CZ20022855A3

CZ20022855A3 - Způsob čiątění lidského choriogonadotropinu a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ20022855A3
Application number: CZ20022855A
Authority: CZ
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2002-11-13
Also published as: EP1257564B1; IL151308A0; EE200200469A; MXPA02007871A; EP1752466A3; HRP20020650A2; CA2399020A1; BG107000A; HU228935B1; CN100482679C; PL205149B1; SK12062002A3; US20030104553A1; EP1257564A1; RS50741B; PT1257564E; US7297777B2; JP4588960B2; SK287146B6; KR100806911B1

Description

Způsob čištění lidského choriogonadotropínu a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu čištění lidského choriogonadotropínu hCG, zvláště čištění rekombinantního lidského choriového gonadotropinu ze surového vzorku této látky. Postup zahrnuje použití chromatografie na iontoměničí a vysokotlaké kapalinové chromatografie HPLC v reversní fázi.

Dosavadní stav techniky

Choriogonadotropin je hormon, produkovaný placentou a získávaný z moči těhotných žen.

Jde o heterodimerní hormon, který je tvořen podjednotkamí alfa a beta, které jsou spolu vázány nekovalentní vazbou. Účinky tohoto hormonu odpovídají účinkům luteinizačního hormonu.

Choriogonadotropin se podává ženám k vyvolání ovulace po stimulaci vývoje folikulu podáváním folikulostimulačního hormonu nebo při léčení neplodnosti, doprovázené anovulačními cykly vzhledem k nízké koncentraci gonadotropinu nebo v případě, že tyto hormony zcela chybí. Podávají se jednotlivé dávky 5000 až 10 000 jednotek nitrosvalové k napodobení vrcholu koncentrace luteinizačního hormonu uprostřed cyklu, po němž obvykle dochází ke stimulaci ovulace. Choriogonadotropin se také podává ve spojení s menotrophinem a někdy také s clomiphencitrátem jako pomocný prostředek při oplodnění • · • · • ·

in vitro a při dalších postupech asistovaného otěhotnění včetně vyvolání superovulace a odběru vajíček. U mužů se tento hormon užívá při léčení prepubertálního kryptorchismu. Způsob podávání se může měnit v širokém rozmezí, obvykle se však podává 500 až 4000 jednotek 3krát týdně nitrosvalově.

Uvedený hormon se také podává v případě mužské neplodnosti, spojené s hypogonadotrofním hypogonadismem.

I v tomto případě se mohou dávky pohybovat v širokém rozmezí, obvykle se podává 500 až 4000 jednotek 2krát až 3krát týdně. Často se přidává ještě látka s folikulostimulačním účinkem, například menotrophin k dosažení normální spermatogenese. V případě oligospermie se podávají dávky až 3000 jednotek choriogonadotropinu týdně spolu s menotrophinem nebo jinou folikulostimulační látkou. Při léčení opožděné puberty, spojené s hypogonadismem u mužů, se podává dávka 500 až 1500 jednotek 2krát týdně. Dávky by měly být podrobeny zkouškám proti koncentraci testosteronu v krevní plasmě.

K izolaci a čištění hCG z moči byly použity různé postupy, například podle publikací Birken a další, Endocrinology, 133(3), 1390-7, 1993, Sakakibara a další, Chem. Pharm. Bull., 35(5), 1414-6, 1990, Donini a další, Acta Endocrinol., 73(1), 133-45, 1973. V poslední době byl vyvinut odlišný postup, založený na afinitní chromatografii a označovaný jako afinitní chromatografie s membránovou filtrací, tento postup byl použit k čištění hCG z moči podle publikace Xu a další, Protein expression and purification, 16, 221-3, 1999. Při uvedeném postupu se neužívá jako pevné fáze pro afinitní chromatografii Sepharosa, aktivovaná BrCN, takže postup znamená variaci • · obvyklých způsobů čištění hCG afinitní chromatografii z moči. Imunologická účinnost čištěného vzorku tímto postupem je 8554 IU/mg.

