ES2307585T3

ES2307585T3 - Procedimiento para purificar hcg recombinante que tiene una bioactividad especifica.

Info

Publication number: ES2307585T3
Application number: ES01901188T
Authority: ES
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Laboratoires Serono SA
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2021-01-22
Also published as: EE200200469A; NO20023985D0; MEP38908A; RS50741B; NO20023985L; UA86938C2; DK1257564T3; CY1108460T1; MXPA02007871A; KR20030001359A; BRPI0108556B8; SK287146B6; EP1752466A2; PL205149B1; WO2001062773A1; YU60202A; AU2680401A; HUP0204231A2; HU228935B1; AU2006200059A1

Abstract

Procedimiento para preparar hCG recombinante con una bioactividad específica dentro del intervalo de 23.000- 28.000 UI/mg, a partir de una muestra, y que comprende las etapas de: (a) eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de sílice, (b) eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de intercambio iónico, (c) eluir a través de una segunda columna cromatográfica de intercambio iónico, (d) eluir a través de una columna de HPLC de fase inversa, y (e) aplicar el eluato a una cromatografía de exclusión por tamaño.

Description

Procedimiento para purificar hCG recombinante que tiene una bioactividad específica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar la Gonadotropina Coriónica, en particular purificar la Gonadotropina Coriónica humana (hCG) recombinante, a partir de una muestra de hCG recombinante bruta. El método comprende el uso de cromatografía de intercambio iónico y HPLC de fase inversa.

La gonadotropina coriónica es una hormona producida en la placenta y obtenida tradicionalmente de la orina de mujeres gestantes.

La hormona es un heterodímero consistente en subunidades \alpha y \beta unidas de forma no covalente.

Sus efectos son, predominantemente, los de la gonadotropina hormona luteinizante.

La gonadotropina coriónica se administra a la mujer para inducir la ovulación, después de haber estimulado el desarrollo del folículo con hormona folículo-estimulante o gonadotropinas menopáusicas humanas, en el tratamiento de la infertilidad anovulatoria, causada por la falta o bajas concentraciones de gonadotropinas. Se administra una dosis única de 5.000 a 10.000 unidades por inyección intramuscular para reproducir el pico de hormona luteinizante a mitad de ciclo que, en condiciones normales, estimula la ovulación. La gonadotropina coriónica se administra también junto con menotropina y, en ocasiones, también citrato de clomifeno, como coadyuvante para los procedimientos de fertilización in vitro y otras técnicas de concepción asistida, que comprenden superovulación y recogida de oocitos. En el hombre, se le ha utilizado en el tratamiento de la criptorquidia prepuberal. Los regímenes varían ampliamente, pero las dosis están comprendidas, habitualmente, entre 500 y 4.000 unidades, tres veces a la semana, por inyección intramuscular.

También se administra contra la infertilidad masculina asociada con hipogonadismo hipogonadotrófico. También en este caso, el régimen de dosificación varía extensamente, y las dosis se encuentran en el intervalo de 500 a 4.000 unidades, dos o tres veces a la semana. A menudo, se agrega un agente con actividad folículo-estimulante, tal como menotropina, para permitir una espermatogénesis normal. Para la oligospermia, se pueden utilizar dosis de hasta 3.000 unidades semanales de gonadotropina coriónica con menotropina u otro preparado folículo-estimulante. En el tratamiento del retraso de la pubertad masculina, asociado con hipogonadismo, se administra una dosis de 500 a 1.500 unidades, dos veces a la semana; la dosis se debe titular con respecto a la concentración de testosterona en
plasma.

Se han utilizado diferentes métodos para aislar y purificar hCG de muestras de orina bruta (Birken et al., Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35(5): 1414-6, 1990; Donini et al., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). Recientemente, se ha desarrollado y aplicado un método diferente de cromatografía de afinidad, denominado cromatografía de afinidad de filtración de membrana, para purificar hCG a partir de orina (Xu et al., Protein expression and purification, 16: 221-3, 1999). El método evita el uso de sefarosa activada con BrCN como fase sólida para la columna de cromatografía de afinidad, y representa una variación de los métodos habituales de purificación de hCG por cromatografía de afinidad a partir de muestras de orina. La inmunoactividad de la hCG purificada según este método es de 8.554 UI/mg.

