DE60015082T2

DE60015082T2 - Künstliche peptide mit oberflächenaktivität und ihre verwendung zur herstellung von künstlichen tensiden

Info

Publication number: DE60015082T2
Application number: DE60015082T
Authority: DE
Inventors: Tore Curstedt; Jan Johansson; Hans Jörnvall; Bengt Robertson; Paolo Ventura
Original assignee: Chiesi Farmaceutici SpA
Current assignee: Chiesi Farmaceutici SpA
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-02-10
Also published as: US7053044B1; HK1042500A1; SK286428B6; PT1151008E; DE60015082D1; TR200102308T2; HUP0200141A2; HUP0200141A3; GEP20032976B; EE04879B1; BR0009964A; JP4754073B2; BG65196B1; HU228997B1; EA004058B1; PL201084B1; IT1308180B1; ZA200106530B; NO20013888D0; CA2362507A1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt neue künstliche Peptide mit Oberflächenaktivität bereit. Insbesondere stellt die Erfindung SP-C-Analoga bereit, die bei Kombination mit geeigneten Lipiden besonders effektiv bei der Verminderung der Oberflächenspannung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche sind.
Daher können die erfindungsgemäßen Peptide in Kombination mit Lipiden und gegebenenfalls in Kombination mit SP-B oder einem aktiven Analogon davon oder einem Substitut von SP-B zur Herstellung von künstlichen Surfaktants verwendet werden, die bei der Behandlung von Atemwegssyndrom (Respiratory Distress Syndrome (RDS)), weiteren Surfaktant-Mängeln oder -Dysfunktionen, verwandten Lungenerkrankungen wie Pneumonie, Bronchitis, Asthma, Mekoniumaspirationssyndrom und ebenfalls weiteren Erkrankungen wie seröser Otitis Media (Paukenerguss) verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Lungen-Surfaktant vermindert die Oberflächenspannung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche der Alveolenwand, und verhindert, dass die Lungen am Ende des Ausatmens kollabieren. Surfaktant-Mangel ist eine verbreitete Erkrankung bei unreifen Säuglingen und verursacht akutes Lungenversagen (RDS), welches effektiv mit natürlichen Surfaktants behandelt werden kann, die aus Tierlungen extrahiert werden (Fujiwara, T. und Robertson B. (1992) in: Robertson, B., van Golde, L.M.G. und Batenburg, B. (Herausgeber) Pulmonary Surfactant; From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam, Elsevier, Seite 561–592). Die Hauptbestandteile dieser Surfaktant-Präparate sind Phospholipide wie 1,2-Dipalmifoyl-sn-glydero-3-phosphocholin (DPPC), Phosphatidylglycerol (PG) und die hydrophoben Surfaktant-Proteine B und C (SP-B und SP-C). Die hydrophilen Surfaktant-Proteine SP-A und SP-D, die kollagenartige Lectine vom C-Typ (Ca²⁺-abhängig) sind und von denen angenommen wird, dass sie primär im Wirts-Verteidigungssystem wirken, sind normalerweise nicht in den Surfaktant-Präparaten enthalten, da Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln verwendet werden.
SP-B und SP-C stellen nur etwa 1–2 % der Surfaktantmasse dar, sind aber immer noch fähig, dramatische Verbesserungen der Oberflächenaktivität auszuüben, verglichen mit reinen Lipidpräparaten (Curstedt, T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255–262; Takahashi, A., Nemoto, T. und Fujiwara, T. (1994) Acta Paediatr. Jap. 36, 613–618). Die Primär- und Sekundärstrukturen von SP-B und SP-C und eine tertiär Struktur von SP-C in Lösung wurden bestimmt (siehe 4). SP-B besteht aus zwei identischen Polypeptidketten aus 79 Aminosäuren, die mit einer Disulfidbrücke zwischen den Ketten (interchain disulfide bridge) verbunden sind (Curstedt, T. et al. (1990) proc. Atl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2985–2989; Johansson, J., Curstedt, T. und Jörnvall, H. (1991 ) Biochemistry 30, 6917–6921). Jede monomere Kette hat drei Disulfidbrücken zwischen den Ketten und mindestens 4 amphipatische Helices, die eine polare und eine unpolare Seite aufweisen, durch die SP-B mit zwei Lipiddoppelschichten wechselwirken und diese in enge Nachbarschaft bringen kann (Andersson, M. et. (1995) FEBS Lett. 362, 328–332). SP-C ist ein Lipoprotein, das aus 35 Aminosäureresten und einer α-helikalen Domäne zwischen den Resten 9–34 aufgebaut ist (Johansson, J. et al. (1994) Biochemistry 33, 6015–6023). Die Helix ist hauptsächlich aus Valyl-Resten aufgebaut und ist in einer Lipid-Doppelschicht eingebettet und parallel zu den Lipid-Acylketten orientiert (Vandenbussche, et al. (1992) Eur. J. Biochem. 203, 201–209). Zwei Palmitoylgruppen sind kovalent mit Cysteinresten in Position 5 und 6 an N-terminalen Bereich des Peptids gebunden (Curstedt, T. et al. (1 990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2985–2989). Die beiden beibehasltenen positiv geladenen Reste, Arginin und Lysin, in den Positionen 11 und 12 wechselwirken möglicherweise mit den negativ geladenen Kopfgruppen der Lipidmembran und erhöhen so die Steifigkeit. Die Steifigkeit der Lipid-Peptid-Wechselwirkung kann in Richtung auf das C-terminate Ende abnehmen, da es nur kleine oder hydrophobe Reste enthält, was diesen Teil in einer Phospholipid-Doppelschicht potentiell mobiler macht. Es wird angenommen, dass SP-D die Dicke und Fluidität der umgebenden Lipide durch die extrem stabile Poly-Valyl-Helix beeinflusst (Johannson, J. und Curstedt, T. (1997) Eur. J. Biochem. 244, 675–693).
