles técnicas tales como la lisis mecánica, sonicación, lisis enzimática, y lisis por detergente. Sin embargo, estas técnicas requieren instrumentación especial o muestran ciertas limitaciones. Lo que es aún más importante, estos métodos no pueden recuperar por completo proteínas recombinantes solubles ni los cuerpos de inclusión. Por lo tanto, el rendimiento de las proteínas recombinantes puede ser muy bajo. Es necesario explorar métodos alternativos para mejorar los rendimientos en proteínas, recuperando tanto la fracción soluble como la insoluble de la proteína recombinante.

Musacchio et al. (1996, Vaccine 15:751-758) describen un procedimiento para la recuperación de la proteína Opic expresada en E. coli en forma de cuerpos de inclusión, en el cual la proteína recombinante se solubiliza y purifica sobre una columna de fase inversa. Finalmente, la proteína eluida se somete a plegamiento.

El documento WO 98/14467 describe un procedimiento para la purificación de proteínas quimioquinas a partir de cuerpos de inclusión, en el que la proteína se purifica utilizando cromatografía de fase inversa tras la renaturalización.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, se interpone una etapa de Cromatografía de Fase Inversa (RPC) entre la etapa de extracción/desnaturalización y la subsiguiente etapa de plegamiento, dando como resultado un incremento del rendimiento de la quimioquina y otras ventajas que resultarán evidentes en la siguiente descripción. Se cree que la separación de la mayoría de las impurezas derivadas de la célula en la etapa RPC ayuda a obtener un rendimiento mayor en la subsiguiente etapa de plegamiento, aunque la invención se debe considerar de manera independiente de esta hipótesis. Los compuestos se adhieren a las columnas de HPLC de fase inversa en la fase móvil acuosa alta y se eluyen desde las columnas de HPLC RP con una fase móvil orgánica alta. En la HPLC RP, los compuestos se separan sobre la base de su carácter hidrófobo. Dado que las columnas son tubulares, las dimensiones de las mismas habitualmente adoptan el siguiente formato, diámetro interno x longitud (por ejemplo, 4,6 mm x 250 mm).

La fase estacionaria está formada, por lo general, por cadenas de alquilo hidrófobas (-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{3}) que interactúan con el analito.

De hecho y de forma característica, los medios para RPC están altamente sustituidos con ligandos hidrófobos, y la unión de sustancias a los medios RPC suele ser muy fuerte y requiere disolventes orgánicos para la elución.

La RPC SOURCE® (Amersham) se puede utilizar en el intervalo de pH completo. La RPC SOURCE® está diseñada para separaciones preparativas rápidas y de alto rendimiento de biomoléculas tales como proteínas, péptidos y oligonucleótidos. Los medios tienen matrices basadas en poliestireno/divinil-benceno rígido, con perlas de tamaño único de diámetros de 15 \mum o 30 \mum, respectivamente.

La distribución del tamaño de poros está controlada y es reproducible. La amplia estabilidad a pH y la elevada capacidad, hacen de los medios RPC SOURCE® una interesante alternativa a los medios basados en sílice. La elevada estabilidad química de la matriz ofrece una flexibilidad incomparable de elección de las condiciones de funcionamiento y limpieza.

Los disolventes de fase inversa se instalan, por convención, en los canales de HPLC A y B. El disolvente A, por convención, es el disolvente acuoso (agua), y el disolvente B, por convención, es el disolvente orgánico (acetonitrilo, metanol, propanol). Es importante atenerse a estas convenciones, dado que los términos A y B se utilizan, con frecuencia, para hacer referencia a los disolventes acuoso y orgánico, respectivamente. El disolvente A es, por lo general, agua de categoría HPLC con 0,1% de ácido. Generalmente, el disolvente B es un disolvente orgánico de categoría HPLC tal como acetonitrilo o metanol, con 0,1% de ácido. El ácido se utiliza para mejorar la forma del pico cromatográfico, y para ofrecer una fuente de protones en la LC/MS de fase inversa. Los ácidos más frecuentemente usados son ácido fórmico, ácido trifluoroacético, y ácido acético.

Como se ha mencionado anteriormente, el procedimiento según la invención representa una mejora de este procedimiento, consistente en que la etapa de Cromatografía de Fase Inversa (RPC) se interpone entre la etapa de extracción/desnaturalización y la subsiguiente etapa de replegamiento. Con el fin de que la descripción sea completa, no obstante, en este documento se describen todas las etapas que se llevan normalmente a cabo en un procedimiento clásico para purificar quimioquinas recombinantes producidas en células hospedadoras procariotas.

Normalmente, un procedimiento clásico para purificar una proteína producida en células procariotas incluye también las siguientes etapas:

\bullet: Preparación de lisados celulares a partir de las células hospedadoras;

\bullet: Aislamiento de los cuerpos de inclusión;

\bullet: Solubilización de las proteínas quimioquinas agregadas en la etapa de cuerpos de inclusión/desnaturaliza-ción;

\bullet: Replegamiento/renaturalización de las proteínas solubilizadas.

Preparación de lisados celulares a partir de las células hospedadoras

La quimioquina expresada en células procariotas debe ser extraída, en primer lugar, de las células hospedadoras en las que se ha expresado. Hay disponibles diversos métodos para lisar células. La elección de uno de estos métodos en un caso específico depende del tipo de células hospedadoras y de la cantidad de células que se deben lisar.

