UA78488C2 - Process for cleaning recombinant hcg and pharmaceutical composition - Google Patents

Description

ристанням як рухомої фази буферного розчину 9. Фармацевтична композиція за п. 8, яка відрізня- бікарбонату амонію. ється тим, що наповнювачем є сахароза. 7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який відрізняєть- 10. Фармацевтична композиція за п. 9, яка відріз- ся тим, що вихідним матеріалом є культуральне няється тим, що є ліофілізованою. середовище клітин СНО. 11. Фармацевтична композиція за п. 8, яка відріз- 8. Фармацевтична композиція, яка містить реком- няється тим, що наповнювачем є маніт. бінантний ПСО, одержаний способом за будь-яким 12. Фармацевтична композиція за п. 9, яка відріз- з пп. 1-7 формули винаходу, та придатні наповню- няється тим, що вона є рідкою. вачі. 13. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 8-12 для підшкірного введення.

Цей винахід стосується способу очищення хо- тиждень; дозу слід коригувати з урахуванням рівня ріонічного гонадотропіну, зокрема, очищення ре- тестостерону в плазмі. комбінантного хоріонічного гонадотропіну людини Для виділення та очищення ПС із препаратів (на) із препарату неочищеного рекомбінантного сечі використовують різні способи |Біркен та інші ба. Спосіб включає використання іонообмінної -- Віїкеп еї аі., ЕпдосгіпоІоду, 133(3): 1390-7, 1993; хроматографії та рідинної хроматографії високої Сакакібара та інші - ЗаКаківага єї аІ., Спет. Рнагт. ефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Виї., 35(5): 1414-6, 1990; Доніні та інші - Юопіпі еї

Хоріонічний гонадотропін є гормон, який про- аі., Асіа Епадостіпої., 73(1): 133-45, 1973). Останнім дукується плацентою, і його традиційно одержують часом був розроблений та застосований для очи- із сечі вагітних жінок. щення пса зі сечі варіант методу афінної хрома-

Цей гормон являє собою гетеродимер, що тографії названий мембранно-фільтраційною складається з а- і ВД-субодиниць, зв'язаних некова- афінною хроматографією |(Цзю та інші - Хи еї аї., лентно. Його ефекти є переважно ефектами гона- Ргоїєїп ехргевзвіоп апа ригійсайоп, 16: 221-3, 1999). дотропіну лютеїнізуючого гормону. Цей спосіб виключає використання активованої

Хоріонічний гонадотропін призначають жінкам бромціаном Сефарози як нерухомої фази в колон- із метою індукування овуляції після стимулювання ці для афінної хроматографії та являє собою різ- розвитку фолікулів гормоном стимуляції яєчників новид звичайного способу очищення ПСО методом або менопаузними гонадотропінами людини при афінної хроматографії із препаратів сечі. Імуноак- лікування ановуляторної безплідності, спричиненої тивність НСО, очищеного цим способом, становить відсутністю гонадотропінів або їх низькими конце- 8554 МоО/мг. нтраціями. При цьому вводять внутрішньом'язово Перевага рекомбінантного ПСО полягає у від- одиничну дозу від 5000 одиниць до 10000 одиниць сутності інших гормонів групи гонадотропінів та для імітації піка лютеїнізуючого гормону в середині домішок, що походять із людського організму, циклу, який за нормальних умов стимулює овуля- більш конкретно, від забруднювачів, присутніх у цію. Хоріонічний гонадотропін вживають також у людській сечі. Неочищений препарат рекомбінант- комбінації з менотрофіном та іноді також із кломі- ного пса містить, однак, усі інші протеїни та домі- фен-цитратом як допоміжний засіб при процеду- шки, що походять із клітин, використаних при оде- рах запліднення іп міо та інших способах штучно- ржанні рекомбінантного матеріалу, і, отже, дуже го запліднення, які включають суперовуляцію та бажаним є створення способу досягнення абсолю- відбирання яйцеклітин. Його використовують та- тної чистоти рекомбінантного хоріонічного гонадо- кож для лікування препубертатного крипторхізму у тропіну. чоловіків. Режими вживання можуть варіювати в Автори цього винаходу з'ясували, що неочи- широких межах, але звичайно дози становлять від щений препарат пСа, одержаний з концентрова- 500 одиниць до 4000 одиниць, які вводять шляхом ного препарату культурального середовища після внутрішньом'язової ін'єкції тричі на тиждень. рекомбінаційного процесу або з неочищеного кон-

