DE69837760T3

DE69837760T3 - Proteinreinigung mittels chromatographie und darauffolgende filtration auf beladener schicht

Info

Publication number: DE69837760T3
Application number: DE69837760T
Authority: DE
Inventors: Gregory BLANK; Daljit NARINDRAY; Gerardo Zapata
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2012-06-21
Anticipated expiration: 2018-06-13
Also published as: DK0998486T4; US6322997B1; DE69837760D1; CA2289665A1; AU735883C; CA2289665C; EP0998486B1; US6716598B2; IL132838A; EP0998486B2; US20020058324A1; PT998486E; AU7838898A; US20040138426A1; WO1998056808A1; DE69837760T2; ES2287976T3; JP2001510483A; DK0998486T3; EP0998486A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Proteingewinnung. Insbesondere betrifft sie die Gewinnung eines Polypeptids, wobei das Polypeptid einem immobilisierten Reagens ausgesetzt wird, welches das Polypeptid modifiziert.
Beschreibung des Stands der Technik
Die wirtschaftliche Reinigung von Proteinen in großem Ausmaß stellt ein immer wichtigeres Problem für die Biotechnologie-Industrie dar. Im Allgemeinen werden Proteine mittels Zellkulturen unter Einsatz von Säugetier- oder Bakterienzelllinien hergestellt, die zur Herstellung des Proteins von Interesse durch Insertieren eines rekombinanten Plasmids, das das Gen für das Protein umfasst, gentechnisch manipuliert wurden. Da die verwendeten Zelllinien lebende Organismen sind, müssen sie mit einem komplexen Nährmedium ernährt werden, das Zucker, Aminosäuren und Wachstumsfaktoren enthält und gewöhnlicherweise aus Präparaten aus Tierserum hergestellt wird. Die Trennung des erwünschten Proteins von dem Verbindungsgemisch, mit dem die Zellen ernährt werden, und den Nebenprodukten der Zellen selbst bis zu einer Reinheit, die für die Verwendung als Therapeutikum für Menschen ausreicht, stellt eine große Herausforderung dar (siehe WO93/11162 und EP 127 737 A1 ).
Verfahren zur Reinigung von Proteinen von Zellresten hängen zunächst von der Stelle der Proteinexpression ab. Manche Proteine können unmittelbar von der Zelle in das umgebende Nährmedium sekretiert werden; andere werden intrazellulär hergestellt. Für letztere Proteine umfasst der erste Schritt eines Reinigungsverfahrens die Zelllyse, die durch verschiedene Verfahren erfolgen kann, umfassend mechanisches Scheren, osmotischer Schock oder Enzymbehandlungen. Dieses Aufschließen setzt die gesamten Zellinhalte in das Homogenat frei und produziert zusätzlich dazu subzelluläre Fragmente, die aufgrund ihrer geringen Größe schwer zu entfernen sind. Diese werden im Allgemeinen durch Differentialzentrifugieren oder Filtration entfernt.
Dasselbe Problem tritt, wenn auch in geringerem Ausmaß, bei direkt sekretierten Proteinen aufgrund des natürlichen Zelltods und der Freisetzung von intrazellulären Wirtszellenproteinen im Verlauf des Proteinherstellungsdurchlaufs auf.
Wenn eine geklärte Lösung erhalten wurde, die das Protein von Interesse enthält, wird gewöhnlicherweise versucht, dieses von anderen, von der Zelle erzeugten Proteinen durch eine Kombination von verschiedenen Chromatographieverfahren zu trennen. Diese Verfahren trennen Proteingemische basierend auf deren Ladung, Hydrophobieausmaß oder Größe. Mehrere verschiedene Chromatographieharze stehen für jedes dieser Verfahren zur Verfügung, wodurch das Reinigungsschema präzise an das jeweilige Protein angepasst werden kann. Die Essenz jedes dieser Trennverfahren besteht darin, dass Proteine entweder dazu veranlasst werden, in verschiedenen Geschwindigkeiten eine lange Säule zu passieren, wodurch es bei fortschreitendem Passieren der Säule zu einer steigenden physikalischen Trennung kommt, oder selektiv an dem Trennmedium zu haften, wonach sie durch verschiedene Lösungsmittel unterschiedlich eluiert werden. In manchen Fällen wird das gewünschte Protein von Verunreinigungen getrennt, wenn diese Verunreinigungen spezifisch an der Säule haften, und das Protein von Interesse tut dies nicht, d. h. das Protein von Interesse ist im ”Durchfluss” vorhanden.
Als Teil des gesamten Gewinnungsprozesses des Proteins kann das Protein einem immobilisierten Reagens ausgesetzt werden, das an das Protein bindet oder dieses modifiziert. Das Protein kann beispielsweise einer Affinitätschromatographie unterzogen werden, wobei ein immobilisiertes Reagens, das spezifisch an das Protein bindet, wie z. B. ein Antikörper, den Antikörper einfängt und Verunreinigungen die Affinitätschromatographiesäule passieren. Das Protein kann in der Folge aus der Säule eluiert werden, indem die Bedingungen so verändert werden, dass das Protein nicht länger an das immobilisierte Reagens bindet. Das immobilisierte Reagens kann auch ein Enzym sein, das das Protein modifiziert. Sahni et al., Anal. Biochem. 193, 178–185 (1991), und Voyksner et al., Anal. Biochem. 188, 72–81 (1990), beschreiben immobilisierte Proteasen.
Eine weitere Art des Reinigungsverfahrens ist die Filtration. Die Filtration von verunreinigenden Substanzen mit kleiner Teilchengröße aus Flüssigkeiten wurde unter Einsatz von verschiedenen porösen Filtermedien erreicht, durch die eine verunreinigte Zusammensetzung so hindurchgeleitet wird, dass der Filter die verunreinigende Substanz zurückhält. Das Zurückhalten einer verunreinigenden Substanz kann durch mechanisches Filtrieren oder durch elektrokinetisches Abfangen und Adsorbieren der Teilchen erfolgen. Bei mechanischem Filtrieren wird ein Teilchen durch physikalisches Einschließen zurückgehalten, wenn es versucht, durch eine Pore, die kleiner als es selbst ist, hindurchzutreten. Bei elektrokinetischen Abfangmechanismen kollidiert das Teilchen mit einer Oberfläche in dem porösen Filter und wird auf der Oberfläche durch Anziehungskräfte mit geringer Reichweite zurückgehalten. Um ein elektrokinetisches Abfangen zu erreichen, können ladungsverändernde Systeme eingesetzt werden, um die Oberflächenladungseigenschaften eines Filters zu verändern (siehe z. B. WO90/11814 ). Wenn die verunreinigende Substanz, die entfernt werden soll, beispielsweise anionisch ist, kann ein kationischer Ladungsveränderer eingesetzt werden, um die Ladungseigenschaften des Filters so zu verändern, dass die verunreinigende Substanz von dem Filter zurückgehalten wird.
Es besteht auf dem Gebiet der Erfindung ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Gewinnung von Polypeptiden, insbesondere von jenen Polypeptiden, die durch Rekombinationsverfahren erzeugt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Polypeptids bereit, das Folgendes umfasst: (a) das Aussetzen einer ein Polypeptid umfassenden Zusammensetzung gegenüber einem Reagens, welches das Polypeptid modifiziert, wobei das Reagens auf einer Festphase immobilisiert ist; und dann (b) das Leiten der Zusammensetzung durch einen Filter, der eine der Ladung des Reagens in der Zusammensetzung entgegengesetzte Ladung aufweist, um abgelöstes Reagens aus der Zusammensetzung zu entfernen. Die Ladungseigenschaften des Polypeptids in der Zusammensetzung sind in Schritt (b) so, dass das Polypeptid durch den Filter hindurchtritt, und der Filter ist hinter der Zusammensetzung angeordnet, die in Schritt (a) dem Reagens ausgesetzt wird, wobei der Ausfluss aus Schritt (a) direkt durch den Filter strömt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem in Schritt (a) zu behandelnden Polypeptid um einen Polypeptid-Vorläufer und bei dem immobilisierten Reagens um eine Protease (z. B. Pepsin), die eine Vorläuferdomäne (z. B. eine Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne) von dem Polypeptid entfernt.
Ebenfalls hierin beschrieben ist ein Verfahren zur Gewinnung eines Polypeptids, wobei dieses das Entfernen von abgelöstem Reagens aus einer Zusammensetzung umfasst, die das Polypeptid und das abgelöste Reagens umfasst, indem die Zusammensetzung durch einen Filter hindurchgeleitet wird, der eine der Ladung des abgelösten Reagens entgegengesetzte Ladung aufweist, wobei das abgelöste Reagens zuvor auf einer Festphase immobilisiert wurde.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modifikation eines Antikörper-Vorläufers bereit, der eine Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne umfasst, wobei das Verfahren das Aussetzen des Antikörper-Vorläufers gegenüber einer Protease umfasst, die auf einer Festphase immobilisiert wurde, so dass die Protease den Leucin-Zipper von dem Antikörper-Vorläufer entfernt. Dieses Verfahren umfasst gegebenenfalls weiters das Leiten des Leucin-Zipper-freien Antikörpers durch einen positiv geladenen Filter, der hinter dem Antikörper angeordnet ist, der der immobilisierten Protease ausgesetzt wurde.
Das Anti-CD18-Reinigungsverfahren ist ein Beispiel für ein Verfahren, bei dem ein immobilisiertes Reagens erforderlich ist, um eine Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne aus dem Anti-CD18-Vorläufer-Antikörper zu entfernen. Der Vorläufer-Antikörper wird zunächst mittels ABX-Kationenaustauschchromatographie gereinigt, bevor die Leucin-Zipper-Domäne durch Verdau mit Pepsin entfernt wird. Die Pepsinmenge, die erforderlich ist, um den Leucin-Zipper vollständig aus dem Vorläufer-Antikörper zu entfernen, ist beträchtlich. Eine Menge von 1 mg Pepsin pro 20 mg Antikörper ist erforderlich, um den Verdau über einen vernünftigen Zeitraum hinweg durchzuführen. Bei einer Behandlung wie dieser bleibt eine große Pepsinmenge zurück, die in den verbleibenden Schritten des Anti-CD18-Reinigungsverfahrens (7) entfernt werden muss. Es wurde festgestellt, dass eine schnelle Entfernung von Pepsin von Vorteil ist, da es durch das übermäßige Aussetzen gegenüber Pepsin zu einem übermäßigen Verdau des Anti-CD18-Antikörpers kam, wodurch bedeutende Mengen des intakten Produkts verloren gingen. Um die Pepsinmenge, die dem Anti-CD18-Vorläufer-Antikörper zugesetzt wird, wirksam zu steuern und alle Pepsinspuren, die im Verlauf des Reinigungsverfahrens bestehen bleiben, wirksam zu eliminieren, wurden zwei Verfahren in das Anti-CD18-Antikörper-Reinigungsverfahren aufgenommen. Zunächst wurde, um die Pepsinmenge, die dem ABX-gereinigten Vorläufer-Antikörper-Pool zugesetzt wird, deutlich zu reduzieren, Pepsin auf einer Festphase immobilisiert (d. h. an Perlen aus Glas mit kontrollierter Porengröße (”Control Pore Glass”; CPG) gebunden und in eine Säule gefüllt). Die Verdaureaktion erfolgte dann, indem der Vorläufer-Antikörper-Pool durch die Pepsin-CPG-Säule geleitet wurde. Dieses Verfahren schränkte die zum Antikörper-Vorläufer-Pool zugesetzte Pepsinmenge ein. Trotzdem wurde ein weiteres Problem festgestellt, da nämlich festgestellt wurde, dass Pepsin sich von der Festphase ablöste. Es wurde festgestellt, dass eine geringe, von der Festphase abgelöste Pepsinmenge ausreichte, um zu einem übermäßigen Verdau von Anti-CD18-Antikörper zu führen, wodurch es zu einer Senkung der Produktionsausbeute kam. Um diesem Problem der Pepsinablösung von der Festphase beizukommen, wurde ein positiv geladener Filter in einer Linie mit dem Abfluss von der Pepsin-CPG-Säule angeordnet. Es wurde festgestellt, dass der Filter das gesamte Pepsin, das sich von der Festphase ablöste, entfernte, wodurch der übermäßige Verdau des Vorläufer-Antikörpers verhindert wurde. Pepsin ist ein saures Protein mit geringem pI. Deshalb blieb Pepsin bei einem pH-Wert von 4, dem pH des Verdauschritts, negativ geladen und band stark an den positiv geladenen Filter. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung eines geladenen Filters anstelle eines Harzes zur Entfernung der ablösbaren Substanzen von Vorteil ist, da Filter kompakt sind und sehr hohe Durchflussraten mit minimalem Staudruck möglich sind. Ein Filter kann in einer Linie angeordnet werden, ohne dass ein zusätzlicher Gewinnungsschritt erforderlich ist, wodurch die Verfahrenskomplexität und die Verfahrensdauer reduziert werden können.
