KR100806911B1 - ｈＣＧ의 정제 방법 및 이 방법에 의해 정제된 재조합ｈＣＧ - Google Patents
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Abstract
CHO 세포의 상등액에서 조 재조합 hCG의 샘플로 부터 재조합 인간 융모막 고나도트로핀(hCG)의 정제 방법은 이온 교환 크로마토그라피 및 역상 HPLC의 혼합 사용을 포함한다. 이온 교환 크로마토그라피는 두 번 수행되고 사이즈 익스클루션 크로마토그라피의 최종 사용은 오염물의 잔여 흔적으로 부터 정제를 할 수 있다. 본 방법으로 수득된 고도로 정제된 hCG의 특정 생물활성은 약 25.000IU/mg의 양으로 특히 높다.
Description
본 발명은 융모막 고나도트로핀의 정제 방법에 관한 것으로, 특히 조 재조합 hCG의 샘플로 부터 재조합 인간 융모막 고나도트로핀(hCG)의 정제 방법에 관한 것이다. 본 방법은 이온 교환 크로마토그라피와 역상 HPLC의 사용을 포함한다.
융모막 고나도트로핀은 태반에서 생산되고 전통적으로 임신한 여성의 뇨에서 수득된다.
이들 호르몬은 비-공유결합된 α및 β서브유닛(subunits)으로 구성된 헤테로다이머이다.
이의 효과는 고나도트로핀 황체형성호르몬의 것에 현저하다.
융모막 고나도트로핀은 고나도트로핀의 부재 또는 저농도에 기한 무배란성 불임의 치료에 있어 여성에게 여포 발생이 여포자극호르몬 또는 인간 폐경기 고나도트로핀으로 자극되어진 후 배란을 유도하기 위해 주어진다. 5000 내지 10000 유닛의 단일 복용량이 정상적으로 배란을 자극하는 황체형성호르몬의 중기 피크에 유사하게 하기 위해 근육내 주사에 의해 주어진다. 융모막 고나도트로핀은 또한 메노트로핀과 연계하여 주어지고 때로는 또한 생체외 수정 생산자에 보조로서 클로미펜 시트레이트 및 과배란과 난모세포 컬렉션을 포함하는 기타 보조적 개념의 기술이 주어진다. 남성에있어, 이는 사춘기전의 잠복고환의 치료에 사용되어 왔다. 치료법은 매우 광범위하지만, 통상 500 내지 4000단위의 범위로 주 3회 근육내 주사로 사용되었다.
또한 이것은 저고나도트로핀성선기능저하증과 연계한 남성불임에 사용된다. 또, 복용량 요법에 상당한 변화가 있으며 복용량은 500 내지 4000단위의 범위로 주 2 내지 3회로 변한다. 때로는 메노트로핀과 같은 여포자극 활성을 갖는 제제가 정상적인 정자형성을 가능하게 부가된다. 정액감소증에 대해, 메노트로핀 또는 여포자극 제제와 함께 주에 3000단위 까지의 융모막 고나도트로핀 복용량이 사용될 수 있다. 남성에 있어, 성선기능저하증과 연계한 지연된 사춘기의 치료에 있어, 500 내지 1500단위의 복용량이 주에 2회 주어지고; 복용량은 플라스마-테스토스테론 농도에 대해 적정된다.
다양한 방법이 원뇨 샘플로 부터 hCG를 분리하고 정제하는데 사용되어 왔다(Birken et al., Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35(5): 1414-6, 1990; Donini et al., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). 최근에는 멤브레인 여과 어피니티 크로마토그라피(membrane filtration affinity 크로마토그라피)라는 다른 방법의 어피니티 크로마토그라피가 발전되어 뇨로 부터 hCG를 정제하는데 적용된다(Xu et al., Protein expression and purification, 16: 221-3, 1999). 이 방법은 어피니티 크로마토그라피 칼럼에 고체 상으로서 BrCN 활성화 세파로스의 사용이 없어 뇨 샘플로 부터 어피니티 크로 마토그라피에 의한 통상의 hCG 정제방법의 변화를 나타낸다. 본 방법에 따른 정제된 hCG의 면역활성은 8554IU/mg이다.
