SK12062002A3

SK12062002A3 - Spôsob čistenia choriogonadotropínu - hCG zo vzorky a farmaceutický prostriedok s obsahom hCG

Info

Publication number: SK12062002A3
Application number: SK1206-2002A
Authority: SK
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2002-12-03
Also published as: EE200200469A; NO20023985D0; MEP38908A; RS50741B; NO20023985L; UA86938C2; DK1257564T3; CY1108460T1; MXPA02007871A; KR20030001359A; BRPI0108556B8; SK287146B6; EP1752466A2; PL205149B1; WO2001062773A1; YU60202A; AU2680401A; HUP0204231A2; HU228935B1; AU2006200059A1

Description

Spôsob čistenia choriogonádotropínu - hCG zo vzorky a farmaceutický prostriedok s obsahom hCG

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu čistenia choriogonádotropínu, najmä čistenia rekombinantného ľudského choriogonádotropínu (hCG) zo vzorky surového rekombinantného hCG. Uvedený spôsob zahŕňa použitie iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou.

Doterajší stav techniky

Choriogonádotropín je heterodimér pozostávajúci z nekovalentne viazaných a a β podskupín.

Choriogonádotropín sa podáva ženám na vyvolanie ovulácie po stimulácii folikulárneho vývoja folikuly stimulujúcim hormónom alebo ľudskými menopauzálnymi gonadotropínmi pri liečbe anovulárnej neplodnosti v dôsledku nízkych koncentrácií gonadotropínov. Jednotlivé dávky 5 000 až 10 000 jednotiek sa podávajú intramuskulárne injekciami na napodobenie stredového maxima cyklu luteinizačného hormónu, ktorý normálne stimuluje ovuláciu. Choriogonádotropín sa podáva tiež v spojení s menotrofínom a niekedy tiež s citrátom klomifénu (orig.: clomiphene) ako doplnok k in vitro fertilizačným postupom a v ďalších asistovaných koncepčných technikách, zahŕňajúcich superovuláciu a zber oocytov. U mužov sa používa v liečbe prepubertálneho kryptorchizmu. Režimy podávania sú v širokom rozmedzí, ale dávky sú zvyčajne v rozmedží od 500 do 4 000 jednotiek intramuskulárnou injekciou tri razy za týždeň.

Uvedená látka sa podáva tiež pri mužskej neplodnosti spojenej s hypogonadotrópnym hypogonadizmom. Aj v tomto prípade môže byť režim podávania veľmi rozdielny a dávky majú byť v rozmedzí od 500 do 4000 jednotiek dva až tri razy za týždeň. Na umožnenie normálnej spermatogenézy sa často pridáva látka s folikulárne stimulujúciou aktivitou ako je menotrofín. Na oligospermiu možno využiť dávky až do 3 000 jednotiek choriogonádotropínu týždenne s menotrofínom alebo

-2iným folikulárne stimulujúcim prostriedkom. V liečbe oneskorenej puberty spojenej s hypogonadizmom u mužov sa podáva dávka 500 až 1500 jednotiek dva razy za týždeň; uvedená dávka má byť nastavená v závislosti od koncentrácie testosterónu v plazme.

Na izoláciu a čistenie hCG zo vzoriek surového moču sa používajú rôzne spôsoby (Birken a ďalší, Endocrinology, 133(3). 1390 až 1397 (1993); Sakakibara a ďalší, Chem. Pharm. Bull., 35(5), 1414 až 1416 (1990); Dinini a ďalší, Acta Endocrinol. 73(1), 133 až 145 (1973)). Na čistenie hCG z moču boli nedávno vyvinuté a použité rôzne spôsoby afinitnej chromatografie, nazvané membránová filtračná afinitná chromatografia (Xu a ďalší, Proteín Expression and Purification 16, 221 až 223 (1999)). Uvedený spôsob obchádza používanie Sepharose aktivovanej s BrCN ako tuhej fázy pre stĺpcovú afinitnú chromatografiu a predstavuje úpravu zvyčajných spôsobov čistenia hCG afinitnou chromatografiou zo vzoriek moču. Imunoaktivita týmto spôsobom čisteného hCG bola 8 554 lU.mg'¹.