La primera elección que se debe hacer es la de la naturaleza y el pH del sistema tampón que se desea emplear. Esta depende de:

\bullet: la estabilidad de la proteína diana con respecto al pH y al compuesto tamponante;

\bullet: el procedimiento de purificación.

Para evitar pérdidas de tiempo y de proteínas con una etapa adicional de intercambio de tampón, es recomendable elegir un tampón que sea compatible con la primera etapa cromatográfica (véase cromatografía). Los tampones y sus intervalos de pH se enumeran en la Tabla 1. Los tampones más utilizados son fosfato, tris-HCl y HEPES NaOH. Normalmente, se les emplea en concentraciones de 20-50 mM.

TABLA 1

Tampón	Intervalo de pH
Ácido cítrico-NaOH	2,2-6,5
Citrato sódico-ácido cítrico	3,0-6,2
Acetato sódico-ácido acético	3,6-5,6
Sal sódica del ácido cacodílico-HCl	5,0-7,4
MES-NaOH	5,6-6,8
Dihidrógeno-fosfato sódico-hidrógeno-fosfato disódico	5,8-8,0
Imidazol-HCl	6,2-7,8
MOPS-KOH	6,6-7,8
Hidrocloruro de trietanolamina-NaOH	6,8-8,8
Tris-HCl	7,0-9,0
HEPES-NaOH	7,2-8,2
Tricina-NaOH	7,6-8,6
Tetraborato sódico-ácido bórico	7,6-9,2
Bicina-NaOH	7,7-8,9
Glicina-NaOH	8,6-10,6

Dependiendo de la proteína quimioquina diana, puede ser necesario agregar compuestos al tampón de lisis para mejorar la estabilidad de la proteína diana, y para mantenerla en solución. Los aditivos más frecuentemente utilizados, sus concentraciones eficaces, y su propósito general se enumeran en la Tabla 2.

TABLA 2

Clase de aditivo	Ejemplo	Concentración	Propósito
Sales	NaCl, KCl, (NH_{4})_{2}SO_{4}	50-150 mM	Mantener la potencia iónica del
			medio
Detergentes	Desoxicolato, Triton X-100	0,1-1%	solubilización de proteínas
			escasamente solubles
Glicerol		5-10%	Estabilización
Glucosa o sacarosa		25 mM	Estabilización de las membranas
			lisosómicas, reducir la liberación
			de proteínas
Quelantes metálicos	EDTA, EGTA	1 mM	Reducir los daños por oxidación,
			quelar iones metálicos
Agentes reductores	2-mercapto-etanol, DTT	0,05%	Reducir la oxidación
Ligandos, iones metálicos	Mg^{2+}, ATP, GTP	1-10 mM	Estabilización

Una clase importante de aditivos es la de los inhibidores de proteasa. En general, la disrupción celular da lugar a la liberación de enzimas proteolíticas, que podría reducir el rendimiento global. Para controlar esta proteólisis indeseable, puede ser necesario agregar una combinación de inhibidores de proteasas a la suspensión celular. Dado que muchos de estos compuestos no son demasiado estables en soluciones acuosas, es importante que se les agregue al tampón de lisis a partir de una solución madre en un disolvente orgánico (metanol, etanol, isopropanol, o DMSO) inmediatamente antes de su uso.

Aun cuando resulta imposible ofrecer un tampón de lisis general, un adecuado tampón inicial sería:

Tris-HCl 50 mM, pH 7,5

NaCl 100 mM

DTT (ditiotreitol) 1 mM

Glicerol al 5% (posiblemente).

La mayoría de los métodos de lisis determinan la liberación de ácidos nucleicos (ADN y ARN). Éstos se deben separar porque pueden provocar problemas de viscosidad, o a causa de su interferencia con las subsiguientes etapas cromatográficas. Existen diferentes métodos:

\bullet: Digestión enzimática mediante la adición de ADNasa I (1 \mug/ml( al lisado celular. La mezcla se incuba sobre hielo durante 10-15 min.

\bullet: Degradación mecánica mediante cizallamiento durante la sonicación. Cuando se utilice la Célula de Presión Francesa es aconsejable agregar ADNasa a la suspensión celular.

\bullet: Precipitación por tratamiento con polietilen-imina (0,1% (peso/volumen)), o un sulfato de protamina (1% (peso/volumen)), seguida de centrifugación. Los precipitantes se deben agregar al lisado celular e incubar la solución durante 30 min a 4ºC.

Se utilizan diferentes métodos para la preparación de lisados celulares a partir de células de E. coli.

La sonicación es la técnica más popular para lisar pequeñas cantidades de células (1-6 l de cultivo celular). Las células se lisan por cizallamiento líquido y cavitación. Durante la sonicación también se produce el cizallamiento del ADN, por lo que no es preciso agregar ADNasa a la suspensión celular. El problema principal es el control de la temperatura. Se soluciona manteniendo la suspensión sobre hielo y utilizando una serie de pulsos breves (5-10 seg) con pausas (10-30 seg) para reestablecer una temperatura baja. Para cantidades de células mayores que 50 g, el método presenta un valor limitado, debido a la dificultad para mantener una temperatura baja, y a los prolongados tiempos de sonicación necesarios para alcanzar una lisis adecuada.

