EA004058B1

EA004058B1 - Синтетические пептиды, обладающие поверхностной активностью, и их применение для приготовления синтетического сурфактанта

Info

Publication number: EA004058B1
Application number: EA200100749A
Authority: EA
Inventors: Торе Курстедт; Ян Йоханссон; Ханс Йёрнвалль; Бенгт Робертсон; Паоло Вентура
Original assignee: КЬЕЗИ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.п.А.
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2003-12-25
Also published as: EA200100749A1; KR20010101904A; MA25381A1; HK1042500A1; EE04879B1; SK11442001A3; HUP0200141A3; CA2362507A1; ZA200106530B; HU228997B1; PL201084B1; CZ301108B6; BG65196B1; ES2228473T3; BG105764A; CN1340060A; DE60015082T2; YU57701A; NO20013888L; CN1221570C

Abstract

Описываются синтетические пептиды - аналоги белка С сурфактанта (SP-C), обладающие поверхностной активностью, а также описывается их применение для приготовления синтетических сурфактантов, полезных при лечении респираторного дистресс-синдрома (РДС) и других заболеваний, связанных с дефицитом сурфактанта или дисфункцией.

Description

В настоящем изобретении предложены новые синтетические пептиды, обладающие поверхностной активностью. В частности, в настоящем изобретении предложены аналоги белка С сурфактанта (8Р-С), которые при комбинировании с подходящими липидами особенно эффективны в снижении поверхностного натяжения на границе раздела воздух-жидкость.

Таким образом, пептиды по данному изобретению могут применяться в комбинации с липидами и, возможно, в комбинации с белком В сурфактанта (8Р-В) или его активным аналогом либо заменителем 8Р-В для приготовления синтетических сурфактантов, полезных при лечении респираторного дистресс-синдрома (РДС), других дефицитов сурфактанта или дисфункции, связанной с лёгочными заболеваниями, такими как пневмония, бронхит, астма, синдром мекониевой аспирации, а также с другими заболеваниями, такими как серозный средний отит (экссудативный отит).

Предпосылки изобретения

Лёгочный сурфактант понижает поверхностное натяжение на границе раздела воздухжидкость альвеолярной выстилки, предохраняя легкие от спадания в конце выдоха. Дефицит сурфактанта представляет собой широко распространенное нарушение у недоношенных детей и является причиной респираторного дистресс-синдрома (РДС), который можно эффективно лечить естественными сурфактантами, выделенными из легких животных (Еицтага, Т. апб КоЬегйоп В. (1992) 1п: КоЬегйоп, В., уап Со1бе, Ь.М.С. апб Ва!епЬигд, В. (еб§) Ри1топагу 8шТае1ап1: Егот Мо1еси1аг Вю1оду 1о С1шюа1 Ргасйсе Атйегбат, Екеу1ег, рр. 561-592). Главными составляющими этих препаратов сурфактанта являются фосфолипиды, такие как 1,2дипальмитоил-§п-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ), фосфатидилглицерин (ФГ) и гидрофобные белки В и С сурфактанта (8Р-В и 8Р-С). Гидрофильные белки сурфактанта 8Р-Л и 8Р-Э, которые являются коллагеновыми лектинами Стипа (Са²⁺-зависимые), хотя и действуют прежде всего в системе защитных сил организма, их обычно не включают в препараты сурфактанта ввиду используемых способов экстракции органическими растворителями.

8Р-В и 8Р-С составляют только около 1-2 мас.% сурфактанта, но тем не менее способны значительно улучшать поверхностную активность по сравнению с чистыми липидными препаратами (СшМеб! Т. е! а1. (1987) Еиг. 1. Вюсйет. 168, 255-262; ТакайакЫ А., Ыето!о Т. апб Ей) Мага Т. (1994) Ас!а Раеб1а1г. 1ар. 36, 613618). Были определены первичные и вторичные структуры 8Р-В и 8Р-С и третичная структура 8Р-С в растворе (см. 4). 8Р-В состоит из двух идентичных полипептидных цепей из 79 аминокислот, связанных межцепочечным дисульфидным мостиком (СшМеб! Т. е! а1. (1990) Ргос. ЫаН. Асаб. 8ск И.8.А. 87, 2985-2989; 1ойап55оп

1., СшМеб! Т. апб 1бгпуа11 Н. (1991) ВюсйетМгу 30, 6917-6921). Каждая мономерная цепь имеет три межцепочечных дисульфидных мостика и по меньшей мере четыре амфипатические спирали, имеющие одну полярную и одну неполярную поверхность, через которые 8Р-В может взаимодействовать с двумя липидными бислоями и обеспечивать их пространственную близость (Апбегакоп М. е! а1. (1995) ЕЕВ8 Ьей. 362, 328-332). 8Р-С представляет собой липопротеин, состоящий из 35 аминокислотных остатков с α-спиральным доменом между остатками с 9 по 34 (бойапхюп 1. е! а1. (1994) ВюсйетМгу 33, 6015-6023). Спираль состоит в основном из остатков валина и включена в липидный бислой и ориентирована параллельно липидным ацильным цепям (УапбепЬикксйе, е! а1. (1992) Еиг. 1. Вюсйет. 203, 201-209). Две пальмитоильные группы ковалентно связаны с остатками цистеина в 5 и 6 положениях Ν-терминальной части пептида (СшМеб! Т. е! а1. (1990) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск и.8.А. 87, 2985-2989). Два консервативных положительно заряженных остатка аргинин и лизин в 11 и 12 положениях возможно взаимодействуют с отрицательно заряженными группами «головки» липидов мембран и таким образом увеличивают ее ригидность. Эта ригидность липид-пептидного взаимодействия может уменьшаться к С-терминальному концу, так как он содержит только небольшие или гидрофобные остатки, благодаря которым эта часть потенциально более подвижна в фосфолипидном бислое. Считается, что 8Р-С влияет на толщину и текучесть липидного окружения через очень стабильную поливалиновую спираль (бойшъюп 1. апб СшМеб! Т. (1997) Еиг. 1. Вюсйет. 244, 675-693).