Rekombinantní hCG má tu výhodu, že je prostý jiných hormonů typu gonadotropinu a kontaminujících sloučenin lidského původu, zvláště takových, které jsou obvykle přítomny v moči. Surový vzorek rekombinantního hCG však obsahuje všechny další proteiny a kontaminující látky z buněk, použitých k produkci rekombinantního hormonu a bylo by proto velmi žádoucí mít k dispozici způsob pro získání naprosto čistého hCG.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že surový vzorek hCG, odvozený od koncentrovaného vzorku v živném prostředí, získaném způsobem výroby rekombinantního hormonu nebo ze surového koncentrátu moči těhotných žen je možno čistit tak, že výsledný hCG je prakticky prostý proteinů a dalších kontaminujících látek, které byly obsaženy v surovém hCG.

Podle vynálezu je čištění založeno na použití chromatografie na iontoměniči a HPLC v reverzní fázi.

Dále je popřípadě ještě možno použít filtraci na materiálu, který odstraní látky s určitou molekulovou hmotností, tak aby došlo k odstranění jakýchkoliv zbytků kontaminujících látek. Optimálních výsledků je možno dosáhnout v případě, že se použití alespoň dva stupně chromatografie na iontoměniči.

Způsob podle vynálezu je možno použít pro čištění rekombinantního hCG ze surového materiálu v živném • · prostředí, v němž byl hormon rekombinantním způsobem získán. Tento r-hCG je možno získat s vysokým stupněm čistoty a s vysokou specifickou biologickou účinností 23000 až 28000 IU/mg, prakticky prostý fetálních proteinů séra skotu (FBS), v případě, že tyto látky byly přítomny v živném prostředí a také prakticky prostý nukleových kyselin nebo jiných kontaminujících látek, obsažených v hostitelských buňkách, použitých k produkci rekombinantního hormonu.

Způsob podle vynálezu je možno použít jak při čištění hCG z moči, kde se vychází ze surového koncentrátu moči těhotných žen, tak pro čištění CG z jiných savců, například skotu, koně, vepře, ovce a opice.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno čistit hCG z nečistého vzorku při použití chromatografie na iontoměniči a HPLC v reverzní fázi. Způsob obsahuje stupně, v nichž se vzorek podrobí chromatografií na iontoměniči a získaný eluát se podrobí HPLC v reverzní fázi. Dalším stupněm může být podrobení eluátu filtraci na sloupci, který oddělí látky s určitou molekulovou hmotností.

Nejprve se s výhodou provádějí 2 chromatografie na iontoměniči za různých podmínek tak, aby bylo možno dosáhnout optimálního čištění. Ve výhodném provedení se způsob podle vynálezu provádí tak, že se:

a) vzorek podrobí chromatografií na sloupci oxidu křemičitého, načež se

b) vzorek podrobí chromatografií na sloupci DEAE-Sepharózy jako iontoměniči,

c) eluát se podrobí chromatografií na sloupci CM• · • · • ♦ • ♦ • ·

-Sepharózy jako iontoměniči,

d) eluát se nechá projít sloupcem HPLC v reverzní fázi s náplní oxidu křemičitého Silica C18, a

e) eluát se nechá projít sloupcem Sephacrylu k odstranění látek s určitou molekulovou hmotností.

V jednom z výhodných provedení způsobu podle vynálezu se k eluci ze sloupce DEAE-Sepharózy užije pufr s fosforečnanem sodným o pH přibližně 7,5.

Eluce ze sloupce s náplní CM-Sepharózy se s výhodou provádí při použití pufru s fosforečnanem sodným o pH přibližně 6.

Stupeň d), to znamená HPLC v reverzní fázi se s výhodou provádí při použití směsi 2-propanolu a tris-fosfátového pufru jako mobilní fáze.

Hormonem, čištěným podle vynálezu je s výhodou lidský CG a zvláště rekombinantní hCG, získaný ze živného prostředí buněk CHO jako hostitelských buněk pro výrobu rekombinantního hormonu.

Součást podstaty vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, který jako účinnou složku obsahuje čištěný rekombinantní hCG, připravený svrchu uvedeným způsobem, spolu s příslušnými pomocnými látkami. Jako příklad vhodné pomocné látky je možno uvést sacharózu, která napomáhá stabilizaci lyofilizovaného produktu. Farmakologický prostředek s obsahem rekombinantního hCG je zvláště vhodný pro podkožní podání.

