PT998486E - ''recuperação de proteínas por cromatografia seguida de filtração numa camada carregada'' - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Recuperação de proteínas por cromatografia seguida de filtração numa camada carregada"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da invenção A presente invenção refere-se em geral à recuperação de proteínas. Em particular, refere-se à recuperação de um polipéptido, em que o polipéptido é exposto a um reagente imobilizado que se liga a, ou modifica o polipéptido.

Descrição da arte relacionada A purificação de proteínas em grande escala, económica, é cada vez mais um problema importante para a indústria biotecnológica. Em geral, as proteínas são produzidas por cultura de células, utilizando linhas celulares de mamífero ou bacterianas, manipuladas, para produzir a proteína de interesse por inserção de um plasmídeo recombinante que contém o gene para essa proteína. Uma vez que as linhas celulares utilizadas são organismos vivos, elas deverão ser alimentadas com um meio de crescimento complexo, contendo glíeidos, aminoácidos e factores de crescimento, normalmente fornecidos a partir de preparações de soro animal. A separação da proteína desejada da mistura de compostos alimentada às células e a partir dos produtos secundários das próprias células até uma pureza suficiente para ser utilizada como agente terapêutico humano constitui um desafio formidável (veja-se WO 93/11162 e EP127737A1).

Os procedimentos para purificação de proteínas a partir de detritos celulares dependem inicialmente do local de expressão da proteína. Pode-se fazer com que algumas proteínas sejam segregadas directamente pela célula para o meio de crescimento envolvente; outras são produzidas intracelularmente. Para estas últimas proteínas, o primeiro passo de um processo de purificação envolve a lise da célula, o que pode ser feito por uma variedade de métodos, incluindo 2 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ corte mecânico, choque osmótico ou tratamentos enzimáticos. Esta ruptura liberta todo o conteúdo da célula para o homogenato e adicionalmente produz fragmentos subcelulares que são dificeis de remover devido ao seu tamanho reduzido. Estes são geralmente removidos por centrifugação diferencial ou por filtração. 0 mesmo problema surge, embora numa escala menor, com proteínas segregadas directamente devido à morte natural de células e libertação de proteínas intracelulares de células hospedeiras ao longo do ciclo de produção da proteína.

Uma vez obtida uma solução clarificada contendo a proteína de interesse, tenta-se a sua separação a partir de outras proteínas produzidas pela célula normalmente utilizando uma combinação de diferentes técnicas cromatográficas. Estas técnicas separam misturas de proteínas com base na sua carga, grau de hidrofobicidade ou tamanho. Estão disponíveis várias resinas cromatográficas diferentes para cada uma destas técnicas, permitindo modelar de forma precisa o esquema de purificação à proteína particular envolvida. A essência de cada um destes métodos de separação é que as proteínas podem ser forçadas a mover-se a diferentes velocidades ao longo de uma coluna extensa, obtendo-se uma separação física que aumenta à medida que elas passam mais abaixo na coluna, ou a aderir selectivamente ao meio de separação sendo então diferencialmente eluídas por diferentes solventes. Nalguns casos, a proteína desejada é separada das impurezas quando as impurezas aderem especificamente à coluna e a proteína de interesse não, isto é, a proteína de interesse está presente na fracção não retida.

Como parte do processo de recuperação global da proteína, esta pode ser exposta a um reagente imobilizado que se liga a, ou modifica a proteína. Por exemplo, a proteína pode ser submetida a cromatográfia de afinidade em que um reagente imobilizado que se liga especificamente à proteína, tal como um anticorpo, captura o anticorpo e as impurezas passam através da coluna de cromatográfia de afinidade. A proteína pode ser subsequentemente eluída da coluna, alterando as condições de modo a que a proteína já não se ligue ao reagente imobilizado. O reagente imobilizado pode ser também uma enzima que modifica a proteína. Sahni et al., Anal. Biochem. 193:178- 3 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 185 (1991) e Voyksner et al., Anal. Biochem. 188:72-81 (1990) descrevem proteases imobilizadas.

Outro tipo de processo de purificação é a filtração. A filtração de contaminantes de tamanho de partícula fino a partir de fluidos tem sido realizada utilizando vários meios de filtração porosos, através dos quais é passada uma composição contaminada, de modo que o filtro retém o contaminante. A retenção do contaminante pode ocorrer por deformação mecânica ou captura de partículas electrocinética e adsorção. Na deformação mecânica, uma partícula é retida por aprisionamento físico quando tenta passar através de um poro menor do que ela própria. No caso de mecanismos de captura electrocinética, a partícula colide com uma superfície dentro do filtro poroso e é retida na superfície por forças atractivas de curto alcance. Para se obter uma captura electrocinética podem-se utilizar sistemas modificadores de carga para alterar as características de carga superficial de um filtro (veja-se, e.g., WO90/11814). Por exemplo, quando o contaminante a remover é aniónico, pode-se utilizar um modificador de carga catiónico para alterar as características de carga do filtro, de modo que o contaminante é retido pelo filtro. Há uma necessidade na arte de métodos melhorados para recuperar polipéptidos, em especial os polipéptidos produzidos por técnicas recombinantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, a invenção proporciona um método para recuperar um polipéptido, compreendendo: (a) expor uma composição que compreende um polipéptido a um reagente que se liga a, ou modifica o polipéptido, em que o reagente está imobilizado numa fase sólida e em seguida (b) passar a composição através de um filtro que possui uma carga que é oposta à carga do reagente na composição, de modo a remover o reagente lixiviado da composição. De preferência, as características de carga do polipéptido na composição no passo (b) são tais que o polipéptido passa através do filtro e de preferência o filtro é colocado em linha com a composição exposta ao reagente como no passo (a). Numa concretização da invenção, o polipéptido a tratar no passo (a) é um polipéptido precursor e o reagente 4 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ imobilizado é uma protease (e.g. pepsina) que remove um dominio precursor (e.g. um domínio de dimerização "fecho de correr" de leucinas) do polipéptido. A invenção também proporciona um método para recuperar um polipéptido, compreendendo remover um reagente lixiviado de uma composição que compreende o polipéptido e o reagente lixiviado, passando a composição através de um filtro que tem uma carga oposta à do reagente lixiviado, em que o reagente lixiviado foi previamente imobilizado num fase sólida.

Ainda noutra concretização, a invenção proporciona um método para modificar um anticorpo precursor compreendendo um domínio de dimerização "fecho de correr" de leucinas, compreendendo expor o anticorpo precursor a uma protease imobilizada numa fase sólida, de modo que a protease remove o "fecho de correr" de leucinas do anticorpo precursor. Este método compreende também opcionalmente passar o anticorpo isento de "fecho de correr" de leucinas através de um filtro carregado positivamente, colocado em linha com o anticorpo que foi exposto à protease imobilizada. 0 processo de purificação de anti-CDl8 é um exemplo de um processo em que é necessário um reagente imobilizado para remover um domínio de dimerização "fecho de correr" de leucinas do precursor do anticorpo anti-CDl8. 0 precursor de anticorpo é inicialmente purificado utilizando cromatografia de permuta catiónica ABX antes do domínio "fecho de correr" de leucinas ser removido por digestão com pepsina. A quantidade de pepsina necessária para remover completamente o "fecho de correr" de leucinas do precursor de anticorpo é considerável. É necessária uma razão de 1 mg de pepsina por 20 mg de anticorpo para realizar a digestão durante um período de tempo razoável. Um tratamento como este irá deixar uma grande quantidade de pepsina por remover nos passos restantes do processo de purificação de anti-CD18 (Figura 7). Verificou-se que a remoção rápida de pepsina é benéfica, uma vez que uma exposição excessiva à pepsina resultou na sobre-digestão do anticorpo anti-CDl8, com perda significativa do produto intacto. De modo a controlar eficazmente a quantidade de pepsina adicionada ao percursor de anticorpo anti-CDl8 e eliminar eficazmente quaisquer vestígios de pepsina que possam 5 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ persistir ao longo do processo de purificação, foram implementados dois métodos no processo de purificação do anticorpo anti-CDl8. Primeiro, para reduzir consideravelmente a quantidade de pepsina adicionada ao conjunto de percursor de anticorpo purificado ABX, imobilizou-se pepsina numa fase sólida (i.e. acoplou-se a pérolas de vidro de poro controlo (CPG) e empacotou-se numa coluna). A reacção de digestão foi então realizada fazendo fluir o conjunto de percursor de anticorpo através da coluna de pepsina-CPG. Este procedimento limitou a quantidade de pepsina adicionada ao conjunto de percursor de anticorpo. Apesar de tudo, foi identificado outro problema na medida em que se verificou que a pepsina era lixiviada a partir da fase sólida. Verificou-se que uma pequena quantidade de pepsina lixiviada a partir da fase sólida era suficiente para provocar a sobre-digestão do anticorpo anti-CDl8, resultando numa redução dos rendimentos de produto. Para ultrapassar este problema da lixiviação da pepsina a partir da fase sólida, colocou-se um filtro carregado positivamente em linha com o efluente da coluna de pepsina-CPG. Verificou-se que o filtro removia toda a pepsina lixiviada a partir da fase sólida, impedindo desse modo a sobre-digestão do percursor de anticorpo. A pepsina é uma proteína ácida com um pi baixo. Deste modo, a pH 4, o pH do passo de digestão, a pepsina permaneceu carregada negativamente e ligou-se fortemente ao filtro carregado positivamente. Verificou-se que a utilização de um filtro carregado em vez de uma resina para remover os produtos lixiviados era vantajosa, uma vez que os filtros são compactos e capazes de fluxos muito elevados, com uma retro-pressão minima. Pode-se implementar um filtro em linha sem a necessidade de realizar um passo de recuperação separado, reduzindo desse modo a complexidade e tempo do processo.