Huth et al., Endocrinology 1994, Vol. 135(3), págs. 911-918, describen la purificación de la subunidad \beta de hCG producida en un sistema de expresión bacteriano, ensamblaje de la subunidad \beta de hCG recombinante y una subunidad \alpha de hCG de origen urinario, y purificación del dímero por cromatografía de intercambio aniónico.

El documento WO 98/56808, publicado en Diciembre de 1998, describe un procedimiento de purificación de un anticuerpo precursor anti-CD-18, que comprende cromatografía de intercambio iónico, así como cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, en sus siglas en inglés).

El documento WO 90/09800, publicado en Septiembre de 1990, describe formas modificadas de hormonas de la reproducción, y composiciones farmacéuticas que las contienen.

La hCG recombinante tiene la ventaja de estar exenta de otras hormonas gonadotropínicas y contaminantes de origen humano y, más específicamente, de los presentes en la orina humana. La preparación bruta de hCG recombinante contiene, sin embargo, todas las restantes proteínas y contaminantes de la célula utilizada en su producción recombinante, siendo altamente deseable un método para lograr la pureza absoluta de la Gonadotropina Coriónica recombinante.

Sumario de la invención

La invención se caracteriza en la reivindicación 1 y en las reivindicaciones dependientes 2 a 7 se definen sus realizaciones preferidas.

Los presentes inventores han encontrado ahora que una preparación bruta de hCG, derivada de una muestra concentrada de un medio de cultivo obtenido tras el procedimiento recombinante, o de un concentrado bruto de orina de mujeres gestantes, se puede purificar de forma que la hCG resultante esté prácticamente exenta de proteínas u otros contaminantes contenidos en la preparación bruta de hCG.

El procedimiento de purificación se basa en el uso de cromatografía de intercambio iónico y de HPLC de fase inversa. El posible uso adicional de una columna de exclusión por tamaño permite la separación de cualquier traza de contaminantes. Se han obtenido resultados óptimos con la realización de al menos dos etapas de cromatografía de intercambio iónico.

El procedimiento de la invención se puede utilizar para la purificación de hCG recombinante a partir de una preparación bruta del medio de cultivo derivado del procedimiento recombinante. Se obtiene la r-hCG con un elevado grado de pureza y una alta bioactividad específica (en el intervalo de 23.000-28.000 UI/mg), prácticamente exenta de proteínas de Suero Bovino Fetal (FBS, en sus siglas en inglés), si se encuentran presentes en el medio de cultivo, y de ácidos nucleicos u otros contaminantes contenidos en las células hospedadoras usadas en el procedimiento recombinante.

El procedimiento de la invención se puede utilizar, asimismo, para la purificación de hCG urinaria, a partir de un concentrado bruto de orina de mujeres gestantes, y para la purificación de CG a partir de otras especies de mamíferos, incluidas, por ejemplo, la bovina, equina, porcina, ovina y el mono.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la purificación de hCG a partir de una muestra, que comprende el uso de cromatografía de intercambio iónico y HPLC de fase inversa. El procedimiento comprende las etapas de someter la muestra a cromatografía de intercambio iónico, y someter el eluato de HPLC de fase inversa. Adicionalmente, se puede llevar a cabo una etapa suplementaria de aplicar el eluato a una columna de exclusión por tamaño. El asunto principal de la invención se define en la reivindicación 1, y las realizaciones preferidas se especifican en las reivindicaciones 2 a 7.