Prednosťou rekombinantného hCG je, že neobsahuje iné gonadotrópne hormóny a nečistoty ľudského pôvodu najmä tie, ktoré sú obsiahnuté v ľudskom moči. Surové preparáty rekombinantného hCG obsahujú ale všetky ďalšie proteíny a nečistoty z buniek, použitých v procese rekombinantnej prípravy a preto je veľmi naliehavá požiadavka na spôsob, ktorým by sa dosiahla úplná čistota rekombinatného choriogonádotropínu.

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že surový preparát hCG, odvodený z koncentrovanej vzorky kultivačného prostredia z rekombinantného procesu alebo zo surového koncentrátu moču tehotných žien možno čistiť tak, že výsledný hCG prakticky neobsahuje proteíny alebo iné znečisťujúce látky, obsiahnuté v surovom preparáte hCG.

Uvedený spôsob čistenia je založený na použití iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou. Možné použitie ďalšej kolóny na veľkostné vylúčenie umožňuje odstránenie všetkých zvyškov znečistenín. Optimálne výsledky sa dosiahnu pri použití najmenej dvoch stupňov iónovo-výmennej chromatografie.

-3Spôsob podľa tohto vynálezu možno použiť na čistenie rekombinantného hCG zo surového preparátu kultivačného prostredia, získaného z rekombinantného procesu. Takto získaný r-hCG má vysoký stupeň čistoty a vysokú špecifickú bioaktivitu (v romedzí 23 000 až 28 000 lU.mg'¹), je prakticky bez prosteínov ^: fetálneho bovinného séra (FBS), ak bolo prítomné v kultivačnom prostredí, a nukleových kyselín alebo iných nečistôt, obsiahnutých v hostiteľských bunkách, použitých v rekombinantnom procese.

Spôsob podľa tohto vynálezu možno použiť tiež na čistenie hCG získaného z moču, pričom sa vychádza zo surového koncentrátu moču tehotných žien; ďalej ho možno použiť na čistenie CG z iných druhov cicavcov vrátane, napríklad kráv,, koní, bravov, oviec a opíc.

Podstatou vynálezu je spôsob čistenia hCG zo vzorky, pričom uvedený spôsob zahŕňa použitie iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou, pričom uvedený spôsob zahŕňa kroky: krok spracovania vzorky iónovovýmennou chromatografiou a krok spracovania eluátu HPLC s reverznou fázou. Možno uskutočniť aj ďalší krok: krok spracovania na kolóne s vylučovaním podľa veľkosti.

Aby sa dosiahli optimálne výsledky spôsobu čistenia je výhodné uskutočniť dva kroky iónovo-výmennej chromatografie, každý v iných podmienkach. Výhodné uskutočnenie uvedeného spôsobu podľa tohto vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky:

, (a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého;

(b) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci DEAE Sepharose;

(c) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci CM-Sepharose;

(d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou C-is oxidu kremičitého a ¹ (e) elúciu na chromatografickom stĺpci Sephacrylu na vylúčenie podľa veľkosti.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa elúcia ionomeničového stĺpca DEAE Sepharose výhodne uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 7,5.

Elúcia ionomeničového stĺpca CM-Sepharose sa výhodne uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 6.

HPLC s reverznou fázou (krok (d)) sa výhodne uskutoční s 2-propanol/Trisfosforečnanovým tlmivým roztokom ako mobilnou fázou.

-4Uvedený CG podľa tohto vynálezu je výhodne ľudský CG a najvýhodnejšie je to rekombinantný hCG, odvodený z kultivačného prostredia CHO buniek, použitých v rekombinantnom procese.