Prevê-se que se possam utilizar filtros carregados negativa e positivamente para resolver problemas associados com a lixiviação de reagentes anteriormente imobilizados, noutros processos de recuperação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras IA e 1B mostram a sequência de aminoácidos de cadeia pesada (Figura IA; SEQ ID N0:1) e cadeia leve (Figura 1B; SEQ ID NO: 2) de rhuMAb CD18. A sequência em 6 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ itálico na Figura ΙΑ (SEQ ID NO:3) é a do "fecho de correr" de leucinas.

As Figuras 2a e 2b mostram o anticorpo intacto (Ab) e uma variedade de fragmentos de anticorpo (F(ab')2> Fab', cadeia leve e Fd'). As cadeias pesadas são apresentadas em branco e as cadeias leves a riscado. As duas ligações dissulfureto que se formam entre duas cadeias pesadas são apresentadas como —ss —. A Figura 2b mostra a clivagem de pepsina do percursor de rhuMAb CD18, para se obter rhuMAb CD18, isento do "fecho de correr" de leucinas. A Figura 3 mostra a estrutura do plasmideo pS1130 utilizado para produzir rhuMAb CD18 do exemplo a seguir.

As Figuras 4A e 4B mostram a sequência completa da cassete de expressão de pS1130 (SEQ ID NO:5). A Figura 5 mostra a derivação da linha celular de produção 49A5. A Figura 6 é um esquema do processo de fermentação para rhuMAb CD18. A Figura 7 é um fluxograma que mostra os passos de purificação para rhuMAb CD18.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Definições:

Tal como aqui utilizado, "polipéptido" refere-se em geral a péptidos e proteínas com mais do que cerca de dez aminoácidos. De preferência, o polipéptido é uma proteína de mamífero, em que os exemplos incluem renina; uma hormona de crescimento, incluindo hormona de crescimento humana e hormona de crescimento bovina; factor libertador de hormona de crescimento, hormona paratiróide; hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró-insulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação, tais como o factor VIIIC, 7 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ factor IX, factor tecidular e factor de von Willebrand, factores anticoagulantes, tais como a proteína C; factor natriurético atrial, tensioactivos pulmonares; um activador de plasminogénio, tal como uroquinase, ou urina humana, ou activador de plasminogénio do tipo tecido (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético; factor alfa e beta de necrose de tumor; encefalinase; RANTES (regulado por activação, normalmente expresso e segregado em células T) ; proteína inflamatória de macrófagos humanos (MiP-l-alfa); uma albumina sérica, tal como albumina sérica humana; substância inibidora do sistema muelleriano; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró-relaxina; péptido associado a gonadotropina de ratinho; proteína microbiana, tal como beta-lactamase; ADNase; igE; antigénio associado a linfócitos τ citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; Proteína A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico, tal como factor neurotrófico derivado de ossos (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um factor de crescimento nervoso, tal como NGF-β; factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crescimento de fibroblastos, tal como aFGF e bFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF), tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΙ, TGF^2, TGF-p3, TGF-p4, ou TGF-p5; factor de crescimento I e II do tipo insulina (IGF-I e IGF-II): des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação ao factor de crescimento tipo insulina (IGFBP); proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina: factores osteoinductores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferão, tal como interferão-alfa, -beta e -gama; factores estimuladores de colónias (CSF), e.g., M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (IL), e.g., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas de membrana de superfície; factor de aceleração de decaimento; antigénio virai, tais como, por exemplo, uma porção do envelope de SIDA; proteínas de transporte: receptores de orientação específica; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas, tais como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antigénio associado a um tumor, tal como o receptor HER2, HER3 ou HER4 e fragmentos e/ou variantes de qualquer um dos polipéptidos acima enumerados. 8 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Uma "variante" ou "variante de sequência de aminoácidos" de um polipéptido de partida é um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos diferente da do polipéptido de partida. Em geral, uma variante irá possuir pelo menos 80% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência e muito preferencialmente pelo menos 98% de identidade de sequência com o polipéptido nativo. A percentagem de identidade de sequência é determinada, por exemplo, pela versão de Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1382-1386 (1983), do algoritmo descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), após alinhamento das sequências para se obter a homologia máxima. As variantes de sequência de aminoácidos de um polipéptido são preparadas introduzindo alterações de nucleótidos adequadas no ADN que codifica para o polipéptido, ou por sintese de péptidos. Estas variantes incluem, por exemplo, eliminações e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos do polipéptido de interesse. Faz-se qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-tradução do polipéptido, tal como alterar o número ou posição dos locais de glicosilação. Os métodos para produzir variantes de sequência de aminoácidos de polipéptidos estão descritos na Pat US 5534615.

Em concretizações preferidas da invenção, o polipéptido é um polipéptido recombinante. Um "polipéptido recombinante" é um que foi produzido numa célula hospedeira que foi transformada ou transfectada com um ácido nucleico que codifica para o polipéptido, ou produz o polipéptido como resultado de recombinação homóloga. "Transformação" e "transfecção" são utilizadas de forma indiferente para designar o processo de introduzir ácidos nucleicos numa célula. Após transformação ou transfecção, o ácido nucleico pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, ou pode existir como um elemento extracromossómico. A "célula hospedeira" inclui uma célula na cultura de células in vitro, bem como uma célula num animal hospedeiro. Os métodos para a 9 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ produção recombinante de polipéptidos estão descritos na patente US 5534615.

Um "polipéptido precursor" é aqui um polipéptido ao qual se fundem um ou mais domínios precursores, e.g. em que o domínio precursor é parte de uma cadeia polipeptídica do polipéptido, ou está liqado de forma covalente ao polipéptido por um ligante químico, por exemplo. 0 "domínio precursor" pode ser um resíduo de aminoácido ou polipéptido. Por exemplo, o domínio percursor pode ser um domínio de dimerização, tal como um "fecho de correr" de leucinas, uma sequência de aminoácidos, tal como poli(ácido glutâmico) que possui uma carga negativa e outra sequência de aminoácidos, tal como polilisina que possui uma carga positiva, ou um feixe de hélices peptídicas que compreende uma hélice, uma volta e outra hélice; um marcador epitópico útil, e.g. na purificação do polipéptido de interesse; um resíduo de aminoácido ou péptido no terminal amino ou carboxilo do polipéptido que se pretende remover, para criar uma preparação de polipéptidos homogénea; uma metionina N-terminal, um artefacto de produção do polipéptido na cultura de células recombinante; um domínio pre, pro ou prepro de um polipéptido maduro (e.g. o domínio pro de protrombina, em que a remoção do domínio pro produz a molécula de trombina madura, biologicamente activa); um polipéptido de polilisina; uma enzima, tal como glutationa transferase; ou a região Fc de um anticorpo intacto que é removido para produzir um F(ab')2·

Um polipéptido "marcador epitópico" tem resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual se pode produzir um anticorpo, mas é suficientemente curto para não interferir com a actividade do polipéptido ao qual está fundido. 0 marcador epitópico é de preferência suficientemente único para que o anticorpo contra ele não tenha substancialmente nenhuma reacção cruzada com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores epitópicos adequados têm geralmente 6 resíduos de aminoácido e normalmente entre 8-50 resíduos de aminoácido (de preferência entre cerca de 9-30 resíduos). Exemplos incluem o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 (Field et al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)); o marcador c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 contra ele (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 10 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 5(12):3610-3616 (1985)); e ο marcador de glicoproteína D (gD) do vírus de Herpes simples e o seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de tamanho total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g., anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, desde que exibam a actividade biológica desejada. O anticorpo é dirigido contra um "antigénio" de interesse. De preferência, o antigénio é um polipéptido biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mamífero que sofre de uma doença ou distúrbio pode resultar num benefício terapêutico para esse mamífero. No entanto, os anticorpos dirigidos contra antigénios não polipeptídicos (tais como antigénios de glicolípidos associados a tumores; veja-se a patente US 5091178) também são contemplados. Quando o antigénio é um polipéptido, este pode ser uma molécula transmembranar (e.g. receptor) ou ligando, tal como um factor de crescimento. Exemplos de antigénios incluem os polipéptidos discutidos acima. Os alvos moleculares preferidos para os anticorpos abrangidos pela presente invenção incluem polipéptidos CD, tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptores de ErbB, tais como o receptor de EGF, HER2, HER3 ou HER4, moléculas de adesão celular, tais como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina αν/β3 incluindo qualquer das suas subunidades α ou β (e.g. anticorpos anti-GDlla, anti-CDl8 ou anti-CDllb): factores de crescimento, tais como VEGF; IgE; antigénios do grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidade (OB), receptor mpl, CTLA-4; polipéptido C, etc. Os antigénios solúveis ou seus fragmentos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser utilizados como imunogénios para produzir anticorpos. Para moléculas transmembranares, tais como receptores, podem-se utilizar fragmentos destas (e.g. o domínio extracelular de um receptor) como imunogénio.

Alternativamente, podem-se utilizar como imunogénio as células que expressam a molécula transmembranar. Estas células podem ser derivadas de uma fonte natural (e.g. linhas celulares de cancro) ou podem ser células que foram transformadas por 11 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar.