Las dos etapas de cromatografía de intercambio iónico se llevan a cabo, preferentemente, bajo condiciones diferentes con el fin de obtener resultados óptimos del procedimiento de purificación. Una realización preferida del procedimiento según la invención comprende las etapas de:

(a): eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de sílice;

(b): eluir a través de una columna cromatográfica de intercambio iónico DEAE-Sefarosa;

(c): eluir a través de una columna cromatográfica de intercambio iónico de CM-Sefarosa;

(d): eluir a través de una columna de HPLC de fase inversa de Sílice C18; y

(e): eluir a través de una columna cromatográfica de exclusión por tamaño de Sephacryl.

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En una realización preferida de la invención, la elución a través de la columna de intercambio iónico DEAE-Sefarosa se lleva a cabo en tampón de fosfato sódico a aproximadamente pH 7,5.

La elución a través de la columna de intercambio iónico CM-Sefarosa se lleva a cabo, preferentemente, en tampón de fosfato sódico a aproximadamente pH 6.

La etapa de HPLC de fase inversa (d) se efectúa, preferentemente, con 2-propanol/tampón de tris-fosfato como fase móvil.

La CG de la presente invención es, preferentemente, CG humana y, de manera muy preferida, es hCG recombinante, derivada del medio de cultivo de células CHO usadas en el procedimiento recombinante.

Descripción detallada de la invención

La invención ofrece un método para la purificación de hCG, en particular para la purificación de hCG recombinante, a partir de una preparación bruta del medio de cultivo del procedimiento recombinante. La r-hCG se obtiene con un elevado grado de pureza y alta bioactividad específica (dentro del intervalo de 23.000-28.000 UI/mg), prácticamente exenta de proteínas de Suero Bovino Fetal (FBS) presentes en el medio de cultivo, y de ácidos nucleicos u otros contaminantes contenidos en las células hospedadoras usadas en el procedimiento recombinante. El uso de la invención está previsto con materiales biológicos, en particular mezclas brutas que contienen hCG y otras proteínas contaminantes, a las que se denomina en este documento muestras de material de partida. Los ejemplos descritos de forma detallada más adelante utilizan muestras de material de partida que contienen r-hCG obtenidas del medio sobrenadante de cultivos celulares de un biorreactor. De forma alternativa, la muestra es orina concentrada bruta de mujeres
gestantes.

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La muestra se obtiene por la recogida reciente del medio sobrenadante de cultivos celulares, perfundido a través de un biorreactor durante dos días. Preferentemente, el sobrenadante se aclara por filtración. Si es necesario, la solución bruta se concentra y se somete a cromatografía sobre sílice C4 para separar los contaminantes derivados del cultivo celular.

A continuación, la cosecha semi-purificada, tras la ultrafiltración, se somete a cromatografía de intercambio iónico que, preferentemente, se lleva a cabo dos veces y, preferentemente, bajo condiciones diferentes, y a HPLC de fase inversa. Se puede efectuar una primera etapa de intercambio iónico DEAE-Sefarosa, que actúa básicamente como etapa de "flujo continuo" de la hCG, en la cual se elimina una gran parte de las proteínas no-hCG y ADN. Una segunda etapa de intercambio iónico, preferentemente a través de una columna CM-Sefarosa, actúa como etapa de aglutinación de hCG, y separa el ADN residual y los contaminantes de células hospedadoras o de proteínas del medio. En una realización preferida, esta etapa se lleva a cabo aproximadamente a 5ºC, eluyendo con tampón de fosfato sódico a aproximadamente pH 6.

La cromatografía de fase inversa sobre una columna de Sílice C18 es eficaz para separar cantidades traza de ácidos nucleicos y contaminantes derivados del cultivo celular. La columna se eluye, preferentemente, con 2-propanol/tampón de tris-fosfato como fase móvil. Preferentemente, la solución de retentato se somete, entonces, a ultrafiltración de corte de 10 kD, se concentra y se puede recuperar con hidrógeno-carbonato de amonio a pH 8. El producto concentrado se puede aplicar, a continuación, a una columna cromatográfica de exclusión por tamaño sobre Sephacryl S200 HR. En esta etapa se alcanza una separación basada en el tamaño molecular, eluyendo con hidrógeno-carbonato de amonio a pH 8 para separar las posibles cantidades traza de contaminantes derivados del cultivo celular, agregados potenciales y subunidades libres de hCG. El eluato se puede someter, entonces, a diálisis por ultrafiltración sobre membranas de corte de 10 kD, preferentemente en tampón de fosfato sódico a pH 7. Tras la filtración, la masa a granel de hCG purificada se conserva preferentemente en viales estériles a temperaturas bajas.

