ES2228473T3

ES2228473T3 - Peptidos artificiales con actividad de superficie y uso de los mismos en la preparacion de un tensioactivo artificial.

Info

Publication number: ES2228473T3
Application number: ES00910658T
Authority: ES
Inventors: Tore Curstedt; Jan Johansson; Hans Jornvall; Bengt Robertson; Paolo Ventura
Original assignee: Chiesi Farmaceutici SpA
Current assignee: Chiesi Farmaceutici SpA
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: EA200100749A1; KR20010101904A; MA25381A1; HK1042500A1; EE04879B1; SK11442001A3; HUP0200141A3; CA2362507A1; ZA200106530B; HU228997B1; PL201084B1; CZ301108B6; BG65196B1; BG105764A; CN1340060A; DE60015082T2; YU57701A; NO20013888L; CN1221570C; BR0009964A

Abstract

Análogos de la SP-C que tienen la fórmula general (I), de acuerdo con el código de aminoácidos de una letra: FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLMGL (I) en la que: X es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por I, L, Nle (norleucina); B es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por K, W, F, Y, ornitina; Z es S y puede estar opcionalmente unido a través de un enlace éster con un grupo acilo que contiene 12-22 átomo de carbono. a es un número entero de 1 a 19; b es un número entero de 1 a 19; c es un número entero de 1 a 21; d es un número entero de 0 a 20; e es 0 ó 1; f es 0 ó 1; n es 0 ó 1; m es 0 ó 1; con las condiciones siguientes: - n + m > 0, - f f >- e; - (XaB)n(XbB)n(XcB)mXd es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferentemente, de 10 a 22 aminoácidos.

Description

Péptidos artificiales con actividad de superficie y uso de los mismos en la preparación de un tensioactivo artificial.

La presente invención proporciona péptidos artificiales novedosos que tienen actividad tensioactiva. En particular, la invención proporciona análogos de la SP-C que, una vez que se combinan con los lípidos adecuados, son particularmente eficaces a la hora de reducir la tensión superficial en la interfaz aire-líquido.

De este modo, los péptidos de la invención pueden usarse en combinación con lípidos y, opcionalmente, en combinación con SP-B o un análogo activo de la misma o un sustituto de SP-B, para preparar tensioactivos artificiales útiles en el tratamiento del síndrome disneico (RDS), de otras insuficiencias y disfunciones tensioactivas, de enfermedades pulmonares relacionadas tales como neumonía, bronquitis, asma, síndrome de aspiración de meconio y también de otras enfermedades tales como la otitis media serosa (oído pegajoso).

Antecedentes de la invención

Los tensioactivos pulmonares reducen la tensión superficial en la interfaz aire-líquido de la túnica interna alveolar, impidiendo que los pulmones se colapsen al final de la espiración. La insuficiencia tensioactiva es un trastorno común en los niños prematuros y provoca el síndrome disneico (RDS), que puede tratarse eficazmente con tensioactivos naturales extraídos a partir de pulmones de animales (Fujiwara, T. y Robertson B. (1992) en: Robertson, B., van Golde, L.M.G. y Batenburg, B. (eds) Pulmonary Surfactant: From Molecular Biology to Clinical Practice, Ámsterdam, Elsevier, págs 561-592). Los constituyentes principales de estas preparaciones tensioactivas son los fosfolípidos tales como 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), fosfatidilglicerol (PG) y las proteínas B y C hidrófobas tensioactivas (SP-B y SP-C). Las proteínas SP-A y SP-D hidrófilas tensioactivas que son lectinas colagenosas del tipo C (dependientes de Ca^{2+}), de las que se piensa que actúan principalmente en el sistema de defensa del hospedador, no se incluyen normalmente en las preparaciones tensioactivas debido a los procedimientos de extracción con disolventes orgánicos empleados.

SP-B y SP-C constituyen sólo el, aproximadamente, 1-2% de la masa tensioactiva pero aún así son capaces de ejercer mejoras notables en la actividad tensioactiva en comparación con las preparaciones meramente lipídicas (Curstedt, T. y col., (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262; Takahashi, A., Nemoto, T. y Fujiwara, T. (1994) Acta Paediatr. Jap. 36, 613-618). Se han determinado las estructuras primaria y secundaria de SP-B y SP-C y una estructura terciaria de SP-C en solución (véase 4). La SP-B está compuesta de dos cadenas idénticas de polipéptido de 79 aminoácidos, conectadas con un puente disulfuro intercatenario (Curstedt, T. y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2985-2989; Johansson, J. Curstedt, T. y Jörnvall, H. (1991) Biochemistry 30, 6917-6 1921). Cada cadena monomérica tiene tres puentes disulfuro intracatenarios y, al menos, cuatro hélices anfipáticas que muestran una cara polar y una cara apolar a través de las que SP-B puede interaccionar con dos bicapas lipídicas y ponerlas en proximidad íntima (Andersson, M y col. (1995) FEBS Lett. 362, 328-332). La SP-C es una lipoproteína compuesta por 35 restos de aminoácidos con un dominio de \alpha-hélice entre los restos 9-34 (Johansson, J. y col. (1994) Biochemistry 33, 6015-6023). La hélice está compuesta mayoritariamente de restos valilo y está incluida en una bicapa lipídica y orientada en paralelo con las cadenas acilo de los lípidos (Vandenbussche, y col. (1992) a Eur. J. Biochem. 203, 201-209). Dos grupos palmitoilo están covalentemente unidos a restos de cisteína en las posiciones 5 y 6 en la parte N-terminal del péptido (Curstedt, T. y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2985-2989). Los dos restos conservados positivamente cargados, arginina y lisina, en las posiciones 11 y 12, interaccionan, posiblemente, con los grupos de cabeza cargados negativamente de la membrana lipídica incrementándose, de este modo, su rigidez. La rigidez de la interacción lípido-péptido puede disminuir a lo largo del extremo C-terminal, ya que contiene solamente restos pequeños o hidrófobos, haciendo a esta parte potencialmente más móvil en una bicapa fosfolipídica. Se piensa que la SP-C influye en el espesor y la fluidez de los lípidos que la rodean por medio de la extremadamente estable hélice poli-valilo (Johansson, J. y Curstedt, T. (1997) Eur. J. Biochem. 244, 675-693).