Stand der Technik
Da aus Tiergewebe erhaltene Surfakte-Präparate einige Nachteile aufweisen, wie ihre Verfügbarkeit in begrenzten Mengen und die Möglichkeit, dass sie infektiöse Agentien enthalten und immunologische Reaktion auslösen, wurden Versuche unternommen, künstliche Surfaktants zu schaffen (Johansson, J. und Curstedt, T. (1997) Eur. J. Biochem. 244, 675–693; Johansson, J. et al. (1996) Acta Paediatr. 85, 642–646), üblicherweise aus synthetischen Lipiden und hydrophoben Proteinen.
Frühere Arbeit hat gezeigt, dass synthetisches SP-C sich nicht wie das native Peptid zu einer α-helikalen Konformation falten kann, die für die optimale Oberflächenaktivität notwendig ist (Johansson. J. et al (1995) Biochem. J. 307, 535–541 ), und daher nicht in geeigneter Weise mit den Surfaktant-Lipiden Wechselwirken.
Dementsprechend falten sich synthetische SP-C Analoga nicht wie das native Peptid und wechselwirken nicht korrekt mit Surfaktant-Lipiden. Um dieses Problem zu umgehen, wurden einige Versuche unternommen, um die Sequenz zu modifizieren, beispielsweise durch Ersetzen aller helikalen Val-Reste im nativen SP-C durch Leu, welcher stark die α-helikale Konformation begünstigt. Das entsprechende transmembranöse Analogon, SP-C(Leu), zeigte gutes Spreiten an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfäche bei Kombination mit DPPC:PG:PA (68:22:9) (w/w/w). Der maximale Oberflächenspannungswert während der zyklischen Oberflächenkompression (γ_max) war jedoch signifikant höher als der von nativem Surfaktant. Es war darüber hinaus nicht möglich, Lipid-Peptid-Mischungen mit höheren Konzentrationen als etwa 20 mg/ml herzustellen, wahrscheinlich aufgrund der Bildung von Peptidoligomeren (Nilsson, G. et al. (1998) Eur. J. Bochem. 255, 116–124). Andere haben bioaktive Polyleucin-SP-C-Analoga verschiedener Längen synthetisiert (Takei. T. et al. (1996) Biol. Pharm. Bull. 19, 1550–1555). In den letztgenannten Studien wurde weder über Selbstoligomerisation noch über Probleme bei der Herstellung von Proben mit hoher Lipidkonzentration berichtet.
Unterschiedliche Publikationen behandeln das Problem der Bereitstellung von peptidischen Analoga natürlicher Surfaktant-Peptide und geben eine Anzahl unterschiedlicher Lösungen an. Von diesen Publikationen offenbaren WO 93 21225, EP 733 645 , WO96 17872, von Tokyo Tonabe, Peptidanaloga von natürlichem SP-C, die sich im allgemeinen vom nativen Peptid hinsichtlich der Sequenz des N-terminalen Teils unterscheiden. Die Patentanmeldung WO 89 06657 und WO92 22315 des Scripps Research Institute offenbaren SP-B Analoga mit alternierenden hydrophoben und hydrophilen Aminosäureresten. Unter anderem wird ein Peptid mit alternierenden Leucin und Lysin-Resten (KL₄) beansprucht.
Clercx A. et al., Eur. J. Biochem 229, 465–72, 1995 offenbaren Peptide unterschiedlicher Länge, die den N-Terminus von Schweine-SP-C entsprechen und Hybridpeptide, die von Schweine-SP-C und Bakteriorhodopsin abgeleitet sind.
Johansson J. et al., Biochem. J. 307, 535 :41, 1995 offenbaren synthetische Peptide, die sich von nativem Schweine-SPC durch Substitution einiger Aminosäuren unterscheiden.
WO 89/04326 von California Biotechnology – Byk Gulden und WO 91 / 18015 von California Biotechnology – Scios Nova offenbaren SP-C-Analoga, welche eine anfängliche N-terminale Sequenz enthalten, in der zwei Cys des natürlichen SP-C durch zwei Ser ersetzt sind.
Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun gefunden, dass SP-C-analoge Peptide, die die folgenden Merkmale kombinieren: i) Substitution von Val-Resten von SP-C durch Ile-, Leu- oder Nle-Reste; ii) Substitution von Cys-Resten durch Ser-Reste; iii) Insertion von positiv geladenen oder sperrigen Aminosäureresten in die SP-C-Sequenz besonders günstige Eigenschaften hinsichtlich der Oberflächenspannungsverminderung zeigen. Insbesondere wurde gefunden, dass das letztere Merkmal, aufgrund der positiven Ladungen, die durch die polaren Reste oder der sterischen Hinderung, welche von den sperrigen Substituenten beigetragen wird, es ermöglicht, die Selbstoligomerisation zu vermeiden.
Wie folgt, stellt die Erfindung entsprechend einem ersten Aspekt SP-C-Analoga bereit, welche die folgende allgemeine Formel (I) aufweisen, unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Aminosäurecodes:
wobei;
X eine Aminosäure ist, die ausgewählt aus der aus V, I, L, Nle (Norleucine) bestehenden Gruppe;
B eine Aminosäure ist, die ausgewählt wird aus der aus Ornithin, K, I, W, F, Y, Q, N bestehenden Gruppe;
Z eine Aminosäure ist, die ausgewählt wird aus der aus S, C, F bestehenden Gruppe, wobei Ser- oder Cys-Reste gegebenenfalls durch Ester- oder Thioester-Bindungen an Acylgruppen gebunden sind, welche 12–22 gebundene Kohlenstoffatome enthalten.
a eine ganze Zahl von 1 bis 19 ist
b eine ganze Zahl von 1 bis 19 ist
c eine ganze Zahl von 1 bis 21 ist
d eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist
e 0 oder 1 ist
f 0 oder 1 ist
n 0 oder 1 ist
m 0 oder 1 ist
unter den Bedingungen:
– n + m > 0
– f ≥ e;
– (X_aB)_n(X_bB)_n(X_cB)mXd ist eine Sequenz mit einer maximalen Anzahl von 22 Amonisäuren, bevorzugt von 10 bis 22.
Bevorzugte Peptide der Formel (I) haben die folgenden Sequenzen:
Von den Sequenzen (Ia) – (Ie), sind diejenigen bevorzugt, welche (B) = Lys or Phe und X = Leu, Ile oder Nle aufweisen.
Entsprechend bevorzugten Ausführungsförmen haben Peptide der Formel (Ia) – (If) jeweils die folgenden Sequenzen:
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung sind die Ser-Reste kovalent an 1 2 bis 22 Kohlenstoffatomen enthaltende Acylgruppen gebunden.
Peptide der Formel (I) können durch synthetische Verfahren oder rekombinante Techniken hergestellt werden.
Konventionelle synthetische Verfahren sind beispielsweise in Schroeder et al., „The peptides", Band 1, Academic Press, 1965; Bodanszky et al., „Peptide synthesis", Interscience Publisher, 1996; Baramy & Merrifield, „The peptides; Analysis, Synthesis, Biology", Band 2, Kapitel 1 , Academic Press, 1980 beschrieben. Diese Techniken schließen Peptidsynthese in fester Phase, in Lösung, synthetische Verfahren der organischen Chemie oder beliebige Kombinationen davon ein.
S- oder O-acylierte Peptide werden bevorzugt durch Behandlung der nicht-acylierten Peptide mit Acylchlorid in reiner Trifluoressigsäure hergestellt wie in Yousefi-Salakdeh et al. Biochem J 1999, 343, 557–562 beschrieben. Nach der Synthese und Reinigung wurden die synthetischen Peptide biochemisch und biophysikalisch charakterisiert, wie im folgenden Abschnitt „Beispiele" berichtet.
Die Aktivität der Peptide gemäß der Erfindung bei der Verminderung der Oberflächenspannung wurde in Kombination mit Lipiden und Phospholipiden, SP-B, Analoga von SP-B oder Substituten von SP-B beurteilt. Insbesondere wurden die Peptide mit DPPC (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-2-phosphocholine)/PG (Phosphatidylglycerol)/PA (Palmitinsäure) mit oder ohne SP-B, einem aktiven Analogon davon und Polymyxinen kombiniert.
Die Ergebnisse der Oberflächenaktivitätstests mit pulsierenden Bläschen zeigen klar, dass die synthetischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung die minimale und maximale Oberflächenspannung während der zyklischen Oberflächenkompression (γ_min und γ_max) stark vermindern auf Werte, die vergleichbar sind mit denjenigen, die unter Verwendung von Surfaktant aus natürlichen Quellen erhalten werden.
Die Zugabe von SP-B oder einem aktiven Analogon davon zur Mischung Peptid-iLipid-Phospholipide ergab besonders günstige Ergebnisse. Weiter wurde überraschenderweise gefunden, dass Polymyxinde, insbesondere Polymyxin B, als Substituenten für SP-B wirken und dass ihre Zugabe vergleichbare Ergebnisse wie diejenigen ergab, die mit SP-B erzielt wurden.