O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos, excepto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente, que poderão estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. 0 adjectivo "monoclonal" indica que o anticorpo é obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não deve ser entendido que é necessário produzir o anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma, pela primeira vez descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (veja-se, e.g., Patente U.S. N.° 4816567). Noutra concretização, os "anticorpos monoclonais" podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos sobre fagos, produzidas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murídeo e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. As publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de afinidade elevada (gama nM) por ligação aleatória de cadeias ("Chain shuffling") (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como por infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridomas de anticorpos monoclonais para o isolamento de anticorpos monoclonais. Alternativamente, é agora possível produzir animais transgénicos (e.g., ratinhos) que são capazes, por 12 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulinas. Por exemplo, foi descrito que a eliminação homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada do anticorpo (Jh) em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinativa, resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana nestes ratinhos mutantes de linha germinativa irá resultar na produção de anticorpos humanos, aquando da provocação com antigénios. Veja-se, e.g.,

Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature. 362:255-258 (1993); Bruggemann et al.; Year in Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992).

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular, ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie, ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (patente U.S. N.° 4816567; e Morrison et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)). 0 termo "região hipervariável" quando aqui utilizado, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende residuos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (i.e. residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no dominio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no dominio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of immunological interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os residuos de uma "laçada hipervariável" (i.e. residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no dominio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no dominio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk j. Mol. Biol. 196:901-917 13 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ (1987)). Resíduos de "esqueleto" ou estruturais, ou "FR", são os resíduos de domínio variável que não os resíduos da região hipervariável, como aqui definido. Os resíduos de CDR e de FR do anticorpo H52 do exemplo a seguir estão identificados em Eigenbrot et al. Polypeptides: Structure, Function and

Genetics, 18:49-62 (1994).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., de murídeo) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que os resíduos de uma região hipervariável do recebedor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador), tal como de ratinho, rato, coelho ou primata não humano, tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região de esqueleto (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis em que todas, ou substancialmente todas, as laçadas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado irá também compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. A escolha de domínios variáveis humanos, quer leves, quer pesados, para utilizar na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o designado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra a biblioteca completa de sequências de domínio variável humanas, conhecidas. A sequência humana que é mais próxima da do roedor é então aceite como sequência esqueleto humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro 14 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ método utiliza uma sequência esqueleto particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma sequência esqueleto pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol 151:2623 (1993)) . É também importante que os anticorpos sejam humanizados mantendo uma afinidade elevada para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se obter este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências mãe e vários produtos humanizados conceptuais, utilizando modelos tridimensionais das sequências mãe e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais estão normalmente disponíveis e são familiares para os peritos na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e representam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas, seleccionadas. A inspecção destas representações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antigénio. Deste modo, os resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir de sequências do recebedor e importadas de modo a que a característica do anticorpo desejada, tal como uma maior afinidade para o(s) antigénio(s) alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR estão directa e muito substancialmente envolvidos na influência à ligação ao antigénio.

Numa concretização preferida da invenção, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que é de preferência humano ou humanizado (veja-se acima a discussão referente a anticorpos humanizados).

Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a sua região variável ou de ligação ao antigénio. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; 15 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por digestão proteolitica de anticorpos intactos (veja-se, e.g., Morimoto et ai., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, podem-se isolar fragmentos de anticorpo a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados directamente de E. colí e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Noutra concretização, como descrito no Exemplo a seguir, o F(ab')2 é formado utilizando o "fecho de correr" de leucinas GCN4 para promover a organização da molécula F(ab')2· De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir da cultura de células hospedeiras. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o perito na arte. Noutras concretizações, o anticorpo de eleição é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Veja-se WO 93/16185.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "sFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Em geral, o polipéptido Fv compreende também um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão sobre sFv veja-se Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequenos com dois locais de ligação ao antigénio, os quais compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL) . Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os 16 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos estão descritos em maior detalhe, por exemplo, em EP404097; WO 93/11161; e Holliger et âl., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993). A expressão "anticorpos lineares" quando utilizada ao longo deste pedido refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al. Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos de Fd organizados sequencialmente (Vh-Ch1-Vh-Ch1 ) que formam um par de regiões de ligação ao antigénio. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Os "anticorpos multiespecíficos" têm especificidades de ligação para com pelo menos dois epítopos diferentes, sendo os epítopos normalmente de diferentes antigénios. Apesar destas moléculas normalmente se ligarem apenas a dois antigénios (i.e. anticorpos biespecíficos, BsAb), os anticorpos com especificidades adicionais, tais como anticorpos triespecíficos, estão incluídos nesta expressão quando aqui utilizada. Exemplos de BsAb incluem os que têm um braço dirigido contra um antigénio de célula tumoral e o outro braço dirigido contra uma molécula desencadeadora citotóxica, tal como anti-FcYRl/anti-CD15, anti-pl85HER2/FcYRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma celular renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (anti-carcinoma do cólon), anti-CD3/anti-análogo da hormona estimuladora de melanócitos, anti-receptor de EGF /anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CDl9, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adesão de células neurais (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de ligação a folato (FBP)/anti-CD3, anti-antigénio associado ao carcinoma pan (AMOC-31)/anti-CD3: BsAb com um braço que se liga especificamente a um antigénio de tumor e um braço que se liga a uma toxina, tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadeia A de ricina, anti-interferão-a (IFN-a)/anti-idiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcalóide de vinca, BsAb para converter prodrogas activadas por enzimas, tal como anti-CD30/anti-fosfatase alcalina (que catalisa a conversão da prodroga fosfato de mitomicina em álcool de 17 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ mitomicina); BsAb que podem ser utilizados como agentes fibrinolíticos, tal como anti-fibrina/anti-activador de plasminogénio tecidular (tPA), anti-fibrina/anti-activador de plasminogénio do tipo uroquinase (uPA); BsAb para direccionar complexos imunitários para receptores de superfície celular, tais como anti-lipoproteína de baixa densidade (LDL)/anti-receptor de Fc (e.g. FcyRI, FcyRll ou FcyRIII); BsAb para utilização em terapia de doenças infecciosas, tais como anti-CD3/anti-vírus de herpes simples (HSV), anti-receptor de células T: complexo CD3/anti-influenza, anti-FcyR/anti-VIH; BsAb para detecção de tumores in vitro ou in vivo, tal como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAb como adjuvantes de vacinas; e BsAb como ferramentas de diagnóstico, tal como anti-lgG de coelho/anti-ferritina, anti-peroxidase de rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-substância P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-p-galactosidase. Exemplos de anticorpos triespecíficos incluem anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/anti-C08/anti-CD37. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de tamanho total ou fragmentos de anticorpo (e.g. anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de tamanho total baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Milstein et al., Nature. 305:537-539 (1983)). Devido ao sortido ao acaso de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é normalmente realizada por passos de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos de produto são baixos. Estão descritos procedimentos semelhantes na WO 93/08829, e em Traunecker et al., EMBOJ., 10:3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são 18 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é de preferência com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. É preferido que a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve esteja presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam para as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto permite uma grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido em concretizações em que razões desiguais das três cadeias de polipéptido utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. No entanto, é possível inserir as sequências codificantes para duas ou todas as três cadeias de polipéptido num vector de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptido em razões iguais resulta em rendimentos elevados, ou quando as razões não têm um significado particular.

Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, híbrido (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações indesejadas de cadeias de imunoglobulina, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem está descrita em WO 94/04690. Para mais detalhes sobre a produção de anticorpos biespecíficos veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita em WO96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste 19 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácido pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (e.g. tirosina ou triptofano). Criaram-se "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo, substituindo as cadeias laterais de aminoácido grandes por outras menores (e.g. alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecificos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Estes anticorpos foram, por exemplo, propostos para dirigir células do sistema imunitário contra células indesejadas (patente US N.° 4676980) e para o tratamento da infecção por VIH (WO 91/00360, WO 92/20373 e EP 03089) . Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na arte e estão descritos na patente US N.° 4676980, juntamente com um número de técnicas de reticulação. Técnicas para gerar anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo também foram descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecificos podem ser preparados utilizando ligação quimica. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para produzir fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e prevenir a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' produzidos são em seguida convertidos em derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é em seguida reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB, para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. 20 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ Ο progresso recente facilitou a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecifico totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' foi segregado separadamente a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico directo in vitro, para formar o anticorpo biespecifico.

Também foram descritas várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecificos directamente a partir da cultura de células recombinantes. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecificos utilizando "fechos de correr" de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os péptidos "fecho de correr" de leucinas das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e em seguida re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Deste modo, os domínios VH e Vl de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando desse modo dois locais de ligação ao antigénio. Também foi referida outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecificos utilizando dímeros Fv de cadeia simples (sFv). Veja-se Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem-se preparar anticorpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Por "recuperar um polipéptido" entenda-se obter uma preparação de polipéptido a partir de uma "preparação pré- 21 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ recuperação", purificando a preparação pré-recuperação (ver a seguir), ou modificando um polipéptido precursor para produzir uma forma do polipéptido que é isenta do dominio precursor.