Хоріонічний гонадотропін вживають також при центрату сечі вагітних жінок, можна очистити так, чоловічій безплідності, пов'язаній з гіпогонадотро- що одержаний ПСО буде практично вільний від пним гіпогеніталізмом. В цьому разі режими дозу- протеїнів або інших домішок, які містилися в не- вання також варіюють в широких межах, і дози очищеному препараті пса. можуть становити від 500 одиниць до 4000 оди- Спосіб очищення базується на використанні ниць два або три рази на тиждень. Для сприяння іонообмінної хроматографії та рідинної хроматог- нормальному сперматогенезу часто додатково рафії високої ефективності з оберненою фазою. вживають також агент, що має здатність стимулю- Можливе подальше використання ексклюзійної вати розвиток фолікулів, такий як менотрофін. У колонки дозволяє видалити з чистого препарату випадках олігоспермії можна застосовувати хоріо- Са будь-які залишкові кількості домішок. Опти- нічний гонадотропін в дозах до 3000 одиниць на мальні результати досягаються при використанні тиждень в комбінації з менотрофіном або іншим щонайменше двох стадій іонообмінного хроматог- препаратом для стимуляції фолікулів. Для ліку- рафування. вання затримання статевого дозрівання у чолові- Спосіб за цим винаходом можна використати ків, пов'язаного з гіпогеніталізмом, застосовують для очищення рекомбінантного пса із неочищено- дози від 500 одиниць до 1500 одиниць двічі на го препарату культурального середовища, одер-

жаного після рекомбінаційного процесу. Одержа- тного пСа, одержаного з рекомбінаційного проце- ний пСОї має високий ступінь чистоти та високу су, як описано питому біоактивність (в діапазоні 23000-28000 вище, разом із придатними для цього напов-

МО/мгГ) і практично вільний від протеїнів сироватки нювачами. Прикладом придатного наповнювача є зародка великої рогатої худоби (ЕВ5), в разі їх сахароза, яка сприяє стабілізації ліофілізованого присутності в культуральному середовищі, нуклеї- продукту. Фармацевтична композиція рекомбінан- нових кислот або інших домішок, присутніх у кліти- тного ПСО особливо придатна для підшкірного нах носія, які використовуються в рекомбінаційно- введення. му процесі. Цей винахід пропонує спосіб очищення пса,

Спосіб за цим винаходом можна використати зокрема, спосіб очищення рекомбінантного пса із також для очищення сечового ПСО, при цьому неочищеного препарату культурального середо- вихідним матеріалом є неочищений концентрат вища рекомбінаційного процесу. Одержаний ПСО сечі вагітних жінок, та для очищення Са, одержа- має високий ступінь чистоти та високу питому біо- ного з організмів інших ссавців, в тому числі, на- активність (в діапазоні 23000-28000 Мо/мг) і прак- приклад, великої рогатої худоби, коней, свиней, тично вільний від протеїнів сироватки зародка ве- овець та мавп. ликої рогатої худоби (ЕВ5), які присутні в

Метою цього винаходу є запропонувати спосіб культуральному середовищі, нуклеїнових кислот очищення пса із вихідного матеріалу з викорис- або інших домішок, присутніх у клітинах носія, які танням іонообмінної хроматографії в комбінації з використовуються в рекомбінаційному процесі. рідинною хроматографією високої ефективності Винахід призначений для застосування до біо- (РХВЕ) з оберненою фазою. Спосіб включає стадії логічних матеріалів, зокрема, до неочищених су- піддавання вихідного матеріалу іонообмінному мішей, які містять НСО та інші протеїнові забруд- хроматографуванню та піддавання елюату рідин- нювачі. Такі суміші в цьому описі позначено ному хроматографуванню високої ефективності з терміном "вихідні матеріали". У прикладах, дета- оберненою фазою. Може бути використана додат- льно описаних нижче, використовуються вихідні кова подальша стадія пропускання елюату через матеріали, що містять /-пСО, одержані з суперна- ексклюзійну колонку. тантного середовища культури клітин в біореакто-