Los homogeneizadores son los dispositivos más frecuentes para lisar bacterias. Las prensas lisan las células mediante la presurización de la suspensión celular y la súbita interrupción de la presión. Se produce un cizallamiento líquido capaz de lisar las células. Las presiones típicas de funcionamiento de los homogeneizadores de tipo más antiguo, es decir, la prensa francesa y el homogeneizador de Manton-Gaulin, son de 6.000-10.000 psi. Por lo general, se requieren múltiples (2-3) ciclos para conseguir una lisis adecuada. No obstante, las elevadas presiones de funcionamiento dan lugar a un incremento de las temperaturas de funcionamiento.

Por lo tanto, las células de presión se enfrían (4ºC) antes de su uso. Además del control de temperatura, se debe tener cuidado para no inactivar las proteínas por espumación.

Los homogeneizadores modernos son, a menudo, continuos y se pueden hacer funcionar a presiones más altas. En EMBL, los inventores disponen de un Avestin Emulsiflex-C5 capaz de lisar eficazmente células de E. coli en un único ciclo a 15.000 psi (100 MPa).

La lisis enzimática se basa en la digestión de la capa de péptido-glicanos de la pared celular bacteriana por lisozima. No obstante, las bacterias gram- negativas poseen una membrana externa que es exterior con respecto a la pared celular y que se debe hacer permeable para exponer la capa de péptido-glicanos. Tris, utilizado a menudo como tampón en los métodos de lisis, permeabiliza eficazmente las membranas externas. Este efecto se puede potenciar con la adición de EDTA (1 mM). EDTA produce la quelación de los iones magnesio que estabilizan la membrana. Durante la lisis celular, se libera, con frecuencia, una cantidad importante de ADN, siendo necesario agregar ADNasa (1 mg/ml) para reducir la viscosidad de la preparación. La lisis enzimática celular se puede llevar a cabo a cualquier escala, pero para preparaciones a gran escala, la lisozima y ADNasa pueden resultar excesivamente costosas. Para aumentar el nivel de lisis celular, es posible someter la solución a sonicación (véase antes).

Un método de lisis alternativo consiste en congelar directamente las células en nitrógeno líquido, y triturarlas hasta formar un polvo, usando un mortero y mano congelados con nitrógeno líquido. El polvo se puede almacenar a -80ºC durante un período indefinido de tiempo, y el lisado celular se puede preparar agregando el polvo a 5 volúmenes de tampón.

El grado de solubilización y la estabilidad de la proteína solubilizada dependen del tipo y concentración de detergente. No es posible ofrecer normas generales acerca de ninguna de estas variables, sino que deben ser optimizadas de manera experimental. Es importante para la solubilización la relación detergente- proteína. En relaciones bajas (1:10), se lisan las membranas y se forman grandes complejos que contienen proteína, detergente y lípidos de membrana. Con relaciones progresivamente mayores, se obtienen complejos más pequeños. Por último, con relaciones de 10:1 hasta 20:1, se forman complejos individuales de detergente-proteína exentos de lípidos de membrana. Para determinar las condiciones óptimas, es importante variar tanto el detergente como la concentración de proteínas.

En la Tabla 3 se indican los detergentes normalmente utilizados y sus concentraciones críticas en micela (cmc).

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TABLA 3

Clase de detergente	Ejemplos	cmc (mM)
No iónico	Triton X-100	0,30
	Octilglucósido	25
Iónico bipolar	CHAPS	0,5
	Zwittergen 3-12	3,6
Iónico	Desoxicolato sódico	4 (a pH > 8)

Aislamiento de cuerpos de inclusión

En la célula se produce una competición entre plegamiento y agregaciones. En muchos casos y en numerosos sistemas hospedadores, las proteínas recombinantes se acumulan en el interior de la célula, formando agregados insolubles. Las proteínas en estos denominados cuerpos de inclusión se encuentran inactivas y desnaturalizadas en su mayor parte. Adicionalmente, puede haber presentes dímeros y multímeros. Sin embargo, la expresión de proteínas recombinantes en cuerpos de inclusión puede ser también ventajosa:

\bullet: La proteína recombinante depositada en los cuerpos de inclusión puede representar 50% o más de la proteína celular total.

\bullet: Los cuerpos de inclusión contienen, a menudo, de manera casi exclusiva la proteína sobre-expresada.

\bullet: En los cuerpos de inclusión, la proteína está protegida contra la degradación proteolítica.

\bullet: La expresión en los cuerpos de inclusión protegerá la célula contra la toxicidad de la proteína recombinante.

El problema principal consiste en recuperar la proteína biológicamente activa y/o soluble en un rendimiento elevado. Para lograrlo, la proteína en los cuerpos de inclusión se debe solubilizar y replegar in vitro. Este procedimiento se lleva a cabo en tres fases:

Los cuerpos de inclusión tienen un densidad relativamente alta y, por lo tanto, se pueden granular por centrifugación. Las células se destruyen, generalmente, por homogeneización de alta presión (opcionalmente, después de un tratamiento con lisozima). Es importante que la lisis celular sea completa, porque las células intactas sedimentan junto con los cuerpos de inclusión, contaminando de esta forma la preparación. Tras la centrifugación, el granulado se lava con tampón que contiene concentraciones bajas de agentes caotrópicos (por ejemplo, guanidina-HCl o urea 0,5-1 M), o detergentes (por ejemplo, Triton X-100 al 1% o 1 mg/ml de desoxicolato sódico). Esta etapa de lavado es necesaria para separar los contaminantes, especialmente proteínas (proteasas) que puedan haber sido absorbidos en los cuerpos de inclusión hidrófobos durante el procesamiento.