• · • · • · • · · * 9 9 • 9 · 99 9 9 ·

9 9999 999 ··· 9·99 ·· ·· ·· ····

Vynález tedy poskytuje nový způsob pro čištění hCG, zvláště pro čištění rekombinantního hCG ze surového materiálu, získaného ze živného prostředí po uskutečnění výroby rekombinantního hormonu. Rekombinantní hCG se získává s vysokým stupněm čistoty a s vysokou specifickou biologickou účinností, obvykle v rozmezí 23000 až 28000 IU/mg, prakticky prostý proteinu fetálního séra skotu, které jsou přítomny v živném prostředí a prakticky prostý nukleových kyselin a dalších kontaminujících látek, obsažených v hostitelských buňkách, použitých při výrobě rekombinantního hormonu. Vynález je určen pro čištění biologických materiálů, zvláště surových směsi s obsahem hCG a jiných kontaminujících proteinů, tyto materiály jsou výchozími materiály pro způsob podle vynálezu. V příkladech, které budou dále uvedeny, se jako výchozí materiály používají vzorky s obsahem r-HCG, získané ze supernatantu živného prostředí z biologických reaktorů.

Je také možno použít vzorky koncentrované moči těhotných žen.

Vzorek se získá odebráním supernatantu buněčné kultury v biologickém reaktoru v průběhu dvou dnů pěstování. Supernatant se s výhodou vyčeří filtrací. V případě potřeby se surový roztok zahustí a podrobí se chromatografií na oxidu křemičitém C4 k odstranění kontaminujících složek, odvozených od buněčné kultury.

Takto částečně čištěný materiál se po ultrafiltraci podrobí chromatografií na iontoměniči, která se s výhodou provádí 2krát a s výhodou za odlišných podmínek a pak chromatografií HPLC v reverzní fázi. První stupeň chromatografie na iontoměniči je možno uskutečnit při použití DEAE-Sepharózy, v průběhu tohoto stupně se ·· ·« ·♦ ·♦ *· ·» ···· · ♦ · ♦ »·** • ··.»» * · <

·. ······.

·♦·· ···· ·· ·· ·· ·*·· odstraní větší část proteinů, odlišných od hCG a DNA. Druhý stupeň chromatografie na iontoměniči se obvykle provádí na sloupci s náplní CM-Sepharózy, v tomto sloupci se hCG váže a odstraňují se zbytky DNA a proteinů z hostitelských buněk jako kontaminující látky. Ve výhodném provedení se tento stupeň provádí při teplotě 5 °C a k eluci se použije pufr s fosforečnanem sodným při pH přibližně 6.

Chromatografie v reverzní fázi na sloupci oxidu křemičitého Silica C18 je účinná pro odstranění stop nukleových kyselin a kontaminujících látek, odvozených od buněčné kultury. K eluci sloupce se s výhodou jako mobilní fáze použije směs 2-propanolu a tris-fosforečnanového pufru. Roztok materiálu, zadrženého v sloupci se pak s výhodou podrobí ultrafiltraci, při níž dochází k oddělení látek od molekulové hmotnosti 10000, eluát se koncentruje a materiál je možno izolovat úpravou pH na hodnotu 8 hydrogenuhličitanem amonným. Koncentrovaný produkt je pak možno dále zpracovávat chromatografii na materiálu Sephacryl S200 HR k ostranění dalších látek s určitou molekulovou hmotností. V tomto stupni se dosahuje oddělení od určité molekulové hmotnosti elucí hydrogenuhličitanem amonným o pH 8 k odstranění stále ještě případně přítomných stop materiálů z buněčné kultury, potenciálních shluků a volných podjednotek hCG. Eluát je pak možno podrobit dialýze ultrafiltraci na membránách, které oddělí látky od molekulové hmotnosti 10000, s výhodou při použití pufru s fosforečnanem sodným o pH 7. Po filtraci se takto čištěný hCG s výhodou ukládá ve sterilních lahvích při nízkých teplotách.