Por "purificar" uma composição compreendendo um polipéptido e um ou mais contaminantes, entende-se aumentar o grau de pureza do polipéptido na composição removendo (completa ou parcialmente) pelo menos um contaminante da composição. Um "passo de purificação" pode ser parte de um processo de purificação global, resultando numa composição "essencialmente pura" que é utilizada aqui para designar uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% em peso do polipéptido de interesse, com base no peso total da composição, de preferência pelo menos cerca de 95% em peso. "Essencialmente homogéneo" refere-se aqui a uma composição que compreende pelo menos cerca de 99% em peso do polipéptido de interesse, com base no peso total da composição. "Reagente" de interesse é aqui um composto ou composição (de preferência um polipéptido) que é capaz de se ligar a e/ou modificar um polipéptido de interesse. Um reagente "lixiviado" é um reagente que se libertou da fase sólida. O reagente pode, por exemplo, ligar-se ao polipéptido, tal como é o caso para "reagentes de captura" utilizados em métodos de purificação por afinidade. Exemplos destes "reagentes de captura" incluem proteína A, ou proteína G, para capturar polipéptidos tais como anticorpos e imunoadesinas; anticorpos que podem ser utilizados para purificação por afinidade de polipéptidos; um domínio de ligação ao ligando de um receptor para capturar um ligando; um domínio de ligação ao receptor para capturar um receptor ou uma proteína de ligação de um seu fragmento (e.g. IGFBP tal como IGFBP-3 e proteínas de ligação à hormona de crescimento (GHBP)); e imunoadesinas. Alternativamente, ou adicionalmente, o reagente pode modificar o polipéptido de interesse. Por exemplo, o reagente pode alterar química ou fisicamente o polipéptido. Por "alteração química" entende-se a modificação do polipéptido, e.g., por formação de ligações ou clivagem, resultando numa nova entidade química. Por "alteração física" entendem-se alterações na estrutura de ordem mais elevada do polipéptido. As enzimas são exemplos de reagentes que podem modificar química e/ou fisicamente o polipéptido. A enzima preferida é uma protease (e.g. para 22 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ remover um ou mais domínios precursores de um polipéptido precursor). Uma "protease" é uma enzima que pode hidrolisar um polipéptido. Exemplos de proteases incluem pepsina, catepsina, tripsina, papaína, elastase, carboxipeptidases, aminopeptidases, subtilisina, quimotripsina, termolisina, protease Vg, prolinase e outras endo- ou exopeptidases.

Por "fase sólida" entenda-se uma matriz não aquosa à qual um reagente pode aderir. A fase sólida pode ser uma coluna de purificação, uma fase descontínua de partículas discretas, uma membrana ou filtro. Exemplos de materiais para formar a fase sólida incluem polissacáridos (tais como agarose e celulose); e outras matrizes mecanicamente estáveis, tais como sílica (e.g. vidro de poro controlado), poli(estirenodivinil)benzeno, poliacrilamida, partículas de cerâmica e derivados de qualquer um dos acima. Em concretizações preferidas, a fase sólida compreende pérolas de vidro de poro controlado retidas numa coluna. Nalgumas concretizações, a fase sólida é revestida com um reagente (tal como glicerol) que se destina a prevenir a aderência não específica de contaminantes à fase sólida. 0 reagente discutido acima pode ser "imobilizado" sobre, ou na fase sólida formando uma ligação covalente entre um grupo funcional do reagente e um grupo reactivo na superfície da fase sólida. Noutras concretizações, o reagente é "imobilizado" na fase sólida por adsorção e ligação iónica, ou pode ser aprisionado na fase sólida, e.g., dentro de células ou polímeros do tipo rede, ou microcápsulas (veja-se Holenberg e Roberts in Enzymes as Drugs John Wiley & Sons NY (1981), páginas 396-411). 0 reagente deve reter essencialmente a sua capacidade para se ligar a e/ou modificar o polipéptido de interesse, uma vez imobilizado na fase sólida. A imobilização do reagente pode ser conseguida por activação da matriz. Em resumo, isto geralmente envolve activar primeiro a fase sólida por uma reacção química específica, dependendo da química de superfície e em seguida imobilizar o reagente combinando-o com a fase sólida activada. A activação da fase sólida pode envolver a activação de grupos hidroxilo (e.g. activação de brometo de cianogénio da fase sólida); grupos carboxilo (e.g. utilizando N-hidroxibenzotriazole na presença de uma carbodiimida solúvel em água); acilo hidrazida (utilizando, e.g., gluteraldeído para produzir grupos aldeído); aminas 23 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ (utilizando, e.g., ácido nitroso, fosgénio e tiofosgénio, ou brometo de cianogénio); ou acrilonitrilo. Noutra concretização, o reagente pode ser imobilizado utilizando um agente de reticulação (i.e. o reagente é imobilizado indirectamente na fase sólida) tal como reticuladores de comprimento zero (e.g. carbodiimida, reagente K de Woodward, cloroformatos e carbonildiimidazole); reticuladores homobifuncionais (e.g. gluteraldeido, cloroformatos e carbonildiimidazole, halogenetos heterocíclicos, divinilsulfona, quinonas e iões de metais de transição); reticuladores heterobifuncionais, incluindo, por exemplo, halogeneto de mono-halogenoacetilo, epicloro-hidrina, bem como reagentes dirigidos para grupos amino e tiol. Ainda noutra concretização, o reagente é reticulado com a fase sólida através de uma cadeia de hidrato de carbono. Para se obter isso, as porções de glicido podem ser primeiro oxidadas em aldeídos que formam bases de Schiff, quer com etilenodiamina, quer gliciltirosina. Pode-se utilizar boro-hidreto de sódio para estabilizar as ligações. A glicoproteína derivatizada é imobilizada na fase sólida. Para revisão de técnicas de imobilização, veja-se Wong, S. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking CRC Press Inc., Boston (1991).

Um "fecho de correr de leucinas" é um péptido (muitas vezes com cerca de 20-40 resíduos de comprimento) tendo vários aminoácidos repetidos, em que cada sétimo aminoácido é um resíduo de leucina. Estas sequências de "fecho de correr" de leucina formam hélices-α anfipáticas com os resíduos de leucina alinhados do lado hidrófobo para a formação de dímeros. Os "fechos de correr" de leucinas podem ter a fórmula estrutural geral conhecida como hepta-repetição (Leucina-Xi-X2-X3, -X4-X5-X6; SEQ ID NO:4)n, em que X podem ser qualquer dos 20 aminoácidos convencionais, mas mais provavelmente aminoácidos com um potencial de formar hélices-α apertadas, por exemplo, alanina, valina, ácido aspártico, ácido glutâmico e lisina, e n pode ser três ou mais, embora tipicamente n seja 4 ou 5. Exemplos de "fechos de correr" de leucinas incluem aqui o "fecho de correr" de leucinas Fos-Jun (0'Shea et al. Science 245:646 (1989)) que pode ser utilizado para formar heterodímeros (e.g. anticorpos biespecíficos); o "fecho de correr" de leucinas GCN4 de levedura (Landschutz et al. Science 240:1759-1764 (1988)) que pode ser utilizado para 24 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ formar homodímeros (e.g. anticorpos monoespecíficos, tal como no exemplo adiante); e "fechos de correr" de leucinas encontrados noutras proteínas de ligação ao ADN, tais como C/ebp e c-myc, bem como variantes de qualquer um destes. O termo "filtro" quando aqui utilizado, refere-se a um meio de filtro poroso através do qual pode passar uma fase aquosa, mas que retém um ou mais contaminantes. 0 filtro pode ser formado a partir de uma variedade de materiais, tais como fibras de celulose, incluindo, e.g. acetato de celulose (adsorventes de membrana SARTOBIND™ da Sartorius); partículas baseadas em sílica; elementos de filtro fibrosos e de partículas; membranas de nylon, ou qualquer combinação destes. 0 filtro de interesse é aqui um "filtro carregado" (i.e. carregado positiva ou negativamente), o que significa que tem uma carga positiva global, ou uma carga negativa global. Isto pode ser conseguido, por exemplo, ligando "grupos modificadores de carga" ao filtro. Os modificadores de carga aniónicos incluem polímeros solúveis em água com grupos funcionais aniónicos, tais como grupos carboxilo, fosforoso, fosfónico, sulfónico (patente US N.° 4604208). Os modificadores de carga catiónicos incluem colóide catiónico de melamina e formaldeído (patente US N.° 4007113), sílica coloidal catiónica inorgânica (patente US N.° 4305782), resina catiónica de poliamido-poliamina epicloro-hidrina, poliamina epicloro-hidrina. O filtro é de preferência um que permite fluxos elevados, sem sacrificar a capacidade de ligação (em oposição às colunas baseadas em pérolas, por exemplo). São contempladas várias configurações do filtro, tais como módulos multicamada e arranjos em espiral.