Solubilización de las proteínas agregadas en los cuerpos de inclusión

Los cuerpos de inclusión lavados se resuspenden e incuban en tampón que contiene un potente agente desnaturalizante y un agente reductor (habitualmente, DTT o b- mercapto-etanol 20 mM). La adición de un agente reductor mantiene todas las cisteínas en estado reducido y escinde los enlaces de disulfuro formados durante la preparación. Se utilizan típicamente temperaturas de incubación mayores de 30ºC para facilitar el proceso de solubilización.

Las condiciones óptimas para la solubilización son específicas para cada proteína, y se deben determinar para cada una de ellas.

Tras la solubilización, la solución se puede centrifugar o filtrar para separar los agregados remanentes, que podrían actuar como núcleos capaces de desencadenar una agregación durante el replegamiento.

De acuerdo con una realización específica de la invención que se describe más adelante, en los Ejemplos, esta etapa se señala como Etapa 1 del procedimiento específico descrito.

Replegamiento de las proteínas solubilizadas

El replegamiento de las proteínas solubilizadas se inicia con la separación del desnaturalizante. La eficacia del replegamiento depende de la competición entre el replegamiento correcto y la agregación. Para retardar el proceso de agregación, el replegamiento se lleva a cabo, habitualmente, con bajas concentraciones de proteínas, en el intervalo de 10-100 mg/ml. Adicionalmente, las condiciones de replegamiento se deben optimizar para cada proteína individual. Variables importantes son la composición del tampón (pH, potencia iónica), la temperatura, y los aditivos (frecuentemente, en combinación).

Si las proteínas contienen enlaces disulfuro, el tampón de replegamiento debe estar suplementado con un sistema redox. La adición de una mezcla de formas reducidas y oxidadas (tiol reducido 1-3 mM y una relación de 5:1 hasta 1:1 de tiol reducido a oxidado) de un reactivo de tiol de bajo peso molecular ofrece, habitualmente, el potencial redox apropiado para permitir la formación y modificación de los enlaces disulfuro. Los reactivos de modificación redox más frecuentemente utilizados son glutatión reducido y oxidado, pero también se utilizan cisteína y cisteamina.

Para determinadas proteínas, probablemente debido a una baja solubilidad de los intermedios de replegamiento, este procedimiento no resulta demasiado eficaz. De manera alternativa, la proteína se oxida por completo en presencia de un fuerte exceso de glutatión oxidado, tras lo cual se diluye en tampón de replegamiento que contiene cantidades catalíticas de glutatión reducido.

Se han descrito diferentes métodos para el replegamiento de proteínas. El método más utilizado es la separación del agente de solubilización mediante diálisis. Durante la diálisis, la concentración del agente de solubilización disminuye lentamente, lo que permite que la proteína tenga un replegamiento óptimo. La relación de los volúmenes de la muestra y del tampón de diálisis debe ser tal que a la concentración de equilibrio del agente de solubilización la proteína se haya replegado por completo.

La concentración del agente de solubilización disminuye por dilución, permitiendo que la proteína se repliegue. Habitualmente, la dilución se lleva a cabo lentamente, mediante la adición gradual de tampón, o por adición continua utilizando una bomba.

Durante la diálisis y la dilución lenta, la proteína queda expuesta durante un período prolongado de tiempo a una concentración intermedia del agente de solubilización (urea o guanidina-HCl 2-4 M), en el que no se repliega todavía pero ya no está sometida a desnaturalización, siendo, de esta manera, extremadamente propensa a la agregación. Esto se puede evitar por la rápida dilución de la solución de proteínas solubilizadas en el tampón de replegamiento. La agregación durante este proceso se puede limitar agregando agentes suaves de solubilización al tampón de replegamiento tales como sulfo-betaínas no detergentes.

Con el fin de mantener baja la concentración de la proteína desplegada, limitando de este modo la agregación, se agregan partes alícuotas de proteína desnaturalizada en momentos predefinidos al tampón de replegamiento. Los intervalos de tiempo entre dos pulsos se deben optimizar para cada proteína individual. El proceso se detiene cuando la concentración del desnaturalizador alcanza un nivel crítico con respecto al replegamiento de la proteína especí-
fica.

Según una realización específica de la invención que se describe más adelante, en la sección de Ejemplos, esta etapa se señala como Etapa 3 del proceso específico descrito.

El agente de solubilización se separa usando una etapa cromatográfica. Se ha descrito la aplicación de diferentes métodos cromatográficos:

\bullet: Cromatografía de exclusión de tamaño (por ejemplo, filtración sobre gel en una columna Superdex 75);

\bullet: Cromatografía de intercambio iónico;

\bullet: Cromatografía de afinidad (por ejemplo, IMAC con el uso de Sefarosa Quelante o agarosa NI-NTA).