Estado de la técnica

Puesto que las preparaciones tensioactivas obtenidas a partir de tejidos animales presentan algunos inconvenientes, como su disponibilidad en cantidades limitadas y la posibilidad de que contengan agentes infecciosos y provoquen reacciones inmunológicas, se han hecho tentativas para crear tensioactivos artificiales (Johansson, J. y Curstedt, T. (1997) Eur. J. Biochem. 244, 675-693; Johansson, J. y col. (1996) Acta Paediatr. 85, 642-646), normalmente a partir de lípidos sintéticos y proteínas hidrófobas.

Los trabajos previos han demostrado que la SP-C sintética puede no doblarse como el péptido natural para constituir una conformación de \alpha-hélice necesaria para la actividad tensioactiva óptima (Johansson, J. y col. (1995) Biochem. J. 307, 535-541) y, por tanto, no interacciona apropiadamente con los lípidos tensioactivos.

Consecuentemente, los análogos sintéticos de la SP-C no se doblan como el péptido natural y no interaccionan apropiadamente con los lípidos tensioactivos. Para evitar este problema, se han hecho algunas tentativas para modificar la secuencia, por ejemplo, sustituyendo todos los restos de Val de la hélice en la SP-C natural por Leu, que favorece fuertemente la conformación de \alpha-hélice. El correspondiente análogo transmembranoso, SP-C (Leu) muestra una buena extensión en la interfaz aire-líquido cuando se combina con DPPC:PG:PA (68:22:9) (peso / peso / peso). Sin embargo, el valor máximo de la tensión superficial durante la compresión superficial cíclica (\gamma_{max}) fue significativamente mayor que el del tensioactivo natural. Además, no fue posible preparar mezclas lípido-péptido de concentraciones mayores de, aproximadamente, 20 mg/ml debido, probablemente, a la formación de oligómeros de péptidos (Nilsson, G. y col. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124). Otros autores han sintetizado análogos de SP-C con polileucina activos biológicamente de diferentes longitudes (Takei, T. y col. (1996) Biol. Pharm. Bull. 19, 1550-1555). En los últimos estudios, no se ha informado ni de autooligomerización ni de problemas a la hora de producir las muestras de concentración lipídica alta.

Diferentes publicaciones tratan del problema de proporcionar análogos peptídicos de péptidos tensioactivos naturales, proporcionando diversas soluciones diferentes. Entre estas publicaciones, WO93 21.225, EP 733 645, WO96 17.872, en el nombre de Tokyo Tanabe, describen análogos de péptidos de la SP-C natural que, en general, difieren del péptido natural con respecto a la secuencia de la parte N-terminal.

Las solicitudes de patentes del Scripps Research Institute, WO89 06657 y WO92 22.315, describen análogos de la SP-B que tienen restos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos alternantes. Se reivindica, entre otros, un péptido de restos de leucina y lisina alternantes (KL_{4}).

Clercx A. y col., Eur. J. Biochem 229, 465-72, 1995, describen péptidos de diferentes longitudes que corresponden al N-terminal de la SP-C porcina y péptidos híbridos que derivan de la SP-C porcina y de la bacteriorrodopsina.

Johansson J. y col., Biochem. 307, 535-41, 1995, describen péptidos sintéticos que difieren de la SP-C porcina natural por la sustitución de algunos aminoácidos.

El documento WO89/04326, en nombre de California Biotechnology - Byk Gulden, y el documento WO91/18015, en nombre de California Biotechnology - Scios Nova, describen análogos de SP-C que contienen una secuencia N-terminal inicial en la que dos Cys de la SP-C natural se sustituyen por dos Ser.

Descripción de la invención

Ahora se ha encontrado que en los péptidos análogos de la SP-C que combinan las siguientes características: i) sustitución de restos de Val de la SP-C con restos de Ile, Leu o Nle; ii) sustitución de restos de Cys con restos de Ser; iii) inserción de restos de aminoácidos positivamente cargados o voluminosos en la secuencia de la SP-C, muestran propiedades particularmente favorables de reducción de la tensión superficial. En particular, se ha encontrado que la última característica, en virtud de las cargas positivas conferidas por los restos polares o del impedimento estérico conferido por los sustituyentes voluminosos, permite evitar la autooligomerización.