재조합 hCG는 고나도트로핀 호르몬 및 인간 유래의 오염물과 더욱 특히는 인간 뇨에 존재하는 것을 회피하는 이점이 있다. 그러나, 재조합 hCG의 조 산물은 이의 재조합 생산에 사용된 세포의 모든 기타 단백질과 오염원을 포함하여 재조합 융모막 고나도트로핀의 절대적 순도를 달성하는 방법이 아주 소망될 수 있다.
본 발명자 등은 재조합 과정 후 수득된 배양 배지의 농축된 샘플로 부터 또는 임신한 여성의 조 농축물로 부터 유래된 hCG의 조 제조산물은 얻어진 hCG가 실용적으로 조 hCG 제조산물에 포함된 단백질 또는 기타 오염물질이 없는 정도로 정제될 수 있다는 것을 알아냈다.
정제법은 이온 교환 크로마토그라피와 역상 HPLC의 사용에 기초한다. 더욱이 사이즈 익스클루션 컬럼의 가능한 사용은 어떠한 오염 잔여물의 흔적도 제거할 수 있게한다. 최적의 결과는 적어도 두 단계의 이온 교환 크로마토그라피가 수행될 때 수득된다.
본 발명의 방법은 재조합 과정으로 부터 유도된 배양배지의 조 제조물로 부터 재조합 hCG의 정제에 사용될 수 있다. 이 r-hCG는, 특히 배양 배지 내에 포함된 태아 송아지 혈청(FBS) 단백질, 및 재조합 과정에서 사용된 호스트 셀에 존재하는 핵산 또는 기타 오염물질이 없는 높은 순도와 높은 특정 생물활성(specific bioactivity)(23.000-28.000IU/mg의 범위)으로 수득된다.
본 발명의 방법은 임신한 여성의 뇨의 조 농축물로 부터 출발하여 뇨의 hCG 정제뿐 아니라, 기타 종, 예를 들어 소과 동물, 말, 돼지, 양 및 몽키를 포함하는 기타 포유동물로 부터 CG의 정제에 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 이온 교환 크로마토그라피와 역상 HPLC의 혼합 사용을 포함하는 샘플로 부터 LH의 정제법을 제공하기 위한 것이다. 이 방법은 샘플을 이온 교환 크로마토그라피하는 단계와 역상 HPLC에 용리하는 단계를 포함한다. 더욱이 사이즈 익스클루션 컬럼에 용리하는 단계가 부가적으로 수행될 수 도 있다.
정제 과정으로 부터 최적의 결과를 얻기 위해서는 두 이온 교환 크로마토그라피 단계가 다른 조건 하에서 수행됨이 바람직하다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태는 다음의 단계를 포함한다:
(a) 실리카 크로마토그라피 칼럼을 통한 샘플 용리;
(b) DEAE 세파로스 이온 교환 크로마토그라피 칼럼을 통한 샘플 용리;
(c) CM-세파로스 이온 교환 크로마토그라피 칼럼을 통한 용리;
(d) 실리카 C18 역상 HPLC 칼럼을 통한 용리; 및
(e) 세파크릴 사이즈 익스클루션 크로마토그라피 칼럼을 통한 용리.
본 발명의 바람직한 실시형태에서 DEAE 세파로스 이온 교환 크로마토그라피 칼럼을 통한 용리는 약 pH7.5에서 소디움 포스페이트 버퍼에서 수행된다.
바람직하기로는 CM-세파로스 이온 교환 칼럼을 통한 용리는 약 pH6에서 소디움 포스페이트 버퍼에서 수행된다.
역상 HPLC 단계(d)는 바람직하기로는 이동상으로 2-프로판올/트리스-인산염 완충액으로 수행된다.
본 발명의 CG는 재조합 과정에서 사용된 CHO 세포의 배양 배지로 부터 유도되는 바람직하기로는 인간 CG 및 가장 바람직하기로는 재조합 인간 CG이다.
더욱이 본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 재조합 과정에 의해 정제된 재조합 hCG의 치료적 유효량을, 적당한 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다. 적절한 부형제의 예는 슈크로스로, 동결건조된 산물의 안정화를 돕는다. 재조합 hCG의 약학적 조성물은 특히 피하 투여에 적당하다.