Es besteht das Vorhaben, dass negativ und positiv geladene Filter zur Lösung von Problemen in Zusammenhang mit der Ablösung von zuvor immobilisierten Reagenzien bei anderen Gewinnungsverfahren eingesetzt werden können.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B stellen die Aminosäuresequenz von der rhuMAb-CD18-Schwerkette (1A, Seq.-ID Nr. 1) und -Leichtkette (1B, Seq.-ID Nr. 2) dar. Die kursiv gedruckte Sequenz in 1A (Seq.-ID Nr. 3) ist die Sequenz des Leucin-Zippers.
2A und 2B stellen einen intakten Antikörper (Ab) und verschiedene Antikörperfragmente (F(ab')₂, Fab', Leichtkette und Fd') dar. Schwerketten werden weiß dargestellt und Leichtketten schraffiert. Die beiden Disulfidbindungen, die zwischen zwei Schwerketten entstehen, sind als -ss- dargestellt. 2B zeigt die Pepsin-Spaltung von Vorläufer-rhuMAb-CD18, wodurch rhuMAb CD18 frei von Leucin-Zipper entsteht.
3 stellt die Struktur von Plasmid pS1130 dar, das eingesetzt wird, um rhuMAb CD18 im untenstehenden Beispiel herzustellen.
4A und 4B zeigen die vollständige Sequenz der pS1130-Expressionskassette (Seq.-ID Nr. 5).
5 zeigt die Ableitung der 49A5-Produktionszelllinie.
6 ist eine schematische Darstellung des Fermentationsprozesses für rhuMAb CD18.
7 ist ein Flussdiagramm, das die Reinigungsschritte für rhuMAb CD 18 darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen:
Wie hierin verwendet, bezieht sich ”Polypeptid” im Allgemeinen auf Peptide und Proteine mit mehr als etwa 10 Aminosäuren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Polypeptid um ein Säugetierprotein, wie z. B. Renin; ein Wachstumshormon, wie z. B. menschliches Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Somatoliberin; Nebenschilddrüsenhormon; thyreotropes Hormon; Lipoproteine; α-1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; Follitropin; Calcitonin; Luteinisierungshormon; Glukagon; Gerinnungsfaktoren, wie z. B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und Von-Willebrands-Faktor; Anti-Gerinnungsfaktoren, wie z. B. Protein C; ANP; Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie z. B. Urokinase oder menschlicher Harn oder ein Plasminogenaktivator des Gewebetyps (t-PA); Bombesin; Thrombin; blutbildenden Wachstumsfaktor; Tumor-Nekrose-Faktor-α und -β; Enkephalinase; RANTES (regulationsaktiviert, normalerweise T-Zell-exprimiert und -sekretiert); menschliches Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP-1-α); ein Serumalbumin, wie z. B. menschliches Serumalbumin; eine Müllerian-hemmende Substanz; Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Protein; ein mikrobielles Protein, wie z. B. β-Lactamase; DNase; IgE; ein zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Antigen (CTLA), wie z. B. CTLA-4; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Protein A oder D; Rheumafaktoren; einen neurotrophen Faktor, wie z. B. neurotropher Faktor aus Knochen (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), oder einen Nervenwachstumsfaktor, wie z. B. NGF-β; Wachstumsfaktor aus Blutplättchen (PDGF); Fibroblastenwachstumsfaktor, wie z. B. aFGF und bFGF; epidermalen Wachstumsfaktor (EGF); von transformierten Zellen gebildeten Wachstumsfaktor (TGF), wie z. B. TGF-α und TGF-β, umfassend TFG-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); Des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), den insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindende Proteine (IGFBP); CD-Proteine, wie z. B. CD3, CD4, CD8, CD19 und CD20; Erythropoietein; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein morphogenetisches Knochenprotein (BMP); ein Interferon, wie z. B. Interferon-α, -β und -γ; das Koloniewachstum stimulierende Faktoren (CSF), wie z. B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (IL), wie z. B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; Zerfall beschleunigenden Faktor; virales Antigen, wie z. B. ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Adressine; Regulatorproteine; Integrine, wie z. B. CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ein ICAM, VLA-4 und VCAM; ein Tumor-assoziiertes Antigen, wie z. B. HER2-, HER3- oder HER4-Rezeptor; und Fragmente und/oder Varianten der oben angeführten Polypeptide.
Eine ”Variante” oder ”Aminosäuresequenzvariante” eines Ausgangspolypeptids ist ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von der des Ausgangspolypeptids unterscheidet. Im Allgemeinen weist eine Variante zumindest 80% Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest 90% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95% Sequenzidentität und besonders bevorzugt zumindest 98% Sequenzidentität, mit dem nativen Polypeptid auf. Der Prozentsatz der Sequenzidentität wird beispielsweise durch die von Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1382–1386 (1983), beschriebene Version des Algorithmus von Needlemen et al., J. Mol. Biol. 48, 443–453 (1970), nach der Anordnung der Sequenzen, um größtmögliche Homologie bereitzustellen, bestimmt. Aminosäuresequenzvarianten eines Polypeptids werden durch das Einführen von geeigneten Nucleotidveränderungen in die DNA, die für das Polypeptid kodiert, oder durch Peptidsynthese erzeugt. Solche Varianten umfasse beispielsweise Deletionen von derund/oder Insertionen in die und/oder Substitutionen von Resten in der Aminosäuresequenz des Polypeptids von Interesse. Eine beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird vorgenommen, um die endgültige Konstruktion zu erzielen, vorausgesetzt, dass die endgültige Konstruktion die gewünschten Eigenschaften aufweist. Die Aminosäureveränderungen können auch post-translationale Prozesse des Polypeptids verändern, wie z. B. durch die Veränderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuresequenzen von Polypeptiden sind in US-Patent Nr. 5.534.615 beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei dem Polypeptid um ein rekombinantes Polypeptid. Ein ”rekombinantes Polypeptid” ist ein Polypeptid, das in einer Wirtszelle produziert wurde, die mit Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, transformiert oder transfiziert wurde oder das Polypeptid in der Folge von homologer Rekombination erzeugt. ”Transformation” oder ”Transfektion” werden synonym verwendet und beziehen sich auf das Verfahren des Einführens von Nucleinsäure in eine Zelle. Nach der Transformation oder Transfektion kann die Nucleinsäure in das Wirtszellengenom integriert werden oder als extrachromosomales Element bestehen. Bei der ”Wirtszelle” handelt es sich um eine Zelle in einer In-vitro-Zellkultur sowie eine Zelle in einem Wirtstier. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Polypeptiden sind in US-Patent Nr. 5.534.615 beschrieben.
Ein ”Vorläufer-Polypeptid” ist hierin ein Polypeptid, an das eine oder mehrere Vorläuferdomänen fusioniert sind, z. B. wenn die Vorläuferdomäne Teil einer Polypeptidkette des Polypeptids ist oder kovalent durch einen chemischen Linker an das Polypeptid gebunden ist. Bei der ”Vorläuferdomäne” kann es sich um einen Aminosäurerest oder ein Polypeptid handeln. Die Vorläuferdomäne kann beispielsweise eine Dimerisierungsdomäne, wie z. B. ein Leucin-Zipper, sein, eine Aminosäuresequenz, wie z. B. Polyglutaminsäure, die eine negative Ladung trägt, und eine weitere Aminosäuresequenz, wie z. B. Polylysin, das eine positive Ladung trägt, oder ein Peptidhelixbündel, das eine Helix, eine Umkehrschleife und eine weitere Helix umfasst; eine Epitop-Markierung, die z. B. für die Reinigung des Polypeptids von Interesse eingesetzt werden kann; ein Aminosäurerest oder ein Peptid am Amino- oder Carboxyende des Polypeptids, das entfernt werden soll, um ein homogenes Polypeptidpräparat herzustellen; ein N-terminales Methionin; ein Artefakt der Produktion eines Polypeptids in einer rekombinanten Zellkultur; eine Prä-, Pro- oder Präprodomäne eines reifen Polypeptids (z. B. die Prodomäne von Prothrombin, wobei durch die Entfernung der Prodomäne das biologisch aktive reife Thrombin-Molekül entsteht); ein Polylysinpolypeptid; ein Enzym, wie z. B. Glutathiontransferase; oder die Fc-Region eines intakten Antikörpers, der zur Erzeugung eines F(ab')₂ entfernt wird.
Ein ”Epitop-Markierungs”-Polypeptid weist ausreichend Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, wogegen ein Antikörper hergestellt werden kann, und ist doch kurz genug, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht beeinträchtigt. Die Epitop-Markierung ist vorzugsweise ausreichend einzigartig, so dass der Antikörper dagegen im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Epitod-Markierungs-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und gewöhnlicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste auf (vorzugsweise zwischen etwa 9 und 30 Reste). Beispiele umfassen das flu-HA-Markierungs-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dazu (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5 (12), 3610–3616 (1985)); und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und ihr Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)).
Die Bezeichnung ”Antikörper” wird im weitesten Sinn verwendet und deckt spezifisch monoklonale Antikörper (umfassend monoklonale Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente ab, solange diese die erwünschte biologische Aktivität aufweisen.