Entsprechend einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein synthetisches Surfaktant bereit, umfassend ein oder mehr Peptide der Formel (I) im Gemisch mit Lipiden und/oder Phospholipiden und gegebenenfalls SP-B, einem aktiven Derivat davon oder Polymyxinen. Geeignete Lipide/Phospholipide können ausgewählt werden aus der aus Phosphatidylcholinen (bevorzugt DPPC) PG, PA, Triacylglycerinen, Sphingomyelin bestehenden Gruppe.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung werden Surfaktant-Mischungen, die das Peptid enthalten, in denen Palmitoyl-Ketten O-kovalent an die Ser-Reste gebunden sind, verwendet. Es wurde gefunden, dass Surfaktant-Mischungen, welche eine dipalmitoylierte Form des Referenzpeptids (SP-C(Leu)) enthalten, eine höhere Oberflächenfilmstabilität und eine erhöhte Größe des oberflächenassoziierten Lipidreservoirs aufweisen, verglichen mit Mischungen, die das entsprechende nicht-palmitoylierte Peptid enthalten, gemessen durch das kaptive Blasensystem. In den 5% dipalmitoyliertes Peptid enthaltenden Proben war γ_min unter 1,5 mN/m und die Filme sehr stabil, da die Oberflächenspannung um weniger als 0,5 mN/m innerhalb 10 Minuten bei konstantem Blasenvolumen anstieg. Im Gegensatz war γ_min für das nicht-palmitoylierte Peptid ungefähr 5 mN/m und die Filme waren weniger stabil, nachgewiesen durch häufiges Blasenzusammenfallen bei niedriger Oberflächenspannung. Darüber hinaus ging nach der Subphasen-Abreicherung bei Proben, die nicht-palmitoyliertes Peptid enthalten, die Fähigkeit zum Erreichen einer stabilen Oberflächenspannung nahe Null nach wenigen Absorbtionsschritten verloren, während mit den dipalmitoylierten Peptidfilmen die Filmqualität sich sogar nach mehr als 10 Expansionsschritten und nach Aufnahme von Reservoirmaterial äquivalent zu mehr als zwei Monoschichten nicht verschlechterte. Die verbesserte Oberflächenaktivität der dipalmitoylierten Peptide wurde auch mit einem Surfaktometer mit pulsierenden Bläschen demonstriert. Zusätzlich wurde gefunden, dass die Anwesenheit von Acylgruppen die Tendenz zur Bildung von Oligomeren weiter vermindert. Dieser Befund ist sehr wichtig, da während der Herstellung von künstlichen Surfaktants gefunden wurde, dass die Peptid-Oligomerisierung die Herstellung von Mischungen mit höheren Konzentrationen als 20 mg/ml behindert (Nilsson et al. Eur J. Biochem 1998, 255, 116–124).
Das synthetische Surfaktant kann hergestellt werden durch Mischen von Lösungen oder Suspensionen von Peptiden und Lipiden und durch anschließendes Trocknen der Mischung.
Bei der Gelegenheit kann die trockene Mischung suspendiert, dispergiert oder als solche Personen verabreicht werden, die einer Behandlung des Surfaktant-Mangels bedürfen.
Das synthetische Surfaktant wird bevorzugt endotracheal oder durch Aerosol gegeben. Die letztere Form der Gabe erfordert die Kombination kleiner Partikel des Surfaktants mit geeigneten inerten Treibmitteln. Andere Formen der Gabe wie Vernebelung oder Versprühen von stabilen Lösungen/Suspensionen des Surfaktants sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten.
Entsprechend einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung der beschriebenen Peptide zur Herstellung eines Surfaktant-Mittels bereit, das in allen Fällen von Surfaktant-Mangel oder -Dysfunktion bei Erwachsenen oder Neugeborenen, verwandten Lungenerkrankungen wie Pneumonie, Bronchitis, Asthma, Mekoniumaspirationssyndrom und auch anderen Erkrankungen wie seröser Otitis media (Paukenerguss) verwendet werden soll.
Üblicherweise wird das Surfaktant-Mittel bevorzugt durch endotracheale Gabe bei der Behandlung des Atemnotsyndroms verwendet, welches häufig unreife Säuglinge befällt.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung im größeren Detail:
Beispiel 1
Peptidsynthese und -Reinigung
Ein Analogon von SP-C, SP-C(LKS) (1) wurde durch Verwendung der schrittweisen Festphasentechnologie und der tert-Butyloxycarbonyl-Chemie (Kent, S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57, 957–989) in einem Applied Biosystems 430A-Gerät synthetisiert. Die Spaltung der Harz-Peptidbindung und die Entschützung der Seitenketten wurden in wasserfreiem Fluorwasserstoff/Methoxybenzol/Dimethylsulfid, 10:1:1 (v/v/v) während 1,5 h bei 0°C durchgeführt. Schutzgruppen und Fänger wurden durch wiederholte Extraktion mit Diethylether entfernt, und das Peptid wurde anschließend aus dem Harz durch Dichlormethan/ Trifluoressigsäure (TFA) 3:1 (v/v) extrahiert, gefolgt von Eindampfen mit dem Rotationsverdampfer. Der rohe Peptidextrakt wurde mit einer Konzentration von 100mg/ml in Chloroform/Methanol 1:1 (v/v), enthaltend 5% H₂O, erneut gelöst. Ein Aliquot von 10 mg wurde auf eine Sephadex LH-60-Säule (40 × 1 cm) in demselben Lösungsmittel aufgetragen (Curstedt, T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255–262). Fraktionen von 2,5 ml wurden gesammelt und die Absorptionen bei 214 und 280 nm gemessen. Die Identifikation und die quantitative Bestimmung wurden durch Aminosäureanalyse durchgeführt.