Уровень техники

Поскольку препараты сурфактанта, полученные из животной ткани, проявляют некоторые недостатки, такие как наличие их в ограниченных количествах и возможность того, что они содержат инфекционные агенты и вызывают иммунные реакции, были предприняты попытки создать синтетические сурфактанты (1ойапхюп 1. апб СшМеб! Т. (1997) Еиг. 1. Вюсйет. 244, 675-693; 1ойап88оп 1. е! а1. (1996) Ас!а Раеб1а!г. 85, 642-646), обычно из синтетических липидов и гидрофобных белков.

В предыдущей работе продемонстрировано, что синтетический 8Р-С не может складываться подобно природному пептиду в αспиральную конформацию, необходимую для оптимальной поверхностной активности (1оЬап88оп 1. е! а1. (1995) Вюсйет. 1. 307, 535-541), и поэтому не взаимодействует соответствующим образом с липидами сурфактанта.

Следовательно, синтетические аналоги 8РС не складываются подобно природному пептиду и не взаимодействуют соответствующим образом с липидами сурфактанта. Чтобы обойти эту проблему, было предпринято несколько попыток модифицирования последовательности, например, заменяя все остатки Уа1 спиральных участков в природном 8Р-С на Ьеи, который в значительной степени способствует αспиральной конформации. Соответствующий трансмембранный аналог 8Р-С (Ьеи) показал хорошее распределение на границе раздела воздух-жидкость при комбинировании со смесью ДПФХ:ФГ :ПК (дипальмитоил-кп-глицеро-3фосфохолин : фосфатидилглицерин : пальмитиновая кислота) (68:22:9) (мас./мас./мас.). Однако максимальная величина поверхностного натяжения при сжатии циклической поверхности (у_тах) была значительно выше, чем эта же величина у природного сурфактанта. Кроме того, было невозможно приготовить липидопептидные смеси со значениями концентраций большими, чем около 20 мг/мл, вероятно, из-за образования пептидных олигомеров (Νίΐδδοη О. е! а1. (1998) Еиг. 1. Вюсйет. 255, 116-124). Другие исследователи синтезировали биоактивные полилейциновые аналоги 8Р-С различной длины (Таке1 Т. е! а1. (1996) Βίο1. Рйагт. Ви11. 19, 1550-1555). В последних исследованиях не сообщалось ни о самоолигомеризации, ни о проблемах, связанных с приготовлением образцов с высокой концентрацией липидов.

В различных публикациях рассматривается задача получения пептидных аналогов природных пептидов сурфактанта, с предложением ряда различных решений. Среди этих публикаций, АО 9321225, ЕР 733645, АО 9617872, где от имени Токуо ТапаЬе описаны пептиды, аналогичные природному 8Р-С, которые в общем отличаются от природного пептида в отношении последовательности Ν-терминальной части.

В заявках на патенты 8спррк Векеагсй 1пк!йи!е АО 8906657 и АО 9222315 описаны аналоги 8Р-В, имеющие чередующиеся гидрофобные и гидрофильные аминокислотные остатки. Среди прочих, заявлены пептиды с чередующимися остатками лейцина и лизина (КЬ₄).

С1егсх А. е! а1., Еиг. 1. Вюсйет 229, 465-72, 1995, описали пептиды различной длины, соответствующие Ν-терминальному концу свиного 8Р-С, а также гибридные пептиды, имеющие происхождение от свиного 8Р-С и бактериородопсина.

1ойапккоп 1. е! а1., Вюсйет. 1. 307, 535:41, 1995, описали синтетические пептиды, которые отличаются от природного свиного 8Р-С заменой некоторых аминокислот.

В АО 89/04326 от имени СайГотша Вю!есйпо1оду - Вук ОиИеп и АО 91/18015 от имени СайГотша Вю!есйпо1оду - 8сюк №га раскрыты аналоги 8Р-С, содержащие первичную Νтерминальную последовательность, в которой два Сук природного 8Р-С заменены двумя 8ет.

Описание изобретения

Обнаружено, что пептидные аналоги 8Р-С, которые сочетают следующие признаки: 1) замена остатков Уа1 другими нейтральными и гидрофобными остатками; 2) замена остатков Сук остатками 8ет; 3) замена некоторых нейтральных аминокислотных остатков большими или полярными остатками, проявляют особенно благоприятные свойства по снижению поверхностного натяжения. В частности, было обнаружено, что последний признак позволяет избежать самоолигомеризации вследствие положительных зарядов, обусловленных полярными остатками, или стерического затруднения, обусловленного большими заместителями.

Таким образом, в соответствии с первым аспектом, в настоящем изобретении предложены аналоги 8Р-С, имеющие следующую общую формулу (I), с использованием однобуквенного аминокислотного кода РеОг1Рг/РУНЬКК(Х_аВ)п(ХьВ)п(ХсВ)тХаОАЬЬМОЬ (I) где X представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, I, Ь, ΝΕ (норлейцин);

В представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из орнитина, К, I, А, Ε, Υ, О. Ν;

Ζ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 8, С, Ε, где остатки 8ег или Сук возможно связаны посредством эфирной или тиоэфирной связи с ацильными группами, содержащими 12-22 связанных атомов углерода;

а представляет собой целое число от 1 до 19;

Ь представляет собой целое число от 1 до 19;

с представляет собой целое число от 1 до 21;

ά представляет собой целое число от 0 до 20;

е представляет собой 0 или 1;

Г представляет собой 0 или 1; п представляет собой 0 или 1; т представляет собой 0 или 1; при условиях п + т > 0,

Г > е;

(Х_аВ)_п(Х_ЬВ)_п(Х_сВ)_тХ₄ представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислотных остатка, предпочтительно от 10 до 22.

Предпочтительные пептиды формулы (I) имеют следующие последовательности:

(Ь) Ε6IР88РVН^КВX₄ΒX₄ΒX₄ΒX6А^^Μ6^ (В>) Ε6IР88РVН^КВX5ΒX5ΒX₄6А^^Μ6^ (к) Ε6IР88РVН^КВX₄ΒX₁₁6А^^Μ6^ (М) Ε6IР88РVН^КВX₈ΒX₇6А^^Μ6^

Це) Ε6IР88РVН^КВX₁₁ΒX₄6А^^Μ6^

Среди последовательностей (^)-(^) предпочтительны те последовательности, которые имеют В=Ьук или Рйе и Х=Ьеи, Не или ΝΒ.

