HU228997B1

HU228997B1 - Artificial peptides having surface activity, artificial surfactant comprising thereof and the use thereof in the preparation of artificial surfactant

Info

Publication number: HU228997B1
Application number: HU0200141A
Authority: HU
Inventors: Tore Curstedt; Jan Johansson; Hans Joernvall; Bengt Robertson; Paolo Ventura
Original assignee: Chiesi Farma Spa
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-09
Publication date: 2013-07-29
Also published as: UA72751C2; ES2228473T3; EA004058B1; PL201084B1; CZ301108B6; ITMI990275A1; BG65196B1; IT1308180B1; DE60015082T2; CA2362507C; EP1151008B1; EE200100413A; PT1151008E; NZ513451A; CO5241361A1; BR0009964A; DE60015082D1; YU57701A; EE04879B1; NO20013888D0

Description

A találmány szerinti peptidek tehát lipídekkel kombinálva, vagy opcionálisan SF-B-vel vagy annak aktív analógjával vagy helyettesítőjével, kombinálva alkalmazhatók mesterséges felületaktív anyagok előállítására, amelyek re-spiratőrik-us disztresez szindróma (RDS) és egyéb tüdőbetegségekkel - mint például tüdőgyulladás, bronhitisz, asztma, mekóni-um aspiráción szindróma - és más betegségekkel is mint például súlyos középfülgyulladás (ragadós fül) - kapcsolatos felületaktív-anyag hiány és rendellenes működés kezelésére al.kelma.sak.

A tüdőben található felületaktív anyag csökkenti a faIhleti feszültséget a léghőlyagok falán lévő levegőfolyadék határfelületen, megakadályozva a tüdő összees-és-ét teljes kilégzéskor. A felületaktív-anyag hiányosság gyakori rendellenesség koraszülöttekben ami respiratórikus dísztressz -szindrómát (RDS) okoz, amelyet hatásosan kezelhetőállati tüdőből extrahált természetes felületaktív anyagokAktaszámunk: 95067-4023/LT

ΦΧΦΦ φφ χ φ φ φφφ * * .,. ·.« · ♦ · kai [Fujiwara, Τ. és Robertson, Β., „Pulmonary Surfacfant: From Molecular Siology to Clinical Farétice, 561-592. old., szerk.; Roberson, B,, van Goide, l.M.G. és Batenburg, B., kiad.; Blsevíer, Amsterdam (1992)}. A felületaktív készítmények fö komponensei foszfolipidek,· mint például 1,2,dípalmítoil-sn-glicero-3-foszfokolín (DRPC) , foszfatid.ilglicerol (RG) és a B és C jelű bidrofób felületaktív fehérjék (3P-B és SP-Cj . Az SP-A és S'P-D hidrofil felületaktív fehérjék, amelyek C-típusú (Ca²-függÖ) kollagénszerü lekéinek, és amelyekről úgy tartják, hogy elsősorban a. gazda-védelmi rendszerben játszanak, szerepet, rendes körülmények között nem részel a felületaktív készítményeknek az alkalmazott szerves oldószeres extre.kciös eljárások miatt.

SP-B és SP--C csak körülbelül 1-2%-át teszik ki a teljes felületaktív anyag mennyiségnek, de még igy is képesek jelentős javulást kifejteni a. felületi, aktivitásra a tiszta lipidkészítményekhez hasonlítva [Curstedt, T. és mtsai,, Eur. J. Biochem. 168, 255-262. old, (1987); Takahashi, A,, bemoto T. és Füjíwara, T„, Aeta Paediatr. Jap. 36, 613-618. old. (1994)1. Az SB-B és SP-C elsődleges és másodlagos szerkezetét, valamint az. SF-C harmadlagos szerkezetét meghatározták. Az SF-8-t két azonos, 79 aminosavböl álló polipeptidlánc alkotja, amelyeket egy láncközti di sznl.fi d~

J,, Gurstedt,

Proc.	h a t.
'); doha	nsson,
-r- +- χ / 5 n· o i, y —s y	6917-
x ΟΓΡ	.1 ánoon
patikus	hélix

belüli disznifíd-híd, és legalább négy amfípatikus hélix « * van, amelyek egy poláros és egy apoiáros oldalt alkotnak, .amelyen keresztül az SF-B két iipid-kettősréteggel léphet kölcsönhatásfea, és hozhatja azokat közel egymáshoz (Andersson, M. ás retsaí., FEBS Lett. 362, 328-332. old. (1995)). SP-C 35 aminosavből álló lipoproteín, egy, a 9-34.

oldalláncok .közötti a-hélixszel (Johansson, Ü. és mtsai., Biochemistry 33, 6015-6023. (1994)). A hélixet főként valí 1-oldalláncok alkotják, és iipíd-káttősrétegbe van. beigyazva a lipidek acil-iáncaival (Vandenbussehe és mtsai, Eur. J. Biochem. 2Ö3, 201-209.

old. (1392)1, a peptid ^-terminális végén az 5. és 6. cisztáin oldallánchoz két palmitoii-csoport van. kovalensen, kötve [Curstedt, T. és mtsai,., Proc.. Natl. Aoad. Sci. ü.S.A. 87, 2985-2989, old. (1990) ] . A XI, és 12. helyen lévő két konzervált pozitiven töltött olöailánc, arginin és l.izin, valószínűleg a lipid membrán negatív töltésű fejcsoportjai~ vei van kölcsönhatásban, ezáltal növelve annak merevségét, A iipíd-peptid kölcsönhatás merevsége csökkenhet a C~terminális felé, mivel az csak kicsi vagy hidrofób oidailáncokat tartalmaz, potenciálisan mozgékonyabbá téve ezt a részt a foszfoiípid-kettősrétegben. ügy gondolják, hogy az SP-C befolyásolja a körülötte lévő lipidek vastagságát és folyékonyságát a rendkívül stabil poli-valil-hélix révén (Johansson, J. es Curstedt, T., Eur. J. Biochem. 244, 675693. old. (1997}], (kivel, az állati szövetekből nyert felületaktív anyag preparátumoknak számos hátránya van, mint a kis mennyiségben való elérhetőségük és annak a lehetősége, hogy fertőző párnuzarBosan » Jf * #

X <

Φ * anyagokat tartalmaznak, valamint immunológia reakciót váltanak ki, történtek próbálkozások mesterséges felületaktív anyagok készítésére [üohansson, J. és Curstedt,· T., Sur. J. Biochem. 244, 675-693. old. (1997); Johansson, J. és mtsai., Aeta Paediatr, 85, 642-646. old. (1996)1, általában szintetikus lipidekből. és hidroféb fehérjékből.

CÍ j. leik, ;	• ogy í	s szintetikus SP-C	nem
felületi	X L J	.vitás	;hoz szükséges.	o-
a t érmé	sztes	pept	id [Johansson,	J.
07, 535-	541,	old.	(1995)1, és ez	ál-

tál nem megfelelő a kölcsönhatása a felületaktív lipidekkel.