Um "tampão" é uma solução que resiste a alterações de pH por acção dos seus componentes ácido-base conjugados. Um "tampão de equilíbrio" é o utilizado para preparar uma fase sólida para carregar o polipéptido de interesse. O "tampão de carga" é um que é utilizado para carregar a composição compreendendo o polipéptido e contaminantes na fase sólida. Muitas vezes, os tampões de equilíbrio e de carga são os mesmos. O "tampão de eluição" é utilizado para eluir o polipéptido a partir da fase sólida. 25 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Tal como aqui utilizado, o termo "imunoadesina" designa moléculas do tipo anticorpo que combinam o "domínio de ligação" de um polipéptido "adesina" heterólogo (e.g. um receptor, ligando ou enzima) com as funções efectoras de um domínio constante de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da sequência de aminoácidos de adesina com a especificidade de ligação desejada, que é diferente do local de reconhecimento e ligação ao antigénio (local de combinação com o antigénio) de um anticorpo (i.e. é "heterólogo") e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina é de preferência derivada das cadeias pesadas γΐ, y2, ou γ4, uma vez que as imunoadesinas compreendendo estas regiões podem ser purificadas por cromatografia de proteína A (Lindmark et al., J. lmmunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 0 termo "domínio de ligação ao ligando", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer receptor de superfície celular nativo, ou qualquer sua região ou derivado retendo pelo menos uma ligação ao ligando qualitativa de um receptor nativo correspondente. Numa concretização específica, o receptor é de um polipéptido de superfície celular com um domínio extracelular, que é homólogo a um membro da superfamília de genes de imunoglobulina. Outros receptores que não são membros da superfamília de genes de imunoglobulina mas são, apesar de tudo, especificamente abrangidos por esta definição, são receptores para citóquinas e, em particular, receptores com actividade de tirosina quinase (tirosina quinases receptoras), membros das superfamílias de receptores de hematopoietina e factor de crescimento nervoso e moléculas de adesão celular, e.g. selectinas (-E, -L e -P). 0 termo "domínio de ligação ao receptor" é utilizado para designar qualquer ligando nativo para um receptor, incluindo moléculas de adesão celular, ou qualquer região ou derivado deste ligando nativo, retendo pelo menos uma capacidade de ligação ao receptor qualitativa de um ligando nativo correspondente. Esta definição, entre outras, inclui especificamente sequências de ligação de ligandos para os receptores acima referidos. 26 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Modos de realizar a invenção A invenção proporciona um método para modificar um polipéptido e/ou purificar um polipéptido a partir de uma composição que compreende o polipéptido e um ou mais contaminantes. A composição é geralmente uma que resulta da produção recombinante do polipéptido, mas pode ser uma que resulta da produção do polipéptido por sintese de péptidos (ou outro meio sintético) ou o polipéptido pode ser purificado a partir de uma fonte nativa do polipéptido. De preferência, o polipéptido é um anticorpo, e.g. um que se liga ao antigénio CD18 .

Para a produção recombinante do polipéptido, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN), ou para expressão. 0 ADN que codifica para o polipéptido é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., quando o polipéptido é um anticorpo, utilizando sondas oligonucleotidicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam para as cadeias pesada e leve do anticorpo) . Estão disponíveis muitos vectores. Os componentes do vector geralmente incluem, mas não se lhes limitam, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição (e.g. como descrito na patente US 5534615) .

As células hospedeiras aqui adequadas para clonagem ou expressão do ADN em vectores são as células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores acima descritas. Os procariotas adequados para este fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41 P descrito na DD 266,710 publicada em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é o E. coli 294 (ATCC 31, 446), 27 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ embora sejam adequadas outras estirpes, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31, 537) e E. coli W3110 (ATCC 27, 325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos.

Além dos procariotas, os micróbios eucariotas, tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam para polipéptidos. A Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padeiro vulgar, é a mais usualmente utilizada entre microorganismos hospedeiros eucariotas. No entanto, vários outros géneros, espécies e estirpes estão normalmente disponíveis e são úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K. marxianus; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234);

Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos, tais como, e.g., hospedeiros Neurospora, Penicillium, Tolypociadium e Aspergillus, tal como A. nidulans e A. niger. Células hospedeiras adequadas para a expressão do polipéptido glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insectos. Foram identificadas várias estirpes e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insecto permissivas, correspondentes, de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti ('mosquitoj, Aedes albopictus ('mosquitoj, Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Está disponível ao público uma variedade de estirpes virais para transfecção, e.g., a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e estes vírus podem ser utilizados aqui de acordo com a presente invenção, em particular para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiros.

No entanto, tem havido um maior interesse em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura 28 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares de mamífero úteis são a linha CVl de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather,

Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CVl ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de figado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de figado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção de polipéptidos e cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados como adequado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os promotores indutores de genes, seleccionar transformantes, ou amplificar os genes que codificam para as sequências desejadas.

As células hospedeiras utilizadas para produzir o polipéptido da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios disponíveis comercialmente, tais como F10 de Ham (Sigma), meio mínimo essencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes U.S. Nos 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; ou 5122469; WO 90103430; WO 87/00195; ou patente U.S. Re. 30985 podem ser utilizados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado como necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou 29 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como a droga GENTAMYCIN”), elementos vestigiários (definido como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose, ou uma fonte de energia equivalente. Podem-se também incluir quaisquer outros suplementos necessários em concentrações adequadas que serão conhecidas dos peritos na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para o perito na arte.

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o polipéptido pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou pode ser directamente segregado para o meio. Se o polipéptido é produzido intacelularmente, como um primeiro passo, os detritos em partículas, quer células hospedeiras, quer células lisadas (e.g. resultantes de homogeneização), são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Quando o polipéptido é segregado para o meio, os sobrenadantes destes sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. 0 polipéptido é então submetido a um ou mais passos de purificação. Exemplos de procedimentos de purificação incluem fraccionamento numa coluna de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrófoba (e.g. em fenil-Sepharose), precipitação com etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina-Sepharose™, cromatografia de permuta aniónica, cromatografia de permuta catiónica (e.g. numa coluna Bakerbond ABX ou coluna SP-Sepharose HP), cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amónio, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade (e.g. utilizando proteína A, proteína G, um anticorpo, um substrato, ligando ou antigénio específico, como reagente de captura). 30 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Numa concretização da invenção, o passo de recuperação envolve expor uma composição compreendendo o polipéptido (e opcionalmente um ou mais contaminantes) a uma fase sólida na qual está imobilizado um reagente que se liga a, ou modifica o polipéptido. Este passo pode ser no inicio ou no final, ou em qualquer altura numa sequência de passos de recuperação para o polipéptido. Numa concretização, a fase sólida é empacotada numa coluna e o reagente imobilizado captura o polipéptido. Noutra concretização, o reagente modifica química e/ou fisicamente o polipéptido e está imobilizado na fase sólida, que é, e.g., empacotada numa coluna e a composição é passada através da coluna. Por exemplo, o polipéptido pode compreender um domínio precursor que o reagente imobilizado remove como parte do processo de recuperação. No exemplo a seguir, o polipéptido precursor era um anticorpo com um domínio de dimerização "fecho de correr" de leucinas que foi removido por pepsina imobilizada no processo de recuperação. A seguir a este passo, a fase sólida (e.g. cromatografia em coluna) pode ser regenerada utilizando técnicas aplicáveis para regenerar esta fase sólida.

Verificou-se aqui que pode ocorrer lixiviação do reagente imobilizado a partir da fase sólida e isto pode resultar em rendimentos reduzidos e/ou contaminação da preparação de polipéptido a seguir a este passo. Em particular, no exemplo a seguir, verificou-se que a pepsina podia lixiviar a partir de uma coluna à qual foi imobilizada e resultar na digestão do anticorpo após remoção do "fecho de correr" de leucinas, reduzindo desse modo os rendimentos de anticorpo funcional.

De modo a obviar este problema, a invenção proporciona um passo após exposição da composição ao reagente imobilizado, como discutido acima. Este envolve passar a composição compreendendo o polipéptido e reagente lixiviado (e opcionalmente um ou mais outros contaminantes) através de um filtro que possui uma carga que é oposta à carga do reagente, ao pH da composição, de modo a remover o reagente lixiviado da composição. O filtro pode ser carregado positivamente para remover contaminantes que estão carregados negativamente ao pH da composição, tais como proteases ácidas, proteína A, proteína G ou outros reagentes que podem lixiviar a partir das colunas de afinidade. Alternativamente, o filtro pode ser 31 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ carregado negativamente para remover contaminantes que estão carregados positivamente ao pH da composição, tais como proteases básicas. De preferência, as caracteristicas de carga do polipéptido de interesse na composição passada através do filtro são tais que o polipéptido não é significativamente retido pelo filtro e passa através dele. A capacidade do reagente lixiviado se ligar ao filtro e do polipéptido passar através dele varia, dependendo do pH da composição que passa através do filtro. Para determinar qual o filtro a utilizar (í.e. filtro carregado positiva ou negativamente), pode-se analisar o pi do reagente lixiviado e, opcionalmente, o pi do polipéptido exposto ao reagente imobilizado, como discutido acima. Numa concretização, (e.g. como no exemplo a seguir), o pH da composição será tal que o reagente lixiviado e polipéptido já têm cargas globais opostas. Noutra concretização, pode ser benéfico ajustar o pH da composição a ser passada através do filtro carregado, de modo a que o reagente lixiviado e o polipéptido tenham cargas opostas. Esta alteração do pH da composição pode servir para aumentar a ligação de contaminantes com carga oposta ao filtro e/ou diminuir a ligação do polipéptido de interesse ao filtro. Outras modificações da composição para se obter o mesmo efeito são aqui equacionadas. Após quaisquer modificações opcionais da composição, pode-se seleccionar um filtro que tem uma carga oposta à do reagente lixiviado a ser removido da composição.

