CN1221570C - 具有表面活性的人造肽及其在制备人造表面活性物质中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有表面活性的SP-C类似物人造肽，及其用于制备人造表面活性物质的用途，该人造表面活性物质可用于治疗呼吸窘迫综合症(RDS)和与表面活性物质缺乏或功能异常有关的其它疾病。
Description
本发明提供了具有表面活性的新型人造肽。具体地说，本发明提供了SP-C类似物，它一旦与适宜脂质结合即可特别有效地降低气-液界面的表面张力。
因此，本发明的肽与脂质结合，并任选与SP-B或其活性类似物或SP-B的代用品结合时，可用于制备对治疗呼吸窘迫综合症(RDS)、其它表面活性物质缺陷或功能异常、相关的肺病如肺炎、支气管炎、哮喘、胎粪吸入综合症以及其它疾病如浆液中耳炎(胶耳)有用的人造表面活性物质。
发明背景
肺表面活性物质可降低肺泡内层中气-液界面的表面张力，防止肺在终末呼气时萎陷。表面活性物质缺乏为早产婴儿的常见病症，并引起呼吸窘迫综合症(RDS)，可以用从动物肺中提取的天然表面活性物质有效地治疗这种疾病(Fujiwara，T.和Robertson B.(1992)于：Robertson，B.，van Golde，L.M.G.和Batenburg，B.(编辑)《肺表面活性物质：从分子生物学到临床实践》Amsterdam，Elsevier，第561-592页)。这些表面活性物质制剂的主要组成成分是如1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、磷脂酰甘油(PG)和疏水表面活性蛋白B和C(SP-B和SP-C)的磷脂。为C-型(Ca2+-依赖性)胶原凝集素并认为主要在宿主防御系统中起作用的亲水表面活性蛋白SP-A和SP-D，由于使用有机溶剂提取步骤，因此在这些表面活性物质制剂中通常不含它们。
SP-B和SP-C仅占该表面活性物质重量的约1-2％，但是与纯脂质制剂相比，它们仍然能够显著地改善表面活性(Curstedt，T.等人(1987)《欧洲生物化学杂志》168，255-262；Takahashi，A.、Nemoto，T.和Fujiwara，T.(1994)Acta Paediatr.Jap.36，613-618)。已测定了在溶解状态中的SP-B和SP-C的一级和二级结构以及SP-C的三级结构(参见4)。SP-B由两个79个氨基酸的相同多肽链组成，它们与链间二硫桥相连(Curstedt，T.等人(1990)《美国国家科学院院报》87，2985-2989；Johansson，J.、Curstedt，T.和J_rnvall，H.(1991)《生物化学》30，6917-6921)。每个单体链有三个链内二硫桥和至少四个具有一个极性和一个非极性表面的两亲螺旋，通过这些表面SP-B可以与两个脂双分子层相互作用并使它们紧密靠近(Andersson，M.等人(1995)FEBS Lett.362，328-332)。SP-C为一在残基9-34之间有一α-螺旋结构域的35个氨基酸残基组成的脂蛋白(Johansson，J.等人(1994)《生物化学》33，6015-6023)。该螺旋主要是由缬氨酰残基组成并包埋在脂双分子层中，与脂质酰基链平行定向(Vandenbussche等人(1992)《欧洲生物化学杂志》203，201-209)。两个棕榈酰基在该肽的N-端部分的位置5和6与半胱氨酸残基共价相连(Curstedt，T.等人(1990)《美国国家科学院院报》87，2985-2989)。在位置11和12的两个保守的正电荷残基-精氨酸和赖氨酸可能与脂膜的负电荷头部基团相互作用，因此增加了其刚度。由于C-末端仅含有小的或疏水的残基，使得这部分潜在地在磷脂双分子层中更易变，因此脂质-肽相互作用的刚度可能朝C-末端减少。SP-C被认为经过极稳定的多缬氨酰螺旋影响周围脂质的厚度和流动性(Johansson，J.和Curstedt，T.(1997)《欧洲生物化学杂志》244，675-693)。
技术现状
由于由动物组织获得的表面活性物质制剂存在一些缺陷，例如它们有限量的可利用性和它们可能含有感染性试剂并且可能诱导免疫反应，因此一直尝试制备人造表面活性物质(Johansson，J.和Curstedt，T.(1997)《欧洲生物化学杂志》244，675-693；Johansson，J.等人(1996)ActaPaediatr.85，642-646)，通常由合成脂质和疏水蛋白质制备。
以前的工作已证实，合成SP-C不可能象天然肽那样折叠成一最佳表面活性所必需的α-螺旋构象(Johansson，J.等人(1995)《生物化学杂志》307，535-541)，因此不能适当地与表面活性物质脂质相互作用。