Következésképpen a szintetikus SP-C-analőgok sem veszik fel a megfelelő konformációt, mint a természtes pepiid, és nem megfelelő a kölcsönhatásuk a felületaktív lipidekkel, E probléma kikerülésére érdekében számos próbálkozás történt a .szekvencia módosítására, például a természetes SP-C hálixének összes Val-o-l dalláncának Leu-val történő helyettesítésével, ami erősen kedvez az o-héiíx konformációnak. A megfelelő transzmembrán analóg, SP-C(Leu) jó szétterülést mutatott a levegő-folyadék határfelületen DFPCnPGíPA (68:22:9) (w/w/w) elegyével kombinálva. Azonban, ciklikus felszíni kompresszió során a maximális felületi feszültség értéke (y_m&s? szignifikánsan magasabb volt, mint a természetes felületaktív anyagé. Ezenfelül nem volt lehetséges 20 mg-ml-nél töményebb üpid-peptid ©legyeket készíteni, valószínűleg peptid-olígomerek kialakulása, miatt [Nilsson, G. és .mtsai.,, Sur. J. Biochem,. 255, 116-124. old.

» * n * * (1998)]. Mások különböző hosszúságú bioaktív pol.i-leuein SP-C-analőgokat szintetizáltak [lakéi, T. és mtsai., Bioi. Pharm. Bull. 19, 1550-1555. old. (1996)]. Ez utóbbi tanulmányokban sem oligomerizációt, sem nagy iipid-konoentrációja minták elkészítésével kapcsolatos problémákat nem. jelez-

közül a WO í	>3/21225.	számú nemz
EB 733 645.	számú	európai
WO 96/17872.	számú	nemzetközi
Tanabe) a természetes	> SP-C pepii

Különböző közlemények foglalkoznak természetes felületaktív anyagok peptidanalögjaí előállításának problémájával, számos különböző megoldást javasolva, Ξ közlemények etközi közzétételi irat, az közzétételi irat és a közzétételi írat (Tokyo .danaiógjait tárja fel, amelyek általában az M-terminális szekvenciát illetően különböznek a természetes pepiidtől,

A Scripps Research Instítate WO 89/06657. és

WO 92/22315. számú nemzetközi közzétételi iratai SP-Banalőgot tárnak fel, amelyek felváltva hidrofób és hidrofil aminosav-oldalláncokat tartalmaznak. Egyebek közt lizint és leucint váltakozva tartalmazó pepiidet (KL«) is igényelnek.

Ülerex, A. és mtsai. [Sur. J.

old. (199:5)) a sertés SF-C, valami bakteriorodopszinból származó hibz iisának megfelelő különböző hossz?

fel.

Biochem. 222, 465-472.

tt a sertés SB-C-bÓi és id peptidek ú-termináxságü peptídeket tárnak

Johansson, J. és mtsai.	[Biochem. J. 307,	535-541
old. {1295)] a sertés SP-C-tői	néhány aminosav he)	Lvettesí
tésévei eltérő szintetikus pept	idekét tárnak fel.

β WO 8:9/04.326, számú nemzetközi közzétételi irat (California Biofcechnology - Byk Gulden) és a WO 91/18015. számú nemzetközi közzétételi irat (California Bíotechnoiogy

Τ* Λ τ* <»> *

Soros Nova) olyan SP-C-analögot tár fei, ameivbex mészetes SP-C kezdeti ^-terminális szekvenciájának két Cysoldaliáncát két Ser helyettesíti. Emellett a WO 91/18015. számú nemzetközi közzétételi irat olyan peptideket ismertet, amelyek „magja az Χ2ΧΒΧ7ΒΧ3ΒΧ általános képlettel irható le, amelyben X jelentése vaiin vagy izoleucin, és δ jelentése izoleuoin.

Azt találtuk, hogy az alábbi jellemzőket kombináló SB~ C-anaiögofc különösen előnyös felületi feszültséget csökkentő tulajdonságokat mutatnak; i) az SP-C Vai-oidaliáncait lle, Leu vagy Nie oldalláncok helyettesítik; ii) Cys~ oldailánookat Ser-oldalláncok helyettesítik; ül) pozitívan töltött vagy nagyméretű eminosav-oldailáncok beinszertálása az SP-C szekvenciába„ Azt találtuk, hogy különösen az utóbbi jellemző, a poláros oldalláncok által okozott pozitív töltések vagy a nagyméretű helyettesítők miatti térbeli gátiás segít elkerülni az oiigomerizációt.

Az alábbi első megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezik az (I) általános képlettel megadott SP-Ganalógok (az egybetüs amínosavkód alkalmazásával.; :

P^GfptzyvHLKRiXaü;^ ahol:

X jelentése a V, .

bármelvíke;

: X&B ? _rx (X_CB f _aX_dGALLMOL· vagy Nle (norzenein; amínosavak * ** i « ♦ ί«*> ♦ ·♦ < ♦♦ * **

Β jelentése az Ornitin, Κ, 1, W, F, Y, Q vagy X aminosavak bármelyike;

Z jelentése as S, C vagy F aminosavak bármelyike, ahol Ser- vagy Cys-oldallánookhos opcionálisan 12-22 szénatomot tartalmazó acii-csoportok vannak kötve észter- vagy tíoész-

tér-kötéssel.
a	értéke	egész szám 1 és	19	között
b	értéke	egész szám 1 és	19	között
c	értéke	egész szám. 1 és	,21	között
d	értéke	egész szám 0 és	20	között
e	értéke	δ vagy 1
£	értéke	0 vagy 1
n	értéke	0 vagy 1
m	értéke	0 vagy 1

azzal a feltétellel, hogy

- n + m > ö,

- f é e;

- iXaSJaVAbBisUXcBjaXö maximum 22 aminosavat, előnyösen 1.0-22 aminosavat tartalmaró szekvencia,.

Az (I) általános képlet szerinti előnyös psptidek az alábbiak;

(la) FGlFSSPVbLXRX^BXíBXíBXGALLMGL (ib s FG.T. PS$PVHLKRXs»X_sSX₄GA1LXGL (IC) FölPSSPVHLKRXiBXi iGALLMGL (1 d · Föl ? S S RVR L KRX_S SX·? G AL LHGL (le) FGIPSSPVRLXBXhBXíGALLXGL

Sf X

Az (la) - (le) szekvenciák közül azok előnyösek, amelyekben B jelentése Lys vagy Phe és X jelentése Len, He vagy Nle.

Előnyös megvalósítási módok szerint az (ia)~(lf) álta lános képlettel megadott peptidek szekvenciája sorrendben a következő;

EGiPBSPyKLHELLlLKLLLLKILLLKLGALLbGL >SP~C (LKS)1

EGIPSSPVH1KRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS) ·.) FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL [SP-C (LKS ) ₂|

E<3IPSSPVHLKRLLILLLLLK'LILLLILGALLMGL [SP-C (LKS)31 EG1PSS PVHLKRLllLLLLLLLIKLL1LGALLMGL (S P-C (LKS}₄ ] EGlPSSPVHLKRLLTLFLLLLFlLLLFLGALLfíGL (SP-G (LES)]

A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja szerint a Ser-oldailáncokhoz 12-22' szénatomot tartalmazó· acii-csoportok vannak kovalensen kötve.