• · ♦ ♦ • · ··

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Reakční činidla:

amoniak, analyticky čistý hydrogenuhličitan amonný, analyticky čistý hydrogenfosforečnan sodný, analyticky čistý absolutní denaturovaný ethanol kyselina fosforečná, analyticky čistá

2-propanol, analyticky čistý chlorid sodný, analyticky čistý dihydrogenfosforečnan sodný, analyticky čistý hydroxid sodný ve formě pelet, analyticky čistý kyselina trifluoroctová, čistota pro použiti při HPLC (TFA) tris-(hydroxymethyl)aminomethan, analyticky čistý

Schématické znázornění způsobu podle vynálezu

Materiál, získaný ze živného prostředí buněčné kultury se čistí a koncentruje v pěti chromatografických stupních. Následující diagram v tabulce 1 shrnuje výhodné provedení způsobu čištění r-hCG, uvádí pryskyřice, použité v chromatografických sloupcích a základní podmínky pro každý stupeň.

• 9 * 9

99

9 · 9 9 9 ··· ··» ···« ·· «· «« ·«>·

Tabulka 1.

Stupeň I	Živné prostředí^ z biologického reaktoru chromatografie na oxidu křemičitém C4 (eluát obsahuje r-hCG) ultrafiltrace s oddělním látek s molekulovou hmotností 10000 (retentát obsahuje r-hCG) koncentrovaný surový r-hCG
Stupeň II	DEAE Sepharóza FF (nenavázaná frakce obsahuje r-hCG)
Stupeň III	CM Sepharóza FF (eluát obsahuje^ r-hCG)
Stupeň IV	RP-HPLC na oxidu křemičitém 08 (eluát obsahuje r-hCG) ultrafiltrace s oddělením látek s molekulovou hmotností 10000
Stupeň V	Sephacryl S-200 HR (eluát obsahuje r-hCG) výsledný roztok čistého r-hCG

Jednotlivé stupně uvedeného postupu budou dále podrobněji popsány. Podmínky ve stupni I jsou podmínky, obvykle užívané v případě, že surový materiál je rekombinantního původu.

Stupeň I (zachycení požadovaného materiálu)

Ve stupni I se dosahuje předběžné koncentrace materiálu a podle potřeby se mění použitý pufr. Tento stupeň obvykle začíná při teplotě místnosti při použití oxidu křemičitého C4 jako náplně chromatografického sloupce a pak pokračuje při teplotě +5 °C. Výhodné

4 4 ·· 44 44

4 4 4 4

4 4 4 ♦ 4 4φ ·· 44 ··«· teplotní rozmezí je 5 ± 3 °C. Tento stupeň se opakuje pro každé odebrání materiálu v průběhu produkčního cyklu biologického reaktoru.

i) Vyčeření materiálu

Čerstvě odebrané živné prostředí z biologického reaktoru se obvykle nejprve vyčeří filtrací.

ii) Chromatografie na oxidu křemičitém C4

Po vyčeření se materiál nanese na chromatografický sloupec s náplní oxidu křemičitého C4, předem uvedeného do rovnováženého stavu ve 25 mM fosforečnanu sodném o pH 7. Výhodné rozmezí hodnoty pH je 6,6 až 7,7. Sloupec se promývá fosforečnanem sodným o koncentraci 25 mM tak dlouho, až se signál na monitoru UV vrátí na základní hodnotu. Pak se produkt eluuje při použití 34,2 hmotnostních procent propanolu ve 25 mM fosforečnanu sodném.

iii) Zpracování amoniakem

K roztoku se přidá amoniak do konečné koncentrace 1 M a směs se inkubuje 6 hodin. Pak se roztok zředí dvojnásobným množstvím vody a pH se upraví na hodnotu 7,5 při použití 85% kyseliny fosforečné. Výhodná hodnota pH je v rozmezí 7,5 ± 0,2.

iv) Koncentrace a dialýza

Membrány pro oddělení látek s molekulovou hmotností od 10000, uložené v 0,05 M hydroxidu sodném, se opláchnou čištěnou vodou tak dlouho, až pH klesne na přibližně 8.

Produkt se zahustí a dialyzuje při použití těchto membrán k odstranění materiálu s molekulovou hmotností • » ·· ♦ · · • · ·· ♦ 4 • · « ·· ··♦· nižší než 10000 a k odstranění stop 2-propanolu a také k výměně roztoku amoniaku za 40 mM fosforečnan sodný o pH 7,5. Výhodná hodnota pH je 7,5 ± 0,2.