Como sigue, de acuerdo con un primer aspecto, la invención proporciona análogos de la SP-C que tienen la siguiente fórmula general (I), usando el código de aminoácidos de una letra:

(I)F_{e}G_{f}IPZZPVHLKR(X_{a}B)_{n}(X_{b}B)_{n}(X_{c}B)_{m}X_{d}GALLMGL

en la que:

X: es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por V, I, L, Nle (norleucina);

B: es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por ornitina, K, I, W, F, Y, Q, N;

Z: es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por S, C, F, estando, los restos de Ser o Cys, opcionalmente unidos a través de enlaces éster o tio-éster con grupos acilo que contienen 12-22 átomos de carbono unidos.

a: es un número entero de 1 a 19

b: es un número entero de 1 a 19

c: es un número entero de 1 a 21

d: es un número entero de 0 a 20

e: es 0 ó 1

f: es 0 ó 1

n: es 0 ó 1

m: es 0 ó 1

con las condiciones:

-: n + m > 0,

-: f \geq e;

-: (X_{a}B)_{n}(X_{b}B)_{n}(X_{c}B)_{m}X_{d} es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferentemente, de 10 a 22.

Los péptidos preferidos de fórmula (I) tienen las siguientes secuencias:

(Ia) FGIPSSPVHLKRX_{4}BX_{4}BX_{4}BXGALLMGL

(Ib) FGIPSSPVHLKRX_{5}BX_{5}BX_{4}GALLMGL

(Ic) FGIPSSPVHLKRX_{4}BX_{11}GALLMGL

(Id) FGIPSSPVHLKRX_{8}BX_{7}GALLMGL

(Ie) FGIPSSPVHLKRX_{11}BX_{4}GALLMGL

Entre las secuencias (Ia)-(Ie), las que tienen B = Lys o Phe y X = Leu, Ile o Nle son las preferidas.

De acuerdo con las realizaciones preferidas, los péptidos de fórmula (Ia)-(If) tienen las siguientes secuencias, respectivamente:

FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLKILLLKLGALLMGL [SP-C (LKS)]

FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS)_{1}]

FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL [SP-C (LKS)_{2}]

FGIPSSPVHLKRLLILLLLLKLILLLILGALLMGL [SP-C (LKS)_{3}]

FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS)_{4}]

FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL [SP-C (LFS)]

En una realización más preferida de la invención, los restos de Ser están covalentemente unidos a grupos acilo que contienen 12-22 átomos de carbono.

Los péptidos de la fórmula (I) pueden prepararse mediante métodos sintéticos o técnicas recombinantes.

Se describen métodos sintéticos ordinarios, por ejemplo, en Schroeder y col., "The peptides", vol. 1, Academic Press, 1965; Bodanszky y col., "Peptide synthesis", Interscience Publisher, 1996; Baramy y Merrifield, "The peptides; Analysis, Synthesis, Biology", vol. 2, capítulo 1, Academic Press, 1980. Dichas técnicas incluyen la síntesis de péptidos en fase sólida, en solución, métodos sintéticos de química orgánica o cualquier combinación de los mismos.

Los péptidos S- u O-acilados se sintetizan preferentemente mediante tratamiento de los péptidos sin acilar con cloruro de acilo en ácido trifluoroacético puro como describen Yousefi-Salakdeh y col., Biochem J 1999, 343, 557-562. Después de la síntesis y purificación, los péptidos sintéticos se caracterizan bioquímica y biofísicamente, como se publica en la siguiente sección de " Ejemplos".

La actividad de los péptidos de la invención a la hora de reducir la tensión superficial ha sido evaluada en combinación con lípidos y fosfolípidos, SP-B, análogos de SP-B o sustitutos de SP-B. En particular, los péptidos han sido combinados con DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina) / PG (fosfatidilglicerol) / PA (ácido palmítico) con o sin SP-B, un análogo activo de la misma y polimixinas.

Los resultados de los análisis de tensioactividad en burbuja pulsátil muestran claramente que los péptidos sintéticos de acuerdo con la presente invención descienden drásticamente la tensión superficial mínima y máxima durante la compresión superficial cíclica (\gamma_{min} y \gamma_{max}) hasta valores comparables con los obtenidos usando tensioactivos de fuentes naturales.

La adición de SP-B o de un análogo activo de la misma a la mezcla de péptido / lípidos-fosfolípidos proporciona resultados particularmente favorables. Además, se ha encontrado sorprendentemente que las polimixinas, en particular, la polimixina B, actúan como sustituyentes de la SP-B y su adición proporciona resultados comparables a los conseguidos con SP-B.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona un tensioactivo sintético que comprende uno o más péptidos de fórmula (I), mezclados con lípidos y/o fosfolípidos y, opcionalmente, SP-B, un derivado activo de la misma o polimixinas. Los lípidos / fosfolípidos adecuados pueden seleccionarse del grupo constituido por fosfatidilcolinas (preferentemente, DPPC), PG, PA, triacilgliceroles, esfingomielina.