본 발명은 재조합 과정의 배양배지 내의 조 산물로 부터 hCG의 정제, 특히 재조합 hCG의 정제방법을 제공한다. r-hCG는, 특히 배양 배지 내에 포함될 수 있는 송아지 태아 혈청(FBS) 단백질 및 재조합 과정에서 사용된 호스트 셀에 포함된 핵산 또는 기타 오염물질이 없는 고도의 순도와 높은 특정 생물활성(23.000-28.000IU/mg의 범위)으로 수득된다.
본 발명은 출발 물질 샘플로 생물학적 물질, 특히 여기서 언급된 기타 오염 단백질 및 hCG를 포함하는 조 혼합물을 사용하기 위한 것이다. 아래에 자세하게 기술된 실시예는 생물반응조로 부터 세포 배양 상등 배지에서 수득된 r-hCG를 포함하는 출발 물질 샘플을 사용한다. 대안적으로, 이 샘플은 임신 여성의 조 농축된 뇨이다.
이 샘플은 2일에 걸쳐 생물반응조를 통해 확산된 신선하게 수집한 세포 배양 상등 배지로 구성된다. 상등액은 바람직하기로는 여과를 통해 분류된다. 그런 다음 조 용액은 필요하다면 농축되고, 세포 배양으로 부터 유도된 오염물질을 제거하기 위해 C4 실리카 크로마토그라피된다.
한외여과 후, 반 정제된 수득물은 그리고 나서 이온 교환 크로마토그라피의 대상이 되고, 바람직하기로는 두번, 또 바람직하기로는 다른 조건 하에서 수행되고 역상 HPLC의 대상된다. 첫번째 DEAE 세파로스 이온 교환 단계는 필수적으로 대부분의 비-hCG 단백질과 DNA가 제거되는 hCG"흐름-관통(flow-through)" 단계로 작용하여 수행될 수 있다. 두번째 이온 교환 단계는 바람직하기로는 CM-세파로스 컬럼으로 수행되고, 이는 hCG 바인딩 단계로 작용하고 잔여 DNA 및 호스트 셀 또는 배지 단백질 오염물질을 제거한다. 바람직한 실시형태로 이 단계는 약 5℃에서 pH6에서 인산 나트륨 완충액으로 용리하여 수행된다.
실리카 C18상에서 역상 크로마토그라피는 핵산 및 세포 배양 유도 오염물질의 잔량을 제거하는데 유효하다. 칼럼은 바람직하기로는 이동상으로 2-프로판올/트리스-인산염 완충액으로 용리된다. 그런 다음 유지된 용액은 10 KD 컷-오프로 한외여과되고 농축되고 pH8의 암모늄 하이드로겐 카보네이트로 회수될 수 있다. 농축된 산물은 바람직하기로는 세파실 S200 HR로 사이즈 익스클루션 크로마토그라피 칼럼에 적용된다. 이 단계에서, 분자 크기에 기초한 분리는 pH8의 암모늄 하이드로겐 카보네이트로 용리하여 여전히 존재가능한 잔량의 세포 배양 유도 오염물질, 잠정적 응집물 및 유리 hCG 서브-유닛을 제거하는 것이 달성된다. 그리고 나서 이 용리액은 바람직하기로는 pH7 소디움 포스페이트 버퍼에서 10 KD 컷-오프로 멤브레인상에서 한외여과에 의해 투석된다. 여과 후, 정제된 hCG 벌크는 바람직하기로는 저온에서 멸균된 병에 보관된다.
시약
암모니아, 분석 등급
암모늄 하이드로겐 카보네이트, 분석 등급 (B.P.)
디-소디움 하이드로겐 포스페이트, 분석 등급
무수 변성 에탄올
인산, 분석 등급 (Ph.Eur.)
2-프로판올, 분석 등급 (Ph.Helv.)
소디움 크로라이드, 분석 등급 (Ph.Eur.)
소디움 디-하이드로겐 포스페이트, 분석 등급
수산화나트륨 펠릿(pellets), 분석 등급 (Ph.Eur.)
트리플루오로초산(TFA), HPLC 등급
트리스-(하이드록시메틸) 아미노메탄, 분석 등급
정제과정 요약 흐름도
세포 배양 과정으로 부터 유도된 수득 물질이 정제되고 일련의 다섯 크로마토그라피 단계로 농축된다.