Перевага віддається двократному використан- рі. Альтернативним різновидом вихідного матеріа- ню іонообміної хроматографії в різних умовах із лу є неочищений концентрат сечі вагітних жінок. метою досягнення оптимальних результатів про- Як вихідний матеріал використовують свіжозі- цесу очищення. Варіант способу згідно з винахо- бране супернатантне середовище культури клітин, дом, якому віддається перевага, включає стадії: що проходило через біореактор протягом двох діб. (а) елюювання вихідного- матеріалу через Перевага віддається просвітленню супернатанта хроматографічну колонку з силікагелем; фільтруванням. Потім неочищений розчин можна (Б) елюювання через колонку для іонообмінної в разі необхідності концентрувати та піддати хро- хроматографії зі стаціонарною фазою ДЕАЕ- матографуванню на силікагелі С4 для видалення

Сефароза (ОЕБАЕ-Зерпагозе); домішок, що походять із культури клітин. (с) елюювання через колонку для іонообмінної Напівочищений вихідний матеріал після ульт- хроматографії зі стаціонарною фазою СМ- рафільтрування піддають іонообмінному хромато-

Сефароза (СМ-5ерпагозе); графуванню, причому перевага віддається двок- (4) елюювання через колонку для РХВЕ з обе- ратному виконанню іонообмінного рненою фазою на силікагелі С18 (5іїїса С18); і хроматографування, у варіанті, якому віддається (е) елюювання через колонку для ексклюзійної перевага, в різних умовах, та РХВЕ з оберненою хроматографії зі стаціонарною фазою "Сефакрил" фазою. На першій стадії іонообмінного хроматог- (Зерпасгу!). рафування можна застосувати як сорбент ДЕАЕ-

У варіанті здійснення винаходу, якому відда- Сефарозу, при цьому пСбО практично повністю ється перевага, елюювання через колонку для проходить через колонку, і досягається видалення іонообмінної хроматографії з ДЕАЕ-Сефарозою значної частки протеїнів, інших ніж ПСО, та ДНК. здійснюють у натрій-фосфатному буферному роз- Друга стадія, при якій перевага віддається засто- чині при рН приблизно 7,5. суванню СМ-Сефарози, діє як стадія зв'язування

При елююванні через колонку для іонообмін- "Са і забезпечує видалення залишкових кількос- ної хроматографії з СМ-Сефарозою перевага від- тей ДНК та клітин носія або протеїнів із середови- дається використанню натрій-фосфатного буфер- ща. У варіанті, якому віддається перевага, цю ста- ного розчину при рН приблизно 6. дію виконують при температурі приблизно 57С з

При виконанні елюювання через колонку для елююванням натрій-фосфатним буферним розчи-

РХВЕ з оберненою фазою на стадії (4) перевага ном при рН приблизно 6. віддається використанню 2-пропанолу з буферним Хроматографування з оберненою фазою на розчином Трис-фосфату як рухомої фази. силікагелі С18 забезпечує ефективне видалення

СО за цим винаходом у варіанті, якому відда- залишкових кількостей нуклеїнових кислот та до- ється перевага, є СО людини, а найбільша пере- мішок, що походять із культури клітин. Перевага вага віддається рекомбінантному пса, одержано- віддається елююванню колонки сумішшю 2- му з культурального середовища клітин СНО, які пропанолу з буферним розчином Трис-фосфату як використовуються в рекомбінаційному процесі. рухомою фазою. Розчин затриманої фракції потім

Іншою метою цього винаходу є запропонувати у варіанті, якому віддається перевага, піддають фармацевтичну композицію, яка містить терапев- ультрафільтруванню при верхній межі пропускан- тично ефективну кількість очищеного рекомбінан- ня молекулярної маси 10 кДа, концентрують, і продукт можна виділити з нього бікарбонатом Фосфорна кислота для аналізу (за Європейсь- амонію, рН 8. Концентрований продукт можна по- кою Фармакопеєю) (далі ЄФ) тім піддати ексклюзійній хроматографії на сорбенті 2-Пропанол для аналізу (за Швейцарською "Сефакрил" (берпасгу! 5-200 НА). На цій стадії фармакопеєю) досягається розділення за розміром молекул з Хлорид натрію для аналізу (ЄФ) елююванням бікарбонатом амонію (рн 8) для ви- Первинний кислий фосфат натрію для аналізу далення залишків домішок, що походять із культу- Гідроксид натрію гранульований для аналізу ри клітин, присутність яких ще можлива, потенціа- (ЄФ) льних агрегатів та вільних субодиниць ПСО. Потім Трифтороцтова кислота (ТФК) для РХВЕ елюат можна піддати діалізу шляхом ультрафіль- Трис-(гідроксиметил)амінометан для аналізу трування через мембрани з верхньою межею про- Схема послідовності технологічних операцій пускання 10 кДа, переважно в натрій-фосфатному процесу очищення у короткому викладі буферному розчині, рН 7. Після фільтрування Первинний матеріал із процесу культивування очищений нерозфасований розчин пса доцільно клітин очищають та концентрують шляхом послі- зберігати в стерильних пляшках при низькій тем- довного виконання п'яти стадій хроматографуван- пературі. ня.