В соответствии с предпочтительными воплощениями, пептиды формул (1а)-(1Г) имеют следующие последовательности соответственно: ГО1Р88РУНЬККЬЬ1ЬКЕЬЬЬК1ЬЬЬКЬОАЬЬМОЬ [8Р-С (ЬК8)] РО1Р88РУНЬКВЬЬ1ЬЬКЬЬЬЬ1КЬЬ1ЬОАЬЬМОЬ [8Р-С (ЬК8)₁] РО1Р88РУНЬКВЬЬ1ЬКЬЬЬЬЬ1ЬЬЬ1ЬОАЬЬМОЬ [8Р-С (ЬК8)₂] РО1Р88РУНРКВРР1РРРРРКР1РРР1РОАРРМОЬ [8Р-С (ЬК8)₃] РО1Р88РУНРКВРР1РРРРРРР1КРР1РОАРРМОЬ [8Р-С (ЬК8)₄] РО1Р88РУНРКВРР1РРРРРРР1РРРРРОАРРМОЬ [8Р-С (ЬР8)]

В наиболее предпочтительном воплощении данного изобретения остатки 8ег ковалентно связаны с ацильными группами, содержащими 12-22 атомов углерода.

Пептиды формулы (I) могут быть приготовлены синтетическими способами или с использованием рекомбинантных технологий.

Обычные синтетические способы описаны, например, 8сДгоебег е! а1., ТЬе рерДбек, νοί. 1, Асабет1с Ргекк, 1965; Вобапкхку е! а1., РерДбе куйДекк, 1и!егкс1еисе РиЫкйег, 1996; Вагату & МетДе1б, ТЬе рерДбек; АпакьК 8уи1Ьекк, В1о1оду, νο1. 2, сЬар!ег 1, Асабетк Ргекк, 1980. Указанные способы включают в себя синтез пептидов на твёрдой фазе, в растворе, синтетические способы органической химии или их любые комбинации.

8- или О-ацилированные пептиды предпочтительно синтезируют путем обработки неацилированных пептидов хлорангидридом в чистой трифторуксусной кислоте, как описано ¥оикеД-8а1акбеЬ е! а1. Вюсйет 1 1999, 343, 557562. После синтеза и очистки определяли биохимические и биофизические характеристики синтетических пептидов, как показано в ниже следующем разделе Примеры.

Активность пептидов по данному изобретению в снижении поверхностного натяжения оценивалась в комбинации с липидами и фосфолипидами, 8Р-В, аналогами 8Р-В или заменителями 8Р-В. В частности, пептиды комбинировали с ДПФХ (1,2-дипальмитоил-кп-глицеро-3фосфохолин)/ФГ (фосфатидилглицерин)/ПК (пальмитиновая кислота) с 8Р-В или без него, его активным аналогом и полимиксинами.

Результаты тестов на поверхностную активность пульсирующего пузырька (рикаДидЬиЬЫе кигГасе асШ'йу !ек!к) ясно показывают, что синтетические пептиды по настоящему изобретению сильно уменьшают минимальное и максимальное поверхностное натяжение при сжатии циклической поверхности (у_тш и у_тах) до значений, сравнимых со значениями, полученными при использовании сурфактантов из естественных источников.

Добавление 8Р-В или его активного аналога к смеси пептиды/липиды-фосфолипиды давало особенно благоприятные результаты. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полимиксины, в частности полимиксин В, действуют как заменители 8Р-В, и их добавление давало результаты, сопоставимые с результатами, достигнутыми с 8Р-В.

В соответствии со вторым аспектом, в настоящем изобретении предложен синтетический сурфактант, содержащий один или более чем один пептид формулы (I), в смеси с липидами и/или фосфолипидами и, возможно, 8Р-В, его активного производного или полимиксинов. Подходящие липиды/фосфолипиды могут быть выбраны из группы, состоящей из фосфатидилхолинов (предпочтительно ДПФХ), ФГ, ПК, триацилглицеринов, сфингомиелина.

В еще более предпочтительном воплощении настоящего изобретения могут использоваться смеси сурфактантов, содержащие пептид, в котором пальмитоильные цепи О-ковалентно связаны с остатками 8ег. Было обнаружено, что смеси сурфактантов, содержащие дипальмитоилированную форму упомянутого пептида (8РС(Ьеи)), проявляют более высокую стабильность поверхностной пленки и увеличенный размер связанного с поверхностью липидного резервуара, по сравнению со смесями, содержащими соответствующий непальмитоилированный пептид, как определено измерениями, проведёнными в системе с фиксированным пузырьком (сарДуе ЬиЬЬ1е кук!ет). В образцах, содержащих 5% дипальмитоилированного пептида, у_тт составляло менее 1,5 мН/м, и пленки были очень стабильные, так как увеличение поверхностного натяжения составляло менее 0,5 мН/м в течение 10 мин при постоянном объеме пузырька. Напротив, у_т1П для непальмитоилированных пептидов составляло приблизительно 5 мН/м, и пленки были менее стабильными, что наблюдалось по частому разрушению пузырьков при малых поверхностных натяжениях. Кроме того, после обеднения подфаз для образцов, которые содержат непальмитоилированный пептид, способность к достижению околонулевого стабильного поверхностного натяжения была утрачена после нескольких стадий адсорбции, в то время как с дипальмитоилированным пептидом качество пленки не ухудшалось даже после более чем 10 стадий растяжения и включения материала резервуара, эквивалентного более чем двум монослоям. Улучшенная поверхностная активность дипальмитоилированных пептидов была также продемонстрирована пульсирующим пузырьковым сурфактометром (рикаДид ЬиЬЬ1е кигГас!оте!ег). Кроме того, было установлено, что присутствие ацильных групп уменьшает тенденцию к образованию олигомеров. Это открытие является очень важным, так как в процессе приготовления синтетических сурфактантов было обнаружено, что олигомеризация пептидов препятствует пригоΊ товлению смесей при концентрациях выше чем 20 мг/мл (Νίΐδδοη е! а1. Еиг 1 Вюсйеш 1998, 255, 116-124).

Синтетический сурфактант может быть приготовлен путем смешивания растворов или суспензий пептидов и липидов и последующего высушивания смеси.

При необходимости, сухую смесь можно суспендировать, диспергировать или вводить как таковую субъектам, нуждающимся в лечении дефицита сурфактанта.