다음 흐름도(표 1)는 크로마토그라피 칼럼 수지와 각 중간 단계의 주요한 조작을 개략적으로 나타낸 r-hCG 정제과정을 요약한 것이다.
| 단계 I | 생물반응조로 부터 배양 배지 ｜ C4 실리카 크로마토그라피 (용리액은 r-hCG를 포함) ｜ 10 kD 컷-오프 한외여과 (보유액은 r-hCG를 포함) ｜ 농축된 조 r-hCG 수득물 ｜ |
| 단계 II | DEAE 세파로스 FF (비결합된 분획 r-hCG를 포함) ｜ |
| 단계 III | CM 세파로스 FF (용리액은 r-hCG를 포함) ｜ |
| 단계 IV | 실리카 C18 상 RP-HPLC (용리액은 r-hCG를 포함) ｜ 한외여과 (10kD) |
| 단계 V | 세파크릴 S-200 HR (용리액은 r-hCG를 포함) ｜ r-hCG 벌크 용액 |
자세한 흐름도 및 과정의 설명은 다음과 같다. 포획 단계(단계 Ⅰ)에 주어진 상태는 원 물질이 재조합 유래의 것일 때 정상적으로 적용되는 것이다.
단계 I(포획 단계)
이 단계(단계 I)에서 예비 농축물이 이루어지고 버퍼는 조절된 조성물로 변한다. 이 단계는 실온에서 시작되고(실리카 C4 크로마토그라피) 나서 약 +5℃에서 지속된다. 바람직한 온도 범위는 5 ±3℃이다. 생물반응조의 생산주기 동안 각 수득물에 대해 개별적으로 반복된다.
(i)수득물의 분류
생물반응조로 부터 신선하게 모아진 배양 배지는 통상적으로 먼저 여과에 의해 분류된다.
(ii)실리카 C4 크로마토그라피
분류 후, 수득물은 pH7의 인산 나트륨 25mM으로 미리 평형화된 C4 실리카 크로마토그라피 칼럼상에 적하된다. 바람직한 pH범위는 6.6 내지 7.7이다. 이 칼럼은 UV 모니터 시그날이 바세린으로 환원될 때 까지 인산 나트륨 25mM으로 수세된다. 그런 다음 이 산물은 인산 나트륨 25mM 내 34.2%(w/w) 2-프로판올로 용리된다.
(iii)암모니아 처리
그런 다음 최종 농도가 1M이 되도록 용액에 암모니아를 부가한다. 이 혼합물은 6 시간 동안 배양된다. 그리고 나서 용액은 물로 두배로 희석되고 pH는 인산 85%를 사용하여 7.5로 조정된다. 바람직한 pH범위는 7.5 ±0.2이다.
(iv)농축 및 투석
뱃찌사이에서 0.05M 수산화나트륨에 보관된 10kD 컷-오프 멤브레인은 pH가 약 8까지 내려갈 때까지 정제수로 린스된다.
이 산물은 농축되고 투석되어(10kD 멤브레인 상에서 한외여과에 의해) 10kD 보다 낮은 분자량을 갖는 물질이 제거되고 잔량의 2-프로판올이 제거되어 암모니아 용액을 pH7.5의 인산나트륨 40mM으로 바뀐다. 바람직한 pH범위는 7.5 ±0.2이다.
3 내지 15mg/ml의 목표 단백질 농도를 이루기 위해 최종 보유액은 인산나트륨 40mM으로 멤브레인으로 부터 회수된다.
그런 다음 용액은 여과되고 얻어진 농축물은 약 -15℃에서 동결 보관된다.
단계Ⅱ(여과 및 DEAE 세파로스 FF 크로마토그라피 상에서 이온 교환)
이 크로마토그라피 단계는 대부분의 비-hCG 단백질과 핵산이 제거되는 r-hCG"흐름-관통" 단계이다. 여과는 실온에서 수행되는 반면, 산물이 칼럼을 통과하는 크로마토그라피 단계는 냉실에서 수행된다.
(i)r-hCG 농축된 조 수득물의 해동 및 저장
동결된 농축물이 해동되어 모아진다. 정제된 벌크 r-hCG의 뱃찌는 동일한 작업 세포 은행으로 부터 생산된 여러 수의 r-hCG 조 농축물의 풀(pool)로 부터 진행된다. 모여진 r-hCG 조 농축물의 수에 대한 표준은 정제과정에서 다음 크로마토그라피 단계의 최대 단백질 결합 능력(4mg 전체 단백질/수지의 mg)에 기초한다.