Az (I) általános képlettel megadott peptideket szintetikus vagy rekombináns úton állíthatjuk elő.

Hagyományos szintetikus eljárások találhatók például az alábbi pufelíkáeíókbon: Sehroeder és mtsai,, „The peptiáes, 1. kötet, kiad.: Academic Press (1965); Bodanszky és mtsai., „Peptid synthesis, kiad.: Interscience Publis'her (1996); Saramy és Merrifield,· „The Peptides; Analysis, Synthesis, Biology, 2. kötet, 1. fejezet, kiad,; Academic Press (1980). Az eljárások tartalmazzák peptidek szintézisét szilárd fázison, oldatban, szerves kémiai eljárásokkal, vagy azok bármilyen kombinációjával,

S— vagy 0-aci.iált peptideket előnyösen a nem. acílált peptidek acii-kloriddal való kezelésével szintetizálhatunk

		O _ * *» .7 + » ♦ ♦ ♦ * * * 1 ««» ♦* '	V « * * * » # ♦ Φ <K * «* * * «Φ XX X ♦ ♦ '♦
tiszta t	r i f 1 u o re c e t s a vban,	Yo us ef i-Sálakdeh é s	mtsa
íEiochem.	J. 343, 557-562.	old. (19993 ] leírása	alap j á:
Szintézis	és tisztítás után ,	a szintetikus peptidek	biokém

d e S íofizikai tulajdonságait meghatározzuk, amint az alábbi. Szabadalmi Példák részben azt bemutatjuk.

A találmány szerinti peptidek felületi feszültséget csökkentő aktivitását lipidekkel és foszfolípidekkel, SP-S és annak helyettesítőivel keverve értékeltük. A peptidéket előnyösen DPPC (1,2~dipaimítoil~sn--glíeero-3~f oszfoko-lin) /PG (ÍGSzfatidil-glioerol)/PA ípslmitinsav) elegyével és polimíxinekkel kevertük, SP-S vagy annak aktív analógjának elenlétében vagy anélkül.

A pulzáló-bnborékos felületi aktivitási vizsgálatok eredményei egyértelműen mutatják, hogy a találmány szerinti szintetikus peptidek jelentősen lecsökkenfik a minimális és maximális felületi feszültséget és y»_a»} ciklikus felszíni kompresszió során olyan értékre, amely a természetes felületaktív anyagok alkalmazásával nyert értékekkel Összehasonlíthatók.

SP-B vagy annak aktív analógjának a peptid/lipid-foszfclipid-elegyhez adása különösen előnyös eredményeket adott. Ezenkívül meglepő módon azt találtuk, hogy polimixínek, különösen a polimixin 8, helyettesítik SP~B~t, és hozzáadásuk az SP-8 alkalmazásával összehasonlítható eredményeket ad.

Második megvalősítási mód szerint a találmány tárgyát szintetikus felületaktív anyag képezi, amely egy vagy több (I.) általános képlettel megadott pepiidet tartalmaz, Iipí10 φ « * * * * * » * Φ*** χ Φ ΦΦ* »*» dekksl és/vagy foszfolipidekkel és opcionálisan SP-S-vel

vagy an	nak aktív származékává	V
Megfele	10 lípidek/foszfoiipid	ek

nyösen.	DPPC), PG, PA, trígii	.ce·
lyike.
A	találmány egy még eí	Lön

szerint	olyan peptídet tart a	Ima

gyet alkalmazunk, amely a Ser-oldallánchoz 0-kovalensen, kötött paimitoil-láncot tartalmaz. Azt találtuk, hogy az (SPC(Leülj referncia-peptid dipalmifoilált formáját tartalmazó felületaktív anyag elegyek nagyobb felületi filmbeli stabilitást és megnövelt felszíni lípid-rezervoár-méretet mutatnak a megfelelő nem pelmitoíiáit péptidet tartalmazó elegygyei összehasonlítva, a visszatartott buborék rendszer mérései alapján. Az 5% dipalmifoilált peptídet tartalmazó mintában y_róti 1,5 md/m alatt volt és a filmek nagyon stabilak voltak, minthogy a felületi feszültség csak 0,5 md/mrel növekedett 10 perc alatt, állandó buborék térfogat mellett, Ezzel ellentétben a nem-palmitoilált peptid y·^» értéke 5 md/m volt és a filmek kevésbé voltak stabilak, amit a kis felületi feszültségeknél megfigyelt gyakori buborékelpattanás mutatott. Ezenfelül a szubfázis kimerítése után a nem-paimitozlált peptídet tartalmazó minták zéró-közeli stabil felületi feszültség elérésére vonatkozó képessége elveszett néhány adszorpciös lépés után, míg a. di.pl ami tolláit peptidekkei a film minősége nem romlott, még több mint 10 expanziós lépés és több mint két lipidrétegnek megfelelő tartalék-anyag beépítése után sem. A dipaImitolIáit peptl: ϊ . ··;

* * * * **** * «4 > »♦«* * * * dek javított felületi feszültségét pulzáló-buborékos felületi feszültségmérővei is igazoltuk. Ezenkívül azt találtuk, hogy az acil-csoportok jelenléte tovább csökkentette az ciigomerek képzésére való hajlamot. Ez a felismerés nagyon fontos, mivel mesterséges felületaktív anyagok készítésekor a peptídek oligomerizácíója megakadályozta- 20 mg/ml-nél töményebb elegyek készítését [Híisson, G. és mtsai., Sur. J. Biochem. 255, 116-124. old. (1998)1 .

A szintetikus felületaktív anyagot petidek és Iípidek oldatainak és szuszpenzióinak összekeverésével készíthetjük el, majd az elegyet heszáritjuk.

Az alkalmazáskor a száraz elegyet felszuszpendálhatjuk, diszpergálhatjuk vagy porként adhatjuk be felületaktív anyag-hiány miatt kezelésre szoruló alanyoknak.

A szintetikus felületaktív anyagot előnyösen légcsöven keresztül vagy aeroszolként adhatjuk be. A beadás utóbbi formája a felületaktív anyag kis részecskéinek megfelelő inért hajtégázzal való keverését igényelheti. A beadás más formái, mint például stabil oldatok/szuszpenziók porlasztása vagy permetezése szintén a találmány oltalmi körébe tarEgy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezi a feltárt peptídek alkalmazása felületaktív reagens készítésére, amely tüdőbetegségekkel - mint például tüdőgyulladás, bronhitisz, asztma, mekőnium aspiráciös szindróma - és más betegségekkel is - mint például súlyos középfülgyulladás (ragadós fül) - kapcsolatos minden fel12 nőtt és újszülött felületaktív-anyag hiány és .rendellenes működés kezelésére alkalmas.

Tipikusan a felületaktív reagenst ~ előnyösen légcső·vön keresztül beadva - respiratórikus disztressz szindróma kezelésére alkalmazhat jnk, ami. gyakran fordul elő koraszülött csecsemőknél.

Az alábbi példákkal részletesen bemutatjuk a találmányt.

1, példa.