Numa concretização preferida da invenção, o filtro é colocado "em linha" com o efluente tratado como no passo anterior fi.e. o efluente flui directamente através do filtro). Isto pode ser obtido ligando o filtro directamente à porta de efluente da coluna, antes do efluente ser recolhido num tanque. O filtro pode ser regenerado utilizando técnicas aplicáveis ao tipo de filtro utilizado. A preparação de polipéptido pode ser submetida a purificação adicional, se necessário. Exemplos de outros passos de purificação foram discutidos acima. 0 polipéptido assim recuperado pode ser formulado num transportador farmaceuticamente aceitável e é utilizado para várias utilizações de diagnóstico, terapêuticas, ou outras, conhecidas para estas moléculas. 32 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Os exemplos seguintes são dados a título ilustrativo e não limitativo.

EXEMPLO

Este exemplo refere-se a um anticorpo (rhuMAb CD18) produzido como um polipéptido precursor com um domínio "fecho de correr" de leucinas que é removido durante o processo de purificação da presente invenção. Criou-se o anticorpo anti-CD18 humanizado, recombinante (rhuMAb CD18) com a sequência de aminoácidos apresentada na Figura IA (cadeia pesada; SEQ ID N0:1) e Figura 1B (cadeia leve; SEQ ID NO:2) por humanização do anticorpo monoclonal de murídeo muMAb H52 (Hildreth et al. J. Immunology 134:3272-3280 (1985)).

Produção recombinante de rhuMAb CD18: O plasmídeo pS1130 foi construído para dirigir a produção da molécula precursora de rhuMAb CD18 em E. coli. O precursor é clivado durante o processo de purificação pela protease pepsina para se obter rhuMAb CD18. O rhuMAb CD18 é uma molécula F(ab')2 composta por 2 péptidos diferentes (cadeias leve e pesada) ligados por ligações dissulfureto. A região Fc de anticorpos intactos normalmente mantém os dois braços Fab juntos (Figura 2A), pelo que quando o Fab' é produzido em E. coli forma-se muito pouco F(ab')2. A fusão de um domínio de dimerização "fecho de correr" de leucinas GCN4 de levedura no terminal-C de um Fab' substitui a região Fc e permite a produção eficaz de F(ab')2 em E. coli. Os domínios "fecho de correr" de leucinas GCN4 interagem para formar estruturas diméricas estáveis (espirais enroladas em paralelo) que mantêm unidos os resíduos de cisteína da região de charneira de duas cadeias pesadas, de modo a que se possam formar as duas ligações dissulfureto intercadeia, nativas. Isto resulta na formação de complexos F(ab')2 que estão ligados de forma covalente por ligações dissulfureto. Os domínios "fecho de correr" de leucinas são mais tarde removidos do precursor de rhuMAb CD18 durante o processo de purificação, utilizando a protease pepsina que cliva uniformemente entre os 2 resíduos de leucina da charneira. Isto resulta na formação da molécula rhuMAb CD18 F(ab')2 (Figura 2B). O plasmídeo pSH30 (Figura 3) baseia-se no plasmídeo bem caracterizado pBR322 que tem uma cassete de expressão de 33 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 2143 pb (Figura 4) inserida no local de restrição de EcoRI. O plasmideo pS1130 é resistente aos antibióticos tetraciclina, e β-lactama. A cassete de expressão contém uma cópia única de cada gene ligadas em tandem. A transcrição de cada gene num ARNm dicistrónico único é dirigida pelo promotor phoA de E. coli (Chang et al. Gene 44:121-125 (1986)) e termina no terminador t0 do fago lambda (Scholtissek e Grosse Nucleic Acids Research 15:3185 (1987)). Os sinais de iniciação da tradução para cada cadeia são proporcionados por sequências de Shine-Dalgarno de STII (enterotoxina estável ao calor) de E. coli (Picken et al. Infection and Immunity 42:269-275 (1983)). A tradução de cada cadeia começa com um péptido sinal de STII de 23 resíduos que dirige a translocação dos péptidos através da membrana citoplasmática, para o espaço periplasmático (SEQ ID NO: 6 e 7). 0 péptido de sinal de STII é em seguida removido pela peptidase de comando de E. coli. As cadeias leve e pesada enrolam-se nas suas conformações nativas após secreção para o periplasma e associam-se no precursor de rhuMAb CD18, um F(ab')2 ligado de forma covalente (Figura 2B) . 0 domínio "fecho de correr" de leucinas é clivado do precursor durante o processo de purificação (ver a seguir) para se obter rhuMAb CD18 (Figura 2B). A linha celular utilizada na produção de rhuMAb CD18 é 49A5, derivada da linha celular de E. coli W3110 (ATCC 27,325) como se pode ver na Figura 5. 0 procedimento de fermentação ocorre como se mostra na Figura 6. A produção do precursor de rhuMAb CD18 ocorre quando o meio fica sem fosfato, tipicamente 30-60 horas após a inoculação. A purificação do precursor de rhuMAb CD18 a partir da pasta de células de E. coli foi como se segue.

Homogeneização e centrifugação: Os sedimentos celulares congelados contendo anticorpo precursor anti-CD18 foram dissolvidos em cerca de 3 volumes de tampão de extracção (tampão MES 120 mM, EDTA 5 mM, pH 6) aquecido a 30-40°C. Isto resultou numa suspensão com um pH entre cerca de 5,4 e 6,5. Esta suspensão foi passada duas vezes através de um homogeneizador Gaulin de 5500 a 6500 psi e mantida abaixo de 20°C com um permutador de calor. Adicionou-se polietilenoimina a 5% (PEI) (p/v), pH 6 ao homogenato numa concentração final de 0,2% de PEI. A mistura foi incubada durante cerca de uma hora a 2-8°C. Adicionou-se cerca de um volume de tampão de extracção (MES 120 mM, EDTA 5 mM, pH 6) ante dos sólidos serem 34 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ removidos por centrifugação a 15.280g. O sobrenadante límpido foi condicionado a uma condutividade inferior a 3 mohms, por adição de água fria.

Cromatografia de permuta iónica: 0 sobrenadante condicionado foi carregado numa coluna de permuta catiónica (coluna ABX; Mallinckrodt Baker, Inc., NJ, EUA) equilibrada em MES 50 mM pH 6,0. A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio e o precursor anti-CDl8 foi eluído com um gradiente linear de MES 50 mM, pH 6,0 a MES 50 mM, citrato de sódio 100 mM, pH 6,0. A coluna foi monitorada por absorvância a 280 nm, e o eluato foi recolhido em fracções. As fracções adequadas foram reunidas com base em cromatografia líquida hidrófoba de permuta catiónica, analítica (HPLC). Após utilização, a coluna de permuta catiónica foi regenerada utilizando guanidina HC1 3,0 M, tampão HEPES 20 mM, pH 7,4, seguido de ácido acético a 1%, ácido fosfórico 120 mM. A coluna foi armazenada em ácido acético a 1%, ácido fosfórico 120 mM.

Digestão do precursor: Acoplou-se quimicamente pepsina (Sigma, MO, USA) a vidro de poro controlado (CPG) pela Bioprocess Ltd., RU. O CPG foi activado com NaI04 seguido de redução da formação de base de Schiff entre CPG e pepsina, utilizando NaBH3CN. O conjunto da permuta catiónica de anticorpo precursor anti-CDl8 do passo anterior foi diluído com MES 50 mM, citrato de sódio 36 mM, pH 4,0 a uma concentração de aproximadamente 2 g/1. O conjunto foi então reajustado para pH 4 por adição de ácido cítrico 2 M e fluiu através de uma coluna contendo pepsina imobilizada (pepsina-CPG) previamente equilibrada com MES 50 mM, citrato de sódio 36 mM pH 4,0. Este procedimento removeu os "fechos de correr" da região de charneira, deixando ao mesmo tempo os F(ab')2 intactos. Após utilização, a coluna de pepsina foi regenerada com HC1 aquoso a 0,12%, pH 1,5 e armazenada em acetato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 150 mM, timerosal a 0,01%, glicerol a 50%, pH 4,5.

Filtração por permuta aniónica: O efluente da coluna de pepsina-CPG foi passado directamente em linha através de uma membrana Sartobind Q de permuta aniónica (Sartorius, 35 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Goettingen, Alemanha). Ο anticorpo anti-CDl8 F(ato *)2 produzido flui através da membrana, enquanto que a pepsina e outras impurezas carregadas negativamente se ligam fortemente à membrana. A membrana foi regenerada utilizando MES 50 mM, citrato de sódio 36 mM, cloreto de sódio 1 M, pH 4,0 e foi armazenada em hidróxido de sódio 0,1 N.

Análise da reacção de digestão: A digestão do anticorpo precursor anti-CDl8 foi analisada por cromatografia de permuta catiónica de HPLC numa coluna de 50 x 4,6 mm carboxissulfona (CSX) BAKERBOND™ (J.T. Baker Phillipsburg, NJ) mantida a 55°C. Os polipéptidos foram eluidos utilizando um gradiente linear crescente de pH 6,0 a pH 8,0 a um fluxo de 4 ml/min, utilizando um comprimento de onda de detecção de 280 nm. O tampão A continha 16 mM de cada HEPES/PIPES/MES, pH 6,0 e o tampão B continha 16 mM de cada HEPES/PIPES/MES, pH 8,0. Para a separação do anticorpo precursor anti-CDl8 digerido e não digerido, correu-se um gradiente linear durante 10 min, de 40% de B a 100% de B.

Análise de pepsina: A quantidade de pepsina lixiviada da coluna pepsina-CPG foi determinada por análise de HPLC de fase inversa e por análise de ELISA de pepsina.