El desnaturalizador se separa mientras la proteína migra lentamente a través de la columna, o unida a la matriz. Normalmente, se consigue de esta forma un elevado rendimiento de proteína activa, incluso a concentraciones de proteínas en el intervalo de mg/ml.

Ejemplos

A continuación, la invención se describirá de manera detallada con respecto a la purificación de una quimioquina expresada en E. coli. Las quimioquinas constituyen una familia de pequeñas citoquinas proinflamatorias con propiedades quimiotácticas y activadoras de leucocitos. Dependiendo de la posición de las primeras cisteínas conservadas, la familia de quimioquinas se puede dividir en quimioquinas C-C, C-X-C, y C-X_{3}-C (Baggiolini M. et al., Adv. Immunol. 1994, 55:97-179; Baggiolini M. et al., Annu Rev. Immunol. 1997, 15:675-705; Taub D. et al., Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7(4):355-76).

De manera particular, la descripción detallada que se presenta seguidamente informa sobre la purificación de un triple mutante de RANES humana. Esta proteína en su forma madura (es decir, tras la escisión de la secuencia líder MKKKWPR), tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y, en la parte adicional de esta especificación, se hará referencia a ella como RANTES triple mutante. El proceso completo se resume en el flujograma que se presenta en la Figura 1, comenzando con la etapa de "solubilización de las proteínas agregadas en los cuerpos de inclusión". Las dos etapas clásicas previas de preparación de los lisados celulares y aislamiento de los cuerpos de inclusión, se llevan a cabo utilizando los métodos conocidos en la técnica y/o anteriormente descritos.

Etapa 1

Solubilización de las proteínas agregadas en los cuerpos de inclusión

Se descongelan 60-90 g de cuerpos de inclusión que contienen RANTES triple mutante. El granulado se disuelve con 450-800 ml de tampón de solubilización (cloruro de guanidinio 6 M, Tris/HCl 0,1 M, DTT 2 mM, pH 7,5+/- 0,1) mediante el homogeneizador Polytron, hasta que dejen de ser visibles las partículas grandes (alrededor de 5 minutos). Una vez homogeneizada, la solución se lleva a una temperatura de 60 \pm 1ºC durante 30 min.

A continuación, se deja que la solución alcance la temperatura ambiente, y se filtra con una membrana de
1,2 \mum.

El material se procesa de la forma habitual en cuanto está preparado o, de forma alternativa, se puede almacenar a -80ºC.

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Etapa 2

Cromatografía de fase inversa sobre RPC Source 30 Tampones Tampón de pre-equilibrio: Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5\pm0,1, acetonitrilo al 5% (en volumen)

Se agregan 12,1 g de tris/hidroximetilamino-metano a 800-900 ml de agua purificada. El pH se ajusta a 7,5 con HCl. Se agregan 50 ml de acetonitrilo y la solución se enrasa a 1 litro con agua purificada.

Tampón de equilibrio: Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5\pm0,1, guanidina 6 M y DTT 2 mM, acetonitrilo al 5% (en volumen)

Se agregan guanidina 6 M y DTT 2 mM a 600 ml del tampón de pre-equilibrio, bajo agitación. Después de finalizar la disolución, la solución se enrasa a 1 litro con tampón de pre-equilibrio.

Tampón de lavado: Acetonitrilo al 5% (en volumen), TFA al 0,1% en agua

Se agregan 50 ml de acetonitrilo y un vial de TFA a 900 ml de agua purificada, y la solución se enrasa a 1 litro con agua purificada.

Tampón de elución: Acetonitrilo al 35% (en volumen), TFA al 0,1% en agua

Se agregan 350 ml de acetonitrilo y un vial de TFA a 500-600 ml de agua purificada, y la solución se enrasa a 1 litro con agua purificada.

Tampón de regeneración: NaOH 0,5 M, n-propanol al 60%

Se agregan 20 g de NaOH a 600 ml de n-propanol, y la solución se enrasa a 1 litro con agua purificada.

Tampón de almacenamiento: NaOH 10 mM

Se agregan 0,4 g de NaOH a 1000 ml de agua purificada.

Procedimiento

Una columna empaquetada con resina RPC Source 30 se trata con al menos 1 BV de NaOH 0,5 M y, subsiguientemente, con agua purificada hasta que el pH alcance un valor neutro. A continuación, la columna se equilibra con 3 BV de tampón de pre- equilibrio, seguido de 2-3 BV de tampón de equilibrio. Se comprueba el pH y se continúa el lavado si los parámetros del caudal de salida de la columna se encuentran fuera de los valores diana: pH 7,5\pm0,1.

Seguidamente, el material solubilizado preparado de la forma descrita se carga en la resina, en el intervalo de 5-18 mg de RANTES triple mutante/ml de resina. Una vez completa la carga de la muestra, la columna se trata con 3-4 BV de tampón de equilibrio de Tris/HCl 0,1 M + acetonitrilo al 5%, pH 7,5\pm0,1. Se recogen conjuntamente la parte mínima del caudal y el lavado.

A continuación, la columna se trata con el tampón de lavado: acetonitrilo al 5% + TFA al 0,1% en agua, hasta que el pH del caudal de salida de la columna sea ácido (control con el indicador de pH).