因此，合成SP-C类似物不象天然肽那样折叠，并且不能适当地与表面活性物质脂质相互作用。为了绕过该问题，已有几种修饰该序列的方案，例如通过用Leu替换天然SP-C中的所有螺旋Val残基，这样强烈地支持α-螺旋构象。相应的跨膜类似物，SP-C(Leu)当与DPPC∶PG∶PA(68∶22∶9)(w/w/w)组合时在气-液界面显示出良好的扩展性。然而，在圆纹曲面压缩期间的最大表面张力值(γmax)明显高于天然表面活性物质的γmax。而且不可能制备浓度高于约20mg/ml的脂质-肽混合物，这可能是由于形成了肽低聚体(Nilsson，G.等人(1998)《欧洲生物化学杂志》255，116-124)。另外已合成了不同长度的生物活性多亮氨酸SP-C类似物(Takei，T.等人(1996)《生物药物公报》19，1550-1555)。在后来的研究中，既没有报道自寡聚化作用，也没有报道在生产高脂质浓度样品中的问题。
不同出版物处理了提供天然表面活性物质肽的肽类似物的问题，并提供了许多不同的解决方案。在这些出版物中，以Tokyo Tanabe名义的WO9321225、EP733645、WO9617872公开了天然SP-C的肽类似物，就N-端部分的序列而言它们通常与天然肽不同。
Scripps研究所的专利申请WO8906657和WO9222315公开了具有交替疏水和亲水氨基酸残基的SP-B类似物。尤其要求保护具有交替亮氨酸和赖氨酸残基的肽(KL4)。
Clercx A.等人《欧洲生物化学杂志》229，465-72，1995公开了相应于猪SP-C的N-端的不同长度的肽以及由猪SP-C和细菌视紫红质获得的杂交肽。
Johansson J.等人《生物化学杂志》307，535：41，1995公开了因一些氨基酸的取代而与天然猪SP-C不同的合成肽。
以California Biotechnology-Byk Gulden名义的WO89/04326和以California Biotechnology-Scios Nova名义的WO91/18015公开了含有初始N-端序列的SP-C类似物，其中天然SP-C的两个Cys被两个Ser替换。
发明描述
现已发现，兼有以下特征的SP-C类似物肽：i)Val残基用其它中性且疏水的残基取代、ii)Cys残基用Ser残基取代、iii)一些中性氨基酸残基用庞大或极性残基替换，显示出用于降低表面张力的特别有用的性质。具体地说，已发现，由于极性残基赋予的正电荷或者庞大取代基赋予的位阻，后一特征使得避免了自寡聚化作用。
如下，按照第一个方面，本发明提供了具有下面使用一字母氨基酸代码的通式(I)的SP-C类似物：
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLMGL (I)
其中：
X为选自以下的一种氨基酸：V、I、L、Nle(正亮氨酸)；
B为选自以下的一种氨基酸：鸟氨酸、K、I、W、F、Y、Q、N；
Z为选自以下的一种氨基酸：S、C、F，其中Ser或Cys残基任选通过酯键或硫酯键与含有12-22个碳原子的酰基相连；
a为1-19的整数
b为1-19的整数
c为1-21的整数
d为0-20的整数
e为0或1
f为0或1
n为0或1
m为0或1
条件是：
n+m＞0，
f≥e；
(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd为最多具有22个氨基酸，优选10-22的序列。
式(I)的优选肽具有以下序列：
(Ia)FGIPSSPVHLKRX4BX4BX4BXGALLMGL
(Ib)FGIPSSPVHLKRX5BX5BX4GALLMGL
(Ic)FGIPSSPVHLKRX4BX11GALLMGL
(Id)FGIPSSPVHLKRX8BX7GALLMGL
(Ie)FGIPSSPVHLKRX11BX4GALLMGL
在序列(Ia)-(Ic)中，优选B＝Lys或Phe且X＝Leu、Ile或Nle的那些。
按照优选实施方案，式(Ia)-(If)的肽分别具有以下序列：
FGIPSSPVHLKRLLIL
KLLLLKILLLKLGALLMGL[SP-C(LKS)]
FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL[SP-C(LKS)1]
FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL[SP-C(LKS)2]
FGIPSSPVHLKRLLILLLLLKLILLLILGALLMGL[SP-C(LKS)3]
FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL[SP-C(LKS)4]
FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL[SP-C(LFS)]
在本发明一更优选的实施方案中，Ser残基与含有12-22个碳原子的酰基共价连接。