Para análise de HPLC, monitorou-se uma coluna TSK-fenilo TosoHass (7,5 x 75 mm) com 90% de solvente A (0,1% de TFA em água) e 10% de solvente B (0,1% de tfa em acetonitrilo) . Após injecção de uma amostra de 75 pg, iniciou-se um gradiente de 30 minutos de 10% a 25% de solvente B; o fluxo era de 1 ml/min e a temperatura foi mantida a 55°C ao longo da análise.

Para a ELISA, fez-se uma ELISA sanduíche. Utilizaram-se anticorpos policlonais anti-pepsina de cabra para revestir uma placa de microtítulo de 96 poços. As amostras contendo pepsina e os padrões foram incubados nos poços revestidos. A sanduíche foi completada com anti-pepsina de cabra biotinilado. Antes da biotinilação, os segundos anticorpos foram purificados por afinidade utilizando CPG-pepsina. Os complexos imunológicos foram detectados nas placas utilizando estreptavidina-fosfatase alcalina e substrato p-nitrofenilfosfato. A absorvância a 405 nm foi medida num leitor de placas de microtítulo. Os padrões cobrem a gama de 33,3 pg/ml até 36 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 0,5 pg/ml em diluições de 2 vezes. Fizeram-se diluições para as amostras (amostra pura ou diluída 1:2, 1:4 e 1:8). As amostras também foram misturadas no nível de 10 pg/ml com pepsina e testadas como amostras. O limite de detecção do teste era 1 pg/ml. Um ajuste de curva logístico de 4 parâmetros aos dados produziu uma curva padrão aceitável.

Cromatografia de permuta catiónica: O conjunto foi diluído para se obter um condutividade de aproximadamente 7 mohms por adição de água. O conjunto foi aplicado a uma coluna de permuta catiónica (SP Sepharose alta eficiência; SPHP) equilibrada em MES 25mM, ácido acético 60 mM, pH 4,0. A coluna de SP Sepharose foi lavada com MES 25 mM, acetato de sódio 75 mM pH 5,6 e eluída num gradiente linear de 75-110 mM de acetato de sódio em MES 25 mM pH 5,6. O eluato da coluna foi monitorado a 280 nm e as fracções de eluato foram reunidas com base em HPLC de permuta iónica analítica. A coluna de SP Sepharose foi regenerada em MES 25 mM, acetato de sódio 400 mM pH 5,6, seguido de uma lavagem com hidróxido de sódio a 0,5%. A coluna foi armazenada em NaOH a 0,1%.

Cromatografia de interacção hidrófoba (HIC): A fracção reunida a partir da coluna de SP Sepharose foi diluída com a adição de sulfato de amónio 3,0 M, MES 25 mM pH 6,0 a uma razão de 0,26 litros por litro de conjunto. Esta foi então passada através de uma coluna de HIC (fenil-Sepharose FF -substituição baixa) previamente equilibrada em sulfato de amónio 0, 625 M, MES 25 mM pH 6,0. Após carga, a coluna foi lavada com o mesmo tampão utilizado no equilíbrio e o rhuMAb CD18 foi eluído em sulfato de amónio 0,375M, MES 25 mM pH 6,0. O eluato foi monitorado a 280 nm e as fracções são recolhidas com base em HPLC de fase inversa analítica. A coluna de HIC foi regenerada em MES 25 mM, pH 6,0, seguido de uma lavagem em NaOH a 0,5%. A coluna foi armazenada em NaOH a 0,1%.

RESULTADOS

Fizeram-se dois ciclos de purificação em grande escala, separados (veja-se Figura 7). O processo de purificação começou com uma pasta de células de E. coli contendo o anticorpo precursor anti-CDl8 e completou-se com o anti-CDl8 F(ab')2 sem o domínio de dimerização "fecho de correr" de leucinas. Durante ambos os ciclos de purificação, a digestão 37 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ da molécula precursora de anticorpo foi realizada passando o anticorpo precursor anti-CDl8 parcialmente purificado através de uma coluna de pepsina-CPG. A digestão foi monitorada por SDS-PAGE e HPLC de permuta catiónica analítica. A quantidade total de pepsina lixiviada a partir da coluna de pepsina-CPG foi determinada medindo a pepsina no conjunto de anticorpo precursor digerido, após digestão da CPG-pepsina e passo de filtração e no conjunto de regeneração de membrana de permuta aniónica. A regeneração da membrana foi realizada eluindo a pepsina e contaminantes ligados à membrana utilizando tampão MES 50 mM, citrato de sódio 36 mM, cloreto de sódio 1 M, pH 4,0 (veja-se Figura 7). A remoção eficaz de pepsina ao longo dos passos de purificação foi monitorada por transferências de Western utilizando anticorpos anti-pepsina de cabra purificados e quantificada utilizando o método de ELISA.

Os resultados da análise de HPLC de fase inversa são apresentados na Tabela 1. No primeiro ciclo, detectou-se pepsina tanto no conjunto de regeneração da membrana de permuta aniónica a uma concentração de 40 pg/ml, como no conjunto de anticorpo precursor digerido, após o passo de CPG-pepsina e filtração, a uma concentração de 48,3 pg/ml. Adicionando a concentração total de pepsina em ambos os conjuntos determinou-se que 13,4 g de pepsina foram lixiviadas da coluna CPG-pepsina durante o passo de digestão no primeiro ciclo. Os dados também revelaram que a quantidade de área de filtração utilizada para remover a pepsina lixiviada não era suficiente aos fluxos e pH utilizados no primeiro ciclo. Apesar de tudo, a membrana conseguiu remover 21% da quantidade total de pepsina lixiviada da coluna de pepsina-CPG. Uma vez que o conjunto de anticorpo precursor digerido continha 10,6 g de pepsina lixiviada que não era removida pela membrana, os rendimentos de purificação do passo de digestão de pepsina-CPG e do passo SPHP eram baixos; 77 e 53%, respectivamente. Além disso, a pepsina foi detectada no conjunto de SPHP por análise de transferência de Western. 38 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ TABELA 1

Concentração de pepsina 48,3 pg/ml 220 1 10,6 g 40,4 pg/ml 70 1 2,8 g Concentração de pepsina 0 630 1 0 230 pg/ml 10 1 2,3 g CICLO 1

Conjunto de Ab digerido com pepsina Volume do conjunto de Ab digerido com pepsina

Quantidade total de conjunto de Ab pepsina Conjunto de regeneração de membrana

Volume de regeneração de membrana Quantidade total de conjunto de membrana de pepsina CICLO 2

Conjunto de Ab digerido com pepsina Volume do conjunto de Ab digerido com pepsina

Quantidade total de conjunto de Ab pepsina

Conjunto de regeneração de membrana

Volume de regeneração de membrana Quantidade total de conjunto de membrana de pepsina

Após o passo de purificação final (fenil-Sepharose), a pepsina não foi detectada por ELISA (Tabela 2), nem por análise de transferência de Western. No segundo ciclo, a área de filtração da membrana de permuta aniónica duplicou de 11 000 cm2 para 22 000 cm2. A pepsina foi detectada apenas no conjunto de regeneração de toca aniónica a uma concentração de 230 pg/ml. Não se detectou pepsina no conjunto de anticorpo precursor digerido, após os passos de digestão com CPG-pepsina e filtração. A quantidade total de pepsina lixiviada pela resina CPG-pepsina era de 2,3 g. Este valor é 17% da quantidade total de pepsina lixiviada detectada durante o primeiro ciclo. Não se detectou pepsina por fase inversa, ELISA de pepsina, ou transferências de Western através dos restantes passos de purificação do segundo ciclo. Como resultado de remover por completo a pepsina do conjunto de precursor digerido, os rendimentos de purificação do passo de 39 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ digestão com pepsina-CPG e SPHP foram melhorados para 97 e 90%, respectivamente. TABELA 2

Amostra Conjunto Abx Conjunto Q ciclo 1 Conjunto Q ciclo 2 Conjunto SPHP ciclo 1 Conjunto SPHP ciclo 2 Conjunto HIC ciclo 1 Conjunto HIC ciclo 2 Produto Form. ciclo 1 Produto Form. Ciclo 2 Formulação de placebo

Valores de pepsina (média de 2 reps.) [pg/ml] <0,5, <0,5 7,4 <,5, <0,5 <0,5, <0,5 <0,5, <0,5 <0,5, <0,5 <0,5, <0,5 <0,5, <0,5 <0,5, <0,5 <0,5, <0,5

Os resultados destas experiências demonstram que a utilização de uma membrana carregada positivamente em linha imediatamente após o passo de digestão com pepsina imobilizada era vantajosa. Quando a pepsina não foi completamente removida pela membrana do conjunto de anticorpo precursor digerido, obtiveram-se rendimentos baixos de anticorpo funcional. Sem estar cingido a nenhuma teoria, isto era provavelmente o resultado da sobre-digestão pela pepsina remanescente no conjunto. Além disso, quando a pepsina não era completamente removida pela membrana carregada positivamente, ela era detectada no conjunto SPHP por transferências de Western. No segundo ciclo, a pepsina lixiviada foi completamente removida pela membrana. Como resultado, os rendimentos de recuperação para o passo de digestão com pepsina e os passos de permuta catiónica de SPHP melhoraram. A introdução da membrana de permuta aniónica melhorou o processo de purificação de anti-CD18 em dois modos fundamentais. Primeiro, os rendimentos foram melhorados por remoção eficaz de pepsina do conjunto de digestão de CPG, impedindo uma digestão futura. Segundo, a eficácia e reprodutibilidade gerais do processo foram melhoradas ao remover a pepsina e outros contaminantes carregados negativamente, numa fase precoce do processo. 40 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Recuperação de proteínas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 1 DNA Way (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete de 3,5 pol., 1,44 Mb