Der Antikörper hierin ist gegen ein ”Antigen” von Interesse gerichtet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Antigen um ein biologisch wichtiges Polypeptid, und die Verabreichung des Antikörpers an ein Säugetier, das an einer Erkrankung oder Störung leidet, kann für dieses Säugetier von therapeutischem Nutzen sein. Antikörper, die gegen Antigene gerichtet sind, die keine Polypeptide sind (wie z. B. Tumor-assoziierte Glykolipidantigene; siehe US-Patent 5.091.178 ), werden jedoch auch in Betracht gezogen. Wenn es sich bei dem Antigen um ein Polypeptid handelt, kann es ein Transmembran-Molekül (z. B. ein Rezeptor) oder ein Ligand, wie z. B. ein Wachstumsfaktor, sein. Beispielhafte Antigene umfassen die oben genannten Polypeptide. Bevorzugte molekulare Ziele für Antikörper, die Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind, umfassen CD-Polypeptide, wie z. B. CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 und CD34; Mitglieder der ErbB-Rezeptorfamilie, wie z. B. EGF-Rezeptor, HER2-, HER3- oder HER4-Rezeptor; Zelladhäsionsmoleküle, wie z. B. LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM und αv/β3-Integrin, umfassend entweder α- oder β-Untereinheiten davon (z. B. Anti-CD11a-, Anti-CD18- oder Anti-CD11b-Antikörper); Wachstumsfaktoren, wie z. B. VEGF; IgE; Blutgruppenantigene; flk2/flt3-Rezeptor; Obesitäts-(OB-)Rezeptor; mpl-Rezeptor; CTLA-4; Polypeptid C etc. Lösliche Antigene oder Fragmente davon, gegebenenfalls an andere Moleküle konjugiert, können als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden. Für Transmembran-Moleküle, wie z. B. Rezeptoren, können Fragmente von diesen (z. B. die extrazelluläre Domäne eines Rezeptors) als Immunogen eingesetzt werden. Alternativ dazu können Zellen, die das Transmembranmolekül exprimieren, als Immunogen verwendet werden. Solche Zellen können von einer natürlichen Quelle (z. B. Krebszelllinien) stammen, oder es kann sich um Zellen handeln, die durch Rekombinationsverfahren transformiert wurden, um das Transmembran-Molekül zu exprimieren.
Die Bezeichnung ”monoklonaler Antiköper” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen Antikörper, der von einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d. h. die einzelnen Antikörper, die Teil der Population sind, sind ident bis auf mögliche, natürlich vorkommende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und gegen eine einzige Antigen-Stelle gerichtet. Außerdem ist jeder monoklonale Antikörper, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörper-Präparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, nur gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Die nähere Bestimmung ”monoklonal” bezeichnet den Charakter des Antikörpers, wie dieser aus einer im Wesentlichen homogenen Antikörper-Population erhalten wird, und soll nicht so ausgelegt werden, dass die Herstellung des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erforderlich ist. Die monoklonalen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzen sind, können beispielsweise durch das erstmals durch Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebene Hybridom-Verfahren oder mittels DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 ) hergestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform können ”monoklonale Antikörper” aus Antikörper-Phagen-Bibliotheken isoliert werden, die unter Einsatz der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Verfahren erstellt werden.
Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolation von Maus-Antikörpern und menschlichen Antikörpern, jeweils unter Einsatz von Phagen-Bibliotheken. Spätere Publikationen beschreiben die Herstellung von menschlichen, hochaffinen (nM-Bereich) Antikörpern durch Ketten-Neukombination (Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion von sehr großen Phagen-Bibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993)). Demnach stellen diese Verfahren praktikable Alternativen zu herkömmlichen Hybridom-Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch Isolation dar. Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z. B. Mäuse) herzustellen, die in der Lage sind, bei Immunisierung ein großes Repertoire an menschlichen Antikörpern ohne endogene Immunglobulin-Produktion zu produzieren. Es wurde beispielsweise beschrieben, dass die homozygote Deletion eines Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregions-(J_H-)Gens in chimären und Keimbahn-Mutantenmäusen zu einer vollständigen Hemmung der endogenen Antikörper-Produktion führt. Die Übertragung des gesamten menschlichen Keimlinien-Immunglobulin-Genarrays in eine solche Keimlinien-Mutantenmaus führt bei Provokation mit einem Antigen zur Produktion von menschlichen Antikörpern. Siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993), sowie Duchosal et al., Nature 355, 258 (1992).
Die monoklonalen Antikörper umfassen hierein spezifisch ”chimäre” Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der Schwer- und/oder Leichtkette mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer speziellen Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, ident oder zu diesen homolog sind, während der Rest der Kette(n) mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Spezies abstammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, ident oder zu diesen homolog sind, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange diese die erwünschte biologische Aktivität aufweisen ( US-Patent Nr. 4.816.567 und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
Die Bezeichnung ”hypervariable Region” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, die für die Antigen-Bindung verantwortlich sind. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste einer ”Komplementaritätsbestimmenden Region” oder ”CDR” (d. h. die Reste 24–34 (L1), 50–56 (L2) und 89–97 (L3) in der variablen Domäne der Leichtkette und 31–53 (H1), 50–65 (H2) und 95–102 (H3) in der variablen Domäne der Schwerkette; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) und/oder die Reste einer ”hypervariablen Schleife” (d. h. die Reste 26–32 (L1), 50–53 (L2) und 91–96 (L3) in der variablen Domäne der Leichtkette und 26–32 (H1), 53–55 (H2) und 96–101 (H3) in der variablen Domäne der Schwerkette; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)). ”Gerüst”- oder ”FR”-Reste sind die Reste veriabler Domänen, die nicht den hierin definierten Resten der hypervariablen Regionen entsprechen. Die CDR- und FR-Reste des H52-Antikörpers in dem untenstehenden Beispiel werden beispielsweise in Eigenbrot et al., Polypeptides: Structure, Function and Genetics 18, 49–62 (1994), identifiziert.
”Humanisierte” Formen von nicht menschlichen (z. B. Maus-)Antikörpern sind chimäre Antikörper, die eine minimale, von nicht menschlichem Immunglobulin abgeleitete Sequenz umfassen. Großteils handelt es sich bei humanisierten Antikörpern um menschliche Immunglobuline (Rezeptor-Antikörper), worin Reste einer hypervariablen Region des Rezeptors durch Reste einer hypervariablen Region einer nicht menschlichen Spezies (Donor-Antikörper), wie z. B. einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder eines nicht menschlichen Primaten, mit der erwünschten Spezifizität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregionen-(FR-)Reste von menschlichem Immunglobulin durch entsprechende nicht menschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die in dem Rezeptor-Antikörper oder dem Donor-Antikörper nicht vorhanden sind. Diese Modifikationen erfolgen, um die Antikörperleistung weiter zu verfeinern. Im Allgemeinen umfassen humanisierte Antikörper im Wesentlichen zumindest eine, und typischerweise zwei, vollständige variable Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle hypervariablen Schleifen jenen eines nicht menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jenen einer menschlichen Immunglobulinsequenz entsprechen. Der humanisierte Antikörper umfasst fakultativ auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunoglobulinregion (Fc), typischerweise den eines menschlichen Immunglobulins.
Die Wahl der menschlichen variablen Domänen, sowohl leicht als auch schwer, die zur Herstellung der humanisierten Antikörper herangezogen werden, ist von großer Bedeutung, um die Antigenität zu reduzieren. Gemäß der sogenannten Methode der ”optimalen Anpassung” wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetier-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek von bekannten Sequenzen von menschlichen variablen Domänen gescreent. Die menschliche Sequenz, die der des Nagetiers am ähnlichsten ist, wird dann als menschliches Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper angenommen (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Bei einem weiteren Verfahren wird ein bestimmtes Gerüst eingesetzt, das von der Consensus-Sequenz aller menschlichen Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten abstammt. Dasselbe Gerüst kann für verschiedene humanisierte Antikörper eingesetzt werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Es ist weiters wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung der hohen Affinität für das Antigen und anderer günstiger biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden gemäß einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper durch ein Analyseverfahren der parentalen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Einsatz von dreidimensionalen Modellen der parentalen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle sind allgemein verfügbar und Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter vermutlicher Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Die Überprüfung dieser Darstellungen ermöglicht eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste beim Funktionieren der vermutlichen Immunglobulinsequenz, d. h. die Analyse der Reste, die die Fähigkeit des vermutlichen Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste von dem Rezeptor und Importsequenzen so ausgewählt und kombiniert werden, dass die gewünschten Antikörper-Eigenschaften, wie z. B. eine gesteigerte Affinität für das Zielantigen/die Zielantigene, erzielt werden. Im Allgemeinen sind CDR-Reste unmittelbar und am wesentlichsten an der Beeinflussung der Antigen-Bindung beteiligt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um ein Antikörperfragment, das vorzugsweise menschlich oder humanisiert ist (siehe obenstehende Erläuterung bezüglich humanisierter Antikörper).
”Antikörperfragmente” umfassen einen Teil eines Antikörpers voller Länge, im Allgemeinen die Antigen-Bindungs- oder variable Region davon. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper; einkettige Antikörper-Moleküle und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden. Zur Herstellung von Antikörperfragmenten wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Herkömmlicherweise wurden diese Fragmente mittels proteolytischem Verdau von intakten Antikörpern abgeleitet (siehe z. B. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107–117 (1992), und Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Diese Fragmente können jedoch nun auch direkt durch rekombinante Wirtszellen produziert werden. Die Antikörper-Fragmente können beispielsweise von den oben besprochenen Antikörper-Phagen-Bibliotheken isoliert werden. Alternativ dazu können Fab'-SH-Fragmente direkt von E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992)). In einer anderen Ausführungsform wird F(ab')₂, wie in dem untenstehenden Beispiel beschrieben, unter Einsatz des Leucin-Zippers GCN4 gebildet, um die Bildung des F(ab')₂-Moleküls zu fördern. Gemäß einem anderen Ansatz können F(ab')₂-Fragmente direkt von der rekombinanten Wirtszellenkultur isoliert werden. Andere Techniken für die Herstellung von Antikörper-Fragmenten sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar. In anderen Ausführungsformen handelt es sich bei dem gewählten Antikörper um ein einkettiges Fv-Fragment (scFv). Siehe WO 93/16185 .
”Einkettige Fv-” oder ”sFv-”Antikörper-Fragmente umfassen die V_H- und V_L-Antikörperdomänen, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptid-Linker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was es dem sFv ermöglicht, die erwünschte Struktur für die Antigen-Bindung zu bilden. Für eine Besprechung von sFv siehe Pluckthun, in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Band 113, 269–315, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer Verlag, New York (1995).
Die Bezeichnung ”Diabodies” bezieht sich auf kleine Antikörper-Fragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Domäne der Schwerkette (V_H) umfassen, die mit einer variablen Domäne einer Leichtkette (V_L) in derselben Polypeptidkette verbunden ist (V_H-V_L). Unter Einsatz eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen zwei Domänen derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu formen. Diabodies werden detaillierter beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
Die Bezeichnung ”lineare Antikörper” bezieht sich in der gesamten Anmeldung auf die in Zapata et al., Polypeptide Eng. 8 (10), 1057–1062 (1995), beschriebenen Antikörper. Kurz gesagt umfassen diese Antikörper ein Paar an Tandem-Fd-Segmenten (V_H-C_H1-V_H-C_H1), die ein Paar von Antigen-Bindungsregionen bilden. Lineare Antikörper können bi- oder monospezifisch sein.