Vynález sa ďalej týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho terapeuticky účinné množstvo čisteného rekombinantného hCG, pripraveného hore opísaným rekombinantným procesom, spolu s vhodnými pomocnými látkami. Príkladom vhodnej pomocnej látky je sacharóza, ktorá napomáha stabilizácii lyofilizovaného produktu. Uvedený farmaceutický prostriedok rekombinantného hCG je veľmi výhodný na subskutánne podávanie.

Vynález sa týka spôsobu čistenia hCG, najmä spôsobu čistenia rekombinantného hCG zo surového preparátu z kultivačného prostredia rekombinantného procesu. Uvedený r-hCG sa získa vo vysokom stupni čistoty a s vysokou špecifickou bioaktivitou (v rozmedzí 23 000 až 28 000 lU.mg'¹) a je prakticky bez proteínov fetálneho bovinného séra, ktoré sú prítomné v kultivačnom prostredí a bez nukleových kyselín alebo iných nečistôt, obsiahnutých v hostiteľských bunkách, použitých v rekombinantnom procese. Vynález je zameraný najmä na využitie v oblasti biologických materiálov, bližšie na využitie pri čistení surových zmesí obsahujúcich hCG a znečisťujúce proteíny; uvedené biologické materiály sa v ďalšom texte označujú ako východiskové materiály. V ďalšom podrobnejšie uvedené príklady využívajú východiskové materiály obsahujúce r-hCG, získané zo supernatantov z prostredia bunkových kultúr z bioreaktora. Alternatívne sa ako východiskový materiál použije surový koncentrovaný moč tehotných žien.

Východiskový materiál tvorí čerstvo oddelený supernatant prostredia bunkovej kultúry po dvoch dňoch prechodov bioreaktorom. Supernatant sa výhodne číri filtráciou. Ak treba, surový roztok sa Skoncentruje a chromatografuje na C4 oxide kremičitom na odstránenie nečistôt pochádzajúcich z bunkovej kultúry.

Polovyčistený výťažok, po ultrafiltrácii, sa potom podrobí iónovo-výmennej chromatogtafii, ktorá sa výhodne raz opakuje a výhodne pri rôznych podmienkach; nasleduje HPLC s reverznou fázou. Prvý krok s DEAE Sepharose iónovo-výmennou chromatografiou možno uskutočniť ako v podstate hCG prietokový krok (orig.: Flow-through step), v ktorom sa eliminuje veľká časť ne-hCG proteínov a DNA. Druhý ionomeničový krok, výhodne na stĺpci CM-Sepharose je hCG väzbovým

-5krokom a odstraňujú sa pri ňom zvyšky DNA a hostiteľských buniek alebo proteínových nečistôt z prostredia. Vo výhodnom uskutočnení sa tento krok uskutoční pri približne 5 °C elúciou tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 6.

Chromatografia s reverznou fázou na stĺpci Ci₈ oxidu kremičitého účinne odstraňuje zvyšné stopové množstvá nukeových kyselín a znečistenín pochádzajúcich z bunkových kultúr. Elúcia stĺpca sa výhodne uskutoční 2propanolom/Tris-fosforečnanovým tlmivým roztokom ako mobilnou fázou. Zachytený roztok sa potom výhodne podrobí 10 kD deliacej ultrafiltrácii, skoncentruje sa a môže sa spracovať s hydrogenuhličitanom amónnym pri pH 8. Koncentrovaný produkt sa potom spracuje chromatografickým delením podľa veľkosti na stĺpci Sephacrylu S200 HR. V tomto kroku sa delenie založené na veľkosti molekuly dosiahne elúciou hydrogenuhličitanom sodným pri pH 8 a odstránia sa ešte možné stopové množstvá znečistenín z bunkovej kultúry, potenciálne agregáty a voľné hCG podskupiny. Eluát sa môže potom podrobiť dialýze ultrafiltráciou na membránach s 10 kD hranou, výhodne v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného pri pH 7. Po filtrácii sa vyčistená dávka hCG výhodne uchováva v sterilných flaštičkách pri nízkej teplote.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Reakčné činidlá:

amoniak, analytickej čistoty hydrogénuhličitan amónny, analytickej čistoty (B.P.) hydrogenfosforečnan disodný, analytickej čistoty absolútny denaturovaný etanol kyselina fosforečná, analytickej čistoty, (Ph. Eur.)