La elución se inicia con el tampón de elución: acetonitrilo al 35% +m TFA al 0,1% en agua. Las fracciones se recogen tan pronto como comienza el incremento de la señal de DO. Se recogen alrededor de 3-4 BV como fracción de elución.

Se calcula el contenido en proteínas de la fracción por medio del análisis a DO 280 nm (\varepsilon = 2,1). La fracción se almacena a +5\pm3ºC, a la espera de la siguiente etapa de replegamiento.

Después de finalizar la elución, se trata la columna con al menos 4 BV de tampón de regeneración, seguidos de 3 BV de agua purificada.

La columna se trata con al menos 3 BV de NaOH 0,5 M y, a continuación, se enjuaga con agua purificada.

Posteriormente, la columna se trata de con al menos 3 BV de tampón de almacenamiento, y se almacena a temperatura ambiente hasta el ciclo siguiente.

La etapa que se acaba de describir es muy eficaz para la separación de impurezas celulares y proporciona una solución, que contiene RANTES triple mutante semi- purificado, preparada para ser sometida a la etapa de replegamiento.

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Etapa 3

Replegamiento

En esta etapa se produce el replegamiento de RANTES triple mutante desplegado, eluido desde la columna de RPC, por medio de la dilución en un tampón adecuado, y el uso de un sistema redox.

Tampón de replegamiento: Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5, glutatión 0,2 mM en forma reducida, glutatión 0,02 mM en forma oxidada; conductividad 6,0\pm1 mS/cm

Se agregan 12,1 g de tris, 61,5 mg de glutatión reducido y 12,2 mg de glutatión oxidado a 900 ml de agua purificada, con agitación, se lleva a pH 7,5\pm0,1 con HCl concentrado y se enrasa a 1 litro. A continuación, la solución se almacena a temperatura refrigerada de +5ºC \pm 3ºC durante no más de dos días.

Procedimiento

Esta etapa se lleva a cabo a temperatura refrigerada (+5\pm3ºC). La fracción de elución de RPC se diluye agregándola durante la noche, gota a gota y bajo agitación suave, a un volumen adecuado de tampón de replegamiento, con el fin de alcanzar una concentración final teórica (calculada por DO) de 0,2-0,4 mg/ml.

La etapa 2 anteriormente descrita es muy eficaz para la separación de impurezas celulares, proporcionando una solución, que contiene RANTES triple mutante semi-purificada, lista para ser sometida a la etapa de replegamiento.

Etapa 4

IEC sobre SP Sefarosa FF Tampones y soluciones Tampón de equilibrio: Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5\pm0,1, conductividad 6,0\pm1 mS/cm

Se agregan 12,1 g de tris a 900 ml de agua purificada, con agitación, el pH se lleva a 7,5\pm0,1 con HCl al 37%, y la solución se enrasa a 1 litro. Se comprueba la conductividad. La solución se almacena a temperatura ambiente durante no más de dos días.

Tampón de elución: Tris/HCl 0,1 M, pH 7,5\pm0,1, NaCl 0,6 M, conductividad 57,0\pm2,0 mS/cm

Se agregan 12,1 g de tris y 35 g de NaCl a 900 ml de agua purificada, con agitación, el pH se lleva a 7,5\pm0,1 con HCl concentrado, y la solución se enrasa a 1 litro. Se comprueba la conductividad. Esta solución se almacena a una temperatura ambiente de +20ºC \pm 5ºC, y se utiliza en el plazo de dos días.

Tampón de regeneración: NaCl 1,5

Se disuelven 87,6 g de NaCl en 900 ml de agua purificada, con agitación, y la solución se enrasa a 1 litro. Esta solución se almacena a una temperatura ambiente de +20ºC \pm 5ºC, y se utiliza en el plazo de dos días.

Solución de saneamiento: NaOH 0,5 M

Se disuelven 20 g de NaOH en 900 ml de agua purificada, con agitación, y la solución se enrasa a 1 litro.

Solución de almacenamiento: NaOH 0,01 M

Se disuelven 0,4 g de NaOH en 900 ml de agua purificada, con agitación, y la solución se enrasa a 1 litro. Esta solución se almacena a una temperatura ambiente de +20ºC \pm 5ºC, y se utiliza en el plazo de dos días.

Procedimiento

La columna empaquetada con resina SP Sefarosa F se trata con 3 BV de NaOH 0,5 M, seguido de agua purificada, hasta que el pH baja a valores neutros (papel indicador de pH). A continuación, la columna se trata nuevamente con 5 o más BV de tampón de equilibrio. Se comprueban el pH y la conductividad, y se prosigue el lavado si los parámetros del caudal de salida de la columna están fuera de los valores diana: pH 7,5\pm0,1, conductividad 6\pm1 mS/cm.

A continuación, el material post-replegamiento filtrado se carga y se recoge la fracción no fijada.

Una vez finalizada la carga de la muestra, la columna se trata con 1-2 BV de tampón de equilibrio y se prosigue la recolección. En este momento, habitualmente la señal UV se encuentra en su nivel inicial.

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Seguidamente, la columna se trata con el tampón de elución. Se inicia la recolección de la fracción de elución cuando la señal UV comienza a aumentar, normalmente después del primer 0,8 BV. Se recogen 3 BV del eluato y esta fracción se almacena a 2-8ºC hasta la siguiente etapa de escisión.