En una realización aún más preferida de la invención, deben usarse mezclas de tensioactivos que contienen el péptido en el que las cadenas de palmitoilo están unidas O-covalentemente a los restos de Ser. Se ha encontrado que las mezclas tensioactivas que contienen una forma dipalmitoilada del péptido de referencia (SP-C (Leu)) muestran una estabilidad mayor de película superficial y un tamaño aumentado de la reserva de lípidos asociados a la superficie, en comparación con las mezclas que contienen el correspondiente péptido sin palmitoilar, tal como se mide mediante el sistema de la burbuja cautiva. En las muestras que contienen el péptido dipalmitoilado 5%, la \gamma_{min} estuvo por debajo de 1,5 mN/m y las películas fueron muy estables, ya que la tensión superficial aumentaba en menos de 0,5 mN/m en 10 minutos a volumen de burbuja constante. Por el contrario, la \gamma_{min} del péptido sin palmitoilar fue, aproximadamente, 5 mN/m y las películas fueron menos estables como se observa por el frecuente balanceo de la burbuja en tensiones superficiales bajas. Además, después de la reducción de la subfase de las muestras que contienen péptidos sin palmitoilar, se perdió la capacidad para alcanzar la tensión superficial estable cercana al cero después de unas pocas etapas de absorción, mientras que con el péptido dipalmitoilado la calidad de la película no se deterioró incluso después de más de diez etapas de extensión y la incorporación de material de reserva equivalente a más de dos monocapas. La actividad superficial mejorada de los péptidos dipalmitoilados también se demostró mediante tensioactivímetro de burbuja pulsátil. Además, se encontró que la presencia de grupos acilo reducía adicionalmente la tendencia a formar oligómeros. Este hallazgo es muy importante, ya que durante la preparación de los tensioactivos artificiales, se ha encontrado que la oligomerización de los péptidos impide la preparación de las mezclas a concentraciones mayores de 20 mg/ml (Nilsson y col., Eur. J. Biochem. 1998, 255, 116-124).

El tensioactivo sintético puede prepararse mezclando soluciones o suspensiones de péptidos y lípidos y mediante secado subsecuente de la mezcla.

Cuando sea necesario, la mezcla seca puede suspenderse, dispersarse o administrarse como tal a sujetos en necesidad de tratamiento de insuficiencia tensioactiva.

El tensioactivo sintético se administrará, preferentemente, endotraquealmente , o por medio de un aerosol. La última forma de administración requerirá la combinación de pequeñas partículas de tensioactivo con un propelente inerte adecuado. Otras formas de administración, como la nebulización o la pulverización de soluciones / suspensiones estables de tensioactivo también se incluyen dentro del alcance de la invención.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de los péptidos descritos para la preparación de un agente tensioactivo para usarse en todos los casos de insuficiencia o disfunción tensioactivas del adulto o neonatal, enfermedades pulmonares relacionadas tales como la neumonía, bronquitis, asma, síndrome de la aspiración de meconio y también otras enfermedades tales como la otitis media serosa (oído pegajoso).

Típicamente, el agente tensioactivo se usará, preferentemente, tras la administración endotraqueal, en el tratamiento del síndrome disneico que afecta frecuentemente a los niños prematuros.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención en más detalle.

Ejemplo 1 Síntesis y purificación de los péptidos

Se sintetizó un análogo de la SP-C, SP-C(LKS) (figura 1) mediante el uso de la tecnología en fase sólida por etapas y la química del tert-butiloxicarbonilo (Kent, S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57, 957-989) en un instrumento 430A de Applied Biosystems. El corte del enlace del péptido con la resina y la desprotección de las cadenas laterales se llevaron a cabo en fluoruro de hidrógeno anhidro / metoxibenceno / dimetilsulfuro, 10:1:1 (vol. / vol. / vol.) durante 1,5 horas a 0ºC. se eliminaron los grupos protegidos y los barredores mediante extracción repetida con éter dietílico y el péptido se extrajo subsecuentemente a partir de la resina mediante diclorometano / ácido trifluoroacético (TFA) 3:1 (vol. / vol.) seguido de evaporación rotatoria. El extracto del péptido bruto se disolvió de nuevo a una concentración de 100 mg/ml en cloroformo / metanol 1:1 (vol. / vol.), que contenía H_{2}O 5%. Se aplicó una parte alícuota de 10 mg en una columna de Sephadex LH-60 (40 x 1 cm) en el mismo disolvente (Curstedt, T. y col., (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262). Se recogieron fracciones de 2,5 ml y se midieron las absorbancias a 214 y 280 nm. La identificación y cuantificación se realizaron mediante análisis aminoacídico.

Para la acilación, el péptido purificado (típicamente, aproximadamente, 5 mg) se secó, se disolvió en TFA destilado (100 \mul) y se añadió cloruro de acilo (10-20 equivalentes en comparación con el péptido). Después de 10 minutos, la reacción se inactivó con etanol acuoso 80% (1,9 ml). La purificación de los péptidos acilados se realizó usando cromatografía en Lipidex 5000 en cloruro de etileno / metanol 1:4 (vol. / vol.) seguida de HPLC de fase inversa en una columna C18 usando un gradiente lineal de 2-propanol / TFA 0,1% desarrollado en metanol (acuoso) 60% / TFA 0,1% o etanol (acuoso) 75% / TFA 0,1%.