2-propanol, analytickej čistoty (Ph. Helv.) chlorid sodný, analytickej čistoty (Ph. Eur.) dihydrogenfosforečnan sodný, analytickej čistoty

-6hydroxid sodný, peletky, analytickej čistoty (Ph. Eur.) trifluóroctová kyselina (TFA), čistota pre HPLC

Tris-(hydroxymetyl)aminometán, analytickej čistoty

Prehľadný vývojový diagram čistiaceho procesu

Východiskový materiál získaný z procesu kultivácie buniek sa čistí a skoncentruje v piatich postupných chromatografických krokoch.

Ďalej uvedený vývojový diagram (Tabuľka 1) zhŕňa výhodné uskutočnenie procesu čistenia r-hCG, zahŕňa živice použité pri stĺpcovej chromatografii a zahŕňa princípy operácií v jednotlivých krokoch.

Tabuľka 1

Prehľad procesu čistenia r-hCG - vývojový diagram

Krok I	kultivačné prostredie z bioreaktora I chromatografia na C₄ oxide kremičitom (eluát obsahuje r-hCG) I ultrafiltrácia s hranou 10 kD (retentát obsahuje r-hCG) I skoncentrovaný surový r-hCG I
Krok II	DEAE Sepharose FF (Neviazaná frakcia obsahuje r-hCG) I
Krok III	CM Sepharose FF (eluát obsahuje r-hCG) I

-Ί -

Krok IV	RP-HPLC na Ci₈-oxide kremičitom (eluát obsahuje r-hCG) I ultrafiltrácia (10 kD)
Krok V	Sephacryl S-200 HR
	(eluát obsahuje r-hCG) I
	roztok získaného r-hCG

Podrobný opis vývojového diagramu a opis postupu sa uvádza v ďalšom texte. Podmienky v kroku viazania (Krok I) sú také, aké sa bežne používajú v prípadoch, keď východiskový surový materiál má rekombinantný pôvod.

Krok I (krok viazania)

V tomto kroku (Krok I) sa dosiahne predbežná koncentrácia a vymení sa tlmivý roztok aby bolo zaručené zloženie. Tento krok začína pri teplote miestnosti (chromatografia na C₄ oxide kremičitom) a potom pokračuje pri približne +5 °C. Výhodný rozsah teplôt je 5 ± 3 °C. Tento krok sa jednotlivo opakuje pre každý zber počas produkčného cyklu bioreaktora.

(i) Čírenie medziproduktu čerstvo oddelené kultivačné prostredie z bioreaktora sa zvyčajne najprv číri filtráciou.

(ii) Chromatografia na C₄ oxide kremičitom

Po vyčírení sa medziprodukt čistí chromatografiou na stĺpci C₄ oxidu kremičitého; kolóna sa vopred uvedie do rovnováhy s 25 mM roztokom fosforečnanu sodného pri pH 7. Výhodná oblasť pH je od 6,6 do 7,7. Stĺpec sa premyje 25 mM roztokom fosforečnanu sodného až sa monitorovaný UV signál vráti na úroveň pozadia. Produkt sa eluuje 34,2%-ným (hmotnostné) 2-propanolom v 25 mM roztoku fosforečnanu sodného.