Výsledný retentát se z membrán oddělí při použití 40 mM fosforečnanu sodného na výslednou koncentraci proteinu 3 až 15 mg/ml.

Získaný roztok se zfiltruje a výsledný koncentrát se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -15 °C.

Stupeň II

Filtrace a chromatografie na DEAE Sepharóze FF jako iontoměniči

Tento chromatografický stupeň je průtokový stupeň, při němž se odstraňuje převážná část proteinů, odlišných od r-hCG a nukleových kyselin. Na rozdíl od filtrace, která se provádí při teplotě místnosti se chromatografie provádí ve chladném prostředí.

i) Roztátí a spojení koncentrovaných surových materiálů s obsahem r-hCG

Zmrazené koncentráty se nechají roztát a spojí se. Částečně čištěné vzorky r-hCG se získávají spojením různého počtu surových koncentrátů r-hCG, získaných z téhož druhu buněk. Kritéria pro počet surových koncentrátů jsou založena na maximální schopnosti vázat protein v následujícím chromatografickém stupni čištění (4 mg celkového proteinu/mg pryskyřice).

·· ·* ·· ·« ♦· · ♦ ♦ · «·♦« • « · · ·* · · · * ········· 9 · · 9 9 · » · « «·<«<··· ·· «· «« ·««· ii) Vyčeřeni filtraci

Roztok r-hCG se s výhodou nechá projit filtračním zařízením a filtry se promyjí 40 mM fosforečnanem sodným o pH 7,5. Zfiltrovaný roztok a promývací kapalina se spoj i.

iii) Chromatografie na DEAE Sepharóze FF jako iontoměniči

Sloupec s náplní slabě nabité aniontoměničové pryskyřice, diethylaminoethansepharózy (DEAE) Fast Flow se uvede do rovnovážného stavu ve 40 mM fosforečnanu sodném o pH 7,5.

Na vrchol sloupce se nanese roztok r-hCG. Sloupec se pak promývá 40 mM fosforečnanem sodným o pH 7,5. Postup chromatografie se sleduje pomocí spektrofotometru při vlnové délce 280 nm.

Počáteční eluát se odloží až do doby, kdy se počíná vymývat vrchol. Pak se shromáždí nenavázané frakce, které obsahují r-hCG.

Stupeň III

Chromatografie na CM Sepharóze FF

V tomto chromatografickém stupni se odstraní převážná část kontaminujících látek z hostitelských buněk. Chromatografický stupeň se provádí při teplotě +5 °C. Výhodná teplota je 5 ± 3 °C.

i) Zředění eluátu z DEAE Sepharózy FF ·· ·· • ♦ · · • · · • · <

9999 ···« *« • · · * • · ·«

K eluátu se přidá voda pro injekční podání a hodnota pH se upraví na 6 při použití kyseliny fosforečné s koncentrací 85 %. Výhodná hodnota pH je 6 ± 0,1.

ii) Chromatografie na CM Sepharóze FF

Sloupec, který je naplněn kationtoměničovou pryskyřicí se slabým nábojem, karboxymethylsepharózou (CM) Fast Flow se uvede do rovnovážného stavu ve 20 mM pufru s fosforečnanem sodným o pH 6. Výhodná hodnota pH je 6 ± 0,1.

Na vrchol sloupce se nanese roztok r-hCG.

Sloupec se promyje 20 mM fosforečnanem sodným o pH 6. Chromatografický postup se sleduje pomocí spektrofotometru při 280 nm.

K eluci produktu se užije 130 mM pufr s fosforečnanem sodným o pH 6. Počáteční eluát se odloží až do počátku eluce vrcholu.

Shromáždí se frakce, odpovídající celému vrcholu s obsahem r-hCG. Výsledný produkt je popřípadě možno v tomto stupni zfiltrovat k odstranění kontaminace viry.