Ejemplo 2 Caracterización bioquímica

Se controló la pureza del péptido mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida (PAGE) (Phast-system, Pharmacia, Suecia) y mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (HPLC), usando una columna C18 y un gradiente lineal de metanol acuoso 60% / TFA 0,1% e isopropanol / TFA 0,1% (Gustafsson, M. y col., (1997) Biochem. J. 326, 799-806).

Las masas moleculares se determinaron mediante espectrometría de masas con ionización por desorción mediante láser, asistida por matriz (MALDI-TOF) (Lasermat 2000, Finnigan MAT) calibrada con péptido intestinal vasoactivo (M_{r} 3326,8).

La estructura secundaria del péptido se investigó usando espectroscopía de dicroísmo circular (CD) (Jasco-720 Jasco, Japón). Después de la solubilización con trifluoroetanol (TFE) se registraron los espectros de 260 a 184 nm con una velocidad de exploración de 20 nm/minuto y una resolución de 2 puntos de datos/nm. Se calculó la elipticidad molar residual y se expresó en kdeg x cm^{2}/dmol. Se utilizaron las elipticidades molares a 208 y 222 nm para estimar el contenido de estructura en hélice (Barrow, C.J. y col., (1992) J. Mol. Biol. 225, 1075-1093).

Las investigaciones de la estructura secundaria de la SP-C(LKS) usando espectroscopía CD mostraron un espectro típico de péptidos con \alpha-hélice y estimó el contenido en \alpha-hélice en, aproximadamente, 75% a partir de los mínimos a 208 nm y 222 nm. La estructura secundaria permaneció estable después de la dilución poco a poco con H_{2}O hasta TFE 12% con la condición de que el péptido se solubilizara en TFE puro.

La SDS-PAGE de la SP-C(LKS) mostró una banda única similar a la SP-C natural mientras que la SP-C(Leu) que ha perdido Lys en la parte de la hélice forma oligómeros. Al contrario que en la experiencia de los autores con mezclas de SP-C(Leu) / lípidos, que son difíciles de solubilizar a concentraciones mayores de 20 mg/ml (Nilsson, G. y col. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124), fue posible hacer una mezcla de SP-C(LKS) / lípidos con una concentración lipídica de 80 mg/ml y una relación polipéptido / lípido del 0,03.

Ejemplo 3 Preparación de mezclas de péptido / lípidos

La DPPC, el PG y el PA se compraron todos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se mezclaron los lípidos, disueltos en cloroformo / metanol 98:2 (vol. / vol.), en las proporciones DPPC:PG:PA de 68:22:9 (peso / peso / peso) o DPPC / PG de 7:3 (peso / peso). Se prepararon las preparaciones de tensioactivos añadiendo SP-C(LKS) sola o SP-C(LKS) y SP-B a cada una de las mezclas de lípidos, a una relación polipéptido / lípidos en peso de 0-0,05. Se evaporaron las mezclas en nitrógeno y se suspendieron de nuevo en NaCl 150 mmoles/litro o en tampón de Hepes 10 mmoles/litro, pH 6,9, que contenía NaCl 140 mmoles/litro y CaCl_{2} 2,0 mmoles/litro, a concentraciones lipídicas de 10-80 mg/ml. Se realizó una congelación repetida y sonicación (50 W, 48 kHz) hasta que se consiguieron suspensiones homogéneas. En algunos casos, las suspensiones finales se incubaron a 45ºC durante 1 hora.

Las preparaciones de tensioactivos se suspendieron en NaCl 150 mmoles/litro que tenía un pH de 3,5-5,5. Se respetaron los valores de pH inferiores de 3,5-4,5 en las preparaciones que contenían SP-B. Puesto que la SP-B natural se purifica usando disolventes orgánicos ácidos (Curstedt, T. y col. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262) pueden quedar pequeñas cantidades de ácidos en las preparaciones. Se obtuvo un pH casi fisiológico suspendiendo la preparación de tensioactivos en tampón de Hepes, pH 6,9, que contenía NaCl 140 mmoles/litro y CaCl_{2} 2 mmoles/litro (tabla 1). En comparación con las preparaciones correspondientes en solución salina sin tamponar no hubo cambios en la \gamma_{max} o la \gamma_{min} cuando se usó DPPC/PG 7:3 (peso / peso) como mezcla lipídica. Sin embargo, cuando se incluyó el PA en la mezcla lipídica tanto la \gamma_{max} como la \gamma_{min} aumentaron en el pH mayor (tablas 1 y 2).

TABLA 1 Propiedades superficiales de las preparaciones de tensioactivos artificiales en solución salina fisiológica

Las medidas se llevaron a cabo directamente después de la preparación de las muestras o después de incubación durante 1 hora a 45ºC. La concentración de fosfolípidos fue 10 mg/ml en NaCl 150 mmoles/litro. Los registros se obtuvieron en diferentes periodos de tiempo con un tensioactivímetro de burbuja pulsátil a 37ºC, compresión superficial del 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto. Los valores son la media (desviación típica) de 3-5 medidas. Las abreviaturas se definen en el texto.