(ii)여과에 의한 분류
r-hCG 용액은 바람직하기로는 여과장치를 통과하고 필터는 pH7.5의 인산나트륨 40mM으로 수세된다.
여과된 용액 및 수세액이 모아진다.
(iii)DEAE 세파로스 FF 상에서 이온 교환 크로마토그라피
약하게 하전된 음-이온 교환 수지, 디에틸 아미노 에탄(DEAE) 세파로스 패스트 플로우로 충진된 칼럼은 40mM 인산나트륨(pH7.5)으로 평형화된다.
r-hCG 용액이 칼럼상에 적하된다. 이 칼럼은 pH7.5의 인산나트륨 40mM이 공급된다. 크로마토그라피 과정은 280nm에서 스펙트로포토메터에 의해 모니터된다. 피크가 용리를 시작할 때 까지 리딩 용리액은 버린다. 그런 다음 r-hCG를 포함하는 비결합 분획이 수집된다.
단계Ⅲ(CM 세파로스 FF 크로마토그라피)
이 크로마토그라피 단계에서 대부분의 호스트 셀 오염물질이 제거된다. 크로마토그라피 단계는 약 +5℃에서 수행된다. 바람직한 온도 범위는 5 ±3이다.
(i) EAE 세파로스 FF 용리액의 희석
주사용수가 EAE 세파로스 FF 용리액에 부가되고 pH는 85%인산을 사용하여 6으로 조정된다. 바람직한 pH 범위는 6 ±0.1이다.
(ii) CM 세파로스 FF 상에서 이온 교환 크로마토그라피
약하게 하전된 양이온-교환 수지, 카르복시메틸(CM) 세파로스 패스트 플로우로 충진된 칼럼은 20mM 인산나트륨 완충액(pH6)으로 평형화된다. 바람직한 pH 범위는 6 ±0.1이다.
r-hCG 용액이 칼럼상에 적하된다.
이 칼럼은 pH6의 인산나트륨 완충액 20mM으로 수세된다. 크로마토그라피 과정은 280nm에서 스펙트로포토메터에 의해 모니터된다.
산물은 pH6의 인산나트륨 완충액 130mM을 사용하여 용리된다. 피크가 용리를 시작할 때 까지 리딩 용리액은 버린다.
r-hCG를 포함하는 전체 피크는 수집된다. 이 산물은 바이러스성 오염물질을 제거하기 위해 이 단계에서 선택적으로 여과될 수 있다.
단계Ⅳ(실리카 C18 상에서 RP-HPLC)
이 RP-HPLC 단계는 흔적으로 남아있는 양의 세포 배양 오염물질, 핵산 잔여물 및 외독소를 제거하는데 유효하다. 10kD 컷-오프 한외여과와 선택적인 여과가 따른다.
(i) 적량의 준비
적량의 pH는 5로 조정되고, 2-프로판올이 최종농도 15%(v/v)로 부가된다.
(ii) 실리카 C18 상에서 RP-HPLC
실리카 C18 수지로 충진된 칼럼이 먼저 트리스-인산염 0.5M 완충액 내 2-프로판올 15%(v/v)로 평형화된다.
첫번째 적량이 칼럼상에 적하되고 크로마토그라피는 UV 스펙트로포토메터에 의해 모니터된다.
이 칼럼은 동일한 평형화 완충액으로 수세된다.
r-hCG의 용리는 이동상으로 15 내지 25%(v/v)의 직선 기울기의 2-프로판올/트리스-인산염 0.5M 완충액으로 연속적으로 수행된다.
상응하는 피크가 스펙트로포토메터에 의해 검지될 때(A280) r-hCG가 분획된다. 상승하는 부분에서 최대 피크의 65%보다 크고 하강하는 부분에서 최대 피크의 20%보다 큰 흡수도를 갖는 분획이 모아진다.
그런 다음 풀을 포함하는 4 r-hCG가 모아져 당량의 주사수(WFI)에 희석된다.
산물은 WFI에 대해서 농축되고 투석(10kD 멤브레인 상에서 한외여과에 의해)되어 10kD보다 낮은 분자량을 갖는 물질을 제거하고 2-프로판올을 제거한다.