Приклад 1 Таблиця 1 являє собою схему послідовності

Реагенти технологічних операцій, що коротко представляє

Аміак для аналізу варіант здійснення процесу очищення І-пСа, яко-

Бікарбонат амонію для аналізу (за Британсь- му віддається перевага, і характеризує сорбенти в кою Фармакопеєю) (далі БФ) хроматографічних колонках та принципи виконан-

Вторинний кислий фосфат натрію для аналізу ня кожної із проміжних стадій.

Етанол абсолютний денатурований

Таблиця 1

Схема послідовності технологічних операпій процесу очищення т-нСЄ у короткому викладі

СТАДІЯЇ КУЛЬТУРАЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ З ВІОРЕАКТОРА

Хроматографування на силікагелі С4 (елюавт містить кК-ПСО) ії

Ультрафільтрування (10 кДа) «Затримана Фракція містить г1- ВС) і

КОНЦЕНТРОВАНИЙ НЕОЧИЩЕНИЙ ПРЕПАРАТ -БСО ї !

СТАДІЯ ДЕАБ-СЕФАРОЗА ЕЕ «(Незв'язана Фракція містить т-пСО) і

СТАДІЯ Її СМ-СЕФАРОЗА ВЕ (сєлюат містить то ПСО) їі

СТАДІЯ ТТРКВЕ З ОБЕРНЕНОЮ ФАЗОЮ НА СМЛІКАГЕЛІ СІВ ( (слюахт містить 1 ПСО) і

Ультрафільтрування (10 кДа) ї

СТАДІЯ У | 5ЕРНАСВУ. 5-20 НЕ (глюат містить г-ПСО) !

І :

НЕФАСОВАНИЙ РОЗЧИН СО

Нижче подано детальну схему послідовності вих кислот. Якщо фільтрування виконують при технологічних операцій процесу та його опис. Для кімнатній температурі, то хроматографічні стадії, попереднього виділення (стадії І) вказані умови, де продукт проходить через колонку, виконують в які звичайно використовуються, якщо неочищений холодному приміщенні. матеріал походить із рекомбінаційного процесу. () Розтоплення та нагромадження неочишених

Стадія І (попереднє виділення) концентратів І-пСа

На цій стадії (Стадії І) досягається попереднє Заморожені концентрати розтоплюють і об'єд- концентрування та виконується заміна буферного нують у загальному збірнику. Партію очищеного розчину з метою регулювання його складу. Цю нефасованого І-пСО одержують з об'єднаних пар- стадію починають при кімнатній температурі (хро- тій неочищеного концентрату І-пСа, одержаних із матографування на силікагелі С4), а потім продо- використанням культури однієї й тієї ж лінії клітин, вжують при приблизно ї5"С. Перевага віддається при цьому кількість об'єднуваних партій концент- робочій температурі в діапазоні 5243"С. Цю стадію рату може змінюватися. Критерієм кількості об'єд- повторюють окремо для кожної партії первинного нуваних партій концентрату є показник максима- матеріалу, зібраної на протязі виробничого циклу льної здатності зв'язування протеїну на наступній біореактора. хроматографічній стадії процесу очищення (4 мг (Ї) Просвітлення первинного матеріалу суми протеїнів на 1 мг смоли).

Свіжовідібране культуральне середовище з (її) Просвітлення фільтруванням біореактора спочатку звичайно просвітлюють шля- Розчин І-пСа у варіанті, якому віддається пе- хом фільтрування. ревага, пропускають через фільтрувальний прист- (ї) Хроматографування на силікагелі СА рій і промивають фільтри 40 мМ розчином фосфа-

Після просвітлення первинний матеріал зава- ту натрію, рН 7,5. нтажують у хроматографічну колонку з силікаге- (її) Іонообмінне хроматографування на ДЕАЕ- лем С4, попередньо зрівноважену в 25 мМ розчині Сефарозі ЕЕ фосфату натрію, рН 7. Перевага віддається діапа- Колонку, заповнену слабко зарядженою аніо- зону рН від 6,6 до 7,7. Колонку промивають 25 мМ нообмінною смолою -діетиламіноетан-(ДЕАЕ)- розчином фосфату натрію до повернення сигналу Сефарозою для високої швидкості потоку (ОЕАЕ-