Zur Acylierung wird das gereinigte Peptide (typischerweise etwa 5mg) getrocknet, in destilliertem TFA (100 μl) gelöst, und Acylchlorid (10-20 Äquivalente verglichen mit dem Peptid) werden zugegeben. Nach 10 Minuten wird die Reaktion mit 80% wässrigem Ethanol (1,9 ml) abgebrochen. Die Reinigung der Acylpeptide wird durch Verwendung von Chromatographie über Lipidex 5000 in Ethylenchlorid/Methanol 1:4 (v/v) durchgeführt, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC mit einer C18 Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 2-Propanol/0,1 % TFA bis zu 60% (wässriges) Methanol/0,1%TFA oder 75% (wässriges) Ethanol/0,1 TFA.
Beispiel 2
Biochemische Charakterisierung
Die Reinheit des Peptides wurde durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) (Phast-System, Pharmacia, Schweden) und durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), unter Verwendung einer C₁₈-Säule und eines linearen Gradienten von 60% wässrigen Methanol/0,1%TFA und Isopropanol/0,1 TFA (Gustafsson, M. et al. (1997), Biochem. J. 326, 799–806) geprüft.
Die Molekularmassen wurden durch Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)- Massenspektrometrie bestimmt (Lasermat 2000, Finnigan MAT), wobei mit vasoaktivem intestinalem Peptid (M_r 3326,8) kalibriert wurde.
Die sekundäre Peptidstruktur wurde unter Verwendung von Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie untersucht (Jasco-730 Jasco, Japan). Nach Solubilisierung mit Trifluorethanof (TFE) wurden Spektren von 260 bis 1 84 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 20 nm/min und einer Auflösung von 2 Datenpunkten/nm aufgezeichnet. Die restliche molare Elliptizität wurde berechnet und in kdeg × cm²/dmol ausgedrückt. Die molaren Elliptizitäten bei 208 und 222 nm wurden zur Bestimmung des Gehalts an helikaler Struktur verwendet (Barrow, C.J. et al (1992) J. Mol. Biol. 225, 1075–193).
Die Untersuchung der Sekundärstruktur von SP-C(LKS) unter Verwendung der CD-Spektroskopie zeigte ein für α-helikale Peptide typisches Spektrum, und ein α-helikaler Anteil von ungefähr 75% wurde aus den Minima bei 208 nm und 222 nm abgeleitet. Die Sekundärstruktur blieb im Anschluss an die schrittweise Verdünnung mit H₂O bis zu 12% TFE stabil, vorausgesetzt, dass das Peptid in reinem TFE solubilisiert wurde.
SDS-Page von SP-C(LKS) zeigte eine einzelne Bande, die der von nativem SP-C gleicht, während SP-C(Leu), welchem Lys im helikalen Teil fehlt, Oligomere bildet. Im Kontrast zu unseren Erfahrungen mit SP-C(Leu)/Lipid-Mischungen, die in höheren Konzentrationen als 20mg/ml schwierig zu solubilisieren sind (Nilsson, G. et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116–124) war es möglich, eine SP-C(LKS)/Lipid-Mischung mit einer Lipidkonzentration von 80mg/ml und einem Polypeptid/Lipid Verhältnis von 0,03 herzustellen.
Beispiel 3
Herstellung von Peptid/Lipid-Mischungen
DPPC, PG und PA wurden alle von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben. Die Lipide, gelöst in Chloroform/Methanol 98:2 (v/v), wurden in den Verhältnissen DPPC:PG:PA 68:22:9 (m/m/m) oder DPPC/PG 7:3 (m/m) gemischt. Surfaktant-Präparate wurden hergestellt durch Zugabe von SP-C(LKS) allein oder SP-C(LKS) und SP-B zu jeder der Lipid-Mischungen bei Gesamtpeptid/Lipid-Gewichtsverhältnissen von 0–0,05. Die Mischungen wurden unter Stickstoff eingedampft und in 150 mmol/l NaCl oder in 10 mmol/l Hepes-Puffer pH 6,9, enthaltend 140 mmol/l NaCl und 2.0 mmol/l CaCl₂, bei Lipidkonzentrationen von 10 = 80 mg/ml resuspendiert. Wiederholtes Einfrieren und Beschallung (50 W, 48 kHz) wurden durchgeführt, bis homogene Suspensionen erzielt wurden. In einigen Fällen wurden die Endsuspensionen bei 45°C während 1 h inkubiert.