(iii) Spracovanie s amoniakom

Potom sa do roztoku pridá amoniak až sa dosiahne konečná koncentrácia 1 M. Táto zmes sa 6 hodín inkubuje. Roztok sa potom dvojnásobne zriedi vodou, pH

-8sa upraví na 7,5 pomocou kyseliny fosforečnej (85 %-nej). Výhodná oblasť pH je 7,5 ±0,2.

(iv) Skoncentrovanie a dialýza

Membrány s hranou 10 kD, uchovávané medzi jednotlivými násadami v

I prostredí 0,05 M roztoku hydroxidu sodného, sa zvlhčia čistenou vodou až pH klesne na hodnotu približne 8. Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou na 10 kD membráne) aby sa odstránili látky sa molekulovou hmotnosťou nižšou ako 10 kD a aby sa eliminovali zvyšky 2-propanolu a aby sa amónny roztok zmenil na 40 mM roztok fosforečnanu sodného s pH 7,5. Výhodná oblasť pH je 7,5 ± 0,2. Výsledný retentát sa získa z membrány pôsobením 40 mM roztoku fosforečnanu sodného tak, aby sa získala cieľová koncentrácia proteínu 3 až 15 mg.ml'¹.

Tento roztok sa potom filtruje a výsledný koncentrát sa uchováva zmrazený pri približne -15 °C.

Krok II (Filtrácia a iónovo-výmenná chromatografia na DEAE Sepharose FF)

Tento chromatografický krok je r-hCG prietokový krok v ktorom sa odstráni veľká časť nie r-hCG proteínov a nukleových kyselín. Filtrácia sa uskutoční pri teplote miestnosti, ale chromatografický krok sa uskutoční v chladnej miestnosti pričom produkt prechádza kolónou.

(i) Roztápanie a združovanie surových koncentrátov r-hCG

Zmrazené koncentráty sa roztopia a združujú. Z viacerých čistených surových koncentrátov r-hCG, pripravených z rovnakej pracovnej banky buniek sa združí násada, ktorá sa ďalej spracuje. Združovanie rôzneho počtu surových koncentrátov závisí od maximálnej proteínovej väzbovej aktivite (4 mg celkových proteínov na 1 mg živice) nasledujúceho chromatografického kroku čistiaceho procesu.

(ii) Čírenie filtráciou

Uvedený roztok r-hCG sa výhodne prepustí filtračným zariadením a filtre sa premyjú 40 mM roztokom fosforečnanu sodného (pH 7,5). Prefiltrovaný roztok a premývacie roztoky sa spoja.

(iii) Iónovo-výmenná chromatografia na DEAE Sepharose FF

-9Kolóna plnená ionexom so slabým nábojom, dietylaminoetán (DEAE) Sepharose, s rýchlym prietokom (Fast Flow, FF) sa uvedie do rovnováhy s 40 mM roztokom fosforečnanu sodného (pH 7,5). Potom sa na kolónu privedie roztok rhCG.

Do kolóny sa nasadí 40 mM roztok fosforečnanu sodného pH 7,5. Chromatografický proces sa monitoruje spektrofotometricky pri 280 nm. Počiatočný podiel až do začiatku výtoku elúcie r-hCG sa vyleje. Zachytáva sa neviazaná frakcia obsahujúca r-hCG.

Krok III (chromatografia na CM Sepharose FF)

V tomto chromatografickom kroku sa odstráni veľká časť hostiteľských buniek. Tento chromatografický krok sa uskutoční pri približne +5 °C. Výhodné teplotné rozmedzie je 5 ± 3 °C.

(i) Riedenie eluátu z DEAE Sepharose FF

K eluátu z DEAE Sepharose FF sa pridá voda v čistote na injekcie. pH sa upraví na 6 kyselinou fosforečnou (85%-nou). Výhodné rozmedzie pH je 6 ± 0,1.

(ii) lónovo-výmenná chromatografia na CM Sepharose FF

Kolóna plnená ionexom so slabým nábojom, karboxymetyl (CM) Sepharose, s rýchlym prietokom (FF) sa uvedie do rovnováhy s 20 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6). Výhodné rozmedzie pH je 6 ± 0,1. Potom sa na kolónu privedie roztok r-hCG.