Уф-детектора на рівень базової лінії. Потім вико- Зерпагозе ЕЕ), зрівноважують 40 мМ розчином нують елюювання продукту сумішшю 25 мМ роз- фосфату натрію, рН 7,5. чину фосфату натрію з 2-пропанолом (34,290 Розчин І-пСа завантажують у верхню частину (мас.)), колонки. (ії) Оброблення аміаком В колонку подають 40 мМ розчин фосфату на-

Потім до розчину додають розчин аміаку до трію, рН 7,5. Хроматографічний процес контролю- досягнення кінцевої концентрації 1 М. Цю суміш ють способом УФ спектрофотометрії на довжині інкубують протягом б год. Після цього розбавля- хвилі 280 нм. ють розчин вдвічі водою і встановлюють рН 7,5, Головну фракцію елюату до початку елюю- використовуючи 85956-ну фосфорну кислоту. Діапа- вання піка відкидають. Після цього збирають не- зон рН, якому віддається перевага, становить зв'язану фракцію, яка містить І-пСа. 7,550 2. Стадія І! (онообмінне хроматографування на (м) Концентрування та діаліз СМ-Сефарозі ЕР)

Мембрани з верхньою межею пропускання На цій хроматографічній стадії видаляється молекулярної маси 10 кДа, які в проміжках між значна частка домішок, що походять із клітин но- операціями зберігають в 0,05 М розчині гідроксиду сія. Стадію виконують при температурі приблизно натрію, промивають очищеною водою до зниження 5"С. Перевага віддається температурі в діапазоні рН приблизно до 8. 53".

Продукт концентрують і діалізують (шляхом () Розбавлення елюату з колонки з ДЕАЕ- ультрафільтрування через мембрани з верхньою Сефарозою ЕЕ межею пропускання 10 кДа) для видалення речо- До елюату з колонки з ДЕАЕ-Сефарозою ЕЕ вин із молекулярними масами менше ніж 10 кДа та додають воду для ін'єкцій і встановлюють рН 6, залишків 2-пропанолу та для заміни розчину аміа- використовуючи 85956-ну фосфорну кислоту. Діапа- ку 40 мМ розчином фосфату натрію, рН 7,5. Діапа- зон рН, якому віддається перевага, становить зон рН, якому віддається перевага, становить 630,1. 7,5-0,2. (її) Іонообмінне хроматографування на СМ-

Кінцеву затриману фракцію виділяють із мем- Сефарозі ЕЕ бран 40 мм розчином фосфату натрію з розрахун- Колонку, заповнену слабко зарядженою аніо- ком на досягнення концентрації цільового протеїну нообмінною смолою - карбоксиметил-(СМ)- 3-15 мг/мл. Сефарозою для високої швидкості потоку (СМ-

Потім розчин фільтрують, і одержаний концен- Зерпагозе Раві Ріом/), зрівноважують 20 мМ натрій- трат зберігають в замороженому стані при темпе- фосфатним буферним розчином, рН 6. Діапазон ратурі приблизно -1576. рН, якому віддається перевага, становить 650,1.

Стадія І! (фільтрування та іонообмінне хрома- Розчин І-пСа завантажують у верхню частину тографування на ДЕАЕ-Сефарозі ЕЕ) колонки.

На цій стадії хроматографування /-пСОе прохо- Колонку промивають 20 мМ натрій-фосфатним дить через колонку, де з розчину видаляється зна- буферним розчином, рН 6. Хроматографічний чна частка протеїнів, інших ніж І-пСа, та нуклеїно- процес контролюють способом УФ спектрофото-

метрії на довжині хвилі 280 нм. лекулярної маси 10 кДа. Операції хроматографу-

Для елюювання продукту використовують 130 вання на сорбенті Сефакрил 5-200 НЕ та ультра-

ММ натрій-фосфатний буферний розчин, рН 6. фільтрування з верхньою межею пропускання мо-

Головну фракцію елюату до початку елюювання лекулярної маси 10 кДа виконують при піка відкидають. температурі приблизно ї5"С. Температурний діа-