In 150 mmol/NaCl suspendierte Surfaktant-Präparate haben einen pH von 3.5–5,5. Die niedrigeren pH-Werte 3,5–4,5 wurden in SP-B enthaltenden Präparaten beobachtet. Da natives SP-B unter Verwendung von angesäuerten organischen Lösungsmitteln gereinigt wird (Curstedt, T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255–262), können kleine Mengen an Säure in den Präparaten zurückbleiben. Ein nahezu physiologischer pH wurde durch Suspendieren des Surfaktant-Präparates in Hepes-Puffer pH 6,9, enthalten 140 mmol/l NaCl und 2 mmol/l CaCl₂, erhalten (Tabelle 1). Verglichen mit den entsprechenden Präparaten in ungepufferter Kochsalzlösung gab es keine Änderungen von γ_max oder γ_min, wenn DPPC/PG 7:3 (m/m) als Lipidmischung verwendet wurde. Wenn aber PA in der Lipid-Mischung enthalten war, stiegen sowohl γ_max als auch γ_min beim höheren pH (Tabellen 1 und 2).
Beispiel 4
Herstellung von Phospholipid-Mischungen mit SP-C(LKS) und Polymyxin B.
DPPC und PG wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) gekauft. Die Phospholipide, gelöst in Chloroform/Methanol 98:2 (v/v), wurden in den Anteilen DPPC/PG 7:3 (m/m) gemischt. SP-C (LKS) wurde zu den Phospholipid-Mischunen in einem Gesamt-Polypeptid/Phospholilpid-Gewichtsverhältnis von 0,03 gemischt. Die Mischungen wurden unter Stickstoff eingedampft und bei Raumtemperatur in 10 mmol/l Hepes-Puffer pH 6,9, enthaltend 140 mmol/l NaCl und 2,0 mmol/l CaCl₂, oder in demselben Puffer, enthaltend 0,01 % Polymyxin B(PxB) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) resuspendiert. Wiederholtes Einfrieren und Beschallung (50 W, 48 kHz) wurden durchgeführt, bis homogene Suspensionen erhalten wurden. Die End-Phospholipidkonzentration für beide Präparate war 10 mg/ml. Zugabe von PxB verminderte sowohl γ_min und γ_max und eine optimale Oberflächenaktivität wurde erhalten (Tabelle 3).
Beispiel 5
Biophysikalische Charakterisierung
Die Oberflächenspreitungskenetik wurde bei etwa 34–38°C mit einer Wilhelmy-Obeiflächenwaage (Biegler, Wien, Österreich) gemessen. Die Oberflächenspannung wurde während 10 Minuten unter Verwendung einer mit einem Spannungsventil verbundenen Platinplatte, die 1 mm in eine Hypophase aus 20 ml 150 mmol/l NaCl in einer Teflonwanne eingetaucht war, aufgezeichnet. Die Suspensionen wurden als Tröpfchen, insgesamt 1 mg Lipide, auf die Hypophase gegeben, 4cm von der Platinplatte entfernt.
Die kinetischen Messungen von 3 Gew.% SP-C(LKS) in DPPC/PG, 7:3 (m/m) unter Verwendung der Wilhelmy-Waage zeigten eine schnelle Spreitung mit einer Oberflächenspannung von 28 mN/m nach 3 s (2). Die Spreitung war einiges langsamer unter Verwendung von 1 Gew.% SP-C(LKS) in derselben Lipid-Mischung (Daten nicht gezeigt). Zugabe von 2 Gew.% SP-B änderte die Spreitungsgeschwindigkeit oder die Gleichgewichtsoberflächenspannung nicht signifikant (2). Nach Inkubation der Mischung während 1 h bei 45°C wurden keine Verbesserungen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Ergebnisse wurden mit DPPC:PG:PA, 68:22:9 (m/m/m) als Lipid-Mischungen erzielt (Daten nicht gezeigt).
Die dynamische Oberflächenspannung wurde unter Verwendung eines „pulsating bubble surfactometer" (Surfactometer International, Toronto, Canada) bei 37°C während der 50%-igen zyklischen Kompression der Blasenoberfläche und bei einer Frequenz von 40 Zyklen pro Minute gemessen. Alle Messungen wurden während 5 Minuten und bei einer Lipid-Konzentration von 10mg/ml durchgeführt. Der Druckgradient durch die Blasenwand wurde bei spezifischen Zeitintervallen gemessen und zur Berechnung der Oberflächenspannungen bei der minimalen (γ_min) und maximalen (γ_max) Blasengröße verwendet.