Peptidek szintézise és tisztítása

SP-C (LKSj-t, az: SP-C analógját Cl- ábra) szakaszos szilárdfázisá módszer és terc-butíloxikarbonil kémia alkalmazásával szintetizáltuk (Kant,· S.S.H., Annu. Rév, Siochem. 57, 957-989., old, (1988) ] Applied Bi©Systems 43ŐA készüléken. A gyanta és peptid közti kötés lehasítása. és a védőcsoportok eltávolítása, vízmentes hidrogénfluorid/metoxibenzol/dimetilszulfíd 10:1:1 (v/v/v) «legyével történt 1,5 órán át O’C-on. A védőcsoportokat és győkfo-gókat dietiiéterre.1 való ismételt extrakcióval távolítottuk el, majd a peptidet dlklórmetán/ferifluorecetsav (TFA; 3:1 (v/v) elegyével extraháltuk ki a gyantából, és rotációsán foepároltűk. A nyers peptid extraktumot újra feloldottuk 100 mg/ml koncentrációban kloroform/metanol 1:1 (v/v) 5% vizet tartalmazó elegyében. Egy lö mg-os alikvotot Sepbadex AH-60 oszlopra (40 χ 1 cm) vittünk fel ugyanebben sz oldószerben [Curstedt, T. és mtsai., Eur. J. öiochem. 168, 255-262.

old. (1987)], 2,5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk és 214 nm-en és 280 nm-en mértük az adszorbanciát. Az azonosítást és mennyiségi meghatározást a.min.osav~elem.zés.sel végeztük.

♦ * *

K A » * * « « » $ ** » >um **

Acíláláshoz a tisztított pepiidet (tipikusan, körülbelül 5 mg-ot) bepároltuk, feloldottuk desztillált TFA-ban (100 μΐ) es acii-kioridot (10-20 ekviavalers a pétidhez képest) adtunk hozzá. lö perc elteltével a reakciót 80%-os vizes etanollál (1,0 ml) leállítottuk. Az acii-peptidek tisztítását kromatográfiás úton végeztük Aipídex 5000 oszlopon etílén-klorid/metanol 1:4 (v/v) elegyében, amit fordított-fázisú HPLC követett C18 oszlopon, lineáris gradiens alkalmazásával 2-propanoi/0,1% TEA és 60% (vizes) metanol /0,1% 'IFA vagy 75% (vizes) etanoi/0,1% TEA között.

2, péld

A peptid tisztaságát natrium-dodecilszulfát (SOS) poliakrilaroid-gélelektroíorézissel (EAGE) (PhastSystem, Pharmacia, Sweden) és fordított-fázisú magasnyomású folyadék-kromatográfiával (HPLC) ellenőriztük, Cis—oszlop és 60% vizes metanol/ 0,1% TEA és izopropanol/ 0,1% TFA közötti lineáris gradiens alkalmazásával (Gustafsson, (4. és mtsai-, Biochem. J. 326, 799-806. old. (1997)].

A molekulatömegekét „matrix-assísted iaser desorption ίοηí s a t i οn-1 íme-o f-fIight (MALOi-TO F) töroe gspe kromét riáva1 határoztuk meg (Laaermaf 20176, .Finnigan ΜΑΤ) , amit vazoaktív intesztinális pepiiddel (molekulatömege '3326,8) kalibráltunk.

A peptidek másodlagos szerkezetét cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia alkalmazásával vizsgáltuk (casco720, Casco, Japan). Trifluoroetanolfean (TF£) való feloldás után a spektrumokat 260 és iti nm között vettük fel, 20 nm/perc letapogatási sebességgel és 2 mérés/nm pontossággal, Kiszámítottuk a rezíduális moláris ellipticitást, és kceg x cKh/dmol értékben fejeztük ki. 208 és 222 nm-néi óért moláris ellipticitást alkalmaztuk a helikális szerkezetek arányának becslésére [B-arrow, C.J, és mtsai., J. Mól. Bioi. 225, 1075-1093. old. (1992].

Az SP-C(ÖKS) másodlagos szerkezetének vizsgálata CDspektroszkópiával o-hélíxet tartalmazó peptidek tipikus spektrumát mutatta, és a 20Q és 222 nm-es minimumok alapján körülbelül 75%-os o-héiiz tartalmat becsültünk. A másodlagos szerkezet stabil maradt, vízzel való szakaszos hígítást kővetően 12% TFE-tartalomig, amennyiben a pept.idet tiszta TFE-ben oldottuk fel.

Az SP-C(LKS) SDS-PAGS-n egy csíkot mutatott a természetes SP-C~hez hasonlóan, míg az SB-CÍLeu) - amelyben nincs Lys a hél.ixben - oiigomereket alkot. Az SPC(Leu)/lipíd elegyeknél tapasztaltakkal ellentétben - amelyeket nehéz 20 mg/ml-néi töményebben feloldani (Nilsso.n, G. és mtsai., Sur. J. Biochem. 2.55, 116-124. old. (1995)] , lehetséges volt 8ö mg/ml lípi.d-koncentrációjú SPC (L.KS)/iipid. elegyet létrehozni 0,03 polipeptid/iipíd arány mellett.

3. példa

Peptíd/lipíd elegyek előállítása

A DPPC-t, FG-t és PA-t a Sígma Chemical Co.-tól (St. louis, MO) .szereztük be. A kloroform/ metanol 98:2 (v/v) elegyhen feloldott lipideket DPPCrPGiPA 68:22:9 (w/w/w) vagy DPPC/PG 7:3 (w/wj arányban elegyítettük. Felületaktív

Ί 5

-φ Φ ♦ * Φ Φ X * Φ * * ♦ * Φ Μ- »«««

Φ*Φ Φ« Χφφφ «φ φ

ΦΦΦ ΦΦ» anyag készítményeket SP-C(LK3)-nek vagy SP-C (LKS)-nek és •SP-B-nek a lipid elegyekhez történő hozzáadásával állítottunk elő 0-től 0,Ö5~üg terjedd végső polipept íd/üpid tömegarányt eredményezve. Az elegyekét nitrogén alatt bepároltuk és újra feloldottuk 10-80 mg/ml lipid koncentrációban 150 mmol/1 HaCl-foan vagy lö mm.ol/1 Hepes pufferben, ρΗ~6,9, ami 14-Ö -mmól/l. NaCl~t és 2,0 mmol/1 GaCI?-! tartalmazott. Ismételt fagyasztást és- ultrahangos kezelést (50 W, 48 kHz) hajtottunk végre, amíg homogén szuszpenziőkát kaptunk. Egyes esetekben a végső s-zuszpenzókat 45’C-on inkubáltu'k 1 órán át,

A 150 mmo.1/1 NaCl-ben felszuszpendált felületaktív anyag készítmények pH-ja 3.,5-5,5. Az. alacsonyabb 3,5-4,5 p.H-értékeket. az SP-B-t tartalmazó készítményeknél figyeltük meg. Mivel a természetes SP-B-t szerekkel tisztítják [Curstedt,