Збирають весь пік, який містить І-пСбО. Про- пазон, якому віддається перевага, становить дукт на цій стадії можна факультативно профільт- 55376. рувати для видалення вірусних забруднювачів. () Хроматограсьування на сорбенті Сефакрил

Стадія ІМ (РХВЕ з оберненою фазою на силі- 5-200 НА кагелі С18) Колонку, заповнену сорбентом Сефакрил 5-

На цій стадії рідинної хроматографії високої 200 НА, зрівноважують 0,5 М розчином бікарбона- ефективності з оберненою фазою забезпечується ту амонію, рН 8. Перевага віддається діапазону рн ефективне видалення залишкових кількостей до- 850,2. мішок, що походять із культури клітин, залишків У верхню частину колонки завантажують роз- нуклеїнових кислот та ендотоксинів. Після неї ви- чин /-пСа і починають елюювання 0,5 М розчином конують ультрафільтрування з верхньою межею бікарбонату амонію, рН 8. Перевага віддається пропускання молекулярної маси 10 кКДА та факу- діапазону рН 8:02. льтативне фільтрування. Збирання фракції /-пСО починають із початку (Ї) Підготовка аліквотних кількостей піка і продовжують до досягнення 5095 максима-

Аліквотні кількості доводять до рН 5 і додають льної висоти піка на низхідній його частині. 2-пропанол до кінцевої концентрації 15905 (об'єми.) (і) Ультрафільтрування з межею пропускання (її РХВЕ з оберненою фазою на силікагелі 10 кДа сС18 Ультрафільтрувальні мембрани з верхньою

Колонку, заповнену сорбентом силікагелем межею пропускання молекулярної маси 10 кДа, які

С18, спочатку зрівноважують в суміші 1595 (об'є- у проміжках між операціями очищення зберігають ми.) 2-пропанолу з 0,5 М буферним розчином в 0,05 М розчині гідроксиду натрію, промивають

Трис-фосфату. водою для ін'єкцій, доки рН не досягне приблизно

Завантажують у верхню частину колонки пер- 8. шу аліквотну кількість розчину г-пСаї і контролю- Продукт концентрують і діалізують (шляхом ють хроматографічний процес методом УФ спект- ультрафільтрування) проти ВДІ. рофотометрії. Потім продукт діалізують (шляхом ультрафіль-

Промивають колонку тим же самим зрівнова- трування) проти 0,01 М натрій-фосфатного буфе- жувальним буферним розчином. рного розчину, рН 7, і регулюють кінцеву концент-

Потім виконують елюювання г-пСсСіз лінійним рацію протеїнів для досягнення кінцевої градієнтом концентрації 2-пропанолу в рухомій концентрації цільового протеїну 3,5 мг/мл. фазі (суміші 2-пропанолу з 0,5 М буферним розчи- Очищений нефасований розчин /-пСе доціль- ном Трис-фосфату) від 1595 (об'ємн.) до 2590 (о0б'- но зберігати замороженим при температурі приб- ємМн.). лизно -1570.

Фракції І-пСа починають відбирати, коли спек- Хроматографічні сорбенти трофотометричний пристрій починає детектувати В процесі очищення можна використовувати відповідний пік (Агво): Фракції, поглинання яких пе- хроматографічні сорбенти, перелічені нижче. Мо- ревищує 6595 максимальної висоти піка у висхідній жна використовувати також їх еквіваленти. його частині і 2095 максимальної висоти піка у низ- Стадія І: Силікагель СА (5ійса С4), розмір пор хідній частині, збирають в один збірник. 250 А, розмір частинок 50 мкм (продукт МаїгехФф,

Потім чотири збірних партії елюату, які містять фірма МШіроге)

І-яба, об'єднують і розбавляють еквівалентним Стадія ІІ: ДЕАЕ-Сефароза для великої швид- об'ємом води для ін'єкцій (ВДІ). кості потоку (ОЕБАЕ-берпагозе ЕЕ) (фірма

Продукт концентрують та діалізують РПпаптасіа) (шляхом ультрафільтрування через мембрану з Стадія І: СМ-Сефароза для великої швидкос- верхньою межею пропускання 10 кДа) проти ВДІ ті потоку (СМ-Зерпагозе ЕЕ) (фірма Рнаптасіа) для видалення речовин із молекулярною масою Стадія ІМ: Силікагель С18 (5іййса С18), розмір менше 10 кДа та 2-пропанолу. пор 300 А, розмір частинок 15-20 мкм (фірма