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech) (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Schwartz, Timothy R. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 32171

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: P1105R1PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 650/225-7467 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 241 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Glu Tyr Thr Met His Trp Met Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Vai Ala Gly Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Ser His 50 55 60

Asn Gin Arg Phe Met Asp Arg Phe Thr Ile Ser Vai Asp Ly3 Ser 41 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 65 70 75

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Arg Gly Leu Asn Tyr Gly 95 100 105

Phe Asp Vai Arg Tyr Phe Asp vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 110 115 120

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 125 130 135

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140 145 150

Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp 155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala Vai 170 175 180

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190 195

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn 200 205 210

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 215 220 225

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 230 235 240

Leu 241 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 214 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai 1 5 10 15 Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His ser Gly Vai Pro Ser 50 55 60 42 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin SO 85 90

Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lya Vai Glu 95 100 105

Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai

140 145 ISO

Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu 155 160 165

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys 214 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Leu Gly Gly Arg Met Lys Gin Leu Glu Asp Lys Vai Glu Glu Leu 15 10 15

Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Vai Ala Arg Leu Lys 20 25 30

Lys Leu Vai Gly Glu Arg 35 36 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 7 43 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2143 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC 50 TCATTGCTGA GTTGTTATTT AAGCTTTGGA GATTATCGTC ACTGCAATGC 100 TTCGCAATAT GGCGCAAAAT GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG 150 GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC AGCATTCCTG ACGACGATAC 200 GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGCAT CCTCGTCAGT 250 AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC AGCTGTCATA AAGTTGTCAC GGCCGAGACT 300 TATAGTCGCT TTGTTTTTAT TTTTTAATGT ATTTGTAACT AGAATTCGAG 350 CTCGCCGGGG ATCCTCTAGA ggttgaggtg ATTTTATGAA AAAGAATATC 400 GCATTTCTTC TTGCATCTAT GTTCGTTTTT TCTATTGCTA CAAACGCGTA 450 CGCTGATATC CAGATGACCC AGTCCCCGAG CTCCCTGTCC GCCTCTGTGG 500 GCGATAGGGT CACCATCACC TGTCGTGCCA GTCAGGACAT CAACAATTAT 550 CTGAACTGGT ATCAACAGAA ACCAGGAAAA GCTCCGAAAC TACTGATTTA 600 CTATACCTCC ACCCTCCACT CTGGAGTCCC TTCTCGCTTC TCTGGTTCTG 650 GTTCTGGGAC GGATTACACT CTGACCATCA GCAGTCTGCA ACCGGAGGAC 700 TTCGCAACTT ATTACTGTCA GCAAGGTAAT ACTCTGCCGC CGACGTTCGG 750 ACAGGGCACG AAGGTGGAGA TCAAACGAAC TGTGGCTGCA CCATCTGTCT 800 TCATCTTCCC GCCATCTGAT GAGCAGTTGA AATCTGGAAC TGCCTCTGTT 850 GTGTGCCTGC TGAATAACTT CTATCCCAGA GAGGCCAAAG TACAGTGGAA 900 GGTGGATAAC GCCCTCCAAT CGGGTAACTC CCAGGAGAGT GTCACAGAGC 950 AGGACAGCAA GGACAGCACC TACAGCCTCA GCAGCACCCT GACGCTGAGC 1000 AAAGCAGACT ACGAGAAACA CAAAGTCTAC GCCTGCGAAG TCACCCATCA 1050 GGGCCTGAGC TCGCCCGTCA CAAAGAGCTT CAACAGGGGA GAGTGTTAAG 1100 44 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ CTGATCCTCT ACGCCGGACG CATCGTGGCG CTAGTACGCA AGTTCACGTA 1150 AAAACGGTAT CTAGAGGTTG AGGTGATTTT ATGAAAAAGA ATATCGCATT 1200 TCTTCTTGCA TCTATGTTCG TTTTTTCTAT TGCTACAAAC GCGTACGCTG 1250 AGGTTCAGCT GGTGGAGTCT GGCGGTGGCC TGGTGCAGCC AGGGGGCTCA 1300 CTCCGTTTGT CCTGTGCAAC TTCTGGCTAC ACCTTTACCG AATACACTAT 1350 GCACTGGATG CGTCAGGCCC CGGGTAAGGG CCTGGAATGG GTTGCAGGGA 1400 TTAATCCTAA AAACGGTGGT ACCAGCCACA ACCAGAGGTT CATGGACCGT 1450 TTCACTATAA GCGTAGATAA ATCCACCAGT ACAGCCTACA TGCAAATGAA 1500 CAGCCTGCGT GCTGAGGACA CTGCCGTCTA TTATTGTGCT AGATGGCGAG 1550 GCCTGAACTA CGGCTTTGAC GTCCGTTATT TTGACGTCTG GGGTCAAGGA 1500 ACCCTGGTCA CCGTCTCCTC GGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTtCCC 1550 CCTGGCACCC TCCTCCAAGA GCACCTCTGG GGGCACAGCG GCCCTGGGCT 1700 GCCTGGTCAA GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA 1750 GGCGCCCTGA CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCGGCTGTCC TACAGTCCTC 1800 AGGACTCTAC TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAGCTTGG 1850 GCACCCAGAC CTACATCTGC AACGTGAATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG 1900 GTCGACAAGA AAGTTGAGCC CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC 1950 GCCGTGCCCA GCACCAGAAC TGCTGGGCGG CCGCATGAAA CAGCTAGAGG 2000 ACAAGGTCGA AGAGCTACTC TCCAAGAACT ACCACCTAGA GAATGAAGTG 2050 GCAAGACTCA AAAAGCTTGT CGGGGAGCGC TAAGCATGCG ACGGCCCTAG 2100 AGTCCCTAAC GCTCGGTTGC CGCCGGGCGT TTTTTATTGT TAA 2143 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 237 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA : Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Met Lys Lys Asn rie Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe -23 -20 -15 -10

Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp lie Gin Met Thr Gin Ser -5 15

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr 10 15 20 45 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

Cya Arg Ala Ser Gin Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin 25 30 35

Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser 40 45 50

Thr Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 55 60 65

Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp 70 75 80

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125

Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140

Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 145 150 155

Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 160 165 170

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 175 180 185

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser 190 195 200

Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210 214 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 300 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Met Lya Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe -23 -20 -15 -10 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser -5 1 5 Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 10 15 20

Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Met 46 ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ

2S 30 3S

Arg Gla Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Gly Ile Asn 40 45 50

Pro Lys Asn Gly Gly Thr Ser His Asn Gin Arg Phe Met Asp Arg 55 60 65

Phe Thr Ile Ser Vai Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gin 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Trp Arg Gly Leu Asn Tyr Gly Phe Asp Vai Arg Tyr Phe Asp 100 105 110

Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125

Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe 145 150 155

Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 160 165 170

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 175 180 185

Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 190 195 200

Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 205 210 215

Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 220 225 230

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Arg Met Lys 235 240 245

Gin Leu Glu Asp Lys Vai Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His 250 255 260

Leu Glu Asn Glu Vai Ala Arg Leu Lys Lys Leu Vai Gly Glu Arg 265 270 275 277

Lisboa

Claims (19)

1. ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para recuperar um polipéptido, que compreende: (a) expor uma composição compreendendo um polipéptido a um reagente que se liga a, ou modifica, o polipéptido, em que o reagente está imobilizado numa fase sólida; e em seguida (b) passar a composição através de um filtro que possui uma carga que é oposta à carga do reagente na composição, de modo a remover o reagente lixiviado da composição.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as caracteristicas de carga do polipéptido na composição no passo (b) são tais que o polipéptido passa através do filtro.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o filtro está carregado positivamente.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o filtro está carregado negativamente.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o filtro é colocado em linha com a composição exposta ao reagente, como no passo (a).
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que 0 reagente imobilizado é uma protease.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a protease é pepsina
8. • 8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que 0 polipéptido exposto à protease nc i passo (a) é um polipéptido precursor e a protease remove um domínio precursor do polipéptido.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que 0 domínio percursor compreende um "fecho de correr " de leucinas.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que 0 polipéptido é um anticorpo. ΕΡ Ο 998 486/ΡΤ 2/2
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o anticorpo é um fragmento F(ab')2·
12. 12. Método para recuperar um polipéptido compreendendo remover um reagente lixiviado de uma composição que compreende o polipéptido e o reagente lixiviado, passando a composição através de um filtro que possui uma carga oposta à do reagente lixiviado, em que o reagente lixiviado foi previamente imobilizado numa fase sólida.
13. 13. Método para modificar um anticorpo precursor que compreende um "fecho de correr" de leucinas, compreendendo expor o anticorpo precursor a uma protease imobilizada numa fase sólida, de modo que a protease remove o "fecho de correr" de leucinas do anticorpo precursor, em que o método compreende passar o anticorpo do qual foi removido o "fecho de correr" de leucinas através de um filtro carregado positivamente.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a protease é pepsina.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a fase sólida compreende pérolas de vidro de poro controlado.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o anticorpo é um F(ab')2·
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o "fecho de correr" de leucinas é GCN4.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o anticorpo se liga a CD18.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o anticorpo se liga ao receptor HER2, HER3 ou HER4. Lisboa,