Синтетический сурфактант предпочтительно вводить эндотрахеально или в виде аэрозоля. Последняя форма введения требует комбинации маленьких частиц сурфактанта с подходящим инертным пропеллентом. Другие формы введения, такие как распыление или разбрызгивание стабильных растворов/суспензий сурфактанта также включены в объем настоящего изобретения.

В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предложено применение описанных пептидов для приготовления сурфактантного агента, который может использоваться во всех случаях дефицита сурфактанта у взрослых или новорожденных или дисфункции, связанной с лёгочными заболеваниями, такими как пневмония, бронхит, астма, синдром мекониевой аспирации, а также с другими заболеваниями, такими как серозный средний отит (экссудативный отит).

Обычно, сурфактантный агент может применяться предпочтительно при эндотрахеальном введении в лечении респираторного дистресс-синдрома, который часто возникает у недоношенных детей.

Следующие примеры более подробно иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1. Синтез и очистка пептидов.

Аналог ЗР-С, ЗР-С(ЬКЗ) (фиг. 1) был синтезирован путем применения поэтапной твердофазной технологии и химической технологии с использованием трет-бутилоксикарбонилов (Кеп!, З.В.Н. (1988) Аппи. Реу. Вюсйеш. 57, 957-989) на аппаратуре АррНеб Вюкуйешк 430А. Гидролиз связи между смолой и пептидом и удаление защитных групп боковых цепей осуществляли в смеси безводный фтороводород/метоксибензол/диметилсульфид, 10:1:1 (об./об./об.) в течение 1,5 ч при 0°С. Защитные группы и поглотители удаляли путем повторной экстракции диэтиловым эфиром, и пептид последовательно экстрагировали из смолы смесью дихлорметан/трифторуксусная кислота (ТФУ), 3:1 (об./об.) с последующим выпариванием в роторном испарителе. Неочищенный пептидный экстракт вновь растворяли до концентрации 100 мг/мл в смеси хлороформ/метанол, 1:1 (об./об.), содержащей 5% Н₂О. Аликвоту в 10 мг наносили на колонку с сефадексом Зерйабех ЬН-60 (40 х 1 см) в том же растворителе (Сит81еб1 Т. е! а1. (1987) Еиг. 1. Вюсйеш. 168, 255-262). Отбирали фракции по 2,5 мл и измеряли оптические плотности при 214 и 280 нм. Идентификацию и количественное определение проводили путем аминокислотного анализа.

В случае ацилирования, очищенный пептид (обычно около 5 мг) сушат, растворяют в дистиллированной ТФУ (100 мкл) и добавляют хлорангидрид (10-20 экв. по отношению к пептиду). Через 10 мин реакцию останавливают 80% водным этанолом (1,9 мл). Очистку ацилпептидов осуществляют, используя хроматографию на Ырйех 5000 в смеси этиленхлорид/метанол, 1:4 (об./об.) с последующей обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке С18, используя линейный градиент 2-пропанол/0,1% ТФУ, переходящий в 60% (водный) метанол/0,1% ТФУ или 75% (водный) этанол/0,1% ТФУ.

Пример 2. Биохимическая характеристика.

Степень чистоты пептида проверяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ЗИЗ-РАСЕ) (Р11а51-5у51ет. Рйагшаша, Швеция) и обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя колонку С18 и линейный градиент 60% водный метанол/0,1% ТФУ и изопропанол/0,1% ТФУ (Сийайкоп М. е! а1. (1997) Вюсйеш. 1. 326, 799-806).

Молекулярные массы определяли посредством время-пролетной масс-спектрометрии с ионизацией путем лазерной десорбции (МАБО1ΤΘΡ) (Ьакегша! 2000, Ршшдап МАТ), с калибровкой по вазоактивному интестинальному пептиду (Мг 3326,8).

Вторичную структуру пептида исследовали, используя спектроскопию (1аксо-720 1а§со, 1арап) кругового дихроизма (КД). После солюбилизации в трифторэтаноле (ТФЭ) спектр записывали в интервале от 260 до 184 нм со скоростью сканирования 20 нм/мин и разрешением 2 точки данных/нм. Рассчитывали остаточную молярную эллиптичность и выражали ее в кдег х см²/дмоль. Молярные эллиптичности при 208 и 222 нм использовали для оценки процентного содержания спиральной структуры (Ваттом С.1. е! а1. (1992) 1. Мо1. Вю1. 225, 1075-1093).

Исследования вторичной структуры ЗРС(ЬКЗ) с использованием КД-спектроскопии показали спектр, типичный для α-спиральных пептидов, и процентное содержание αспиралей, составляющее приблизительно 75%, было определено из минимумов 208 и 222 нм. Вторичная структура оставалась стабильной после поэтапного растворения в Н₂О до концентрации ТФЭ 12% при условии, что пептид был солюбилизирован в чистом ТФЭ.

Электрофорез ЗР-С(ЬКЗ) в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ЗИЗРАСЕ) показал наличие отдельной полосы, аналогичной полосе природного ЗР-С, в то время как ЗР-С(Ьеи), у которого отсутствует Ьук в спиральной части, образует олигомеры. В соот ветствии с нашим опытом, в отличие от 8РС(Ьеи)/липидных смесей, которые трудно растворять при концентрации выше чем 20 мг/мл (Ийккоп 6. е1 а1. (1998) Еиг. 1. Вюсйеш. 255, 116124), возможно приготовление 8Р-С(ЬК8)/ липидной смеси с концентрацией липида 80 мг/мл и отношением полипептид/липид 0,03.

Пример 3. Приготовление пептид/ липидных смесей.

ДПФХ, ФГ и ПК были приобретены у 8щта С11е1шса1 Со. (81 Ьошк, МО). Липиды, растворенные в смеси хлороформ/метанол, 98:2 (об./об.), смешивали в пропорциях ДПФХ: ФГ:ПК 68:22:9 (мас./мас./мас.) или ДПФХ/ФГ 7:3 (мас./мас.). Препараты сурфактанта готовили путем добавления только 8Р-С(ЬК8) или 8РС(ЬК8) и 8Р-В к каждой липидной смеси до общего весового соотношения полипептид/липид 0-0,05. Смеси выпаривали в атмосфере азота и ресуспендировали в 150 ммоль/л ИаС1 или в 10 ммоль/л буфере Нерек с рН 6,9, содержащем 140 ммоль/л №1С'1 и 2,0 ммоль/л СаС1₂, при концентрациях липидов от 10 до 80 мг/мл. Затем проводили повторное замораживание и обработку ультразвуком (50 Вт, 48 кГц) до получения гомогенных суспензий. В некоторых случаях полученные суспензии инкубировали при 45°С в течение 1 ч.