”Multispezifische Antikörper” weisen Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Epitope auf, wobei die Epitope gewöhnlicherweise von verschiedenen Antigenen sind. Während solche Moleküle gewöhnlicherweise nur zwei Antigene binden (d. h. bispezifische Antikörper, BsAbs), deckt diese Bezeichnung, wie hierin verwendet, auch Antikörper mit zusätzlichen Spezifitäten, wie z. B. trispezifische Antikörper. Beispiele für BsAbs umfassen jene mit einem gegen ein Tumorzell-Antigen gerichteten Arm und einem gegen ein zytotoxisches Trigger-Molekül gerichteten Arm, wie z. B. Anti-FcγRI/Anti-CD15, Anti-p185^HER2/FcγRIII (CD16), Anti-CD3/Anti-maligne B-Zelle (1D10), Anti-CD3Anti-p185^HER2, Anti-CD3/Anti-p97, Anti-CD3/Anti-Nierenzellkarzinom, Anti-CD3/Anti-OVCAR-3, Anti-CD3/L-D1 (Anti-Kolonkarzinom), Anti-CD3/Anti-Melanocyten-stimulierendes-Hormonanalogon, Anti-EGF-Rezeptor/Anti-CD3, Anti-CD3/Anti-CAMA1, Anti-CD3/Anti-CD19, Anti-CD3/MoV18, Anti-Nervenzelladhäsionsmolekül (NCAM)/Anti-CD3, Anti-Folatbindungsprotein (FBP)/Anti-CD3, Anti-pan-Karzinom-assoziiertes Antigen (AMOC-31)/Anti-CD3; BsAbs mit einem Arm, der spezifisch an ein Tumor-Antigen bindet, und einem Arm, der an ein Toxin bindet, wie z. B. Anti-Saporin/Anti-Id-1, Anti-CD22/Anti-Saporin; Anti-CD7/Anti-Saporin, Anti-CD38/Anti-Saporin, Anti-CEA/Anti-Ricin-A-Kette, Anti-Interferon-α (IFN-α)/Anti-Hybridom-Idiotyp, Anti-CEA/Anti-Vinca-Alkaloid; BsAbs zur Umwandlung von enzymaktivierten Prodrugs, wie z. B. Anti-CD30/Anti-alkalische Phosphatase (die die Umwandlung von Mitmycinphosphat-Prodrug in Mitomycinalkohol katalysiert); BsAbs, die als fibrinolytische Wirkstoffe eingesetzt werden können, wie z. B. Anti-Fibrin/Anti-Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), Anti-Fibrin/Plasminogenaktivator des Anti-Urokinasetyps (uPA); BsAbs für das Targeting von Immunkomplexen an Zelloberflächenrezeptoren, wie z. B. Anti-Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL)/Anti-Fc-Rezeptor (z. B. FcγRI, FcγRII oder FcγRIII); BsAbs zur Verwendung für die Therapie von Infektionskrankheiten, wie z. B. Anti-CD3/Anti-Herpes-Simplex-Virus (HSV), Anti-T-Zellen-Rezeptor, CD3-Komplex/Anti-Influenza, Anti-FcγR/Anti-HIV; BsAbs zur Tumordetektion in vitro oder in vivo, wie z. B. Anti-CEA/Anti-EOTUBE, Anti-CEA/Anti-DPTA, Anti-p185^HER2/Anti-Hapten; BsAbs als Vakzinehilfsstoffe; sowie BsAbs als Diagnoseinstrument, wie z. B. Anti-Kaninchen-IgG/Anti-Ferritin; Anti-Meerrettichperoxidase (HRP)/Anti-Hormon, Anti-Somatostatin/Anti-Substanz P, Anti-HRP/Anti-FITC, Anti-CEA/Anti-β-Galactosidase. Beispiele für trispezifische Antikörper umfassen Anti-CD3/Anti-CD4/Anti-CD37, Anti-CD3/Anti-CD5/Anti-CD37 und Anti-CD3/Anti-CD8/Anti-CD37. Bispezifische Antikörper können als Antikörper voller Länge oder Antikörper-Fragmente (z. B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper) hergestellt werden.
Verfahren zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die herkömmliche Produktion von bispezifischen Antikörpern voller Länge beruht auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Ketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Milstein et al., Nature 305, 537–539, (1983)). Aufgrund der zufälligen Anordnung der Immungloblin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörper-Molekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die gewöhnlicherweise durch Affinitätschromatographie-Schritte erfolgt, ist eher mühevoll und die Produktausbeute gering. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829 und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) an konstante Domänensequenzen von Immunglobulin fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Domäne einer Immunglobulin-Schwerkette, die zumindest einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Vorzugsweise umfasst die erste konstante Region der Schwerkette (CH1) die Stelle, die erforderlich ist, um die Leichtkette zu binden, die zumindest in einer der Fusionen vorhanden ist. DNA, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen und, wenn gewünscht, die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dadurch wird große Flexibilität bei der Anpassung der jeweiligen Anteile der drei Polypeptid-Fragmente in den Ausführungsformen bereitgestellt, wenn ein ungleiches Verhältnis der drei Polypeptid-Ketten, die zur Konstruktion eingesetzt werden, eine optimale Ausbeute bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die Kodiersequenzen für zwei oder alle drei Polypeptid-Ketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptid-Ketten im gleichen Verhältnis zu einer höheren Ausbeute führt oder wenn die Verhältnisse nicht signifikant sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) in dem anderen Arm. Es wurde festgestellt, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der erwünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulin-Kettenkombinationen erleichtert, da die Trennung durch das Vorhandensein von Immunglobulin-Leichtketten in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls erleichtert wird. Dieser Ansatz ist in WO 94/04690 offenbart. Für weitere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Gemäß einem anderen Ansatz, der in WO 96/27011 beschrieben ist, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörper-Molekülen so verändert werden, dass der Prozentsatz von Heterodimeren, die aus einer rekombinanten Zellkultur gewonnnen werden, maximiert werden kann. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der C_H3-Domäne einer konstanten Antikörper-Domäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäure-Seitenketten der Granzfläche des ersten Antikörper-Moleküls durch größere Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Auf der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls werden komplementäre ”Aushöhlungen” mit gleicher oder ähnlicher Größe wie die große(n) Seitenkette(n) gebildet, indem große Aminosäure-Seitenketten durch kleinere (z. B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Das stellt einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers gegenüber anderen, unerwünschten Endprodukten, wie z. B. Homodimeren, bereit.
Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder ”Heterokonjugat”-Antikörper. Einer der Antikörper in dem Heterokonjugat kann beispielsweise an Avidin gekoppelt werden, der andere an Biotin. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf ungewünschte Zellen zu richten ( US-Patent Nr. 4.676.980 ), sowie für die Behandlung von HIV-Infektionen ( WO 91/00360 , WO 92/20373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Einsatz von geeigneten Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzer sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und in US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe an Vernetzungsverfahren offenbart.
Verfahren zur Erzeugung von bispezifischen Antikörpern aus Antikörper-Fragmenten wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Einsatz von chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, bei dem intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivaten überführt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin in Fab'-Thiol zurück überführt und mit einer äquimolaren Menge eines anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um einen bispezifischen Antikörper zu bilden. Die hergestellten bispezifischen Antikörper können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Jüngster Fortschritt hat die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli, die chemisch gebunden werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden, vereinfacht. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Herstellung eines vollständig humanisierten bispezifischen Antikörper-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolation von bispezifischen Antikörper-Fragmenten direkt aus einer rekombinanten Zellkultur wurden auch beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Einsatz von Leucin-Zippern erzeugt. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide von Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann erneut oxidiert, um Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren eingesetzt werden. Das ”Diabody”-Verfahren, das von Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben wurde, stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von bispezifischen Antikörper-Fragmenten bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (V_H), die mit einer variablen Leichtketten-Domäne (V_L) durch einen Linker verbunden ist, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen. Dementsprechend sind die V_H- und die V_L-Domäne eines Fragments gezwungen, mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments ein Paar zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungstellen gebildet werden. Eine weitere Strategie zur Herstellung von bispezifischen Antikörper-Fragmenten unter Verwendung von einkettigen Fv-(sFv-)Dimeren wurde ebenfalls beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Mit ”Gewinnung eines Polypeptids” ist das Erhalten eines Polypeptid-Präparats aus einer ”Prä-Gewinnungspräparat” durch die Reinigung des Prä-Gewinnungspräparats (siehe unten) oder die Modifikation eines Vorläufer-Polypeptids zur Erzeugung einer Form eines Polypeptids, die keine Vorläufer-Domäne aufweist, gemeint.
Unter ”Reinigung” einer Zusammensetzung, die ein Polypeptid und eine oder mehrere verunreinigende Substanzen umfasst, versteht man die Steigerung des Reinheitsgrades des Polypeptids in der Zusammensetzung durch (vollständige oder teilweise) Entfernung zumindest einer der verunreinigenden Substanzen aus der Zusammensetzung. Ein ”Reinigungsschritt” kann Teil eines umfassenden Reinigungsverfahrens sein, der zu einer ”im Wesentlichen reinen” Zusammensetzung führt, wobei diese Bezeichnung hierin verwendet wird, um eine Zusammensetzung zu bezeichnen, die zumindest etwa 90 Gew.-%, vorzugsweise zumindest etwa 95 Gew.-%, des Polypeptids von Interesse umfasst, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. ”Im Wesentlichen homogen” bezieht sich hierin auf eine Zusammensetzung, die zumindest etwa 99 Gew.-% eines Polypeptids von Interesse umfasst, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Das ”Reagens” von Interesse ist hierin eine Verbindung oder Zusammensetzung (vorzugsweise ein Polypeptid), die/das in der Lage ist, ein Polypeptid von Interesse zu modifizieren. Ein ”gelöstes” Reagens ist ein Reagens, das sich von der Festphase gelöst hat. Das Reagens kann das Polypeptid beispielsweise chemisch oder physikalisch verändern. Unter ”chemischer Veränderung” versteht man die Modifikation des Polypeptids beispielsweise durch die Bildung von Bindungen oder Spaltung, wodurch eine neue chemische Einheit entsteht. Mit ”physikalischer Veränderung” sind Veränderungen in der höheren Ordnung der Polypeptidstruktur gemeint. Enzyme sind Beispiele für Reagenzien, die das Polypeptid chemisch und/oder physikalisch verändern können. Das bevorzugte Enzym ist eine Protease (z. B. zur Entfernung von einer oder mehreren Vorläuferdomänen von einem Vorläufer-Polypeptid). Eine ”Protease” ist ein Enzym, das ein Polypeptid hydrolysieren kann. Beispiele für Proteasen umfassen Pepsin, Cathepsin, Trypsin, Papain, Elastase, Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen, Subtilisin, Chrymotrypsin, Thermolysin, V₈-Protease, Prolinase und andere Endo- oder Exopeptidasen.
Unter ”Festphase” versteht man eine nicht wässrige Matrix, an der ein Reagens haften kann. Die Festphase kann eine Reinigungssäule, eine diskontinuierliche Phase diskreter Teilchen, eine Membran oder ein Filter sein. Beispiele für Materialien, die die Festphase bilden, umfassen Polysaccharide (wie z. B. Agarose und Cellulose); und andere mechanisch stabile Matrizen, wie z. B. Siliciumdioxid (z. B. ”Controlled Pore Glass”), Poly(styroldivinyl)benzol, Polyacrylamid, Keramikteilchen und Derivate der oben genannten. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Festphase Perlen aus porösem Glasmaterial (”Controlled Pore Glass”), die in einer Säule angeordnet sind. In manchen Ausführungsformen ist die Festphase mit einem Reagens (wie z. B. Glycerin) beschichtet, das die nicht spezifische Haftung von verunreinigenden Substanzen an der Festphase verhindern soll.