그런 다음 이 산물은 pH8의 암모늄 하이드로겐 카보네이트 완충액 0.1M에 대해 한외여과에 의해 투석된다.
수득된 중간물질은 약 +5℃에서 저장되거나 필요하다면 동결된다. 바람직한 저장온도는 각각 5 ±3℃ 및 -15℃ 또는 그 이하이다.
단계Ⅴ(세파크릴 S-200 HR 상에서 사이즈 익스클루션 크로마토그라피)
이 사이즈 익스클루션 크로마토그라피 단계는 흔적으로 남아있는 양의 세포 배양 오염물질, 잠정적인 응집물 및/또는 유리 서브-유닛을 제거하는데 유효하다. 10kD 컷-오프 한외여과가 따른다. 세파크릴 S-200 HR 및 10kD 컷-오프 한외여과 단계는 약 +5℃에서 수행된다. 바람직한 온도 범위는 5 ±3℃이다.
(i) 세파크릴 S-200 HR 상에서 사이즈 익스클루션
세파크릴 S-200 HR 수지로 충진된 칼럼이 암모늄 하이드로겐 카보네이트 0.5M(pH8)로 평형화된다. 바람직한 pH 범위는 8 ±0.2℃이다.
r-hCG 용액이 칼럼 상에 적하되고, 용리는 암모늄 하이드로겐 카보네이트 0.5M, pH8을 사용하여 시작된다. 바람직한 pH 범위는 8 ±0.2℃이다.
r-hCG 분획의 수집은 피크의 처음부터 시작하여 피크의 하강 부분에서 최대 피크 높이의 50% 표지에 달할 때 까지 계속된다.
(ii) 10kD 컷-오프 한외여과
뱃찌사이에서 0.05M 수산화나트륨에 보관된 10kD 컷-오프 멤브레인은 pH가 약 8까지 내려갈 때까지 WFI로 린스된다.
이 산물은 WFI에 대해 농축되고 투석(한외여과에 의해)된다.
그런 다음 이 산물은 pH 7의 인산나트륨 완충액 0.01M에 대해 투석(한외여과에 의해)되어, 최종 단백질 농도가 3.5mg/ml의 목표 최종 농도에 달하도록 조절된다.
수득된 r-hCG 최종 벌크 용액은 바람직하기로는 약 -15℃에서 동결보존된다.
크로마토그라피 수지
다음의 크로마토그라피 수지가 정제 과정에 채용될 수 있다. 당량 수지(Equivalent resins)도 또한 채용될 수 있다.
단계 Ⅰ: C4 실리카, 250 옹스트롬 - 50㎛ (Matrexⓡ,Millipore)
단계 II: DEAE 세파로스 FF (Pharmacia)
단계 III: CM 세파로스 FF (Pharmacia)
단계 IV : 실리카 C18, 300 옹스트롬 - 15-20㎛ (Vydac)
단계 V: 세파크릴 S-200 HR (Pharmacia)
현재 공급사는:
아머샴 파마시아 바이오텍 밀리포어 코포레이션
(Amersham Pharmacia Biotech,) (Millipore Corporation)
스웨덴 엎살라 S-751 84, 미국 MA 01923 덴버 17 체리 힐 드라이버
브죠르가탄 30
비닥, 더 세퍼레이션스 그룹
(Vydac, The Separations Group)
미국 CA 92345 헤스페리아 17434 모자브 스트리트.
결과
●분자량 및 사이즈
SDS-PAGE
본 발명의 정제 방법에 따라 수득된 r-hCG의 상대 분자량은 표준 단백질의 공지 분자량에 대해 SDS-PAGE에 의해 결정된다.
비환원 SDS-PAGE 후 쿠마지 브릴리언트 블루 스테이닝(Coomassie brilliant blue staining)은 약 분자량 70kD(범위 65-75kD)에서 r-hCG 헤테로다이머에 대한 싱글 브로드 밴드를 밝혀낸다. 이 밴드의 동정은 웨스턴 브롯팅(Western blotting)에 의해 확인된다.