Препараты сурфактанта, суспендированные в 150 ммоль/л ИаС1, имеют значение рН от

3.5 до 5,5. Более низкие значения рН от 3,5 до

4.5 наблюдались в препаратах, содержащих 8РВ. Так как природный 8Р-В очищали, используя подкисленные органические растворители (Ситк1ей1 Т. е1 а1. (1987) Еиг. 1. Вюсйеш. 168, 255-262), в препаратах могут оставаться небольшие количества кислоты. Близкое к физиологическому значение рН было достигнуто путем суспендирования препарата сурфактанта в буфере Нерек с рН 6,9, содержащем 140 ммоль/л №1С1 и 2 ммоль/л СаС1₂ (табл. 1). По сравнению с соответствующими препаратами в незабуференном физиологическом растворе не наблюдалось изменений у_тах или у_тт при использовании в качестве липидной смеси ДПФХ/ФГ, 7:3 (мас./мас.). Однако когда в липидную смесь была введена ПК, у_тах или у_тт увеличивались при более высоких значениях рН (табл. 1 и 2).

Таблица 1

Поверхностные свойства препаратов искусственного сурфактанта в физиологическом солевом растворе Измерения были выполнены непосредственно после приготовления образцов или после инкубации в течение 1 ч при 45°С. Концентрация фосфолипидов составляла 10 мг/мл в 150 ммоль/л ИаС1. Данные были получены в различные периоды времени при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра при 37°С, 50% поверхностном сжатии и при скорости 40 циклов в минуту. Показатели представляют собой средние значения (стандартное отклонение) 3-5 измерений. Аббревиатуры определены в тексте.

Препарат сурфактанта	Поверхностное натяжение, мН/м
8Р-С(ЬК8) (% мас./мас.)	8Р-В (% мас./мас.)	Фосфолипиды	Температура инкубации	7,5 с	1 мин	5 мин
Утш	^утах	Утт	^утах	у_тт	^утах
3	-	ДПФХ/ФГ/ПК	-	<1	41(1)	<1	41(1)	<1	41(0)
3	-	ДПФХ/ФГ/ПК	45°С	<1	41(1)	<1	41(1)	<1	41(1)
3	2	ДПФХ/ФГ/ПК	-	<1	33(2)	<1	33(2)	<1	33(2)
3	2	ДПФХ/ФГ/ПК	45°С	<1	34(1)	<1	34(2)	<1	25(2)
3	-	ДПФХ/ФГ	-	12	39(5)	14(4)	42(4)	9(5)	42(2)
3	-	ДПФХ/ФГ	45°С	8(3)	35(5)	9(3)	39(5)	6(4)	42(3)
3	2	ДПФХ/ФГ	-	2(1)	31(1)	2(1)	31(3)	2(1)	33(1)
3	2	ДПФХ/ФГ	45°С	3(3)	29(3)	1(1)	33(2)	1(0)	36(1)
3	1	ДПФХ/ФГ	-	<1	24(4)	1(2)	26(4)	<1	31(1)
3	0,5	ДПФХ/ФГ	45°С	4(2)	29(1)	4(3)	29(2)	3(1)	34(2)

Таблица 2 Поверхностные свойства препаратов искусственного сурфактанта в забуференном солевом растворе Измерения были выполнены на образцах, содержащих фосфолипиды в концентрации 10 мг/мл в буфере Нерек (рН 6,9), в свою очередь содержащем 140 ммоль/л ИаС1 и 2,0 ммоль/л СаС1₂. Данные получали в различные периоды времени при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра при 37°С, 50% поверхностном сжатии и при скорости 40 циклов в минуту. Показатели представляют собой средние значения (стандартное отклонение) 3-5 измерений. Аббревиатуры определены в тексте.

Препарат сурфактанта	Поверхностное натяжение, мН/м
8Р-С(ЬК8) (% мас./мас.)	8Р-В (% мас./мас.)	Фосфолипиды	7,5 с	1 мин	5 мин
у_тп	утах	утт	утах	утт	утах
3	-	ДПФХ/ФГ/ПК	4(1)	44(2)	5(2)	47(2)	7(2)	50(1)
3	2	ДПФХ/ФГ/ПК	3(3)	38(3)	4(4)	40(2)	3(3)	44(2)
3	-	ДПФХ/ФГ	15(3)		16(2)	42(3)	13(3)	44(3)
3	2	ДПФХ/ФГ	39(4)		1(1)	29(3)	<1	35(1)
			2(2)	26(3)

Пример 4. Приготовление фосфолипидных смесей с 8Р-С(ЬК8) и полимиксином В.

ДПФХ и ФГ были приобретены у 8фта Сйеш1са1 Со (8ΐ Ьошк, МО). Фосфолипиды, растворенные в смеси хлороформ/метанол, 98:2 (об./об.), смешивали в пропорциях ДПФХ/ФГ 7:3 (мас./мас.). К этим фосфолипидным смесям добавляли 8Р-С(ЬК8) до общего весового соотношения полипептид/фосфолипид 0,03. Эти смеси выпаривали в атмосфере азота и ресуспендировали при комнатной температуре в 10 ммоль/л буфере Нерек (рН 6,9), содержащем 140 ммоль/л ИаС1 и 2,0 ммоль/л СаС1₂, или в том же самом буфере, содержащем 0,01% полимиксин В (РхВ) (81дта Сйет1са1 Со, 8ΐ Ьошк, МО). Затем проводили повторное замораживание и обработку ультразвуком (50 Вт, 48 кГц) до получения гомогенных суспензий. Окончательная концентрация фосфолипидов в обоих препаратах составляла 10 мг/мл. При добавлении РхВ значения у_тт и у_тах уменьшались, и была достигнута оптимальная поверхностная активность (табл. 3).