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TABLA 2 Propiedades superficiales de las preparaciones de tensioactivos artificiales en solución salina tamponada

Las medidas se llevaron a cabo en muestras que contenían fosfolípidos a la concentración de 10 mg/ml en tampón de Hepes (pH 6,9), conteniendo a su vez NaCl 140 mmoles/litro y CaCl_{2} 2,0 mmoles/litro. Los registros se obtuvieron en diferentes periodos de tiempo con un tensioactivímetro de burbuja pulsátil a 37ºC, compresión superficial del 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto. Los valores son la media (desviación típica) de 3-5 medidas. Las abreviaturas se definen en el texto.

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Ejemplo 4 Preparación de mezclas de fosfolípidos con SP-C(LKS) y polimixina B

La DPPC y el PG se compraron a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se mezclaron los fosfolípidos, disueltos en cloroformo / metanol 98:2 (vol. / vol.), en la proporción DPPC/PG de 7:3 (peso / peso). Se añadió SP-C(LKS) a las mezclas de fosfolípidos, a una relación polipéptido / fosfolípido en peso de 0,03. Se evaporaron las mezclas en nitrógeno y se suspendieron de nuevo a temperatura ambiente en tampón de Hepes 10 mmoles/litro, pH 6,9, que contenían NaCl 140 mmoles/litro y CaCl_{2} 2,0 mmoles/litro o en el mismo tampón que contenía polimixina B (PxB) 001% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se realizó una congelación repetida y sonicación (50 W, 48 kHz) hasta que se consiguieron suspensiones homogéneas. La concentración final de fosfolípidos en ambas preparaciones fue de 10 mg/ml. La adición de PxB disminuyó tanto la \gamma_{min} como la \gamma_{max} y se obtuvo una actividad superficial óptima
(tabla 3).

TABLA 3 Propiedades superficiales del tensioactivo artificial con y sin polimixina B

Los registros se obtuvieron en diferentes periodos de tiempo con un tensioactivímetro de burbuja pulsátil a 37ºC, compresión superficial del 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto. Los valores son la media (desviación típica) de 5-11 medidas. Las abreviaturas se definen en el texto.

3

Ejemplo 5 Caracterización biofísica

Se midió la cinética de extensión de superficie a, aproximadamente, 34-37ºC con una balanza de superficies de Wilhelmy (Biegler, Viena, Austria). Se controló la tensión superficial durante 10 min usando una placa de platino conectada a un calibrador de tensión e insertado 1 mm en una hipofase de 20 ml de NaCl 150 mmoles/litro en una depresión de teflón. Se añadieron las suspensiones como gotas, 1 mg de lípidos total, sobre la hipofase, a 4 cm de la placa de platino.

Las medidas cinéticas de la SP-C(LKS) 3% en peso en DPPC/PG, 7:3 (peso / peso), usando la balanza de Wilhelmy, mostraron una rápida extensión con una tensión superficial de 28 mN/m después de 3 s (figura 2). La extensión fue, de algún modo, menor usando la SP-C(LKS) 1% en peso en la misma mezcla lipídica (datos sin mostrar). La adición de SP-B 2% en peso no cambió, significativamente, la velocidad de extensión o la tensión superficial del equilibrio (figura 2). No se observaron mejoras después de la incubación de la mezcla durante 1 hora a 45ºC (datos sin mostrar). Se obtuvieron resultados similares con DPPC:PG:PA, 68:22:9 (peso / peso / peso) como mezcla lipídica (datos sin mostrar).

Se registró la tensión superficial dinámica usando un tensioactivímetro de burbuja pulsátil (Surfactometer International, Toronto, Canadá) a 37ºC durante la compresión cíclica al 50% de la superficie de la burbuja y a una frecuencia de 40 ciclos por minuto. Todas las medidas se realizaron durante 5 minutos y a una concentración lipídica de 10 mg/ml. Se midieron los gradientes de presión a lo largo de la pared de la burbuja en intervalos de tiempo específicos y se usó para calcular las tensiones superficiales en el tamaño de burbuja mínimo (\gamma_{min}) y máximo (\gamma_{max}).

En el tensioactivímetro de burbuja pulsátil, la SP-C(LKS) 3% en peso en DPPC:PG:PA, 68:22:9 (peso / peso / peso), produjo una tensión superficial menor de 1 mN/m en el radio mínimo de burbuja (\gamma_{min}) mientras que se observó una \gamma_{min} de 9-14 mN/m con SP-C(LKS) 3% en peso en DPPC:PG, 7:3 (peso / peso) (tabla 1). La tensión superficial en el radio máximo de burbuja (\gamma_{max}) fue, aproximadamente, 40 mN/m en ambos casos. La adición de SP-B 2% en peso proporcionó valores de \gamma_{max} de 31-33 mN/m y de \gamma_{min} de 0-2 mN/m para ambas preparaciones lipídicas. Estos valores son muy similares a los obtenidos con preparaciones tensioactivas aisladas a partir de fuentes naturales (Robertson, B. y col. (1990) Prog. Respir. Res. 25, 237-246). La incubación de las preparaciones a 45ºC durante 1 hora no tuvo un efecto significativo sobre la actividad superficial (tabla 1). Al disminuir la cantidad de SP-B hasta 0,5% en peso en SP-C(LKS) 3% en peso en DPPC:PG 7:3 (peso / peso) la \gamma_{min} tiende a aumentar, aunque los resultados no alcanzaron una significación estadística (tabla 1). Al contrario que la SP-B, la adición de KL4 2% en peso (Cochrane, C.G. y Revak, S.D. (1991) Science 254, 566-568) a SP-C(LKS) 3% en peso en DPPC:PG:PA 68:22:9 (peso / peso) no redujo la \gamma_{max} que permaneció relativamente alta a 41-42 mN/m.