Stupeň IV

RP-HPLC na oxidu křemičitém C18

Tento chromatografický stupeň RP-HPLC slouží k účinnému odstranění stopových množství kontaminujících látek z buněčné kultury, k odstranění zbytků nukleových kyselin a endotoxinů. Tento stupeň je následován ft * * 9 •

• 4 44 44 44

4 9 4 4 · ♦ · · * 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 9 4

4 4 4 4 4 9 • 94 94 49 94 4 4 ultrafiltraci s oddělením látek od molekulové hmotnosti 10000 a popřípadě filtrací.

i) Příprava podílů pro zpracování

Podíly se upraví na pH 5 a přidá se 2-propanol do konečné koncentrace 15 % objemových.

ii) RP-HPLC chromatografie na oxidu křemičitém C18

Sloupec s náplní oxidu křemičitého C18 se nejprve uvede do rovnovážného stavu v tris-fosforečnanovém pufru s koncentrací 0,5 M s obsahem 15 % objemových

2-propanolu.

První podíl se nanese na sloupec a chromatografie se sleduje UV spektrofotometrem.

Sloupec se promyje ekvilibračním pufrem.

Eluce r-hCG se provádí při použití lineárního gradientu 2-propanolu a 0,5 M tris-fosforečnanového pufru jako mobilní fáze od 15 do 25 % objemových.

Výsledný r-hCG se odebírá v okamžiku, kdy se prokáže přítomnost odpovídajícího vrcholu pomocí spektrofotometru (A₂8o) · Frakce, jejichž absorbance je vyšší než 65 % maximální výšky vrcholu v jeho stoupající části a vyšší než 20 % maximální výšky vrcholu v jeho klesající části se spojí.

Čtyři spojené šarže s obsahem r-hCG se pak spojí a zředí na ekvivalentní objem vodou pro injekční podání WFI.

0

0 • 0

0 0 0000 0000 00

0 0 0 0

0

Produkt se zahustí a dialyzuje proti WFI ultrafiltrací s použitím membrány pro oddělení látek s molekulovou hmotností vyšší než 10000 k odstranění zbývajících nečistot a 2-propanolu.

Pak se produkt dialyzuje ultrafiltrací proti 0,1 M pufru s hydrogenuhličitanem amonným o pH 8.

Výsledný meziprodukt se uloží při teplotě +5 °C nebo se v případě potřeby zmrazí. Výhodná teplota pro uložení je 5 ± 3 °C a v případě zmrazení -15 °C nebo nižší.

Stupeň V

Chromatografie na prostředku Sephacryl S-200 HR

Tento chromátografický stupeň s vyloučením látek od určité molekulové hmotnosti je účinný pro odstranění stopových množství materiálů s buněčné kultury, potenciálních shluků a/nebo volných podjednotek. Tento stupeň je následován ultrafiltrací, při níž dochází k oddělení látek s molekulovou hmotností vyšší než 10000. Oba stupně se provádějí při teplotě přibližně +5 °G, výhodná teplota je 5 ± 3 °C.

i) Chromatografie na prostředku Sephacryl S-200 HR

Sloupec s náplní pryskyřice Sephacryl S-200 HR se uvede do rovnovážného stavu v 0,5 M hydrogenuhličitanu amonného o pH 8. Výhodná hodnota pH je 8 ± 0,2.

Roztok r-hCG se nanese na sloupec a eluce se zahájí při použití 0,5 M hydrogenuhličitanu amonného o pH 8. Výhodná hodnota pH je 8 ± 0,2.

• 9 ·* • · · · • · • * «9 «» «» «« • 9 «> 9 <> ( • 99 99 *

9 » 9 9 9 9

9 * 9 9 *9

99 99 9999

Frakce r-hCG se začnou shromažďovat od začátku průchodu vrcholu, frakce se odebírají tak dlouho, až se dosáhne 50 % maximální výšky vrcholu na jeho klesající části.

ii) Ultrafiltrace k odstranění látek s molekulovou hmotností vyšší než 10000

Membrány pro odstranění látek s molekulovou hmotností látek vyšší než 10000, uložené v 0,05 M hydroxidu sodném se opláchnou vodou pro injekční podání WFI až do poklesu pH na hodnotu přibližně 8.

Produkt se zahustí a pak se dialyzuje ultrafiltrací proti WFI.