Das oben erläuterte Reagens kann auf oder in der Festphase ”immobilisiert” werden, indem eine kovalente Bindung zwischen einer funktionellen Gruppe des Reagens und einer reaktiven Gruppe auf der Oberfläche der Festphase gebildet wird. In anderen Ausführungsformen wird das Reagens auf der Festphase durch Adsorption und ionische Bindung ”immobilisiert” oder in der Festphase eingeschlossen, z. B. in den Zellen oder netzartigen Polymeren oder Mikrokapseln (siehe Holenberg und Roberts, in: Enzymes as Drugs, 396–411, John Wiley & Sons, NY (1981)). Das Reagens sollte im Wesentlichen seine Fähigkeit beibehalten, das Polypeptid von Interesse zu modifizieren, wenn es auf der Festphase immobilisiert ist. Die Immobilisierung des Reagens kann durch Matrix-Aktivierung erfolgen. Kurz gesagt umfasst dies im Allgemeinen zunächst die Aktivierung der Festphase durch eine spezifische chemische Reaktion in Abhängigkeit von der Oberflächenchemie und dann das Immobilisieren des Reagens durch dessen Kombination mit der aktivierten Festphase. Die Aktivierung der Festphase kann die Aktivierung von Hydroxylgruppen (z. B. Cyanogenbromidaktivierung der Festphase); Carboxylgruppen (z. B. unter Einsatz von N-Hydroxybenzotriazol in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids); Acylhydrazid (z. B. unter Einsatz von Glutaraldehyd zur Erzeugung von Aldehydgruppen); Aminen (z. B. unter Einsatz von salpetriger Säure, Phosgen und Thiophosgen oder Bromcyan) oder Acrylnitril umfassen. In einer anderen Ausführungsform kann das Reagens unter Einsatz eines Vernetzers (z. B. Carbodiimid, Woodward-Reagens K, Chlorformiaten und Carbonyldiimidazol); homobifunktionellen Vernetzern (z. B. Glutaraldehyd, Chlorformiaten und Carbonyldiimidazol, heterozyklischen Halogeniden, Divinylsulfon, Chinonen und Übergangsmetallionen); heterobifunktionellen Vernetzern, wie z. B. Monohalogenacetylhalogenid, Epichlorhydrin sowie Amino- und Thiolgruppen-gerichteten Reagenzien immobilisiert werden. In einer weiteren Ausführungsform ist das Reagens mit der Festphase durch eine Kohlenhydratkette vernetzt. Um das zu erreichen, können die Zucker-Gruppierungen zunächst zu Aldehyden oxidiert werden, die mit Ethylendiamin oder Glycyltyrosin Schiffsche Basen bilden. Natriumborhydrid kann zur Stabilisierung der Bindungen eingesetzt werden. Das derivatisierte Glykoprotein wird auf der Festphase immobilisiert. Für eine Übersicht über Immobilisierungsverfahren siehe S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, in: CRC Press Inc., Boston (1991).
Ein ”Leucin-Zipper” ist ein Peptid (oft etwa 20–40 Aminosäurereste lang) mit verschiedenen wiederholenden Aminosäuren, wobei jede siebente Aminosäure ein Leucin-Rest ist. Solche Leucin-Zipper-Sequenzen bilden amphipathische α-Helices, wobei die Leucin-Reste auf der hydrophoben Seite zur Dimerbildung angeordnet sind. Leucin-Zipper können die als Heptad-Wiederholung (Leucin-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆; Seq.-ID Nr. 4)_n, bekannte Strukturformel aufweisen, worin X eine beliebige der 20 herkömmlichen Aminosäuren sein kann, aber wahrscheinlich eine Aminosäure mit einem hohen α-Helix-Bildungspotential, beispielsweise Alanin, Valin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Lysin, ist, und worin n = 3 oder größer sein kann, wenngleich n typischerweise 4 oder 5 ist. Beispiele für Leucin-Zipper hierin umfassen den Fos-Jun-Leucin-Zipper (O'Shea et al., Science 245, 646 (1989)), der für die Bildung von Heterodimeren (z. B. bispezifischen Antikörpern) eingesetzt werden kann; den GCN4-Leucin-Zipper von Hefe (Landschulz et al., Science 240, 1759–1764 (1988)), der für die Bildung von Homodimeren (z. B. monospezifischen Antikörpern wie in dem untenstehenden Beispiel) eingesetzt werden kann, und Leucin-Zipper, die in anderen DNA-Bindungsproteinen vorhanden sind, wie z. B. C/EBP und c-myc, sowie Varianten der eben genannten.
Die Bezeichnung ”Filter” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf poröse Filtermedien, durch die eine wässrige Phase hindurchtreten kann, die aber einen oder mehrere verunreinigende Substanzen zurückhalten. Der Filter kann aus verschiedenen Materialien bestehen, wie z. B. Cellulosefasern, wie z. B. Celluloseacetat (SARTOBIND^TM-Membranadsorber von Sartorius); Teilchen auf Siliciumdioxidbasis; Faser- und Teilchenfilterelementen; Nylonmembranen oder einer Kombination von diesen. Der Filter von Interesse hierin ist ein ”geladener Filter” (d. h. positiv oder negativ geladen), was bedeutet, dass er eine positive oder eine negative Gesamtnettoladung trägt. Das kann beispielsweise dadurch erreicht werden, indem ”ladungsverändernde Gruppen” an dem Filter angebracht werden. Anionische Ladungsveränderer umfassen wasserlösliche Polymere mit anionischen funktionellen Gruppen, wie z. B. Carboxyl-, Phosphor-, Phosphon-, Sulfongruppen ( US-Patent Nr. 4.604.208 ). Kationische Ladungsveränderer umfassen kationisches Melaminformaldehyd-Kolloid ( US-Patent Nr. 4.007.113 ), anorganisches kationisches kolloidales Siliciumdioxid ( US-Patent Nr. 4.305.782 ), kationisches Polyamidopolyaminepichlorhydrin-Harz, Polyaminepichlorhydrin. Der Filter ermöglicht vorzugsweise eine hohe Durchflussgeschwindigkeit, ohne dass dadurch Bindungskapazität eingebüßt wird (beispielsweise im Gegensatz zu Säulen auf Perlenbasis). Verschiedene Filterkonfigurationen werden in Betracht gezogen, wie z. B. Mehrschichtmodule und spiralförmig gewundene Anordnungen.
Ein ”Puffer” ist eine Lösung, die pH-Veränderungen durch die Wirkung seiner konjugierten Säure-Base-Komponenten widersteht. Ein ”Äquilibrierungspuffer” wird eingesetzt, um eine Festphase für das Laden des Polypeptids von Interesse vorzubereiten. Der ”Ladungspuffer” wird eingesetzt, um die Zusammensetzung, die das Polypeptid und die verunreinigenden Substanzen umfasst, auf die Festphase zu laden. Oft sind Äquilibrierungs- und Ladungspuffer dieselben. Der ”Elutionspuffer” wird eingesetzt, um das Polypeptid von der Festphase zu eluieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung ”Immunadhäsin” auf Antikörperähnliche Moleküle, die die ”Bindungsdomäne” eines heterologen ”Adhäsin”-Polypeptids (z. B. einen Rezeptor, einen Liganden oder ein Enzym) mit den Effektor-Funktionen eines konstanten Immunglobulin-Domäne kombiniert. Strukturell betrachtet umfassen Immunadhäsine eine Fusion einer Adhäsin-Aminsosäuresequenz mit der erwünschten Bindungsspezifität, die sich von der der Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle (Antigen-Kombinationsstelle) eines Antikörpers (d. h. ”heterolog” ist) unterscheidet, und einer konstanten Immunglobulin-Domänensequenz. Die konstante Immunglobulin-Domänensequenz in dem Immunadhäsin stammt vorzugsweise von γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten, da Immunadhäsine, die diese Regionen umfassen, durch Protein-A-Chromatographie gereinigt werden können (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983).
Die Bezeichnung ”Liganden-Bindungsdomäne” bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen beliebigen nativen Zelloberflächenrezeptor oder eine beliebige Region oder ein beliebiges Derivat davon, die zumindest eine qualitative Liganden-Bindung eines entsprechenden nativen Rezeptors beibehalten. In einer spezifischen Ausführungsform stammt der Rezeptor von einem Zelloberflächenpolypeptid mit einer extrazellulären Domäne, die zu einem Mitglied der Immunglobulin-Supergenfamilie homolog ist. Andere Rezeptoren, die nicht Mitglieder der Immunglobulin-Supergenfamilie sind, aber dennoch von dieser Definition speziell gedeckt werden, sind Rezeptoren für Cytokine und insbesondere Rezeptoren mit Tyrosinkinase-Aktivität (Rezeptor-Tyrosinkinasen), Mitglieder der Hämatopoietin- und Nervenwachstumsfaktorrezeptorsuperfamilien und Zelladhäsionsmoleküle, z. B. (E-, L- und P-)Selectine.
Die Bezeichnung ”Rezeptor-Bindungsdomäne” bezieht sich auf einen beliebigen nativen Liganden für einen Rezeptor, umfassend Zelladhäsionsmoleküle, oder eine beliebige Region oder ein beliebiges Derivat eines solchen nativen Liganden, die/das zumindest eine qualitative Rezeptorbindungsfähigkeit eines entsprechenden nativen Liganden beibehält. Diese Definition umfasst u. a. spezifisch Bindungssequenzen von Liganden für die oben genannten Rezeptoren.
Beste Art der Ausführung der Erfindung
Die Erfindung stellt hierin ein Verfahren zur Modifikation eines Polypeptids und gegebenenfalls zur Reinigung eines Polypeptids aus einer Zusammensetzung bereit, die das Polypeptid und eine oder mehrere verunreinigende Substanzen umfasst. Bei der Zusammensetzung handelt es sich im Allgemeinen um eine Zusammensetzung, die sich aus der rekombinanten Produktion des Polypeptids ergibt, kann sich aber auch aus der Produktion des Polypeptids durch Peptidsynthese (oder andere synthetische Mittel) ergeben, oder das Polypeptid kann aus einer nativen Polypeptidquelle gereinigt werden. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein Antikörper, z. B. ein Antikörper, der CD18-Antigen bindet.
Zur rekombinanten Produktion des Polypeptids wird die Nucleinsäure, die für dieses kodiert, isoliert und in einen replizierbaren Vektor für weiteres Klonieren (DNA-Amplifikation) oder zur Expression insertiert. Die DNA, die für das Polypeptid kodiert, wird isoliert und unter Einsatz von herkömmlichen Verfahren (z. B. wenn das Polypeptid ein Antikörper ist unter Einsatz von Oligonucleotid-Sonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene binden zu können, die für die Schwer- und Leichtketten des Antikörpers kodieren) sequenziert. Es stehen zahlreiche Vektoren zur Verfügung. Die Vektor-Komponenten umfassen im Allgemeinen eines oder mehrere der folgenden Elemente, sind aber nicht auf diese beschränkt: eine Signalsequenz, ein Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markierungsgene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz (z. B. wie in US-Patent 5.534.615 beschrieben).