Biochem.. 168, 255-262, old, (1987}}, kis mennyiségű sav maradhat a preparátumokban. Fiziológiást megközelítő pH-t értünk el. -a. felületaktív anyag készítmények 140 mmol/1 NaCl-t és 2,0 mmol/X CaClz-t tartalmazó 10 mmol/1 Hepes pufferben, pH-6,9 való felszuszpendálásával (1, táblázat). A megfelelő nem puff-ereit készítményekhez hasonlítva nem volt változás a Yssík és γ^χ értékekben, amikor DPPC-PG 7:3 (w/w) eíegyet alkalmaztunk llpidként, Azonban amikor PA-t is tartalmazott a lipid elegy, mind y,_Sv_Tl, mind értéke emelkedett magasabb pH-kon (1. és 2. táblázat}., savanyított szerves oldónur. a es mtsai (1. és 2 * « «

I φ

IP

i 1	c:	•Ö
	'ít!
0	P	'fO
'Ό l	-X

i	ií)	□
írti	'iő	&
'Φΐ	,-í
•y-í:	•IŐ	•P
	,o	<ö
'O	3Í	,-VÍ
f ·'? i	d	O
O	Kp	P
Ή	<<-·	«5
N		*τ·>. Kp
*H	<í	fü

ί	'£}	N
Ή : ni :	4~>

•η)

ö) ci Ο, ΌI ο

Η .3

Ρ

Ή

Ρ

Φ

O :Ö

P

P 'fő 'fő w

Ό φ

P í

fp o;

!

d •H

O o

-p if) '3!

N ií) «

Φ

P a

£ o

d rp •<Ő >p

-,~j

5P

O

X) ρ

3i <Ή

Φ <Ρ d

φ >β

Ό β

Ρ

Ni !β •φ d j !

Oj

ÍŐ:

dl

Cj «

·> i fp Ρ ί d í Íöi P: <3>i —! •Ό I

Φ

C

O !

o so p· fp &

cs _tp <:í >P if) !

_:\.'.x ó

ifi

Φ •b

N ff)

Φ

P

3) d

ií) 'Φ

P .ρ

XS

-P

κ.

ρ

P

3) 3) fre •öi »i Pi 35 i P 05 Φ ·>' ö>

fő >

Φ ií) '35

P xp

N ή

vrtí d

Pp o

d

-fő

P tí

P fp é

d.

Ö’ i£ ö

-1—1

Ό

-P ο

•iő

P

P ö

ííj r~

3>

•<Ő

P

Ό

M ©

ííj

3)5 iő

ÍŐ fp ;;:3

C

Φo d

d

Φ xs

Φ i>

N íO d

P íií d

ííí <p

N if) o

>p

P

Φ >

© >

>/*-» x<{ \(5.) s

ö>

Ό

Ö) p

p n

η

Φ ip

-P p

3)

,...| p

,-p

3) '35

US •<y

P '3!

s

Ifi f

o d

'Φ

P

Ό

N fX

P ©

<-i

P	-Φ		p4	35
IŐ	P			β
N	Ό	t	<0
•ÍŐ	is		o
fp		:::)		Κχ
X)		P		35
•lő		w	M	Ο,
&'i		3)	o
		Of		05
«		'35
r-f			5-0

* ♦♦ X « ♦ ♦· ♦ ♦ * * * * x «X * ♦««« Φ « «

Φ ♦ Φ * *

<Ν	CÓ	ϊΗ	<~ί	<····	C'-i
				W	-x..-
<Ν	C\>	ίη	κο	Ct
'χΓ	^>-5j'	(η	<*>	Ο	<Υ>

.»··ν	,·-'χ	·***»
ι.Ο	*sP	1---Í	ο	ϊ-ί	i-i
	<Ο	<\5	fí	V	ro

	νΓ>	σ'ί	C'-S		¢-.,5
-νχ..·		'χχ—		^..s·
<ύ	·3\	γΉ	r~>	u>
	<λ	<ό	Γβ	Cíf	0

.»··*«, ν·ί<	.·*···,	_Α-χ_ν			S
Μ	r*>	ϊ~ί	V'M	;\4	<Ο
r—{	σ>	CM	«··.·«	ϊ™}

Φ**Χ Χ-*Χ .*ΛΧ <*?Μ»

5-S (Ο
χ.’-'	v<.y	>'	X.
γΗ		*\Γ	θ'.
	Ο·!	<Ν	C-J

ί rH !

CN ΓΟ

ΓΗ Ά,»—

CO

(ί	ΌΊ	<ί	<\ϊ
Ν	<Ο

ο ο ο ♦ , ο Φ

V) ! ί/} * (ϊ)

0 β,.	0 β.	0 «,	0 Οί	r Λ ν...· β,	0 β,
^χ.		Ύχ.	^χχ„	'χ.	m.
Ο	0	Ο	0	r 5	0
&<	ίλ:	ÍU	β»	&	£.:
CU	βχ	ίλι	β-ι	ftí	β.
α	α	Q	Q	η	0

C'-i <Ν •η

V-Í

ΟfO γ>~) fO Ö'· <ν\ ·*<->

., _Λ „ • · «»«,«« . . X r-<

Ό

Oi

AJ

OÍ

A-i

Φ

ÍU •Hl·

Φί

CK

'.Öi

B5

C j

Ö

Ή ::5

AR

-H

AJ

Φ r~i

-.3

AZ

OL

C 'Φ +j <H

N

W '0

ÁZ i

O'^; d

>Ί

C fO

C* i φί Xi

4_>

ÍÖ ’T’* } í-H

Ö g

P d

P

N

Φ o>

AZ

Φ

A->

c

-H g

N i« g

iö

AR

Zi «5

-AJ

P

Φ ·>··(

P

O p

M

V.·

Aa

AZ ·:·}

AJ <y

Ό

Φ

4-A

Φ

0>

φ xi

Φ

AJ

Φ aJj φ

N aö:

.A ι J-Ai

Ό| e-d '3

-r'i

O <··)

Ó 'd

Zi υ

¢5

Ö

AZ r-i

AJ

Φ

AZ

Φ ift

-rti

Zi ><y £

sr:

Ό ,--i	ί ΑΖ
'Φ	Ρ	<
Ν	υ	.'Ζ
Η		···<
3		-iJ
α	’ϊζΓ	<Η '3
ΑΑ ίβ	φ Φ	•Η C
		>>-)
·*\		ΑΑ
Ρ fÖ	•Ή j-i	Φ Χί
ίΠ	Φ Φ	tí;
Ν	fi) < »
<:	Λ-3 Γλ> Ρ	σ· ο
ο	ΧΜ 0 Ρ	ο Ν
X <0		W
ίϊ t^r*	-Ρ	Φ
α	>Ή	ΑΑ
	:3	φ
X»	χ·Α	ÁZ
£	Φ	Φ ό
Φ	•Μ
J0		'Φ
ρ	ζλ»	AJ
φ	ί	\Ρ
Ρ	Ο'^	XÖ
ρ	ο	Ή
’J	ip	!>
α	'.0
		Ρ
σϊ	>·< ο 1	sí;
Λ)
&	ί ο
φ	♦
Ρ	ί-~	ΧΛ
ρ	ίΌ	«) 'φ
Ρ		Μ
Ρ	X Λ—J fi)
Ο	l·) >75
1	Ρ
í-h		Φ
	ρ	σ>
ν.^.·	'£?
Γί		r'4
<0	-+··»·	Ρ
Φ	<0
Ν
Φ		νθ
<3 Η Φ	•Ρ	-Φ
Φ	Μ 'Φ
Α-¹ £	^:Ο	S
Ρ	LQ
Φ Ρ	ΜΙ) fcü
	Ö’»	ΓΠ
.·:.·)	'φ	Ρ
ο-ί	{ £	φ
1p	Ρ	.< >.χ
ο φ ο	Ρ Ν	'φ AR Ζί
	Φ	Ό
Ρ bs.	Ρ'	Ν
		«ΐ
6	<ί~»
£3	ΑΑ	,
s3	φ
ί~Α	>Η	ί }
^*S.	'3	φ
ν·<’	—i	Γ*Ι
	/ί'
Ρ	φ V-:	-Α Φ
		IÁ
Φ	«	X-
-Φ	0	υ
	ΑΖ	Zi
Ρ	'Φ	φ Q,
ί	ΖΑ
Ρ	Ο	<.
Ο	.0	ο
φ	3	3
	-Q