Таблица 3 Поверхностные свойства искусственного сурфактанта с полимиксином В и без него

Данные были получены в различные периоды времени при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра при 37°С и 50% поверхностном сжатии при скорости 40 циклов в минуту. Показатели представляют собой средние значения (стандартное отклонение) 5-11 измерений. Аббревиатуры определены в тексте.

Препарат сурфактанта	Поверхностное натяжение, мН/м
8Р-С(ЬК8) (% мас./мас.)	РхВ (% мас./мас.)	Фосфолипиды	7,5 с	1 мин	5 мин
утш	^утах	утт	^утах	утт	^утах
3	-	ДПФХ/ФГ	15(3)	39(4)	16(2)	42(3)	13(3)	44(3)
3	1	ДПФХ/ФГ	3(2)	29(3)	2(2)	31(4)	1(1)	34(2)

Пример 5. Определение биофизических характеристик.

Кинетику поверхностного распределения измеряли приблизительно при 34-37°С при помощи поверхностных весов Вильгельми (^11йе1ту кигГасе Ьа1аисе) (В1ед1ег, У1еииа, Аик1па). Поверхностное натяжение определяли в течение 10 мин, используя платиновую пластину, соединенную с тензометром и введённую на 1 мм в нижний слой, состоящий из 20 мл 150 ммоль/л №1С1 в тефлоновом жёлобе. В этот нижний слой добавляли по каплям суспензии, всего в количестве 1 мг липидов, на расстоянии 4 см от платиновой пластины.

Кинетические измерения 3% по массе 8РС(ЬК8) в ДПФХ/ФГ, 7:3 (мас./мас.), используя весы Вильгельми, показали быстрое распределение, с поверхностным натяжением 28 мН/м, через 3 с (фиг. 2). Распределение было несколько медленнее при использовании 1%-ного по массе 8Р-С(ЬК8) в той же липидной смеси (данные не приводятся). Добавление 2%-ного по массе 8Р-В не изменяло существенно скорость распределения или состояние равновесия поверхностного натяжения (фиг. 2). После инкубации смеси в течение 1 ч при 45°С никаких улучшений не наблюдалось (данные не приводятся). Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве липидной смеси ДПФХ:ФГ:ПК, 68:22:9 (мас./мас./мас.) (данные не приводятся).

Динамическое поверхностное натяжение регистрировали, используя пульсирующий пузырьковый сурфактометр (8игГас!оте!ег 1и1ета1юиа1, ТогоШо, Сапаба) при 37°С при 50% поверхностном сжатии пузырьковой поверхности и частоте 40 циклов в минуту. Все измерения проводили в течение 5 мин и при концентрации липидов 10 мг/мл. Также измеряли градиенты давления через поверхность пузырька в определенные интервалы времени и использовали их для расчета поверхностного натяжения при минимальном (у_тт) и максимальном (у_тах) размерах пузырька.

В пульсирующем пузырьковом сурфакгометре 3%-ный по массе 8Р-С(ЬК8) в смеси ДПФХ:ФГ:ПК, 68:22:9 (мас./мас./мас.) обеспечивал поверхностное натяжение менее чем 1 мН/м при минимальном радиусе пузырька (у_тт), в то время как с 3%-ным по массе 8Р-С(ЬК8) в смеси ДПФХ:ФГ, 7:3 (мас./мас.) при у_тт наблюдалось поверхностное натяжение от 9 до 14 мН/м (табл. 1). Поверхностное натяжение при максимальном радиусе пузырька (у_тах) составляло около 40 мН/м в обоих случаях. Добавление 2%-ного по массе 8Р-В давало значение у_тахот 31 до 33 мН/м и значение у_тш от 0 до 2 мН/м для обоих липидных препаратов. Эти значения абсолютно аналогичны значениям, полученным для препаратов сурфактанта, выделенных из естественных источников (КоЬейкои В. е! а1. (1990) Ргод. Кекрй. Кек. 25, 237-246). Инкубация препаратов при 45°С в течение 1 ч не вызывала существенного влияния на поверхностную активность (табл. 1). Уменьшение количества 8РВ до 0,5% по массе в 3%-ном по массе 8РС(ЬК8) в смеси ДПФХ:ФГ, 7:3 (мас./мас.) имело тенденцию к увеличению значения у_тш, хотя результаты не достигали статистической значимости (табл. 1). В отличие от 8Р-В, добавление

2%-ного по массе пептида с чередующимися остатками лейцина и лизина (КЬ₄) (Сосйгапе, С.6. апб Кеуак, 8.Ό. (1991) 8с1епсе 254, 566-568) К 3%-ному по массе 8Р-С(ЬК8) в смеси ДПФХ:ФГ:ПК, 68:22:9 (мас./мас./мас.) не уменьшало значение у_тах, которое оставалось относительно высоким, от 41 до 42 мН/м.

Пример 6. Сравнение смесей, содержащих дипальмитоилированные и непальмитоилированные упомянутые пептиды.

Препараты сурфактанта приготавливали путем добавления 3% мас./мас. 8Р-С(Ьеи) или дипальмитоилированного 8Р-С(Ьеи) к каждой липидной смеси, образованной ДПФХ/ФГ/ПК 68:22:9 (мас./мас./мас.). Смеси выпаривали в атмосфере азота и ресуспендировали в 150 ммоль/л ЫаС1 при концентрации липидов 10 мг/мл. К образцам, в которых также использовался заменитель 8Р-В, добавляли 1% мас./мас. полимиксин В. Смеси, содержащие дипальмитоилированный 8Р-С(Ъеи), с полимиксином В или без него, обладают значительно улучшенными свойствами, особенно в уменьшении у_тахчерез 5 мин и у_тт в начальные интервалы времени.

Таблица 4

Поверхностные свойства

Значения поверхностного натяжения для смесей получали при помощи пульсирующего пузырькового сурфактометра. После уравновешивания в течение 2 мин регистрировали данные в различные моменты времени при 37°С, 50% поверхностном сжатии и с частотой 40 циклов в минуту.

Препарат сурфактанта	Поверхностное натяжение, мН/м
8Р-С(Ьеи), мас.%	Э\|ра1т. 8Р-С(Ьеи), мас.%	РхВ, мас.%	7,5 с	1 мин	5 мин
Утт	^утах	Утт	^утах	Утт	^утах
1			11	39	6,2	39	2	42
1		1	3	37	3	38	0	44
	1	_-	1	34	1	35	1	36
	1	1	0	29	0	34	0	35

Пример 7. Определение ίη νίνο.