Geeignete Wirtszellen für das Klonieren oder die Expression der DNA in den Vektoren hierin sind prokaryotische, Hefe- oder höhere eukaryotische Zellen, die oben beschrieben wurden. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck umfassen Eubakterien, wie z. B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, Enterobacteriaceae, wie z. B. Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. b. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), wenngleich andere Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325), auch geeignet sind. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonier- oder Expressionswirte für Vektoren, die für ein Polypeptid kodieren. Saccharomyces cerevisiae oder herkömmliche Backhefe wird von den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen am verbreitetsten eingesetzt. Jedoch stehen eine Reihe von anderen Gattungen, Spezies und Stämmen allgemein zur Verfügung und können hierin eingesetzt werden, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-Wirte, wie z. B. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa; Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentails, und Fadenpilze, wie z. B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans und A. niger.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykolysiertem Polypeptid stammen von multizellulären Organismen. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten, wie z. B. Spodoptera frugiperda (Raupe); Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, wurden identifiziert. Eine Reihe von viralen Stämmen für die Transfektion sind allgemein verfügbar, wie z. B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, wobei diese Viren hierin als Virus gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, insbesondere für die Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen. Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdapfel (Kartoffel), Sojabohne, Petunie, Paradeiser (Tomate) und Tabak können auch als Wirte eingesetzt werden.
Das Interesse war jedoch an Wirbeltier-Zellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltier-Zellen in Kulturen (Gewebekulturen) ist zu einem Routineverfahren geworden. Beispiele für Säugetierwirtszelllinien, die eingesetzt werden können, umfassen die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche embryonale Nierenzelllinie (293- oder 293-Zellen, die zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden; Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Baby-Hamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen des chinesischen Hamsters/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); AGMK-Zellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Cervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL2); Hundenierenzellen (MDCK; ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mausmammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC5-Zellen; FS4-Zellen und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden durch die oben beschriebenen Expressions- oder Kloniervektoren zur Polypeptidherstellung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die auf geeignete Weise für das Induzieren von Promotoren, die Auswahl von Transformanten oder das Amplifizieren der Gene, die für die gewünschte Sequenz kodieren, modifiziert werden.
Die Wirtszellen, die eingesetzt werden, um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung herzustellen, können in verschiedenen Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z. B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma), sind für das Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Zusätzlich dazu können alle Medien als Kulturmedien für die Wirtszellen eingesetzt werden, die in Harn et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patent Nr. 4.767.704 , 4.657.866 , 4.927.762 , 4.560.655 oder 5.122.469 ; WO 90/03430 ; WO 87/00195 oder US-Patent Re. 30.985 beschrieben wurden. Ein beliebiges dieser Medien kann nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z. B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (beispielsweise HEPES), Nucleotiden (wie beispielsweise Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z. B. GENTAMYCIN^TM-Arzneimittel), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die gewöhnlicherweise in einer Endkonzentration im Mikromolarbereich vorhanden sind) und Glucose oder eine gleichwertige Energiequelle ergänzt sein. Beliebige andere, erforderliche Ergänzungen können auch in angemessener Konzentration, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, zugesetzt werden. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH und dergleichen, entsprechen den zuvor für die zur Expression ausgewählte Wirtszelle eingesetzten und sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar.
Bei Einsatz von Rekombinationsverfahren kann das Polypeptid intrazellulär, im Periplasma, produziert werden oder direkt in das Medium sekretiert werden. Wenn das Polypeptid intrazellulär produziert wird, werden im ersten Schritt Teilchenreste, entweder Wirtszellen oder lysierte Zellen (z. B. als Ergebnis der Homogenisierung), beispielsweise durch Zentrifugieren oder Ultrafiltrieren entfernt. Wenn das Polypeptid in das Medium sekretiert wird, werden Überstände solcher Expressionssysteme im Allgemeinen zunächst unter Einsatz eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, beispielsweise einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, eingeengt.
Das Polypeptid wird dann einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen. Beispiele für Reinigungsverfahren umfassen Fraktionierung auf einer Ionenaustausch-Säule, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (z. B. auf Phenylsepharose), Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Siliciumdioxid, Chromatographie auf Heparin-Sepharose^TM, Anionenaustauschchromatographie, Kationenaustauschchromatographie (z. B. auf einer Bakerbond-ABX-Säule oder SP-Sepharose-HP-Säule), Chromatofokussierung, SDS-PAGE, Ammoniumsulfatfällung, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse und Affinitätschromatographie (z. B. unter Einsatz von Protein A, Protein G, einem Antikörper, einem spezifischen Substrat, Liganden oder Antigen als Einfang-Reagens).
In der Erfindung umfasst der Schritt der Gewinnung das Aussetzen einer Zusammensetzung, die das Polypeptid (und gegebenenfalls eine oder mehrere verunreinigende Substanzen) umfasst, gegenüber einer Festphase, auf der ein Reagens immobilisiert ist, welches das Polypeptid modifiziert. Dieser Schritt kann zu Beginn, am Ende oder mitten in einer Reihe von Gewinnungsschritten für das Polypeptid erfolgen. In einer Ausführungsform wird die Festphase in eine Säule gefüllt, und das immobilisierte Reagens fängt das Polypeptid ein. In einer anderen Ausführungsform modifiziert das Reagens das Polypeptid chemisch und/oder physikalisch und ist auf der Festphase immobilisiert, die z. B. in eine Säule gefüllt, wobei die Zusammensetzung durch die Säule hindurchgeleitet wird. Das Polypeptid kann beispielsweise eine Vorläuferdomäne umfassen, die durch das immobilisierte Reagens als Teil des Gewinnungsverfahrens entfernt wird. In dem untenstehenden Beispiel handelte es sich bei dem Vorläufer-Polypeptid um einen Antikörper mit einer Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne, die durch immobilisiertes Pepsin im Gewinnungsverfahren entfernt wurde. Nach diesem Schritt kann die Festphase (z. B. die Chromatographiesäule) unter Einsatz von Verfahren zur Regeneration von solchen Festphase regeneriert werden.
Es wurde hierin festgestellt, dass es zur Ablösung des immobilisierten Reagens von der Festphase kommen kann und dass das zu geringerer Ausbeute und/oder Verunreinigung des Polypeptid-Präparats nach diesem Schritt führen kann. In dem untenstehenden Beispiel wurde insbesondere festgestellt, dass das Pepsin sich von der Säule, auf der es immobilisiert war, ablösen konnte, was zum Verdau des Antikörpers nach der Entfernung des Leucin-Zippers führte, wodurch die Ausbeute an funktionellem Antikörper reduziert wurde.
Um dieses Problem zu umgehen, stellt die Erfindung einen Schritt nach dem oben erläuterten Aussetzen der Zusammensetzung gegenüber dem immobilisierten Reagens bereit. Dieser umfasst das Leiten der Zusammensetzung, die das Polypeptid und das abgelöste Reagens (und gegebenenfalls eine oder mehrere verunreinigende Substanzen) umfasst, durch einen Filter, der eine Ladung trägt, die der Ladung des Reagens bei dem pH der Zusammensetzung entgegengesetzt ist, um das abgelöste Reagens aus der Zusammensetzung zu entfernen. Der Filter kann positiv geladen sein, um verunreinigende Substanzen zu entfernen, die bei dem pH der Zusammensetzung negativ geladen sind, wie z. B. saure Proteasen oder andere Reagenzien, die von Säulen abgelöst werden können. Alternativ dazu kann der Filter negativ geladen sein, um verunreinigende Substanzen zu entfernen, die bei dem pH der Zusammensetzung positiv geladen sind, wie z. B. basische Proteasen. Vorzugsweise sind die Ladungseigenschaften des Polypeptids von Interesse in der Zusammensetzung, die durch den Filter geleitet wird, so, dass das Polypeptid im Wesentlichen nicht durch den Filter zurückgehalten wird und diesen passiert. Die Fähigkeit des abgelösten Reagens, an den Filter zu binden, und des Polypeptids, diesen zu passieren, variiert in Abhängigkeit von dem pH der Zusammensetzung, die durch den Filter geleitet wird. Um zu bestimmen, welcher Filter einzusetzen ist (d. h. ein positiv oder negativ geladener Filter), kann der pI des abgelösten Reagens bestimmt werden sowie fakultativ der pI des Polypeptids, das dem immobilisierten Reagens wie oben erläutert ausgesetzt wird. In einer Ausführungsform (z. B. wie in dem untenstehenden Beispiel) ist der pH der Zusammensetzung so, dass das abgelöste Reagens und das Polypeptid bereits entgegengesetzte Nettoladungen aufweisen. In einer anderen Ausführungsform kann es von Vorteil sein, den pH der Zusammensetzung, die durch den geladenen Filter geleitet wird, so anzupassen, dass das abgelöste Reagens und das Polypeptid entgegengesetzte Ladungen aufweisen. Eine solche Veränderung des pH der Zusammensetzung kann dazu dienen, die Bindung von entgegengesetzt geladenen verunreinigenden Substanzen an den Filter zu steigern und/oder die Bindung des Polypeptids von Interesse an den Filter zu senken. Weitere Modifikationen der Zusammensetzung zum Erzielen derselben Wirkung werden hierin in Betracht gezogen. Nach einigen fakultativen Modifikationen der Zusammensetzung kann ein Filter ausgewählt werden, der eine der Ladung des abgelösten Reagens, das aus der Zusammensetzung entfernt werden soll, entgegengesetzte Ladung aufweist.
In der Erfindung, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, wird der Filter ”in einer Linie” mit dem wie im vorherigen Schritt beschrieben behandelten Abfluss angeordnet (d. h. der Abfluss fließt direkt durch den Filter). Das kann dadurch erreicht werden, indem der Filter direkt mit der Abflussöffnung der Säule verbunden wird, bevor der Abfluss in einem Poolgefäß gesammelt wird. Der Filter kann unter Einsatz von Verfahren, die auf den verwendeten Filter angewandt werden können, regeneriert werden.
Das Polypeptid-Präparat kann bei Bedarf einer zusätzlichen Reinigung unterzogen werden. Beispielhafte weitere Reinigungsschritte wurden zuvor erläutert. Das so gewonnene Polypeptid kann in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert werden und für verschiedene Diagnose-, Therapie- und andere Anwendungen, die für solche Moleküle bekannt sind, eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
BEISPIEL
Dieses Beispiel betrifft einen Antikörper (rhuMAb CD18), der als Vorläufer-Polypeptid mit einer Leucin-Zipper-Domäne produziert wird, die während des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung entfernt wird. Ein rekombinanter humanisierter Anti-CD18-Antikörper (rhuMAb CD18) mit der in 1A (Schwerkette; Seq.-ID Nr. 1) und 1B (Leichtkette; Seq.-ID Nr. 2) dargestellten Aminosäuresequenz wurde durch die Humanisierung des monoklonalen Maus-Antikörpers muMAb H52 hergestellt (Hildreth et al., J. Immunology 124, 3272–3280 (1985)).