Ejemplo 1 Reactivos

Amoniaco, grado analítico,

Hidrógenocarbonato de amonio, grado analítico (B.P.),

Hidrógenofosfato disódico, grado analítico,

Etanol absoluto desnaturalizado,

Ácido fosfórico, grado analítico (Ph. Eur.),

2-propanol, grado analítico (Ph. Helv.),

Cloruro sódico, grado analítico (Ph. Eur.),

Di-hidrógenofosfato sódico, grado analítico,

Hidróxido sódico en gránulos, grado analítico (Ph. Eur.),

Ácido trifluoroacético (TFA), grado de HPLC,

Tris-(hidroximetil)aminometano, grado analítico.

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Flujograma resumen del procedimiento de purificación

El material cosechado, derivado del procedimiento de cultivo celular, se purifica y concentra mediante una serie de cinco etapas cromatográficas.

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El siguiente flujograma (Tabla 1) resume una realización preferida del procedimiento de purificación de r-hCG, indicando las resinas de las columnas cromatográficas y los principios operativos de cada una de las etapas intermedias.

TABLA 1 Flujograma que resume el procedimiento de purificación de r-hCG

1

A continuación, se proporciona un flujograma y descripción del procedimiento detallados. Las condiciones establecidas para la etapa de captura (etapa I) son las que se aplican normalmente cuando el material bruto es de origen recombinante.

Etapa I

Etapa de captura

En esta etapa (Etapa I), se logra una concentración preliminar, y se cambia el tampón por uno de composición controlada. Esta etapa se inicia a temperatura ambiente (cromatografía sobre Sílice C4) y, seguidamente, se continúa a aproximadamente +5ºC. Un intervalo preferido de temperatura es de 5 \pm 3ºC. Se repite individualmente para cada cosecha durante el ciclo de producción del biorreactor.

(i): Clarificación de las cosechas

: El medio de cultivo recién recogido de un biorreactor se clarifica habitualmente, en primer lugar, por filtración.

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(ii): Cromatografía sobre Sílice C4

: Tras la clarificación, las cosechas se cargan sobre una columna cromatográfica de sílice C4, que se ha equilibrado previamente con fosfato sódico 25 mM, pH 7. Un intervalo de pH preferido es desde 6,6 hasta 7,7. La columna se lava con fosfato sódico 25 mM hasta que la señal UV del monitor retorna al valor inicial. A continuación, se eluye el producto con 34,2% en peso de 2-propanol en fosfato sódico 25 mM.

(iii): Tratamiento con amoniaco

: Entonces, se agrega amoniaco a la solución, hasta alcanzar una concentración final de 1 M. Esta mezcla se incuba durante 6 horas. Luego, la solución se diluye 2 veces con agua, y se ajusta el pH a 7,5 usando ácido fosfórico al 85%. Un intervalo de pH preferido es 7,5 \pm 0,2.

(iv): Concentración y diálisis

: Las membranas de corte de 10 kD, conservadas en hidróxido sódico 0,05 M entre lotes, se lavan con agua purificada hasta que el pH desciende a aproximadamente 8.

: El producto se concentra y dializa (por ultrafiltración sobre la membrana de 10 kD) para separar el material con un peso molecular menor que 10 kD, y para eliminar las trazas de 2-propanol y cambiar la solución de amoniaco a fosfato sódico 40 mM, pH 7,5. Un intervalo de pH preferido es 7,5 \pm 0,2.