Ejemplo 6 Comparación entre mezclas que contienen péptidos de referencia dipalmitoilados y sin palmitoilar

Se prepararon preparaciones tensioactivas añadiendo SP-C(Leu) 3% peso / peso o SP-C(Leu) dipalmitoilada a cada mezcla lipídica, hecha de DPPC/PG/PA 68:22:9 peso / peso / peso. Se evaporaron las mezclas en nitrógeno y se suspendieron de nuevo en NaCl 150 mmoles/litro a concentraciones lipídicas de 10 mg/ml. En las muestras en las que se usó también un sustituyente de la SP-B, se añadió polimixina B 1% peso / peso.

Las mezclas que contenían SP-C(Leu) dipalmitoilada, con o sin polimixina B, mostraron una mejora significativa, especialmente, a la hora de reducir la \gamma_{max} a 5 min y la \gamma_{min} en intervalos de tiempo anteriores.

TABLA 4 Propiedades superficiales

Se obtuvo la tensión superficial de las mezclas con un tensioactivímetro de burbuja pulsátil. Después de dos minutos de equilibrio, se obtuvieron los registros en diferentes periodos, a 37ºC, compresión superficial del 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto.

4

Ejemplo 7 Determinación in vivo

Se evaluó el efecto de la terapia con tensioactivos sobre las propiedades mecánicas de pulmones inmaduros en 9 conejos prematuros recién nacidos con una edad de gestación de 27 días. Se traqueotomizaron los animales en el momento de su nacimiento y cinco de ellos recibieron dos veces, a través de una cánula traqueal, 2,5 ml/kg de tensioactivo artificial que contenía DPPC, PG y SP-C(LKS), con o sin polimixina B, en las proporciones proporcionadas anteriormente. La concentración de fosfolípidos total del material tensioactivo exógeno fue de 40 mg/ml. Dos animales, que servían como control negativo, no recibieron material a través del tubo traqueal, y otros dos, que servían como control positivo, se trataron con la misma dosis de tensioactivo natural modificado (Curosurf, Chiesi Farmaceutici Spa, Parma , Italia), diluido hasta 40 mg/ml. Un animal se trató con una mezcla de DPPC y PG en solución salina (mismas concentraciones que anteriormente) a una dosis de 2,5 mg/kg. Todos los animales se mantuvieron en cajas corporales pletismográficas a una temperatura de 37ºC y con ventilación en paralelo durante 60 minutos con oxígeno 100%, usando un Servoventilador 900B (Siemens-Elema, Solna, Suecia) ajustado a una frecuencia de 40 minutos y un tiempo de inspiración del 50%. Se midieron los volúmenes corrientes con un pneumotacógrafo conectado a cada caja pletismográfica. Los animales fueron ventilados con un volumen corriente estándar de 8-10 ml/kg y sin una presión positiva al final de la espiración (PEEP). Se definió el cumplimiento pulmón-tórax como la relación entre el volumen corriente y la presión pico de inspiración, y se expresó como ml/cm H_{2}O kg.

En comparación con el animal control sin tratar, el cumplimiento mejoró significativamente en los animales tratados con el tensioactivo artificial, especialmente, en el animal que recibió el tensioactivo que contenía polimixina B. De modo notable, la mejora parece ser superior a la vista después del tratamiento con una dosis similar de tensioactivo natural modificado (figura 3).

Breve descripción de las figuras Figura 1 Secuencias de aminoácidos y presentaciones en rueda de las hélices de la SP-C y sus análogos

Se toma la secuencia de la SP-C humana de Johansson, J. y col. (1988) FEBS Lett. 232, 61-64 y la de la SP-C(Leu) de Nilsson, G. Y col. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124). La SP-C(LKS) está basada en la estructura primaria de la SP-C pero todos los restos de Val en las posiciones 16-28, con la excepción de la posición 17, se sustituyeron por restos de Leu, restos de Lys se han introducido en las posiciones 17, 22 y 27, y las Cys palmitoiladas en las posiciones 5 y 6 se sustituyeron por Ser.

Figura 2 Extensión superficial de las preparaciones de tensioactivos sintéticos

Cinética de extensión de la SP-C(LKS) 3% en peso (cuadrados rellenos, línea continua) y de la SP-C(LKS) 3% en peso con adición de SP-B 2% en peso (triángulos vacíos, línea discontinua). Se examinaron todas las preparaciones a una concentración de 10 mg/ml de DPPC/PG, 7:3 (peso / peso) en NaCl 150 mmoles/litro. Se obtuvieron los registros con una balanza de Wilhelmy y cada punto de datos es la media de tres registros diferentes.