Kolóna sa premyje 20 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pH 6. Chromatografický proces sa monitoruje spektrofotometricky pri 280 nm.

Produkt sa eluuje 130 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6). Počiatočný podiel až do začiatku výtoku elúcie r-hCG sä vyleje. Zachytáva sa celý podiel eluátu obsahujúci r-hCG. Získaný produkt možno v tejto etape voliteľne filtrovať na odstránenie kontaminácie vírusmi.

Krok IV (RP-HPLC na C-ιβ oxide kremičitom)

Tento RP-HPLC chromatografický krok na C-i₈ oxide kremičitom účinne odstraňuje stopové množstvá znečistenín z bunkových kultúr, zvyšky nukleových

-10kyselín a endotoxíny. Po chromatografickom kroku nasleduje ultrafiltrácia s hranou 10 kD a voliteľne filtrácia.

(i) Príprava alikvotných podielov pH hodnoty alikvotných podielov sa nastavia na 5 a pridá sa 2-propanol až do výslednej koncentrácie 15 % (objemových);

(ii) RP-HPLC chromatografia na C₁₈ oxide kremičitom

Kolóna plnená C₁₈ oxidom kremičitým sa najprv uvedie do rovnováhy s 15%ným (objemovo) roztokom 2-propanolu v tlmivom 0,5 M roztoku Tris-fosforečnanu.

Prvý alikvotný podiel sa privedie na kolónu a priebeh chromatograficého procesu sa monitoruje UV spektrofotometriou.

Kolóna sa premýva rovnakým tlmivým roztokom ako pri ustálení rovnováhy.

Elúcia r-hCG sa potom uskutoční s použitím lineárneho gradientu 2propanolu od 15 % do 25 % (objemových) v Tris-fosforečnanovom 0,5 M tlmivom roztoku ako mobilnej fázy. Zachytáva sa eluát, v ktorom sa identifikoval príslušný spektrofotometrický pík (A₂₈o). Jednotlivé podiely, ktorých absorbancia je väčšia ako 65 % z maximálnej výšky piku v zvyšujúcej sa časti a väčšia ako 20 % z maximálnej výšky piku v klesajúcej časti sa spoja.

Štyri spojené podiely obsahujúce r-hCG sa potom združia a zriedia rovnakým objemom vody pre injekcie (waterfor injection, WFI).

Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou na 10 kD membráne) proti WFI na odstránenie materiálov s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 10 kD a na elimináciu 2-propanolu.

Produkt sa potom dialyzuje ultrafiltráciou proti tlmivému 0,1 M roztoku hydrogénuhličitanu amónneho (pH 8).

Výsledný medziprodukt sa uchováva pri približne +5 °C alebo ak sa vyžaduje, uchováva sa zmrazený. Výhodné teploty pre skladovanie sú 5 ± 3 °C a rovné alebo nižšie ako -15 °C.

Krok V (chromatografia na štipci Sephacrylu S-200 HR na veľkostné vylúčenie)

Tento chromatografický krok na veľkostné vylúčenie umožňuje odstránenie všetkých zvyškov znečistenín z bunkovej kultúry, potenciálnych agregátov a/alebo voľných podskupín. Po ňom nasleduje ultrafiltrácia s hranou 10 kD. Uvedené

-11 operácie chromatografia na Sephacrylu S-200 HR a ultrafiltrácia sa uskutočnia pri +5 °C. Výhodné teplotné rozmedzie je 5 ± 3 °C.

(i) Vylúčenie podľa veľkosti na Sephacrylu S-200 HR

Kolóna naplnená živicou Sephacryl S-200 HR sa uvedie do rovnováhy s 0,(j M roztokom hydrogénuhličitanu amónneho (pH 8). Výhodné rozmedzie hodnôt pH je 8 ±0,2.