Rekombinante Produktion von rhuMAb CD18: Das Plasmid pS1130 wurde konstruiert, um die Produktion des Vorläufermoleküls von rhuMAb CD18 in E. coli zu steuern. Der Vorläufer wird während des Reinigungsverfahrens durch die Protease Pepsin gespalten, wodurch rhuMAb CD18 entsteht. rhuMAb CD18 ist ein F(ab')₂-Molekül aus 2 verschiedenen Peptiden (Leicht- und Schwerketten), die durch Disulfidbindungen verbunden sind. Die Fc-Region von intakten Antikörpern hält normalerweise die beiden Fab-Arme zusammen (2A), so dass bei der Produktion von Fab' in E. coli sehr wenig F(ab')₂ gebildet wird. Die Fusion einer Hefe-GCN4-Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne an den C-Terminus eines Fab'-Ersatzes für die Fc-Region ermöglicht die effiziente Produktion von F(ab')₂ in E. coli. Die GCN4-Leucin-Zipper-Domänen Wechselwirken, um stabile dimere Strukturen (parallele Superhelixes) zu bilden, die die Gelenkregion-Cysteinreste der zwei Schwerketten zusammenhält, so dass sich die zwei nativen Interketten-Disulfidbindungen bilden können. Dies führt zur Bildung von F(ab')₂-Komplexen, die kovalent durch Disulfidbindungen verbunden sind. Die Leucin-Zipper-Domänen werden später aus dem Vorläufer-rhuMAb-CD18 während des Reinigungsverfahrens unter Einsatz der Protease Pepsin entfernt, wobei der Protease Pepsin einheitlich zwischen den 2 Leucin-Resten des Gelenks spaltet. Das führt zur Bildung des rhuMAb-CD18-F(ab')₂-Moleküls (2B).
Das Plasmid pS1130 (3) basiert auf dem gut charakterisierten Plasmid pBR322 mit einer 2143 bp großen Expressionskassette (4), die an der EcoRI-Restriktionsstelle insertiert ist. Das Plasmid pS1130 ist gegenüber Tetracyclin- und β-Lactam-Antibiotika resistent. Die Expressionskassette umfasst eine einzige Kopie jedes im Tandem verbundenen Gens. Die Transkription jedes Gens in eine einzige dicistronische mRNA wird durch den E.-coli-phoA-Promotor (Chang et al., Gene 44, 121–125 (1986)) angeleitet und endet an dem Phagen-λ-t₀-Terminator (Scholtissek und Grosse, Nucleic Acids Research 15, 3185 (1987)). Translationsinitiierungssignale für jede Kette werden durch E.-coli-STII-(wärmestabiles Enterotoxin) (Picken et al., Infection and Immunity 42, 269–275 (1983)) Shine-Dalgarno-Sequenzen bereitgestellt. Die Translation jeder Kette beginnt mit einem 23-Rest-STII-Signalpeptid, das die Translokation der Peptide durch die Zytoplasma-Membran in das Periplasma anleitet (Seq.-ID Nr. 6 und 7). Das STII-Signalpeptid wird dann durch die E.-coli-Leitpeptidase entfernt. Die Leicht- und Schwerketten falten sich nach der Sekretion in das Periplasma in ihre native Konformation und binden an den rhuMAb-CD18-Vorläufer, ein kovalent gebundenes F(ab')₂ (2B). Die Leucin-Zipper-Domäne wird von dem Vorläufer während des Reinigungsverfahrens (siehe unten) abgespalten, wodurch man rhuMAb CD18 (2B) erhält. Die für die Herstellung von rhuMAb CD18 verwendete Zelllinie ist 49A5, die von der in 5 dargestellten E.-coli-Zelllinie W3110 (ATCC 27.325) stammt. Die Fermentation erfolgt wie in 6 dargestellt. Es kommt zur Produktion von rhuMAb-CD18-Vorläufer, wenn das Medium an Phosphat abgereichert wird, typischerweise 30–60 h nach der Inokulation.
Die Reinigung von rhuMAb-CD18-Vorläufer aus der E.-coli-Zellpaste erfolgte wie folgt.
Homogenisierung und Zentrifugieren: Gefrorene Zellpellets, die Anti-CD18-Vorläufer-Antikörper umfassten, wurden in etwa 3 Volumina Extraktionspuffer (120 mM MES, 5 mM EDTA-Puffer, pH 6), der auf 30–40°C erhitzt wurde, gelöst. Das ergab eine Suspension mit einem pH zwischen etwa 5,4 und 6,5. Diese Suspension wurde zweimal bei 5500 bis 6500 psi durch einen Gaulin-Homogenisator geleitet und durch einen Wärmeaustauscher auf unter 20°C gehalten. 5% Polyethylenimin (PEI) (Gew./Vol.), pH 6, wurde zu dem Homogenat zu einer Endkonzentration von 0,2% PEI zugesetzt. Das Gemisch wurde etwa 1 h lang bei 2–8°C inkubiert. Etwa ein Volumen Extraktionspuffer (120 mM MES; 5 mM EDTA, pH 6) wurde zugesetzt, bevor die Feststoffe durch Zentrifugieren bei 15.280 g entfernt wurden. Der klare Überstand wurde durch die Zugabe von kaltem Wasser auf eine Leitfähigkeit von weniger als 3 mOhm konditioniert.
Ionenaustauschchromatographie: Der konditionierte Überstand wurde auf eine Kationenaustauschsäule (ABX-Säule; Mallinckrodt Baker, Inc., NJ, USA) geladen, die in 50 mM MES, pH 6,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und der Anti-CD18-Vorläufer wurde mit einem linearen Gradienten von 50 mM MES, pH 6,0, bis 50 mM MES, 100 mM Natriumcitrat, pH 6,0, eluiert. Die Säule wurde durch das Absorptionsmaß bei 280 nm überwacht, und das Eluat wurde in Fraktionen gewonnen. Die geeigneten Fraktionen wurden basierend auf einer analytischen hydrophoben Kationenaustauschflüssigchromatographie (HPLC) gepoolt. Nach dem Einsatz wurde die Kationenaustauschsäule unter Einsatz von 3,0 M Guanidin-HCl, 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, gefolgt von 1% Essigsäure, 120 mM Phosphorsäure regeneriert. Die Säule wurde in 1% Essigsäure, 120 mM Phosphorsäure gelagert.
Vorläuer-Verdau: Pepsin (Sigma, MO, USA) wurde chemisch an ”Controlled Pore Glass” (CPG) von Bioprocess Ltd., UK, gebunden. Das CPG wurde mit NaIO₄ aktiviert, wonach die Schiff-Base-Bildung zwischen CPG und Pepsin unter Einsatz von NaBH₃CN reduziert wurde.
Der Kationenaustausch-Anti-CD18-Vorläufer-Antikörper-Pool aus dem vorhergehenden Schritt wurde mit 50 mM MES, 36 mM Natriumcitrat, pH 4,0, auf eine Konzentration von etwa 2 g/l verdünnt. Der Pool wurde dann durch die Zugabe von 2 M Zitronensäure auf pH 4 angepasst und durch eine Säule geleitet, die immobilisiertes Pepsin (Pepsin-CPG) umfasste und zuvor mit 50 mM MES; 36 mM Natriumcitrat, pH 4,0, äquilibriert worden war. Durch dieses Verfahren wurden die Zipper aus der Gelenksregion entfernt, während F(ab')₂ intakt blieb. Nach dem Einsatz wurde die Pepsin-Säule mit 0,12%iger wässriger HCl, pH 1,5, regeneriert und in 100 mM Natriumacetat, 150 mM Natriumchlorid, 0,01% Thimerosal, 50% Glycerin, pH 4,5, gelagert.
Anionenaustauschfiltration: Der Abfluss von der Pepsin-CPG-Säule wurde direkt in einer Linie durch eine Anionenaustausch-Sartobind-Q-Membran (Sartorius, Göttingen, Westdeutschland) geleitet. Der erzeugte Anti-CD18-F(ab')₂-Antikörper fließt durch die Membran hindurch, während Pepsin und andere negativ geladene Verunreinigungen stark an die Membran binden. Die Membran wurde unter Einsatz von 50 mM MES, 36 mM Natriumcitrat, 1 M Natriumchlorid, pH 4,0, regeneriert und in 0,1 N Natriumhydroxid gelagert.
Analyse der Verdaureaktion: Der Verdau des Anti-CD18-Vorläufer-Antikörpers wurde mittels HPLC-Kationenaustauschchromatographie an einer BAKERBOND^TM-Carboxysulfon-(CSX-)Säule (50 × 4,6 mm) (J. T. Baker, Philipsburg, NJ), die auf 55°C gehalten wurde, analysiert. Die Polypeptide wurden unter Einsatz eines ansteigenden linearen Gradienten von pH 6,0 auf pH 8,0 bei einer Durchflussrate von 4 ml/min unter Einsatz einer Detektionswellenlänge von 280 nm eluiert. Puffer A umfasste 16 mM HEPES/PIPES/MES, pH 6,0, und Puffer B umfasste 16 mM HEPES/PIPES/MES, pH 8,0. Zur Trennung von verdautem und nicht verdautem Anti-CD18-Vorläufer-Antikörper wurde ein linearer Gradient 10 min lang von 40% B bis 100% B durchlaufen gelassen.
Pepsin-Analyse: Die von der Pepsin-CPG-Säule abgelöste Pepsinmenge wurde durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse und Pepsin-ELISA-Analyse bestimmt.
Für die HPLC-Analyse wurde eine TosoHass-TSK-Phenyl-Säule (7,5 × 75 mm) mit 90% Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und 10% Lösungsmittel B (0,1% TFA in Acetonitril) überwacht. Bei Injektion von 75 μg Probe wurde ein 30-minütiger Gradient von 10% bis 25% Lösungsmittel B initiiert; die Durchflussrate betrug 1 ml/min, und die Temperatur wurde auf 55°C gehalten.
Als ELISA wurde ein Sandwich-ELISA durchgeführt. Polyklonale Ziegen-Anti-Pepsin-Antikörper wurden eingesetzt, um eine 96-Well-Mikrotiterplatte zu beschichten. Pepsin-hältige Proben und Standards wurden in den beschichteten Wells inkubiert. Das Sandwich wurde mit biotinyliertem Ziegen-Anti-Pepsin vervollständigt. Vor der Biotinylierung wurden die zweiten Antikörper unter Einsatz von CPG-Pepsin affinitätsgereinigt. Die immunologischen Komplexe wurden in den Platten unter Einsatz von Streptavidin-alkalischer Phosphatase und p-Nitrophenylphosphatsubstrat nachgewiesen. Das Absorptionsmaß bei 405 nm wurde in einem Mikrotiterplattenlesegerät gemessen. Standards decken den Bereich von 33,3 μg/ml bis 0,5 μg/ml in 2fachen Verdünnungen. Die Verdünnungen wurden für die Proben vorgenommen (reine Probe oder 1:2, 1:4 und 1:8 verdünnt). Proben wurden auch in einem Maß von 10 μg/ml mit Pepsin versehen und als Proben getestet. Die Nachweisgrenze des Tests betrug 1 μg/ml. Eine logistische 4-Parameterkurve, die den Daten angepasst war, ergab eine annehmbare Standardkurve.