Im „pulsating bubble surfactometer" bildeten 3 Gew.% SP-C(LKS) in DPPC:PG:PA, 68:22:9 (m/m/m) eine Oberflächenspannung von weniger als 1 mN/m bei minimalem Blasenradius (γ_min), während ein γ_min von 9–14 mN/m mit 3 Gew.% SP-C(LKS) in DPPC:PG, 7:3 (m/m) beobachtet wurde (Tabelle 1). Die Oberflächenspannung beim maximalen Blasenradius (γ_max) War in beiden Fällen etwa 40 mN/m. Zusatz von 2 Gew.% SP-B ergab γ_max-Werte von 31–33 mN/m und γ von 0–2mN/m für beide Lipidpräparate. Diese Werte sind sehr ähnlich mit denjenigen, die mit aus natürlichen quellisolierten Surfaktant-Präparaten erzielt wurden (Robertson, B. et al. (1990) Prog. Respir. Res. 25, 237–246). Inkubation der Prärapate bei 45°C während 1 h hatte keine signifikante Auswirkung auf die Oberflächenaktivität (Tabelle 1). Verminderung der Menge an SPB auf 0,5 Gew.% in 3 Gew.% SP-C(LKS) in DPPC:PG 7:3 (m/m) zeigte eine Tendenz zur Verminderung von γ_min, obwohl die Ergebnisse keine statistische Bedeutung erreicht haben (Tabelle 1). Im Kontrast zu SP-B reduzierte Zugabe von 2 Gew.% KL₄ (Cochrane, C.G. und Refak, S.D. (1991) Science 254, 566–568) bis 3 Gew.% SP-C(LKS) in DPPC/PG:PA 68:22:9 (m/m) γ_max nicht, der relativ hoch bei 41–42 mN7m blieb.
Beispiel 6
Vergleich zwischen Mischungen, die dipalmitoylierte und nicht-palmitoylierte Referenzpeptide enthalten.
Surfaktant-Präparate wurden durch Zugabe von 3% m/m SP-C(Leu) oder dipalmitoyliertes SP-C(Leu) zu jeder der Lipidmischungen hergestellt, die aus DPPC/PG/PA 68:22:9 m/m/m hergestellt wurden. Die Mischungen werden unter Stickstoff eingedampft und in 150 mmol/l NaCl bei Lipidkonzentration von 10 mg/ml resuspendiert. Zu den Proben, in denen auch ein SP-B Ersatz verwendet wurde, wurde 1 % m/m Polymyxin B zugegeben.
Dipalmitoyliertes SP-C(Leu) enthaltende Mischungen, mit oder ohne Polymyxin B, zeigen eine signifikante Verbesserung insbesondere bei der Verminderung von γ_max nach 5 Minuten und γ_min zu früheren Zeitintervallen.
Tabelle 4: Oberflächeneigenschaften
Die Oberflächenspannung der Mischungen wurde mit einem „pulsating bubble surfactometer" gemessen. Nach zwei Minuten Äquilibrierung wurden die Ergebnisse nach unterschiedlichen Zeiten bei 37°C, 50% Oberflächenkompression und mit einer Rate von 40 Zyklen pro Minute erhalten.
Beispiel 7
In vivo-Bestimmung
Die Wirkung der Surfaktant-Therapie auf die mechanischen Eigenschaften unreifer Lungen wurde bei 9 vorzeitig geborenen Kaninchen mit einem Gestationssalter von 27 Tagen beurteilt. Die Tiere wurden bei der Geburt tracheotomisiert und fünf von ihnen erhielten durch die Trachealkanüle zweimal 2,5 ml/kg künstliches Surfaktant, enthaltend DPPC, PG und SP-C (LKS), mit oder ohne Polymyxin B, in den oben angegebenen Anteilen. Die Gesamt-Phospholipid-Konzentration des exogenen Surfaktant-Materials war 40 mg/ml. Zwei als negative Kontrolle dienende Tiere erhielten kein Material durch das Trachealröhrchen, und weitere zwei als positive Kontrolle dienende wurden mit derselben Dosis modifiziertes natürliches Surfaktant behandelt (Curosuf, Chiesi Farmaceutici Spa, Parma, Italien), verdünnt auf 40 mg/ml. Ein Tier wurde mit einer Mischung von DPPC und PG in Kochsalzlösung (dieselbe Konzentration wie oben) mit einer Dosis von 2,5 ml/kg behandelt. Alle Tiere wurden in Körper-Plethysmograph-Boxen bei einer Temperatur von 37°C gehalten und parallel während 60 Minuten mit 100% unter Verwendung eines Servo-Ventilators 900B (Siemens-Elema, Solna, Schweden) belüftet, der auf eine Frequenz von 40 Minuten und 50% Einatmungszeit eingestellt war. Das Atemzugvolumen wurde mit einem Pneumotachygraphen gemessen, der mit jeder Plethysmograph-Box verbunden war. Die Tiere wurden mit einem standardisierten Atemzugvolumen von 8–10 ml/kg und ohne positiven End-Atmungsdruck (positive end-expiratory pressure (PEEP)) beatmet. Die Lungen-Thorax-Compliance wurde definiert als das Verhältnis zwischen Atemzugvolumen und Peak-Einatmungsdruck und als ml/cm H₂O kg ausgedruckt.
Im Vergleich mit den nicht behandelten Kontrolltieren war die Compliance bei den Tieren signifikant verbessert, die mit dem künstlichen Surfaktant behandelt wurden, insbesondere bei dem Tier, das Polymyxin B enthaltendes Surfaktant erhielt. Bemerkenswerterweise scheint die Verbesserung derjenigen überlegen zu sein, die nach Behandlung mit einer gleichen Dosis modifizierten natürlichem Surfaktant festgestellt wurde (3).