Figura 3 Resultados in vivo

Cumplimiento pulmón-tórax en 5 conejos prematuros recién nacidos (edad de gestación de 27 días) ventilados con un volumen corriente estándar de 8-10 mg/kg y sin una presión positiva al final de la espiración (PEEP). El cumplimiento mejoró significativamente en los animales tratados. La adición de polimixina B (PxB) parece aumentar el efecto del tensioactivo artificial. La concentración de fosfolípidos es la misma en todas las preparaciones de tensioactivos, es decir, 40 mg/ml.

<110> Chiesi Farmaceutici spa

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<120> Péptidos artificiales que tienen actividad superficial y uso de los mismos en la preparación de tensioactivos artificiales

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<130> chiesi

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<140>

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<141>

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<150> MI99A000275

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<151> 1999-02-12

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidos sintéticos

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<400> 1

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\sa{Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu}

\sac{Lys Leu Leu Leu Leu Lye Ile Leu Leu Leu Lys Leu Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

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<210> 2

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidos sintéticos

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<400> 2

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\sa{Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu}

\sac{Leu Lye Leu Leu Leu Leu Ile Lye Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

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<210> 3

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidos sintéticos

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<400> 3

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\sa{Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu}

\sac{Lye Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

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<210> 4

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidos sintéticos

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<400> 4

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\sa{Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu}

\sac{Leu Leu Leu Leu Lye Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

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<210> 5

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidos sintéticos

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<400> 5

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\sa{Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu}

\sac{Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Lys Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

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<210> 6

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptidos sintéticos

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<400> 6

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\sa{Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu}

\sac{Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Leu}

\sac{Met Gly Leu}

Claims

1. Análogos de la SP-C que tienen la fórmula general (I), de acuerdo con el código de aminoácidos de una letra:

(I)F_{e}G_{f}IPZZPVHLKR(X_{a}B)_{n}(X_{b}B)_{n}(X_{c}B)_{m}X_{d}GALLMGL

en la que:

X: es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por I, L, Nle (norleucina);

B: es un aminoácido seleccionado del grupo constituido por K, W, F, Y, ornitina;

Z: es S y puede estar opcionalmente unido a través de un enlace éster con un grupo acilo que contiene 12-22 átomos de carbono.

a: es un número entero de 1 a 19;

b: es un número entero de 1 a 19;

c: es un número entero de 1 a 21;

d: es un número entero de 0 a 20;

e: es 0 ó 1;

f: es 0 ó 1;

n: es 0 ó 1;

m: es 0 ó 1;

con las condiciones siguientes:

-: n + m > 0,

-: f \geq e;

-: (X_{a}B)_{n}(X_{b}B)_{n}(X_{c}B)_{m}X_{d} es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferentemente, de 10 a 22 aminoácidos.

2. Análogos de la SP-C de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen la fórmula (Ia):

(Ia)FGIPSSPVHLKRX_{4}BX_{4}BX_{4}BXGALLMGL

3. Análogos de la SP-C de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen la fórmula (Ib):

(Ib)FGIPSSPVHLKRX_{5}BX_{5}BX_{4}GALLMGL

4. Análogos de la SP-C de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen la fórmula (Ic):

(Ic)FGIPSSPVHLKRX_{4}BX_{11}GALLMGL

5. Análogos de la SP-C de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen la fórmula (Id):

(Id)FGIPSSPVHLKRX_{8}BX_{7}GALLMGL

6. Análogos de la SP-C de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen la fórmula (Ie):

(Ie)FGIPSSPVHLKRX_{11}BX_{4}GALLMGL

7. Análogos de la SP-C de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, en los que los restos de Ser están acilados preferentemente con grupos palmitoilo.

8. Análogos de la SP-C de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en los que B es lisina o fenilalanina y X es leucina, isoleucina o norleucina.

9. Análogos de la SP-C de acuerdo con la reivindicación 8, seleccionados del grupo constituido por:

SP-C (LKS) FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLKILLLKLGALLMGL

SP-C (LKS)_{1} FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL

SP-C (LKS)_{2} FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL

SP-C (LKS)_{3} FGIPSSPVHLKRLLILLLLLKLILLLILGALLMGL

SP-C (LKS)_{4} FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL

SP-C (LFS) FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL

10. Un tensioactivo sintético que comprende, al menos, un análogo de la SP-C de fórmula (I) mezclado con lípidos y fosfolípidos.

11. Un tensioactivo sintético de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mezcla de lípidos / fosfolípidos comprende DPPC, PG, PA.

12. Un tensioactivo sintético de acuerdo con las reivindicaciones 10-11, que comprende adicionalmente SP-B o un derivado activo de la misma o una polimixina.

13. Un tensioactivo sintético de acuerdo con las reivindicaciones 10-12, en forma de solución, dispersión, suspensión, polvo seco.

14. Uso de los análogos de la SP-C de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un tensioactivo artificial para usar en todos los casos de insuficiencias tensioactivas pulmonares y disfunciones relacionadas.

15. Uso de una polimixina, preferentemente, polimixina B para la preparación de un tensioactivo artificial de acuerdo con las reivindicaciones 10-13, para el tratamiento de todos los casos de insuficiencias tensioactivas pulmonares y disfunciones relacionadas.

16. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 14 y 15, en el que la insuficiencia tensioactiva es el síndrome disneico.