Pak se produkt dialyzuje ultrafiltrací proti 0,01 M pufru s fosforečnanem sodným o pH 7 a konečná koncentrace proteinu se upraví na požadovanou konečnou koncentraci

3,5 mg/ml.

Výsledný roztok čištěného r-hCG se s výhodou uloží ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -15 °C.

Chromatografické pryskyřice

Při způsobu čištění je možno použít následující chromatografické pryskyřice a také jejich ekvivalenty.

Stupeň I:Silica C4, 250 angstróm-50 pm(Matrex^R, Milipore) Stupeň II: DEAE Sepharose FF (Pharmacia)

Stupeň III: CM Sepharose FF (Pharmacia)

Stupeň IV: Silica C18, 300 angstróm-15-20 pm (Vydac) Stupeň V: Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) ϋ—^ř

ΙΛΑΛΜΜν.ΤΛΛΒΚ!

A A Aa ·· 4« • · A A AAAA • A AAAA • A AAAA • A AA • A A A

A A A • A A

A A AAAA

V současné době jsou hlavními výrobci těchto materiálů následující firmy:

Amersham Pharmacia Biotech, Millipore Corporation

Bjórkgatan 30 17 Cherry Hill Drive

S-751 84, Uppsala Danvers, MA 01923

Sweden USA

Vydac, The Separations Group,

17434 Mojave St.

Hesperia, CA 92345

USA

Výsledky • Molekulová hmotnost a velikost molekul

SDS-PAGE

Relativní molekulová hmotnost r-hCG, získaného způsobem podle vynálezu byla stanovena pomocí SDS-PAGE ve srovnání se standardními proteiny se známou molekulovou hmotností.

Barvení briliantovou modří Coomassie po neredukujícím průběhu SDS-PAGE poskytuje jediný široký pás pro heterodimer r-hCG přibližně při molekulové hmotnosti 70 000 (rozmezí 65000 až 75000) . Totožnost pásu byla potvrzena metodou Western blot.

• Biologická účinnost

Biologická účinnost různých šarží r-hCG po čištění způsobem podle vynálezu je shrnuta v následující «9 • 9 9 · • 9 • 9 9« • 9 9

9

9 • 9 99 • 9 9 9

9 9 • 99 · 9

9999 tabulce 2. Koncentrace proteinu byla stanovena spektrofotometricky při 276,5 nm, a=0,616.

Průměrná specifická účinnost takto připraveného rhCG je zvláště vysoká a dosahuje až 25000 IU/mg.

Tabulka 2.

Šarže r-hCG	Specifická biologická účinnost
	(IU/mg)
BCEA 9901	244427
BCEA 9902	26868
BCEA 9903	25636
BCEA 9904	27152
BCEA 9905	23729

• Prostředky s obsahem hormonu

Byly připraveny kapalné i lyofilizované prostředky s obsahem vysoce čištěného rekombinantního hCG podle vynálezu.

Kapalné prostředky

Dva kapalné prostředky s účinnosti 10000 IU/ml byly připraveny v lékovkách DIN 2R při použiti mannitolu nebo sacharózy jako pomocné látky, vzorky byly podrobeny na stálost při teplotě 50, 40, 25 a 4 °C.

Složeni jednotlivých prostředků je uvedeno v následujících tabulkách 3 a 4.

»· ♦* ·· ·* ·» »· • · · · ·«*· ···· · · Φ Φ» 9 · · • · ««<· · 9 9 «·Κ Ι»4« ·· 99 99 9999

Tabulka 3.

Složka	Jednotka	Množství
r-hCG	IU/ml	10000
Sacharóza	mg/ml	102, 6
Kyselina o-fosforečná	mg/ml	0,98
Hydroxid sodný		do pH 7,0

Objem plnění: 0,5 ml

Tabulka 4.

Složka	Jednotka	Množství
r-hCG	IU/ml	10000
Mannitol	mg/ml	54,6
Kyselina o-fosforečná	mg/ml	0,98
Hydroxid sodný		do pH 7,0

Objem plnění: 0,5 ml

Výsledky na stálost, prováděné se zkušebním balíčkem Bioassay nebo pomocí SE/HPLC a RP-HPLC prokázaly, že prostředek s obsahem mannitolu byl stálejší, než prostředek obsahující sacharózu. Aby nedošlo ke tvorbě podjednotek a oxidace proteinu byla snížena na minimum, bylo nutno prostředky skladovat v chladničce.