Kationenaustauschchromatographie: Der Pool wurde durch die Zugabe von Wasser verdünnt, um eine Leitfähigkeit von etwa 7 mOhm zu erhalten. Der Pool wurde auf eine Kationenaustauschsäule (SP Sepharose High Performance; SPHP) angewandt, die in 25 mM MES, 60 mM Essigsäure, pH 4,0, äquilibriert worden war. Die SP-Sepharose-Säule wurde mit 25 mM MES, 75 mM Natriumacetat, pH 5,6, gewaschen und in einem linearen Gradienten aus 75–110 mM Natriumacetat in 25 mM MES, pH 5,6, eluiert. Das Säuleneluat wurde bei 280 nm überwacht, und die Eluatfraktionen wurden basierend auf einer analytischen Ionenaustausch-HPLC gepoolt. Die SP-Sepharose-Säule wurde in 25 mM MES, 400 mM Natriumacetat, pH 5,6, regeneriert, gefolgt von Waschen mit 0,5% Natriumhydroxid. Die Säule wurde in 0,1% NaOH gelagert.
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC): Die gepoolte Fraktion der SP-Sepharose-Säule wurde durch die Zugabe von 3,0 M Ammoniumsulfat, 25 mM MES, pH 6,0, in einem Verhältnis von 0,26 l pro l des Pools verdünnt. Dann wurde sie durch eine HIC-Säule (Phenylsepharose-FF, geringe Substitution) geleitet, die zuvor in 0,625 M Ammoniumsulfat, 25 mM MES, pH 6,0, äquilibriert worden war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit demselben Puffer, der für die Äquilibrierung eingesetzt wurde, gewaschen, und rhuMAb CD18 wurde in 0,375 mM Ammoniumsulfat, 25 mM MES, pH 6,0, eluiert. Das Eluat wurde bei 280 nm überwacht, und die Fraktionen wurden basierend auf einer analytischen Umkehrphasen-HPLC gesammelt. Die HIC-Säule wurde in 25 mM MES, pH 6,0, regeneriert, wonach sie in 0,5% NaOH gewaschen wurde. Die Säule wurde in 0,1% NaOH gelagert.
ERGEBNISSE
Zwei getrennte Reinigungsdurchläufe in großem Ausmaß wurden durchgeführt (siehe 7). Das Reinigungsverfahren begann mit E.-coli-Zellpaste, die Anti-CD18-Vorläufer-Antikörper umfasste, und wurde mit Anti-CD18-F(ab')₂ abgeschlossen, dem die Leucin-Zipper-Dimerisierungsdomäne fehlte. Während beider Reinigungsdurchläufe erfolgte der Verdau des Antikörper-Vorläufermoleküls dadurch, dass teilweise gereinigter Anti-CD18-Vorläuferantikörper durch eine Pepsin-CPG-Säule geleitet wurde. Der Verdau wurde mittels SDS-PAGE und analytischer Kationenaustausch-HPLC überwacht. Die Gesamtmenge des von der Pepsin-CPG-Säule abgelösten Pepsins wurde durch die Messung des Pepsins in dem verdauten Vorläufer-Antikörper-Pool nach dem CPG-Pepsin-Verdau und dem Filtrationsschritt sowie in dem Anionenaustausch-Membranregenerationspool ermittelt. Die Regeneration der Membran erfolgte durch das Eluieren von Pepsin und verunreinigenden Substanzen, die an der Membran hafteten, unter Einsatz von 50 mM MES, 36 mM Natriumcitrat, 1 M Natriumchlorid, Puffer mit pH 4,0 (siehe 7). Die wirksame Entfernung von Pepsin in den Reinigungsschritten wurde durch Western-Blotting unter Einsatz von gereinigten Ziegen-Anti-Pepsin-Antikörpern überwacht und unter Einsatz des ELISA-Verfahrens mengenmäßig bestimmt.

Die Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC-Analyse sind in Tabelle 1 angeführt. Im ersten Durchlauf wurde Pepsin in dem Anionenaustauschmembranregenerationspool in einer Konzentration von 40 μg/ml und in dem verdauten Vorläufer-Antikörper-Pool nach dem CPG-Pepsin- und dem Filtrationsschritt in einer Konzentration von 48,3 μg/ml nachgewiesen. Durch Addition der Gesamtkonzentration von Pepsin in beiden Pools wurde bestimmt, dass 13,4 g Pepsin von der CPG-Pepsin-Säule während des Verdauschritts im ersten Durchlauf abgelöst wurden. Die Daten zeigten auch, dass die zur Entfernung des abgelösten Pepsins eingesetzte Filtrationsfläche bei den im ersten Durchlauf eingesetzten Durchflussraten und pH-Wert nicht ausreichte. Dennoch war die Membran in der Lage, 21% der Gesamtmenge des von der Pepsin-CPG-Säule abgelösten Pepsins zu entfernen. Da der verdaute Vorläufer-Antikörper-Pool 10,6 g abgelöstes Pepsin umfasste, das durch die Membran nicht entfernt wurde, war die Reinigungsausbeute des Pepsin-CPG-Verdauschritts und des SPHP-Schritts gering; 77 bzw. 53%. Pepsin wurde auch in dem SPHP-Pool durch Western-Blotting nachgewiesen. TABELLE 1

Durchlauf Nr. 1	Pepsinkonzentration
Pepsin-verdauter Ab-Pool	48,3 μg/l
Pepsin-verdautes Ab-Pool-Volumen	220 l
Gesamtmenge des Pepsin-Ab-Pools Membranregenerationspool	10,6 g 40,4 μg/ml
Membranregenerationsvolumen	70 l
Gesamtpepsinmenge Membranpool	2,8 g
Durchlauf Nr. 2	Pepsinkonzentration
Pepsin-verdauter Ab-Pool	0
Pepsin-verdautes Ab-Pool-Volumen	630
Gesamtmenge des Pepsin-Ab-Pools	0
Membranregenerationspool	230 μg/ml
Membranregenerationsvolumen	10 l
Gesamtpepsinmenge Membranpool	2,3 g

Nach dem abschließenden Reinigungsschritt (Phenylsepharose) wurde durch ELISA (Tabelle 2) oder Western-Blotting-Analyse kein Pepsin nachgewiesen. Im zweiten Durchlauf wurde die Filtrationsfläche der Anionaustauschmembran von 11.000 cm² auf 22.000 cm² verdoppelt. Pepsin wurde nur in dem Anionenaustauschregenerationspool in einer Konzentration von 230 μg/ml nachgewiesen. Pepsin wurde in dem verdauten Vorläufer-Antikörper-Pool nach den CPG-Pepsin-Verdau- und Filtrationsschritten nicht nachgewiesen. Die Gesamtmenge des durch das CPG-Pepsin-Harz abgelösten Pepsins betrug 2,3 g. Dieser Wert entspricht 17% der Gesamtmenge des abgelösten Pepsins, das im ersten Durchlauf nachgewiesen wurde. Pepsin wurde durch Umkehrphasen, Pepsin-ELISA oder Western-Blotting in den verbleibenden Reinigungsschritten des zweiten Durchlaufs nicht nachgewiesen. Als Folge der vollständigen Entfernung von Pepsin aus dem verdauten Vorläufer-Pool wurde die Reinigungsausbeute des Pepsin-CPG-Verdauschritts und von SPHP auf 97 bzw. 90% verbessert. TABELLE 2

Probe	Pepsinwerte (Mittel von 2 Wdhlg.) [μg/ml]
Abx-Pool	< 0,5; < 0,5
Q-Pool Durchlauf 1	7,4
Q-Pool Durchlauf 2	< 0,5; < 0,5
SPHP-Pool Durchlauf 1	< 0,5; < 0,5
SPHP-Pool Durchlauf 2	< 0,5; < 0,5
HIC-Pool Durchlauf 1	< 0,5; < 0,5
HIC-Pool Durchlauf 2	< 0,5; < 0,5
Bildung Produkt Durchlauf 1	< 0,5; < 0,5
Bildung Produkt Durchlauf 2	< 0,5; < 0,5
Placeboformulierung	< 0,5; < 0,5

Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die Verwendung einer positiv geladenen Membran in einer Linie unmittelbar nach dem Verdauschritt unter Einsatz von immobilisiertem Pepsin vorteilhaft war. Wenn Pepsin durch die Membran nicht vollständig aus dem verdauten Vorläufer-Antikörper-Pool entfernt wurde, ergab das gesenkte Ausbeuten an funktionellem Antikörper. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, war das wahrscheinlich das Ergebnis eines übermäßigen Verdaus durch das verbleibende Pepsin in dem Pool. Außerdem wurde Pepsin, wenn es nicht vollständig durch die positiv geladene Membran entfernt wurde, in dem SPHP-Pool mittels Western-Blotting nachgewiesen. Im zweiten Durchlauf wurde abgelöstes Pepsin vollständig durch die Membran entfernt. In der Folge konnte die Gewinnausbeute des Pepsinverdauschritts und des SPHP-Kationenaustauschschritts verbessert werden. Der Einsatz einer Anionenaustauschmembran verbesserte das Anti-CD18-Reinigungsverfahren auf zwei grundlegende Weisen. Zunächst wurde die Ausbeute durch eine wirksame Entfernung von Pepsin aus dem CPG-Verdau-Pool, wodurch ein weiterer Verdau verhindert wurde, verbessert. Zweitens wurden die Gesamteffizienz und die Reproduzierbarkeit des Verfahrens durch die Entfernung von Pepsin und anderen negativ geladenen, verunreinigenden Substanzen in einer frühen Phase des Verfahrens verbessert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Gewinnen eines Polypeptids, umfassend: (a) das Aussetzen einer Polypeptid umfassenden Zusammensetzung gegenüber einem Reagens, das das Polypeptid modifiziert, wobei das Reagens auf einer festen Phase immobilisiert ist; und anschließend (b) das Leiten der Zusammensetzung durch ein Filter, das eine zur Ladung des Reagens in der Zusammensetzung entgegengesetzte Ladung aufweist, um abgelöstes Reagens aus der Zusammensetzung zu entfernen, worin die Ladungseigenschaften des Polypeptids in der Zusammensetzung in Schritt (b) so sind, dass das Polypeptid das Filter passiert und worin das Filter dem Aussetzen der Zusammensetzung gegenüber dem Reagens in Schritt (a) nachgeschaltet ist, worin Ausfluss von Schritt (a) direkt durch das Filter fließt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filter positiv geladen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Filter negativ geladen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das immobilisierte Reagens eine Protease ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Protease Pepsin ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Polypeptid, das in Schritt (a) der Protease ausgesetzt wird, ein Polypeptidvorläufer ist und die Protease eine Vorläuferdomäne aus dem Polypeptid entfernt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Vorläuferdomäne einen Leucin-Zipper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Polypeptid ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der Antikörper ein F(ab')₂-Fragment ist.
Verfahren zum Modifizieren eines einen Leucin-Zipper umfassenden Antikörpervorläufers, umfassend das Aussetzen des Antikörpervorläufers gegenüber einer Protease, die auf einer festen Phase immobilisiert ist, so dass die Protease den Leucin-Zipper aus dem Antikörpervorläufer entfernt, wobei das Verfahren das Leiten des Antikörpers, aus dem der Leucin-Zipper entfernt worden ist, durch ein positiv geladenes Filter umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Protease Pepsin ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die feste Phase Kügelchen aus porösem Glasmaterial („Controlled Pore Glass”) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10 worin der Antikörper ein F(ab')₂ ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Leucin-Zipper GCN4 ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Antikörper CD18 bindet.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Antikörper HER2-, HER3- oder HER4-Rezeptor bindet.