* * Χ44 « 4 X példa νδΐ

A DPPC~t és PG-t a Sigiaa Chemical Co.-től (St. szereztük be. A kioroformlmetanol 98:2 (v/v) elegyben feloldott lipideket DPFC/PG 7:3 (w/w) arányban elegyítettük. SP-C'LKS)~t adtunk a llpid elegyekbe2 0,-03 végső polipeptíd/foszfolipid tömegarányt eredményezve. Az eiegyeket nitrogén alatt bepároltuk és szobahőmérsékleten újra feloldottuk 140 mmoi/I NaCl-t és 2,0 mmol/i CsC!;-t tartalmazd 10 mmoi/1 Hepes pufferben, ρΗ«δ,9, vagy ugyanebben a pufferben, ami 0,01% polimixin 5-t (PxB) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) is tartalmazott. Ismételt fagyasztást és ultrahangos kezelést (50 48 kHz) hajtottunk végre, amíg homogén szuszpenziókat kaptunk. Mindkét fajta készítmény végső foszfolipid-koncentráciéja 10 mg/ml volt. A PxB hozzáadása mind y^n, mind y_W5S értékét csökkentette, és optimális felületi aktivitás értünk el (3. táblázat).

t ο

C'.J ί

ló c

X

H

Ή: •i-> i Φί

M~í

Φ ő:

'Φ g

4~>

••H

O'J •Φ !

O¹ <tS £

re •H i~>

es 4^ Φ -—ΐ es

Φ

Wf to

Φ

Ö>

•Φ to to Ό to Φ »$,- Λ.Ίί •U <$

N

Ά3

X 'íti

« » « «X V χ V 4> * χ * φ

S x ♦ «:* «φ « «* ♦ » « 9> « β

5. példa

Biofizikai jellemzés

Felületi szétterjedési kinetikát mértünk 34-3?’C-on dilhelmy-féie felszíni mérleggel (Biegler, Vienna, Austría). A felületi feszültséget 10 percen át követtük feszülés-mérőhöz kötött platinalemezzel, amit I ® mélyen teflon-vályúban lévő 20 mi, 150 mmol/1 NaCl hipofázásába helyeztünk. Az összesen 1 mg lípidet tartalmazó szuszpenziókat cseppenként adtuk a hípofázíshoz, 4 c®-re a piatinalemeztoi.

DFPC/PG 7:3 (v/v)-ben szuszpendált 3 «%-os SP-C (LK.S)

Wilhelny-féle mérleg alkalmazásával történő kinetikus mérése a gyors széttrejedést mutatott 3 másodperc elteltével 28 mN/m felületi feszültség mellett (2. ábra). A szétterjedés valamelyest lassabb volt 1 w%-os SP-C(LKS) alkalmazásával ugyanazon 1ipid-elegyben (adatokat nem közlünk). 2 w% SP-S hozzáadása nem változtatta meg szignif lkán s-an a szétterjedési. sebességet és az egyensúlyi felületi feszültséget (2.

ábra).	Nem vol t	javulás megfigyelhető	az elegyek 45’C-ón
való 1	órás inka	nációját követően sem	(adatokat nem köz-
lünk) .	Hasonló	eredményeket kaptunk	DPFC:PG:PA 68:22:9
(W / V / w)	iipíd-eie	cjgyei is (adatokat nem	köziünk).
A	dinamikus	felületi feszültséget	po 1. z á 1 ó bubo r é ko s
felület	i feszültség-mérővel vettük fel	(Surfactometer In-
ternati	öíiü Jv $ Á ott.	jnt©·, Canada) , 37’C-on	, a baborskfeiszín

508-s felületi kompressziója és 4 0 ciklus/perc frefcvenoí< mellett. Minden mérést 5 percig végeztünk 10 mg/ml lipidkoncentrációnál, A buborék falának nyomás-gradiensét mégha22 « fc » fc· H*v * « fc tározott időpontokban mértük,- és a minimális és maximális buborékméret felületi feszültségének illetve y~_aK} kiszámítására alkalmaztuk.

A pulzáló buborékos felületi feszültség-mérőben a DP PC:PG: PA 6 8 ; 2 2: 9 (w / w./ w) -ben szusz ρe n dá 11 3 w % - o s S ? C(LKS) 1 mR/m-né! kisebb felületi feszültséget hozott létre a minimális buborékátmérőnél (y^l, mig a 9-14 mN/m volt a DPPC/PG 7:3 ív/v)-ben szuszpendáít 3 wl-os SP-C(LKS) esetében. A maximális buborékátmérőnél (γ»_3Χ) mért felületi feszültség körülbelül 40 mh/m volt mindkét esetben. 2 u% SP-B hozzáadása 31-33 mN/m y_Rax és 0-2 mN/m értékeket adott mindkét lipíd-készitmény esetében. Ezek .az értékek nagyon hasonlóak a természetes forrásokból izolált felületaktív anyag készítményekéhez (Robertson, B. és mtsai,, Prog. Respir. Rés. 25, 237-246. old. (1990) ] . A készítmények 45 C-on 1 órán át való inkubálásának nem volt szignifikáns hatása a felületi aktivitásra (1. táblázat). Az SP-B mennyiségének 0.5 w%-ra való csökkentése a DPPC/PG 7:3 (v/v) elegyben sz-uszpendáifc 3 w%-os SP-C (LKS) y»i_S értékének növelését okozta, habár az eredmények nem. voltak statisztikusan. szignifikánsak. (1. táblázat}. Ellentétben az SP-Bvei, 2 w% KIm hozzáadása iCochrane, C.G. és Revak, S.D., Science 254, 566-568, old. (1991)1 a DPPC:PG:RA 68:22:9 (w/w/w) elegyben szuszpendáít 3 w%-os SP-C(LKG)-hoz nem csökkentette Ymax-ot, ami viszonylag magas maradt, 41-42 mh/m,

6. példa

Palm tol Iáit és nem-palmítolIáit referencia-pefcideket tartalmazó elegyek összehasonlítása

A felületaktív anyag készítményeket 3 w% SP-C(Leu)~nak vagy dipalmitcilált SP-C(leu}-nak DPPC:PG:PA 68:22:9 (w/w/w) lípideiegyekhez. való hozzáadásával állítottuk elő. Az szegyeket nitrogén alatt bepároltuk és 10 mg/ml iipid koncentrációban 150 rrtmoi/l NaCl-ban újra felszuszpendáituk, Azokhoz a mintákhoz, amelyekben. SP-8-helyettesítőfc alkalmaztunk, 1% (u/u) polimixín 8~t adtunk.