: El retentato final se recupera de las membranas con fosfato sódico 40 mM, con el fin de alcanzar una concentración de proteína diana de 3 a 15 mg/ml.

: A continuación, se filtra la solución y el concentrado resultante se conserva congelado a aproximadamente -15ºC.

Etapa II

Filtración y cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-Sefarosa FF

Esta etapa cromatográfica es una etapa de "flujo continuo" de r-hCG, en la que se elimina gran parte de las proteínas no-r-hCG y de los ácidos nucleicos. Mientras que la filtración se lleva a cabo a temperatura ambiente, la etapa cromatográfica en la que el producto pasa a través de la columna, se lleva a cabo en ambiente frío.

(i): Descongelación y combinación de las cosechas brutas concentradas de r-hCG

: Los concentrados congelados se descongelan y se combinan. Se procesa un lote de r-hCG a granel purificado a partir de una combinación de un número variable de concentrados brutos de r-hCG, obtenidos del mismo banco celular de procesamiento. Los criterios para determinar el número de concentrados brutos de r-hCG combinados se basan en la máxima capacidad de fijación de proteínas de la siguiente etapa cromatográfica en el procedimiento de purificación (4 mg de proteínas totales/mg de resina).

(ii): Clarificación por filtración

: La solución de r-hCG se hace pasar, preferentemente, a través de un dispositivo de filtración, lavando los filtros con fosfato sódico 40 mM, pH 7,5.

: Se combinan la solución filtrada y los lavados.

(iii): Cromatografía de intercambio iónico sobre DEAE-Sefarosa FF

: La columna, empaquetada con una resina de intercambio aniónico débilmente cargada, dietil amino etano (DEAE) Sefarosa de FF (Flujo Rápido, FF, en sus siglas en inglés), se equilibra con fosfato sódico 40 mM (pH 7,5).

: La solución de r-hCG se carga en la columna.

: La columna se alimenta con fosfato sódico 40 mM, pH 7,5. El proceso cromatográfico se monitoriza por espectrofotometría a 280 nm.

: El efluente inicial se desecha hasta que comienza la elución del pico. A continuación, se recoge la fracción no fijada que contiene la r-hCG.

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Etapa III

Cromatografía CM-Sefarosa FF

En esta etapa cromatográfica, se elimina una gran parte de los contaminantes de las células hospedadoras. La etapa cromatográfica se lleva a cabo a aproximadamente +5ºC. Un intervalo de temperatura preferido es de 5 \pm 3ºC.

(i): Dilución del eluato de DEAE-Sefarosa FF

: Se agrega agua para inyección al eluato de DEAE-Sefarosa FF, y se ajusta el pH a 6 usando ácido fosfórico al 85%. Un intervalo de pH preferido es 6 \pm 0,1.

(ii): Cromatografía de intercambio iónico sobre CM-Sefarosa FF

: La columna, empaquetada con una resina de intercambio catiónico de carga débil, Carboximetil (CM) Sefarosa FF, se equilibra con tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 6). Un intervalo de pH preferido es 6 \pm 0,1.

: La solución de r-hCG se carga en la columna.

: La columna se lava con tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 6. El procedimiento cromatográfico se monitoriza por espectrofotometría a 280 nm.

: El producto se eluye usando tampón de fosfato sódico 130 mM, pH 6. Se desecha el efluente inicial hasta que comienza la elución del pico.

: Se recoge la totalidad del pico que contiene la r-hCG. Opcionalmente, el producto se puede filtrar en esta etapa para separar contaminantes víricos.

Etapa IV

HPLC de fase inversa (RP, en sus siglas en inglés) sobre Sílice C18

Esta etapa de HPLC RP es eficaz para separar las cantidades traza de contaminantes del cultivo celular, residuos de ácidos nucleicos y endotoxinas. Va seguida de una ultrafiltración de corte de 10 kD y filtración opcional.

(i): Preparación de las partes alícuotas

: El pH de las partes alícuotas se ajusta a 5, y se agrega 2-propanol hasta una concentración final de 15% en volumen.