Lyofilizovaný prostředek

Lyofilizovaný prostředek s účinností 5000 IU byl připraven v lékovkách DIN 2R a použit při testu na stálost při teplotě 50, 40, 25 a 4 °C při použití sacharózy jako pomocného prostředku.

4» ** 4* 44 »· ···· · · 4 4 4 4 4 4 · 4 4 44 44 4

4 44 44 444 4 · • 4 4444 444 «444 4444 44 44 44 4444

Výsledky uvedených zkoušek jsou shrnuty v následující tabulce 5.

Tabulka 5.

Složka	Jednotka	Množství
r-hCG	IU	5000
Sacharóza	mg	30
Kyselina o-fosforečná	mg	0,98
Hydroxid sodný		do pH 7,0

Výsledky zkoušek na stálost, provedených při použití zkušebního balíčku Bioassay nebo pomocí SE/HPLC a RP-HPLC prokázaly, že lyofilizovaný prostředek je stálý při teplotě 40 a 50 °C po dobu alespoň 19 týdnů.

Zkoušky na stálost při teplotě 25 a 4 °C byly prováděny 6 měsíců, v průběhu této doby nebylo možno pozorovat žádnou degradaci účinné látky.

Zastupuj e:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

44 44 • · « ·

4 4 44 • « · 4 • 4 4 4

44 44

99 94

4 4 4 4

4 4 4

4 4 9 4 • 4 · ·· 4444

1. Způsob čištění lidského choriogonadotropinu ze vzorku, vyznačující se tím, že se k čištění užije chromatografíe na iontoměniči a vysokotlaká kapalinová chromatografíe v reversní fázi.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se:

a) vzorek podrobí chromatografií na iontoměniči za získání prvního eluátu,

b) první eluát se podrobí vysokotlaké kapalinové chromatografií v reversní fázi za získání druhého'eluátu a

c) druhý eluát se podrobí chromatografií, při níž se odstraní látky od určité molekulové hmotnosti.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m, že se ve stupni a) užije dvojího odděleného průchodu chromatografickým iontoměničem.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se oba stupně chromatografíe na iontoměniči provádějí za odlišných podmínek.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se provádí v následujících stupních:

a) vzorek se podrobí chromatografií na sloupci oxidu křemičitého, načež se

b) vzorek podrobí chromatografií na sloupci DEAE-Sepharózy jako iontoměniči,

c) eluát se podrobí chromatografií na sloupci CM22

-Sepharózy jako iontoměniči,

d) eluát se nechá projít sloupcem HPLC v reverzní fázi s náplní oxidu křemičitého Silica C18, a

e) eluát se nechá projít sloupcem Sephacrylu k odstranění látek s určitou molekulovou hmotností.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se eluce sloupce s náplní DEAE Sepharózy jako iontoměniče provádí při použití pufru s fosforečnanem sodným o pH 7,5.
7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj ící se t i m, že se eluce sloupce s náplní CM-Sepharózy jako iontoměniče provádí při použití pufru s fosforečnanem sodným o pH 6.
8. Způsob podle nároku 5, 6 nebo 7, vyznačující se tím, že se stupeň c) provádí při použití směsi 2-propanolu a tris-fosforečnanového pufru jako mobilní fáze.
9. Způsob podle některého z nároků 5 až 8, vyznačující se tím, že se stupeň d) provádí při použití pufru s hydrogenuhličitanem amonným jako mobilní fáze.
10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že čištěným hCG je rekombinantní hCG.
11. Způsob podle nároku 1 až 10, vyznačuj ící se t í m, že čištěným vzorkem je živné prostředí buněk CHO.

• · • · • ·
12. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že jako účinnou složku obsahuje rekombinantní hCG, připravený způsobem podle nároků 10 nebo 11 spolu s příslušnými pomocnými látkami.
13. Farmaceutický prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že jako pomocnou látku obsahuje sacharózu.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že jako pomocnou látku obsahuje mannitol.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 12, 13 nebo 14, vyznačující se tím, že je určen pro podkožní podání.