A dlpalmitolláit SP-C(Leu)-t tartalmazó elegyek - polimixin S-vel vagy anélkül ís - szignifikáns javulást mutatnak, különösen a y_sax csökkentésében 5 percnél és a csökkentésében korábbi időpontoknál.

4. Táblásat: Felületi tu1ajdonsagok

As elegyek felületi feszültségét pusziló buborékos felületi feszültségmérővel mértük. Két perc ekvílibrálás után as adatokat 37’c-on 50%~s felületi kompresszió és 40 ciklus /perc mellett vettük fel különböző időközöknél.

Felületaktív anyag készítmény :	Felületi feszültség (mS/m)
SP-C ίLeu) (% w/%?')	Dipalm. SP-CíLeu) (% w/w)	PxB (% v/w)	7,í	s	1 perc	5 perc
Y®i K	Yksx	Viliin	Y«ax	Vinin Ytnstíí
1			11	39	6,2	39	2	42
1		1	3:	37	3	38	0	4 0
	1		X	34	1	35	1	36 (
	1	1	0	2 9	0	34	: o	35

* * tf φ ♦ * « * > *»♦ ΦΦΦ * Φ Φ Φ φχχ « φ φ »»Μ« XX- « φφ χχ né Ida

Συ vívó jellemzés

A felületaktív anyag-terápia éretlen tüdő mechanikai tulajdonságaira gyakorolt hatását kilenc - 27 napos vemhesség után - koraszülött nyúion értékeltük. Az áriatokat születéskor légcsőmetszésnek vetettük alá, és közülük öt kapott kétszer 2,5 ml/kg mesterséges felületaktív anyagot, iégesőkanülön keresztül. A felületaktív anyag DPPC-t, PG-t és SF-C(LKS)~t tartalmazott a fentiekben megadott arányban, polímíxin δ-vsl vagy anélkül. Az exogén felületaktív anyag totál foszfolipid 'koncentrációja 40 mg/ml volt. Két, negatív kontrollként .szolgáló állat nem. kapott, semmit a légcső— kanülön keresztül, é.s két másik, pozitív .kontrollként szolgáló állat módosított természetes felületaktív anyagot (Curosurf, Chíesi Farmaoeuficí Spa, Parma, Xtaly) kapott ugyanabban a dózisban, 40 mg/ml-re hígítva. Sgy állatot OPEC és PG elegyévei kezeltünk fiziológiás sóoidatban {fentivel megegyezd koncentrációban} , 2,5 mi/kg dózissal. Az összes állatot test-plefcizmográf dobozban tartottuk 37’C-os hőmérsékleten 60 percen át, és 100% oxigénnel lélegeztettük Servo Ventillátor 9QQS íSíemens-Elema, Solna, Swedexi) készülék alkalmazásával 40./perc frekvenciára és 50% belélegzést időre állítva. A légzési térfogatokat a pletzzmográfokhoz kapcsolt pneumotachígráffai mértük. Az állatokat ΒΙΟ ml/kg-es standardizált légzési térfogattal lélegeztettük porit.ív kíiégzésvégl nyomás („positíve end-explratory pressure, PEEE) nélkül. A tüdö-meiikasi teljesítményt a

ΖΟ * φφ «X X ΦΦ **

V9 Φ X Φ Φ -9 Φ ·* * · * * ♦«♦'♦· Φ *** **♦

ΦΦΦΦ * Φ «ΦΦΦ * χ ♦ χφφ Φφ «φφφ φ-χ * *« ** légzési térfogat és a. belégzési csűcsnyomás arányaként definiáltuk, és ml/« H₂o kg egységben fejeztük ki,

A nem kezelt kontroll állatokhoz hasonlítva a teljesítmény szignifikánsan javult a mesterséges felületaktív anyaggal kezelt állatokban, különösen a polimí.xin B-t tartalmazó felületaktív anyagot kapott állatokban, Figyelemre méltó módon a javulás nagyobb mértékű a hasonló dózisű, módosított természetes felületaktív anyaggal történő kezelésnél megfigyeltnél {31 ábra).

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat:

Az 1, ábrán az SP-C és analógjai aminosav-s2ekvencíájának csigavonaláé ábrázolását mutatjuk be.

Az ertebri SP-C szekvenciáját Johansson, J. és mtsai, [FESS lett, 232, 61-64. old. (1998)1 közleményéből, az SPCíLeu) szekvenciáját Nilsson, G. és mtsai. [Búr. J. Siocherr, 255, 116-124. old. (1938)] közleményéből vettük.

Az SP~C(LKS) az SP-C elsődleges szerkezetén alapul, de minden 16-28 közötti Val-oldalláncot a 17, kivételével Lenoldailánecal helyettesítettük, lys-oidaliáncokat építettünk be a 17., 22, és 27. helyen, és a paimifoilált Cys-eket az

5. és 6. helyen Ser helyettesíti.

A 2. ábrán a szintetikus felületaktív anyag-készítmények felszíni szétterjedését mutatjuk be.

wl-os S'P-C(LKS) {teli négyzetek, folyamatos vonallal jelölve) és 3 w%-os SE-C(LKS) 2 %?% SP-B hozzáadásával (üres háromszögek, szaggatott vonallal jelölve) széftérjedési kinetikáié. Minden késsítménvt 10 mg/ml koncentrációban vizs-

myefcet	mutatjuk be.
után -	koraszülött
; érfoga	thai és pozit
léleg	eztetett nyűi

gálfunk DPPC/PG 7:3 (ν/ν) elegy és 150 nan-ol/1 NaCl szuszpenziójában. A méréseket bilbelmy-féle mérleggel végeztük és minden pont három különböző mérés átlaga.

A 3. ábrán az in vivő eres Öt - 27 napos vemhessé·:

mi/kg-es standardizált légzési légzésvégi nyomás (PEEP) néli mellkasi teljesítménye, A teljesítmény szignifikánsan javult a kezeit állatokban. Fol.isB.lxin B (PxS) hozzáadása növelni látszik a mesterséges felületaktív anyag hatását, A fos'zfolipidek koncentrációja ugyanaz, minden felületaktív anyag-készit mé nyben, 40 mgZm1,

X « '* * 9 9 » * X X « * ♦ « κ » * * « χχ ♦ * * ♦ * ♦ ♦♦♦♦ Φ * »** ** ««*Χ XX χ »«

Szekvencia!ista

<210>	ί
<211>	35
<212>	BRT
<213>	Mesterséges sz	ekvencia

<22Ό>
<223>	M-s s t. e r s ég e s s z	ekvencía leírása:	gt gf j íg τ- pN'i n	kas
<400>	1
Phe Gly	lle Pro Ser Ser	Pro Val His let Lys 5	irg Leu Leu	lie
	₁₇	10		S