Воздействие терапии сурфактантами на механические свойства легких у новорожденных оценивали на 9 недоношенных новорожденных кроликах с гестационным возрастом 27 дней. Животные были подвергнуты трахеотомии при рождении и пятеро из них получили дважды через трахеотомическую канюлю 2,5 мл/кг искусственного сурфактанта, содержащего ДПФХ, ФГ и 8Р-С(ЬК8), с полимиксином В или без него, в пропорциях, приведённых выше. Общая концентрация фосфолипидов экзогенного материала сурфактанта составила 40 мг/мл. Двое животных, которые использовались в качестве отрицательного контроля, не получали материал через трахеальную трубку, а двое других, которые использовались в качестве положительного контроля, были подвергнуты лечению той же самой дозой модифицированного естественного сурфактанта (куросурф, Сигокиг!, СЫек1 Еагтасеийс1 8ра, Рагта, Иа1у), разбавленного до 40 мг/мл. Одно животное лечили смесью ДПФХ и ФГ в физиологическом растворе (той же концентрации, как указано выше) в дозе

2,5 мл/кг. Все животные содержались в камерах плетизмографа при температуре 37°С и при параллельной вентиляции в течение 60 мин 100% кислородом, используя вентилятор с сервоприводом 8ег\'о УеШбаЮг 900В (81етепк-Е1ета, 8о1па, Швеция) при заданной частоте 40 мин и времени вдоха 50%. Дыхательные объемы измеряли пневмотахографом, соединенным с каждой камерой плетизмографа. Животных вентилировали стандартизированным дыхательным объе мом 8-10 мл/кг и без положительного давления в конце выдоха (ПДКВ). Эластичность легких и грудной клетки определяли как отношение между дыхательным объемом и пиковым давлением вдоха и выражали в мл/см Н₂О кг.

По сравнению с контрольным животным, не подвергнутым лечению, у животных, подвергавшихся лечению искусственным сурфактантом, эластичность была существенно улучшена, особенно у животного, получившего сурфактант, содержащий полимиксин В. Примечательно, что улучшение было более существенным по сравнению с улучшением, которое наблюдалось после лечения аналогичной дозой модифицированного естественного сурфактанта (фиг. 3).

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - аминокислотные последовательности и спирально-круговые представления 8РС и его аналогов.

Последовательность человеческого 8Р-С взята у 1ойапккоп 1. е1 а1. (1988) ЕЕВ8 Ьей. 232, 61-64 и последовательность 8Р-С(Ьеи) у №1ккоп 6., е1 а1. (1998) Еиг. 1. Вюсйеш. 255, 116-124. 8РС(ЬК8) основана на первичной структуре 8Р-С, но все остатки Уа1 в положениях с 16 по 28, за исключением положения 17, заменены на остатки Ьеи; остатки Ьук. которые были введены в 17, 22 и 27 положениях, и пальмитоилированный Сук в 5 и 6 положениях, заменены на 8ег.

Фиг. 2 - поверхностное распределение препаратов искусственного сурфактанта.

Кинетика распределения 3%-ного по массе 8Р-С(ЬК8) (заполненные квадраты, сплошная линия) и 3%-ного по массе 8Р-С(ЬК8) с добав15 лением 2%-ного по массе 8Р-В (открытые треугольники, пунктирная линия). Все препараты исследовались при концентрации 10 мг/мл смеси ДПФХ/ФГ, 7:3 (мас./мас.) в 150 ммоль/л №1С1. Значения были получены при помощи весов Вильгельми, и каждая точка данных представляет собой среднее значение трех различных измерений.

Фиг. 3 - результаты ίη νίνο.

Эластичность легких и грудной клетки у 5 недоношенных новорожденных кроликов (гестационный возраст 27 дней), которых вентили<400» 2

РЬе

Ьеи

МеЬ

В1у- 11е

Ьуз

С1у <210» <211» <212» <213»

Рго бег бег Рго Уа1'Н1з

Ьеи Ьуз Агд Ьеи Ьеи

Не Ьеи

Ьеи

Ьеи Ьеи Не Ьуз Ьеи

Ьеи Не Ьеи СХу АХа

Ьеи Ьеи

ПРТ

Искусственная последовательность ровали стандартизированным дыхательным объёмом 8-10 мл/кг и без положительного давления в конце выдоха (ПДКВ). У животных, подвергнутых лечению, эластичность была значительно улучшена. Добавление полимиксина В (РхВ) увеличивает эффект искусственного сурфактанта. Концентрация фосфолипидов является одинаковой во всех препаратах сурфактанта, т.е. 40 мг/мл.

<220» <223» <400»

РЬе

Ьуз

Мее

Описание искусственной последовательности: синтетические пептиды

С1у

Не

Рго бех бех Рго Уа1 Нхз' Ьеи Ьуз Ахд Ьеи Ьеи 1Хе

10 15

Ьеи

С1у

Ьеи

Ьеи Ьеи Не Ьеи Ьеи Ьеи Не Ьеи С1у А1а Ьеи

30

Ьеи

Перечень последовательностей <110» СЬхезх РагтасеиСхсх зра <120» Синтетические пептиды, обладающие поверхностной активностью, и их применение для приготовления синтетического сурфактанта <210> 4 <211» <212> <213»

ПРТ

Искусственная последовательность <130» сЫеях <220» <223» Описание искусственной последовательности: синтетические пептиды <140» <141» <400» 4

РЬе

С1у

Не

Рго <150» ΜΙ99Α000275 <151» 1999-02-12 бег 5ег Рго Уа1 Нхз

Ьеи Ьуз Ахд Ьеи Ьеи 1Хе

15

Ьеи

Ьеи <160» 6

Ьеи

Ьуз* Ьеи Не Ьеи Ьеи

Ьеи Не Ьеи СХу АХа Ьеи

Ьеи <170» РаЬепЫп Уег. 2.1

Мее

СХу

Ьеи <210» 1 <211» 35 <212» ПРТ <213» Искусственная последовательность <210» <211» <212» <220» <223» Описание искусственной последовательности: синтетические пептиды <213»

ПРТ

Искусственная последовательность <400» 1

РЬе <220» <2 23»