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Aminosäuresequenzen und „Helical wheel" Darstellungen von SP-C und seinen Analoga
Die Sequenz von Human-SP-C ist Johansson, J. et al. (1988) FEBS Lett. 232, 61–64 entnommen, und die von SP-C(Leu) aus Nilsson, G., et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116–124). SP-C(LKS) basiert auf der Primärstruktur von SP-C, alle Val-Reste an den Positionen 16–28 mit Ausnahme von Position 17 sind jedoch durch Leu-Reste ersetzt, Lys-Reste wurden an Position 17, 22 und 27 eingeführt, und die palmitoylierten Cys bei Positionen 5 und 6 sind durch Ser ersetzt worden.
2 Oberflächenspreitung der synthetischen Surfaktant-Präparate
Speitungskinetiken von 3 Gew.% SP-C(LKS) (ausgefüllte Quadrate, durchgezogene Linie) und 3 Gew.% SP-C(LKS) unter Zugabe von 2 Gew.% SP-B (offene Dreiecke, gepunktete Linie). Alle Präparate wurden bei Konzentrationen von 10 mg/ml DPPC/PG, 7:3 (m/m) in 150 mmol/l NaCl untersucht. Die Daten wurden mit einer Wilhelmy-Wage erhalten, und jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von drei verschiedenen Messungen.
3 In vivo-Ergebnisse
Die Lungen-Thorax-Compliance in 5 unreifen neugeborenen Kaninchen (Gestationsalter 27 Tage), die mit einem standardisierten Atemzugvolumen von 8 bis 10 ml/kg und ohne positiven Endatmungsdruck (PEEP) beatmet wurden. Die Compliance wird signifikant bei den behandelten Tieren verbessert. Die Zugabe von Polymyxin B (PxB) scheint die Wirkung des künstlichen Surfaktants zu erhöhen. Die Konzentration von Phospholipiden ist in allen Surfaktant-Präparaten dieselbe, d. h. 40 mg/ml.
Sequnzprotokoll

Claims

SP-C-Analoga mit der allgemeinen Formel (I) entsprechend dem Ein-Buchstaben-Aminosäurecode:
wobei: X eine Aminosäure ist, die ausgewählt wird aus der aus I, L, Nle (Norleucin) bestehenden Gruppe; B eine Aminosäure ist, die ausgewählt wird aus der aus K, W, F, Y, Ornithin bestehenden Gruppe; Z S ist und gegebenenfalls über eine Esterbindung an 12 bis 22 Kohlenstoffatomen enthaltende Acylgruppen gebunden sein kann, a eine ganze Zahl von 1 bis 19 ist; b eine ganze Zahl von 1 bis 19 ist; c eine ganze Zahl von 1 bis 21 ist; d eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist; e 0 oder 1 ist; f 0 oder 1 ist; n 0 oder 1 ist; m 0 oder 1 ist, mit den folgenden Bedingungen: – n + m > 0; – f ≥ e; – (X_aB)_n(X_bB)_n(X_cB)_mX_d ist eine Sequenz mit maximal 22 Aminosäuren, bevorzugt 10 bis 22 Aminosäuren.
SP-C-Analoga nach Anspruch 1, welche die Formel (Ia) aufweisen:
SP-C-Analoga nach Anspruch 1, welche die Formel (Ib) aufweisen:
SP-C-Analoga nach Anspruch 1, welche die Formel (Ic) aufweisen:
SP-C-Analoga nach Anspruch 1, welche die Formel (Id) aufweisen:
SP-C-Analoga nach Anspruch 1, welche die Formel (Ie) aufweisen:
SP-C-Analoga nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei Ser-Reste acyliert sind, bevorzugt mit Palmitoyl-Gruppen.
SP-C-Analoga nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei B Lysin oder Phenylalanin ist und X Leucin, Isoleucin oder Norleucin ist.
SP-C-Analoga nach Anspruch 8, ausgewählt aus der Gruppe, welche besteht aus:
Synthetisches Surfaktant, umfassend mindestens ein SP-C-Analogon der Formel (I) im Gemisch mit Lipiden und Phospholipiden.
Synthetisches Surfaktant nach Anspruch 10, wobei das Lipide/Phospholipide-Gemisch DPPG, PG, PA umfasst.
Synthetisches Surfaktant nach den Ansprüchen 10 bis 11, darüber hinaus umfassend SP-B oder ein aktives Derivat davon oder ein Polymyxin.
Synthetisches Surfaktant nach den Ansprüchen 10 bis 12 in Form einer Lösung, Dispersion, Suspension oder eines Trockenpulvers.
Verwendung von SP-C-Analoga nach den Ansprüchen 1 bis 7 zur Herstellung eines künstlichen oberflächenaktiven Mittels, das in allen Fällen von Lungen-Surfaktant-Mangel und verwandten Dysfunktionen verwendet werden soll.
Verwendung eines Polymyxins, bevorzugt Polymyxin B, zur Herstellung eines künstlichen Surfaktant nach den Ansprüchen 10 bis 13 zur Behandlung aller Fälle von Lungen-Surfaktant-Mangel und verwandten Dysfunktionen.
Verwendung nach den Ansprüchen 14 und 15, wobei der Surfaktant-Mangel respiratorische Insuffizienz ist.