Después de completar la elución, la columna se trata con al menos 4 BV de tampón de regeneración.

La columna se trata con al menos 3 BV de NaOH 0,5 M y, a continuación, se enjuaga con 3 BV de agua purificada. La columna se trata con al menos 3 BV de solución de almacenamiento y se almacena hasta el ciclo siguiente.

Etapa 5

Escisión

La etapa de escisión se utiliza para separar la secuencia líder de RANTES triple mutante (MKKKWPR) de la secuencia correcta.

Procedimiento

La escisión se lleva a cabo a una temperatura de 37\pm1ºC en un horno termostático.

La cantidad de tripsina que se debe agregar se calcula sobre la base de una relación de 1:10.000 con respecto al contenido en RANTES triple mutante, calculado por análisis de HPLC RP.

La tripsina se agrega en cuanto el material a escindir haya alcanzado la temperatura diana.

La evolución de la escisión se analiza por HPLC RP capaz de separar el pico no escindido del escindido. Habitualmente, la escisión se completa en un plazo de 3 horas. Inmediatamente después de que haya finalizado la escisión, con el objetivo de detener la reacción, el pH de la solución se lleva a 3,2 con ácido fosfórico concentrado.

Etapa 6

IEC sobre SP Sefarosa HP Tampones y soluciones Tampón A - Equilibrio-: Acetato de amonio 50 mM, pH 3,2\pm0,2, conductividad 0,4\pm0,1 mS/cm

Se agregan 2,8 ml de ácido acético a 900 ml de agua, con agitación, el pH se lleva a 3,2\pm0,2 con amoniaco al 25%, y la solución se enrasa a 1 litro.

Se comprueba la conductividad. La solución se almacena a una temperatura ambiente de +20ºC \pm 5ºC durante no más de dos días.

Tampón B - Elución-: Acetato de amonio 50 mM, pH 3,2\pm0,2, NaCl 1 M, conductividad 83 \pm 2 mS/cm

Se agregan 2,8 ml de ácido acético y 58,4 g de NaCl a 900 ml de agua purificada, con agitación, el pH se lleva a 3,2\pm0,2 con amoniaco al 25%, y la solución se enrasa a 1 litro. Se comprueban el pH y la conductividad.

La solución se almacena a una temperatura ambiente de +20ºC \pm 5ºC durante no más de dos días.

Solución de saneamiento: NaOH 0,5 M

Solución de almacenamiento: NaOH 0,01 M

Se disuelven 0,4 g de NaOH en 900 ml de agua purificada, con agitación, y la solución se enrasa a 1 litro. Esta solución se almacena a una temperatura ambiente de +20ºC \pm 5ºC, y se utiliza en el plazo de cinco días.

Procedimiento

El material post-escisión se diluye en relación 1:2 con agua purificada para obtener una conductividad de la solución de aproximadamente 30 mS/cm.

Esta etapa cromatográfica exige el uso de un sistema capaz de establecer gradientes entre los tampones de equilibrio y elución.

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La columna se trata con al menos 3 BV de NaOH 0,5 M, y se enjuaga con agua purificada hasta que el pH sea neutro. Entonces, la columna se trata con 4-5 o más BV de tampón de equilibrio. Se comprueban el pH y la conductividad, y se prosigue el lavado si los parámetros del caudal de salida de la columna están fuera de los valores diana: pH 3,2\pm0,2 y conductividad 0,4\pm0,1 mS/cm.

El material de partida, preparado de la forma anterior, se carga en la columna. En cuanto ha finalizado la carga, la columna se trata con 2-3 BV de tampón de equilibrio hasta que la señal UV alcanza el nivel inicial y, entonces, se trata la columna con un tampón compuesto por 60% de tampón de equilibrio y 40% de tampón de elución. Se recogen alrededor de 5-6 BV de esta fracción de lavado.

La elución se lleva a cabo con un gradiente entre 40% y 100% de tampón B en 20 BV. La elución se recoge en fracciones (1 min cada una) que se combinarán posteriormente, de acuerdo con el patrón cromatográfico que muestra habitualmente los picos de la secuencia de péptidos, la escindida (correcta) y la molécula no escindida. Sobre la base del cromatograma, se recogen las fracciones que forman el pico de interés para formar la fracción de elución.

A continuación, se trata la columna con al menos 3-4 BV de NaOH y, seguidamente, se enjuaga con 3-4 BV de agua purificada.

La columna se trata con al menos 3 BV de solución de almacenamiento y se almacena hasta el ciclo siguiente.

Etapa 7

Ultrafiltración a granel Tampones y soluciones Tampón: Acetato de amonio 50 mM, pH 4,0\pm0,1, conductividad 1,0\pm0,2 mS/cm

Se agregan 2,8 ml de ácido acético a 900 ml de agua purificada, con agitación. La solución se enrasa a 1 litro. El pH se lleva a 4,0\pm0,1 con amoniaco al 25%, y se comprueba la conductividad. Esta solución se almacena a una temperatura ambiente de +20\pm5ºC y se utiliza en el plazo de un día.