(ii): Cromatografía HPLC RP sobre Sílice C18

: La columna, empaquetada con una resina de Sílice C18, se equilibra inicialmente en 2-propanol al 15% en volumen en tampón de tris-fosfato 0,5 M.

: La primera parte alícuota se carga en la columna, y la cromatografía se monitoriza por espectrofotometría UV.

: La columna se lava con el mismo tampón de equilibrado.

: Subsiguientemente, se lleva a cabo la elución de r-hCG con una fase móvil de gradiente lineal de 2-propanol/tampón de tris-fosfato 0,5 M de 15% a 25% en volumen.

: La r-hCG se fracciona cuando se detecta el pico correspondiente por espectrofotometría (A_{280}). Se combinan las fracciones cuya absorbancia es mayor que 65% de la altura máxima del pico en la parte ascendente, y mayor que 20% de la altura máxima del pico en la parte descendente.

: Las cuatro combinaciones que contienen r-hCG se combinan y se diluyen en un volumen equivalente de agua para inyección (WFI, en sus siglas en inglés).

: El producto se concentra y se dializa (por ultrafiltración sobre una membrana de 10 kD) contra WFI para separar el material que tiene un peso molecular menor que 10 kD, y para eliminar el 2-propanol.

: Seguidamente, el producto se dializa por ultrafiltración contra tampón de hidrógeno-carbonato de amonio 0,1 M, pH 8.

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: El intermedio resultante se conserva a aproximadamente +5ºC, o se congela, si es necesario. Las temperaturas de conservación preferidas son 5 \pm 3ºC e igual o por debajo de -15ºC, respectivamente.

Etapa V

Cromatografía de exclusión por tamaño sobre Sephacryl S-200 HR

Esta etapa cromatográfica de exclusión por tamaño es eficaz para separar cantidades traza de contaminantes derivados del cultivo celular, agregados potenciales y/o subunidades libres. Va seguida de una ultrafiltración de corte de 10 kD. Las etapas de Sephacryl S-200 HR y de ultrafiltración de corte de 10 kD se llevan a cabo a aproximadamente +5ºC. Un intervalo de temperaturas preferido es de 5 \pm 3ºC.

(i): Exclusión por tamaño sobre Sephacryl S-200 HR

: La columna empaquetada con resina Sephacryl S-200 HR se equilibra con hidrógeno-carbonato de amonio 0,5 M (pH 8). Un intervalo de pH preferido es de 8 \pm 0,2.

: La solución de r-hCG se carga en la columna, y la elución se inicia usando hidrógeno-carbonato de amonio 0,5 M, pH 8. Un intervalo de pH preferido es de 8 \pm 0,2.

: La recogida de la fracción de r-hCG se inicia desde el comienzo del pico y se prolonga hasta alcanzar la marca de 50% de la altura máxima del pico en su parte descendente.

(ii): Ultrafiltración de corte de 10 kD

: Membranas de corte de 10 kD, conservadas en hidróxido sódico 0,05 M entre lotes, se lavan con WFI hasta que el pH desciende a aproximadamente 8.

: El producto se concentra y se dializa (por ultrafiltración) contra WFI.

: Seguidamente, el producto se dializa (por ultrafiltración) con tampón de fosfato sódico 0,01 M, pH 7, y la concentración final de proteínas se ajusta hasta alcanzar una concentración final diana de 3,5 mg/ml.

: La solución a granel final resultante de r-hCG se conserva preferentemente congelada a aproximadamente -15ºC.

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Resinas cromatográficas

En el procedimiento de purificación se pueden emplear las siguientes resinas cromatográficas: También se pueden usar resinas equivalentes.

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2

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Los proveedores actuales son:

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4

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Resultados \bullet Peso y tamaño moleculares SDS-PAGE

Se ha determinado el peso molecular relativo de la r-hCG, obtenida de acuerdo con el método de purificación de la presente invención, por SDS-PAGE contra proteínas estándares de peso molecular conocido.