Roztok r-hCG sa privedie na kolónu a elúcia sa začína použitím 0,5 M roztoku hydrogénuhličitanu amónneho pH 8. Výhodné rozmedzie hodnôt pH je 8 ± 0,2.

Zber frakcií s r-hCG sa začína od začiatku piku a trvá až do poklesu na 50 % maximálnej výšky piku.

(ii) Ultrafiltrácia s hranou 10 kD

Medzi jednotlivým použitím sa 10 kD membrány uchovávajú v 0.05M roztoku hydroxidu sodného a pred použitím sa premyjú WFI až do poklesu pH na asi 8.

Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou) proti WFI.

Produkt sa potom dialyzuje (ultrafiltráciou) proti tlmivému 0,01 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 7) a záverečné skoncentrovanie sa uskutoční tak, aby sa dosiahla cieľová konečná koncentrácia 3,5 mg.ml'¹.

Výsledný roztok r-hCG sa výhodne uchováva zmrazený pri -15 °C.

Chromatografické živice . V uvedenom procese čistenia možno použiť nasledujúce chromatografické živice alebo tiež im rovnocenné živice:

Krok I	C₄ oxid kremičitý, 250 Ä - 50 μηη	(Matrex®, Milipore)
Krok II	DEAE Sepharose FF	(Pharmacia)
Krok III	CM Sepharose FF	(Pharmacia)
Krok IV	C₁₈ oxid kremičitý, 300 Á - 20 μm(Vydac)
Krok V	Sephacryl S-200 HR	(Pharmacia).

Dodávatelia živíc v súčasnosti sú: Amersham Pharmacia Biotech Bjôrkgatan 30, S-751 84, Uppsala, Švédsko

-12Millipore Corporation

Cherry Hill Ďrive, Danvers, MA 01 923, USA Vydac, The Separations Group,

434 Mojave St„ Hesperia, CA 92 345, USA.

Výsledky • Molekulová hmotnosť a veľkosť

SDS-PAGE

Pomerná molekulová hmotnosť r-hCG, získaného spôsobom čistenia podľa tohto vynálezu, sa určovala spôsobom SDS-PAGE proti štandardnému proteinu so známou molekulovou hmotnosťou.

Farbenie Coomassiho brilantnou modrou po neredukčnej SDS-PAGE poskytlo jeden široký pás pre r-hCG heterodimér približne pre molekulovú hmotnosť 70 kD (rozmedzie 65 až 75 kD). Identita pásu sa potvrdila pijakovaním (Western blotting).

• Biologická účinnosť

Biologická účinnosť viacerých násad r-hCG po čistení spôsobom podľa tohto vynálezu sa uvádza v Tab. 2. Koncentrácia proteinu sa stanovila spektrofotometricky pri 276,5 nm, a = 0,616.

Stredná špecifická aktivita preparátu r-hCG je mimoriadne vysoká, dosahuje až približne 25 000 lU.mg’¹.

Tabuľka 2

Násada r-hCG	Špecifickábioaktivita (lU.mg-¹)
BCEA 9901	24 427
BCEA 9902	26 868
BCEA 9903	25 636
BCEA 9904	27 152
BCEA 9905	23 729

- 13• Farmaceutické prostriedky

S vysoko vyčisteným rekombinantným hCG podľa tohto vynálezu sa vyvinuli kvapalné a vymrazovaním sušené prostriedky.

Kvapalný prostriedok

V skúmavkách podľa DIN 2R sa pripravili dva kvapalné prostriedky s 10 000 lU.mg'¹ s použitím manitolu alebo sacharózy ako nosiča; pripravené prostriedky sa podrobili skúškam stálosti pri 50, 40, 25 a 4 °C. Zloženie prípravkov sa uvádza v Tabuľke 3 a 4.