Solución de saneamiento: NaOH 0,5 M

Se disuelven 20 g de hidróxido sódico en 900 ml de agua purificada, con agitación. La solución se enrasa a 1 litro y se almacena a temperatura ambiente.

Solución de almacenamiento: NaOH 0,05 M

Se disuelven 2 g de hidróxido sódico en 900 ml de agua purificada, con agitación. La solución se enrasa a 1 litro, se almacena a una temperatura ambiente de +20\pm5ºC, y se utiliza en el plazo de tres días.

Procedimiento

El sistema de ultrafiltración está equipado con una membrana de celulosa regenerada con corte de 3KD (Millipore).

Los ultrafiltros se sanean con 200 ml de NaOH 0,5 M, reciclando la solución alcalina durante no menos de 30 min y, a continuación, se enjuagan con agua purificada hasta que el pH permeable sea menor que 7,5.

La solución de elución de la combinación SP HP se hace recircular en el sistema a una presión constante de ligeramente menos de 0,5 bar, y se agrega agua purificada, intentando mantener constante el volumen. Se comprueba la conductividad y se continúa el lavado hasta que alcanza valores menores que 1 mS/cm.

A continuación, la columna se lava con el tampón a granel: acetato de amonio 50 mM, pH 4,0\pm0,1, conductividad 1,0\pm0,2 mS/cm, hasta que el sustrato permeable alcanza los mismos valores.

Se recoge la fracción de retención y el sistema se lava, haciendo recircular el mismo tampón hasta que la espuma deje de ser visible.

Los ultrafiltros se lavan y sanean haciendo reciclar alrededor de 200 ml de NaOH 0,5 M durante al menos 30 minutos. A continuación, los ultrafiltros se enjuagan con agua purificada hasta que el pH del sustrato permeable sea menor que 7,5. Seguidamente, se almacenan los ultrafiltros en NaOH 0,05 M a +20\pm5ºC hasta el ciclo siguiente.

Análisis

El análisis preliminar para la cuantificación de RANTES triple mutante mide la concentración de la molécula en la muestra del proceso, para controlar el rendimiento del mismo y monitorizar las etapas de replegamiento y escisión. A continuación, se describen los análisis.

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Equipo	Sistema de HPLC analítica equipado con horno de
	columna
\hskip0.5cm Columna	Symmetry C18, 3,5 \mum, 4,6 x 7,5 mm
\hskip0.5cm Eluyente A	TFA acuoso al 0,1%
\hskip0.5cm Eluyente B	TFA al 0,1% en acetonitrilo
\hskip0.5cm Eluyente C (para almacenamiento de la columna)	Acetonitrilo al 50% en agua
Método
\hskip0.5cm Detección UV	214 nm
\hskip0.5cm Temperatura	45ºC
\hskip0.5cm Tiempo de inyección	50 minutos
\hskip0.5cm Volumen de inyección	10-100 \mul
Gradiente	Tiempo	% de A	% de B
	0	75	25
	25 min	65	35
	25,1 min	20	80
	30 min	20	80
	*30,1 min	75	25
	*38 min	75	25
	38,1 min	75	25
Caudal	1 ml/minuto

	*etapa realizada a 1,2 ml/min
Muestra de referencia	RANTES triple mutante no escindido y purificado,
	a una concentración de 0,65 g/ml según DO (E = 21)

La recuperación global del proceso de purificación, determinada por HPLC RP, resultó ser superior a 30%, lo que representa un muy buen resultado en comparación con los datos de la bibliografía; la pureza por HPLC RP es >90%, por HPLC SE es >95%, y el contenido de HCP, analizado con un kit comercial de ELISA, es <100 ppm.

Un conjunto de análisis adicionales, tales como SDS, IEF y Maldi TDF, de los diferentes lotes de sustancias farmacológicas producidas, confirmó la consistencia del procedimiento en lo que se refiere tanto a la pureza como a la calidad de la molécula.

<110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

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<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EXPRESADAS EN BACTERIAS

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<130> EP808Z

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 67

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<212> PRT

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<213> Escherichia coli

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 74

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<213> Esccherichia coli

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<220>

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<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

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<222> (1)..(7)

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<223> Secuencia líder

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<400> 2

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2

Claims

1. Procedimiento para la recuperación de una quimioquina expresada en células hospedadoras procariotas en forma de cuerpos de inclusión, y su subsiguiente purificación, caracterizado porque interpone una etapa de Cromatografía de Fase Inversa entre la etapa de solubilización de las proteínas agregadas en los cuerpos de inclusión/desnaturalización y la etapa de renaturalización/replegamiento.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

\bullet: Solubilización de las proteínas quimioquinas agregadas en los cuerpos de inclusión;

\bullet: Sometimiento de las proteínas quimioquinas solubilizadas a una Cromatografía de Fase Inversa;

\bullet: Sometimiento del producto obtenido a una etapa de renaturalización/replegamiento;

\bullet: Sometimiento del producto obtenido a una etapa cromatográfica seleccionada de cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

\bullet: Sometimiento del producto obtenido a dos etapas de cromatografía de intercambio iónico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, tras la etapa de solubilización y/o replegamiento, se lleva a cabo una etapa de filtración.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células procariotas son células bacterianas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células bacterianas son células de E. coli.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la quimioquina es el mutante de la quimioquina de la SEQ ID NO: 1.