La tinción con azul brillante de Coomassie posterior a SDS-PAGE no reductora reveló una única banda ancha para el heterodímero de r-hCG a un peso molecular de aproximadamente 70 kD (intervalo 65-75 kD). La identidad de la banda se confirmó por transferencia de Western.

\bullet Actividad biológica

En la Tabla 2 se recogen los datos de actividad biológica de diferentes lotes de r-hCG tras la purificación con el método según la presente invención. La concentración de proteína se ha determinado por espectrofotometría a 276,5 nm, a = 0,616.

La actividad específica media de la preparación de r-hCG es especialmente alta, ascendiendo a aproximadamente 25.000 UI/mg.

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TABLA 2

5

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Ejemplo comparativo \bullet Formulaciones

Se han desarrollado formulaciones tanto líquidas como liofilizadas con la hCG recombinante altamente purificada de la presente invención.

Formulación líquida

Se prepararon dos formulaciones líquidas de 10.000 UI/ml en viales DIN 2R, usando manitol o sacarosa como excipiente, y se sometieron a ensayos de estabilidad a 50, 40, 25 y 4ºC.

La composición se recoge en las Tablas 3 y 4.

TABLA 3

6

: Volumen de llenado: 0,5 ml.

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TABLA 4

7

: Volumen de llenado: 0,5 ml.

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Los resultados de los ensayos de estabilidad, llevados a cabo por Bioassay, SE/HPLC y HPLC RP, demostraron que la formulación de manitol fue más estable en comparación con la de sacarosa. Fueron necesarias, preferentemente, condiciones de conservación refrigeradas para minimizar la oxidación de proteínas y la formación de subunidades libres.

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Formulación liofilizada

Se preparó una formulación liofilizada, con una potencia de 5.000 UI, en viales DIN 2R, para ensayos de estabilidad a 50, 40, 25 y 4ºC, utilizando sacarosa como excipiente.

Su composición aparece en la Tabla 5.

TABLA 5

8

: Volumen de llenado: 0,5 ml.

Los resultados de los ensayos de estabilidad, llevados a cabo por Bioassay, SE/HPLC y HPLC RP, demostraron que esta formulación liofilizada fue estable a 40 y 50ºC durante al menos 19 semanas.

Se llevaron a cabo ensayos de estabilidad a 25 y 4ºC durante períodos de hasta 6 meses, que no indicaron degradación de la sustancia activa.

Claims

1. Procedimiento para preparar hCG recombinante con una bioactividad específica dentro del intervalo de 23.000-28.000 UI/mg, a partir de una muestra, y que comprende las etapas de:

(a): eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de sílice,

(b): eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de intercambio iónico,

(c): eluir a través de una segunda columna cromatográfica de intercambio iónico,

(d): eluir a través de una columna de HPLC de fase inversa, y

(e): aplicar el eluato a una cromatografía de exclusión por tamaño.

2. Procedimiento para preparar hCG recombinante, según la reivindicación 1, a partir de una muestra, y que comprende las etapas de:

(a): eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de sílice,

(b): eluir la muestra a través de una columna cromatográfica de intercambio iónico DEAE-Sefarosa,

(c): eluir a través de una columna cromatográfica de intercambio iónico CM-Sefarosa,

(d): eluir a través de una columna de HPLC de fase inversa de Sílice C18, y

(e): aplicar el eluato a una cromatografía de exclusión por tamaño de Sephacryl.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el cual la elución a través de cromatografía de intercambio iónico DEAE-Sefarosa se lleva a cabo en tampón de fosfato sódico a pH 7,5.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el cual la elución a través de cromatografía de intercambio iónico CM-Sefarosa se lleva a cabo en tampón de fosfato sódico a pH 6.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la etapa de HPLC de fase inversa (d) se lleva a cabo con 2-propanol/ tampón de tris-fosfato como fase móvil.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño (e) se lleva a cabo con tampón de hidrógenocarbonato de amonio como fase móvil.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual la muestra es un medio de cultivo de células CHO.