С1у

Не

Рго бег 5ег Рхо УаХ Н1з Ьеи Ьуз Ахд Ьеи Ьеи

10

Ьуз

Ьеи

Ьеи Ьуз Не Ьеи Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи СХу А1а

30

Мее

61у

Ьеи

IIе Ьеи

Ьеи Ьеи <400» .5

РЬе

Ьеи

Мее

С1у

Ьеи

С1у

Не

Рго вех бег· Рго УаХ Нхз Ьеи Ьуз Агд Ьеи Ьеи 5 10

11е

Ьеи

Ьеи Ьеи Не

Ьуз Ьеи Ьеи Не Ьеи· СХу А1а

30

Ьеи

Ьеи <210» <211» <212» <213»

ПРТ

Искусственная последовательность

Ьеи <220» <223» описание искусственной последовательности: синтетические пептиды <210» <211» <212» <213» б

ПРТ

Искусственная последовательность <220» <223»

Описание искусственной последовательности: синтетические пептиды <400»

РЬе б

С1у

Не

Рго бег бег Рго Уа1 Ηχί

Ьеи Ьуз Агд Ьеи Ьеи

Не

Ьеи

РЬе

Ьеи

Ьеа РЬе Не Ьеи Ьеи

Ьеи РЬе Ьеи <31у АХа

Ьеи

МеС <31у

Ьеи

Claims

1. Аналоги белка С сурфактанта (8Р-С), имеющие общую формулу (I), в соответствии с однобуквенным аминокислотным кодом Р_еО_г1Р77РУНЬКЯ(Х_аВ)(Х_ьВ)_п(Х_сВ)_тХ_аОАТТМОТ (I) где X представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, Ь, И1е (норлейцина);

В представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из К, Р, Υ, орнитина;

Ζ представляет собой 8 и, возможно, может быть связан через эфирную или тиоэфирную связи с ацильной группой, содержащей 1222 атома углерода;

а представляет собой целое число от 1 до 19;

ь представляет собой целое число от 1 до 19;

с представляет собой целое число от 1 до 21;

ά представляет собой целое число от 0 до 20;

е представляет собой 0 или 1;

ί представляет собой 0 или 1;

п представляет собой 0 или 1;

т представляет собой 0 или 1;

при следующих условиях:

п + т > 0;

ί > е;

(Х_аВ)(Х_ьВ)_п(Х_сВ)_тХ_а представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты, предпочтительно от 10 до 22 аминокислот.

2. Аналоги 8Р-С по п.1, имеющие формулу (la) Е61Р88РУНЕККХ4ВХ₄ВХ4ВХ6АЕЕМ6Е (1а)

3. Аналоги 8Р-С по п.1, имеющие формулу (lb) ЕО1Р88РУНЕККХ5ВХ₅ВХ₄6АЕЕМ6Е (1Ь)

4. Аналоги 8Р-С по п.1, имеющие формулу (lc)

Е61Р88РУНЕККХ₄ВХ₁₁ОАЕЕМОЕ (1с)

5. Аналоги 8Р-С по п.1, имеющие формулу (Ιά)

ЕО1Р88РУНЕККХ₈ВХ₇6АЕЕМ6Е (Ιά)

6. Аналоги 8Р-С по п.1, имеющие формулу (1е)

Е61Р88РУНЕККХ₁₁ВХ₄ОАЕЕМОЕ (1е)

7. Аналоги 8Р-С по пп.1-6, в которых остатки 8ег ацилированы предпочтительно пальмитоильными группами.

8. Аналоги 8Р-С по пп.1-7, в которых В представляет собой лизин или фенилаланин и Х представляет собой лейцин, изолейцин или норлейцин.

9. Аналоги 8Р-С по п.8, выбранные из группы, состоящей из

8Р-С(ЬК8) ΙΑΡΙ^ΙΑ-Ί II К1<1 I II К1 I I I КП I I К1 А А11МА1

8Р-С(ЬК8)! ЕА1Р88РУН1 КК1 I II I К1 I I I 1К1 I II А А11МА1

8Р-С(ЬК8)₂ ЕА1Р88РАН1 КА1 I II К1 I I I I II I I II А А11МА1

8Р-С(ЬК8)₃ ЕО!Р88РУН1КР1XДXXXX,К1ДXXД,О А11МА1

8Р-С(ЬК8)₄ ЕА[Р88РУН1КР1XДXXXXXX1К1,1Д,О А11МА1

8Р-С(ЬР8) РАРР88РУНРКР1XД,Р1XXX,РДXX,Р1,О

АРРМАР

10. Синтетический сурфактант, содержащий по меньшей мере один аналог 8Р-С формулы (I) в смеси с липидами и фосфолипидами.

11. Синтетический сурфактант по п.10, в котором смесь липидов/фосфолипидов содержит ДПФХ (1,2-дипальмитоил-кп-глицеро-3фосфохолин), ФГ (фосфатидилглицерин), ПК (пальмитиновую кислоту).

12. Синтетический сурфактант по пп.10-11, дополнительно содержащий 8Р-В или его активное производное либо полимиксин, предпочтительно полимиксин В.

13. Синтетический сурфактант по пп.10-12 в форме раствора, дисперсии, суспензии, сухого порошка.

14. Применение аналогов 8Р-С по пп.1-7 для приготовления синтетического сурфактанта, используемого во всех случаях дефицитов сурфактанта.

15. Применение синтетического сурфактанта по п.12, содержащего полимиксин, предпочтительно полимиксин В, для лечения всех случаев дефицитов или дисфункции сурфактанта или серозного среднего отита (экссудативного отита).

16. Применение по п.14 или 15, где дефицит сурфактанта представляет собой респираторный дистресс-синдром.

Человеческий 8Р-С

5Р-СЦХ5]

8Р-С(Ьеи)

ΓβΙΡΟΟΡνΗΏΚΗΓΕίνννννΛΛΕίνννίναΆΤΏΜαη ----33—Δ------1/ЪЫГ.Ь—Ы1Б -ь----------83------—-ЪКЪЬЪЬК-ЪЪЕКЬ-------

5Р-С(ЬК8] 5Р-С(Ьеи)

Фиг. 1

Фиг. 2

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

И 5Р-С(ЬК5]

И 5Р-С[ЬК5]+1% РхВ Куросурф 40 мг/мл □ Контроля

Время (мин.)