Після цього продукт діалізують проти ОД М Мудас) буферного розчину бікарбонату амонію, рн 8. Стадія М: Сефакрил 5-200 НА (Зернасгу! 5-

Одержаний проміжний продукт зберігають 200 НА) (фірма Рпаптасіа) приблизно при к5"7С або в разі необхідності замо- Нинішні постачальники: рожують. Перевага віддається температурі збері- Атегзпат РПаптасіа Віоїесі, Віоїкдаїап 30, 5- гання відповідно 5243" або -157С чи нижче. 751 84, Оррзаїа, Змедеп;

Стадія М (ексклюзійне хроматографування на МіШроге Согрогайоп, 17 Спепу Ні! Оіїме, сорбенті Сефакрил 5-200 НЕ) Бапмеге, МА 01923, ОБА;

На цій хроматографічній стадії з розділенням Мудас, Тне Зерагайоп Стор, 17434 Модаме 5І., за розміром молекул забезпечується видалення Незрепа, СА 92345, О5А. залишкових кількостей домішок, що походять із Результати культури клітин, потенціальних агрегатів та/або Молекулярна маса та розміри молекул вільних суббдиниць. Після неї виконують ультра- 5О5-РАСЕ фільтрування з верхньою межею пропускання мо- Відносну молекулярну масу І-пСа, одержано-

го за способом очищення згідно з цим винаходом, Розфасовка: 0,5 мл визначали методом електрофорезу в поліакрила- мідному гелі (5О5-РАСЕ) в порівнянні зі стандарт- Таблиця 4 ними протеїнами з відомими молекулярними ма- сами. Інгредієнти Одиниці Кількість

Забарвлення індикатором брильянтовим зе- ооотедієнти | Одикищ | Кльксть леним (продукт фірми Соотаввіє) після невіднов- лювального 50О5-РАСЕ виявило одну широку сму- гу гетеродимеру І-пСО із молекулярною масою орто-Фосфорна приблизно 70 кДа (діапазон 65-75 кДа). Ідентич- ність смуги підтверджено вестерн-блотингом. Гідроксид натрію за потребою до

Біологічна активність різних партій І-пСа після очищення за способом цього винаходу відображе- Розфасовка: 0,5 мл на в Таблиці 2. Концентрацію протеїну визначали Результати випробувань стабільності, одер- спектрофотометричним методом на довжині хвилі жані методами біопроб, ексклюзійної хроматогра- 216,5 нм, ах0,616. й й фії в комбінації з рідинною хроматографією висо-

Середня питома активність препаратів -нСа кої ефективності та рідинною хроматографією має особливо високе значення і досягає приблиз- високої ефективності з оберненою фазою, показа- но 25000 МО/Мг. ли, що композиція з манітом більш стабільна в порівнянні з композицією, що містить сахарозу. з

Таблиця 2 точки зору мінімізації окиснення протеїну та утво- етан од

Ліофілізована композиція

Ліофілізовану композицію з ефективністю 5000

МО, приготовану у флаконах за стандартом ОІМ 2А із використанням сахарози як наповнювача, випробовували на стабільність при температурах 50"С,40"С,257"С і 4.

Композиції Характеристики композиції подано в Таблиці 5.

Розроблено як рідкі, так і ліофілізовані компо- зиції на основі рекомбінантного ПСО високої чис- Таблиця 5 тоти, очищеного способом за цим винаходом.

Дві рідкі композиції з активністю 10000 МО/мл, виміру приготовані у флаконах за стандартом О0ІМ 2А із -СаЇ1 МОЇ 00005ОВО використанням маніту або сахарози як наповню- вачів, випробовували на стабільність при темпе- ратурах 50"С, 407С, 2570 і 476. кислота

Характеристики композицій наведено в Таб- Гідроксид натрію за потребою до

Таблиця З Результати випробувань стабільності, одер- - - ---- жані методами біопроб, ексклюзійної хроматогра- фії в комбінації з рідинною хроматографією висо- вимір кої ефективності та рідинною хроматографією високої ефективності з оберненою фазою, показа- ли, що ця ліофілізована композиція зберігала ста- більність при 402С ії 50"С протягом щонайменше кислота 19 тижнів. (ароксиднатію | 000 |залотебоюдо Випробування стабільності при 252С і 42С на рн протязі 6 місяців не виявили ознак розкладу акти- вної речовини.

Комп'ютерна верстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601