●생물학적 활성
본 발명의 방법으로 정제 후 r-hCG의 다른 뱃찌의 생물학적 활성은 표 2에 나타난다. 단백질 농도는 276.5nm, a=0.616에서 스펙트로포토메터에 의해 결정된다.
r-hCG 수득물의 평균 생물활성은 약 25.000IU/mg의 양으로 특히 높다.
| r-hCG 뱃찌 | 특정 생물활성 (IU/mg) |
| BCEA 9901 | 24427 |
| BCEA 9902 | 26868 |
| BCEA 9903 | 25636 |
| BCEA 9904 | 27152 |
| BCEA 9905 | 23729 |
●제형화
액체 및 동결건조된 제형 양자는 본 발명의 고도로 정제된 재조합 hCG로 전개된다.
액체 제형
10000IU/ml로 두 액체 제형이 부형제로 만니톨 또는 슈크로스를 사용하여 바이알 DIN 2R에 제조되어 50, 40, 25 및 4℃에서 안정성 시험을 한다.
조성물은 표 3 및 4에 나타나있다.
| 성분 | 단위(UNIT) | |
| r-hCG | IU/ml | 10000 |
| 슈크로스 | mg/ml | 102.6 |
| O. 인산 | mg/ml | 0.98 |
| 수산화나트륨 | q.s. to pH 7.0 |
최종 부피 : 0.5 ml
| 성분 | 단위(UNIT) | |
| r-hCG | IU/ml | 10000 |
| 만니톨 | mg/ml | 54.6 |
| O. 인산 | mg/ml | 0.98 |
| 수산화나트륨 | q.s. to pH 7.0 |
최종 부피 : 0.5 ml
바이오어세이, SE/HPLC 및 RP-HPLC에 의해 수행된 안정성 시험의 결과는 만니톨 제형이 슈크로스 제형에 비해 보다 안정하다는 것을 보여준다. 냉동 보관 조 건은 바람직하기로는 단백질 산화와 유리 서브유닛 제형을 최소화하기 위해 요구된다.
동결 건조 제형
5000IU 강도로 동결 건조 제형이 부형제로 슈크로스를 사용하여 50, 40, 25 및 4℃에서 안정성 시험을 위해 바이알 DIN 2R에 제조된다.
조성물은 표 5에 나타나있다.
| 성분 | 단위(UNIT) | |
| r-hCG | IU | 5000 |
| 슈크로스 | mg | 30 |
| O-인산 | mg | 0.98 |
| 수산화나트륨 | q.s. to pH 7.0 |
바이오어세이, SE/HPLC 및 RP-HPLC에 의해 수행된 안정성 시험의 결과는 동결 건조 제형은 40 및 50℃에서 적어도 19주 동안 안정하다는 것을 보여준다.
25 및 4℃에서 안정성 시험은 활성 물질의 분해를 나타내지 않고 6개월 까지 수행돼었다.
Claims (15)
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- (a) 실리카 크로마토그라피 칼럼을 통한 샘플 용리 단계;(b) DEAE 세파로스 이온 교환 크로마토그라피 칼럼을 통한 샘플 용리 단계;(c) CM-세파로스 이온 교환 크로마토그라피 칼럼을 통한 용리 단계;(d) 실리카 C18 역상 HPLC 칼럼을 통한 용리 단계; 및(e) 세파크릴 사이즈 익스클루션 크로마토그라피 칼럼에 용리액을 적용하는 단계를 포함하는 샘플로부터 재조합 hCG의 정제 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 DEAE 세파로스 이온 교환 수지를 통한 용리가 pH 7.5에서 인산나트륨 완충액에서 수행되는 샘플로부터 재조합 인간 융모막 고나도트로핀의 정제 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, CM-세파로스 이온 교환 수지를 통한 용리가 pH 6에서 인산나트륨 완충액에서 수행되는 샘플로부터 23,000~28,000 IU/mg의 특정 생물활성을 갖는 재조합 인간 융모막 고나도트로핀의 정제 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 역상 HPLC 단계 (d)가 이동상으로 2-프로판올/트리스-인산염 완충액으로 수행되는 샘플로부터 재조합 인간 융모막 고나도트로핀의 정제 방법.
- 제8항에 있어서, 단계 (e)가 이동상으로 암모늄 하이드로겐 카보네이트 완충액으로 수행되는 샘플로부터 재조합 hCG의 정제 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 샘플이 CHO 세포의 배양배지인 샘플로부터 재조합 인간 융모막 고나도트로핀의 정제 방법.
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