Tabuľka 3

Zložka	Jednotky	Množstvo
r-hCG	lU.mg·¹	10 000
sacharóza	mg.mľ¹	102,6
kyselina o-fosforečná	mg.mľ¹	0,98
hydroxid sodný		podľa potreby na pH 7,0

Objem plnenia: 0,5 ml.

Tab. 4

Zložka	Jednotky	Množstvo
r-hCG	lU.mg¹	10 000
manitol	mg.mľ¹	54,6
kyselina o-fosforečná	mg.mľ¹	0,98 , '
hydroxid sodný		podľa potreby na pH 7,0

Objem plnenia: 0,5 ml.

Výsledky skúšok stálosti, uskutočnené pomocou Bioassay, SE/HPLC a RPHPLC ukázali, že manitolový prostriedok bol stálejší ako sacharózový. Skladovanie

-14bolo výhodnejšie v chladnom prostredí, čím sa minimalizovala oxidácia proteínu a vznik voľných podskupín.

Prostriedok s vymrazovaním

V skúmavkách podľa Dl N 2R sa vymrazovaním pripravil prostriedok s aktivitou 5 000 IU; skúšky stálosti sa uskutočnili pri 50, 40, 25 a 4 °C s použitím sacharózy ako nosiča. Zloženie sa uvádza v Tabuľke 5.

Tabuľka 5

Zložka	Jednotka	Množstvo
r-hCG	lU.mg'¹	5000
sacharóza	mg	30
kyselina o-fosforečná	mg	0,98
hydroxid sodný		podľa potreby na pH 7,0

Výsledky skúšok stálosti, uskutočnené pomocou Bioassay, SE/HPLC a RPHPLC ukázali, že tento vymrazovaný prostriedok bol pri 40 a 50 °C stála najmenej po dobu 19 týždňov. Skúšky stálosti pri 25 a 4 °C sa uskutočnili až do 6 mesiacov a ukázali, že nenastal rozklad účinnej látky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob čistenia hCG zo vzorky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa použitie iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky:

(a) vystavenie vzorky pôsobeniu iónovo-výmennej chromatografii, aby sa získal prvý eluát;

(b) vystavenie prvého eluátu pôsobeniu HPLC s reverznou fázou, čím sa získa druhý eluát; a (c) vystavenie druhého eluátu pôsobeniu chromatografie s vylučovaním podľa veľkosti.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že krok (a) zahŕňa dva oddelené iónovo-výmenné chromatografické priechody.
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že iónovovýmenné chromatografické priechody sa uskutočnia v rôznych podmienkach.
5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa kroky:

(a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého;

(b) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci DEAE Sepharose;

(c) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci CM-Sepharose;

(d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou Cis oxidu kremičitého; a (e) spracovanie eluátu chromatografiou na Sephacryle na vylúčenie podľa veľkosti.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že elúcia DEAE Sepharose iónovo-výmennej živice sa uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH
7,5.

-167. Spôsob podľa nároku 5 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že elúcia CM-Sepharose iónovo-výmennej živice sa uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH 6.
8. Spôsob podľa nároku 5, 6 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že krok (c) sa uskutoční s 2-propanolom v tris-fosforečnanovom tlmivom roztoku ako mobilnou fázou.
9. Spôsob podľa niektorého z nárokov 5 až 8, vyznačujúci sa tým, že krok (d) sa uskutoční s tlmivým roztokom hydrogénuhličitanu amónneho ako mobilnou fázou.
10. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa t ý m, že hCG je rekombinantný hCG.
11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa t ý m, že vzorkou je kultivačné prostredie z CHO buniek.
12. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa terapeuticky účinné množstvo rekombinantného hCG pripraveného spôsobom podľa nároku 10 alebo 11a vhodné excipienty.
13. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m, že excipientom je sacharóza.

I ·
14. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m, že excipientom je manitol.
15. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12, 13 alebo 14, vyznačujúci sa t ý m, že je vo forme na subkutánne podávanie.