Lys Leu	Leu Leu Leu Lys	lle Lee Leu Lsu Lys L	.eu eiy A.Is	Leu
	20	25	30
Kát Gly	Leu

	2 S

<210>
<211 >
<212>	T>r*{ cp í. i
<213>	Mesterséges sz	•ekvencia
<220>
<223>	Mesterséges .sz	ekvencia leírása;	szinteti	kus
<400>	.'Λ

* ·*♦ *♦ ♦* κ « « * * * * » ί »ΐίφ Φ χ

99-κ ** «Φ«Φ Φφ 9 Φχ ««

Phe Gly Ile :ώ Ser Ser Pro Val His tea Lys

7->.r« me reu iíe ueu leu Leu tea tsu Ils Lvs tea

Ile tea Gly Ais Leu Leu

Met Glv tea <21 ö> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása: szintetikus peptidek <400> 3 the Gly lie Pro Ser Ser Pro Val His tea Lvs Ara tea Leu Iie tea

Leu Leu tea Leu tea lle tea Leu tea il ily Alá Lez tea

z.z>

Met Glv tér »* «>*« «fr χψ φ » * * * X * * * * * » ♦ * «*» * * * * · « ««»« * « ♦* ΧΚνΐ *χ φ Κ_# <211> 35 <212> P.RT <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírási <400> 4 ;íntetikus peptidek

Fhe Gly II Gpro Ser Ser Pro Val Alá Lee Lys Arg Lee Lou

5 10 .^eo ~»ys oou lio Lee. m Leu Xle Lan V±y Aló Leó iiÖU <210> 5 <211> 35 <212> 3RT <213> Mesterséges szekvencia <22:0>

<22.3> Mesterséges szekvencia leírása: szintetikus peptidei <40O> 5

Phe Giy Tie Pro Ser Ser t.ro Val Ris Leu Lys Arg Leu Lsu jSC '!

ÍQ * Φ » X * 9 999* 9 Φ *

Χ«φ Φ» «««κ χχ φ XX ΦΦ *φ .eu fen Leu Len Les Leu lle Lys Len Len lle Len Gly Alá Lee L

25 30 <21ö> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mesterséges szekvencia leírása <400> S szintetikus peptidek he Glv lle Pro Ser Ser Pro Val His Len Lvs Arc? Len Leu lle Leu

Phe Leu Len Les Leu Phe 11« Leu Leu fen Phe Leu Gly Aia ΙΞΟ 25 30

Meg Oly Leu megadott szerkezetű SP-ü-amúég, az egybetüs

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Az (Ϊ) általános képlettel anarnosavkod szerint:

F_sG_iiPZZPVHLK;R(X_sBXX_i>B)_S3(X_cB)_mX₄öÁi.LMGL álról:

X jelentése L L vagy Nle (norkucln) amínosavak bármelyike;

B jelentése K, W, Ρ, Y vagy Ornitin amínosavak bármelyike;
2 jelentése S, és opcionálisan 12-22 szénatomot tartalmazó acil-csoporttal lö kapcsolódhat észter- -kötésen keresztül;

a értéke egész szám 1 és 19 között;

b értéke egész szám I és 19 között;

c értéke egész szám 1 és 21 között;

d értéke egész szám 0 és 2ö között;

e értéke 0 vagy 1;;

f értéke 0 vagy 1;

n értéke ö vagy 1;

xn értéke d vagy 1;

az alábbi feltételekkel: 20 n + m>0;

mwtvhoaCXsBVQ maximum 22 aminosavból- állő szekvencia, előnyösen 10-22 aminosavból álló szekvencia.

2, Az L igénypont szerinti SP-C-anaiogok, amelyek az (is) általános képlettel adhatók

25 meg:

meg:

meg:

a) FGíFSSPVHLKRXíBXíBXíBXGáILMGL
3, Az L igénypont szerinti SP-C-anaiőgok, amelyek az (Ib) általános képlettel adhatók (Ib) FGIPSSPVHLKItX_sBX_sBX4GÁLLMGL
4, Az 1. igénypont szerinti SP-C-anatógok, amelyek az (le) általános képlettel adhatók (le) FG1FS SPVHLKRX4SX: 5 GALLMGt
5, Az 1. igénypont szerinti SF~C-analógok, amelyek az (Id) általános képlettel adhatók mez:

»32

1) FGíPSSPVHLKRX^BXtGALLMGL
6. Az 1. igénypont szerinti SP-€~analőgok_s amelyek az (le) általános képlettel a meg:

(le) FGíPSSPVKLKKXi _}BX₄GALLMGL

5
7. Az l-b. igénypontok bármelyike szerinti SP-C-analőgok, amelyekben a SeroldaHáneok aciláltafc, előnyösen palmitoil-csoportokkal.
8. Áz 1-7, igénypontok bármelyike szerinti SP-C-analógok, amelyekben B jelentése Iizin vagy fenilalanin és X jelentéseleucin, ízoleuem vagy norleucin.
9. A 8, igénypont szerinti SP~C~anaióg, amely az alábbiak;
10 [SP-C (LKS)] FÖIPSSPVHLKRLLíLKLLLLXÍLLLKLGAtLMÖL·

FGlPSSPVHLKMLILLKLLLLIKLLiLGALLMGIg FG1PSSPVHLKRLLILXI,1,LLLILLLILGALLMGI;

iSP-C (LKS)i

SP~C(LO}_? [SP-C(tKS)₃] [SP~C (LKS)₄] (SP-C(LFS)]

FGI?SSPVHLOIddLLLLLXLILLLlLGAI.,LMGL;

FGIPSSPVHLKKLLILUlXLLIKLIdLGALLMGt;

FGIPSSPVHLKPXLiLFLLLLFILLLFLGALLMGt bámtelyike.

10, Szintetikus felületaktív anyag, amely legalább egy, (1) általános képlettel megadott SF-C-anaiógot tartalmaz lipidekkel és feszío lipidekkel elegyítve.
11, A 10. igénypont szerinti szintetikus felületaktív anyag, amelyben a 20 lipidek/foszfolipidek elegye DPPC-t, PG-t vagy PA-t tartalmaz.
12. A 10 vagy 11. igénypontok szerinti szintetikus felületaktív anyag, amely SP-B-t vagy annak aktív származékát, vagy polimixint is tartalmaz.
13. A 10-12. Igénypontok bármelyike szerinti szintetikus felületaktív anyag, oldat, diszperzió, szuszpenzíó vagy por alakban.

25
14. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti SP-C-analog alkalmazása bármely pulrnonális felületaktív anyag-elégtelenség és azzal kapcsolatos rendellenesség esetén alkalmazható szintetikus felületaktív anyag előállítására,
15. Polinüxin, előnyösen polimixin B alkalmazása bármely putmonálís felületaktív anyag-elégtéleoség és azzal kapcsolatos rendellenesség kezelésére alkalmas 10-13.

30 igénypontok bármelyike szerinti mesterséges felületaktív anyag előállítására,
16. A H vagy 15, igénypontok szerinti alkalmazás, felületaktív anyagelégtelenségként respiratórikus dísztressz szindróma kezelésére alkalmas mesterséges felületaktív anyag előállítására.