式(I)的肽可以通过合成法或重组技术制备。
常规合成法例如描述在：Schroeder等人的《肽》第1卷，学术出版社，1965；Bodanszky等人的《肽合成》，Interscience Publisher，1996；Baramy和Merrifield的《肽：分析、合成、生物学》第2卷第1章，学术出版社，1980。所述技术包括在固相、在溶解状态中的肽合成、有机化学合成法、或其任意组合。
S-或O-酰化肽优选使用酰基氯在纯三氟醋酸中处理非酰化肽合成的，如Yousefi-Salakdeh等人的《生物化学杂志》1999，343，557-562中所述。合成和纯化之后，合成肽如下面“实施例”部分中所报道的经生物化学和生物物理方法表征。
与脂质和磷脂、SP-B、SP-B类似物或SP-B代用品组合，评价了本发明的肽在降低表面张力方面的活性。具体地说，在有或没有SP-B、其活性类似物和多粘菌素的情况下这些肽已与DPPC(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)/PG(磷脂酰甘油)/PA(棕榈酸)组合。
脉动-气泡表面活性试验的结果清楚地显示出，本发明的合成肽强有力地将圆纹曲面压缩期间的最小和最大表面张力(γmin和γmax)降低至可与使用天然来源的表面活性物质获得的值比较的值。
将SP-B或其活性类似物加入该混合肽/脂质-磷脂中获得了特别有用的结果。而且，出人意料地发现，多粘菌素，特别是多粘菌素B，起SP-B代用品的作用，并且其加入获得的结果比得上用SP-B获得的结果。
按照第二个方面，本发明提供了一种合成表面活性物质，它含有一种或多种式(I)的肽，并混合有脂质和/或磷脂以及任选地SP-B、其活性衍生物或多粘菌素。适宜的脂质/磷脂可以选自磷脂酰胆碱(优选DPPC)、PG、PA、三酰基甘油、鞘磷脂。
在本发明的更优选的实施方案中，应使用含有其中棕榈酰基链与Ser残基经O-共价地相连的肽的表面活性物质混合物。已发现，与含有相应非棕榈酰化肽的混合物相比，通过被捕获的气泡体系测得，参照肽(SP-C(Leu))的含有二棕榈酰化形式的表面活性物质混合物呈现出较高的表面膜稳定性，并且与表面相关的脂质贮器的尺寸增加。在含有5％二棕榈酰化肽的样品中，γmin低于1.5mN/m，并且这些膜非常稳定，因为在10分钟内在恒定的气泡体积下表面张力增加不到0.5mN/m。相反，非棕榈酰化肽的γmin约为5mN/m，在低表面张力下通过频繁的气泡发出咔哒声观察到膜不太稳定。而且，在含有非棕榈酰化肽的样品的面下相衰竭之后，在几个吸附步骤之后，其达到接近零稳定表面张力的能力丧失，而使用二棕榈酰化肽，甚至在10多个膨胀步骤且掺入与两个以上单层等价的贮器材料之后，膜质量也没有变坏。二棕榈酰化肽的提高的表面活性通过脉动气泡表面活性计也得到了证实。此外，发现酰基的存在还降低形成低聚体的趋势。该发现非常重要，这是因为在制备人造表面活性物质的过程中，已发现肽寡聚化作用阻碍浓度高于20mg/ml的混合物的制备(Nilsson等人《欧洲生物化学杂志》1998，255，116-124)。
可以通过将肽和脂质的溶液或悬浮液混合，然后将该混合物干燥来制备该合成表面活性物质。
在这种情况下，可以将该干燥混合物悬浮、分散或照此施用于需要治疗表面活性物质缺乏的患者中。
该合成表面活性物质优选经气管内或通过气雾剂施用。后一种给药形式需要将小粒表面活性物质与适宜的惰性推进剂混合。其它的给药形式，如雾化或喷雾表面活性物质的稳定溶液/悬浮液也包括在本发明的范围内。
按照另一方面，本发明提供了所述肽用于制备表面活性物质的用途，该表面活性物质可用于成人或新生儿表面活性物质缺乏或功能异常、相关肺病如肺炎、支气管炎、哮喘、胎粪吸入综合症以及其它疾病如浆液中耳炎(胶耳)的所有病症。
典型地，在治疗经常侵袭早产婴儿的呼吸窘迫综合症时，优选通过气管内给药使用该表面活性物质。
以下实施例更详细地描述了本发明。
实施例1
肽合成和纯化
使用逐步固相技术和叔丁氧基羰基化学(Kent，S.B.H.(1988)《生物化学年鉴》57，957-989)在一应用生物系统430A仪器中合成SP-C类似物，SP-C(LKS)(图1)。在无水氟化氢/甲氧基苯/二甲硫醚10∶1∶1(v/v/v)中在0℃下进行1.5小时的树脂-肽键切割和侧链的去保护。通过用二乙醚反复提取除去保护基和清除剂，接着通过二氯甲烷/三氟醋酸(TFA)3∶1(v/v)从树脂中提取出肽，然后旋转蒸发。将粗制肽提取物以浓度100mg/ml再溶于含5％水的氯仿/甲醇1∶1(v/v)中。在相同溶剂中将10mg的等分试样涂布到一Sephadex LH-60柱(40×1cm)上(Curstedt，T.等人(1987)《欧洲生物化学杂志》168，255-262)。收集2.5ml级分，测定214和280nm下的吸光度。通过氨基酸分析进行鉴定和定量。
为了酰基化，将纯化的肽(典型地约5mg)干燥，溶于蒸馏TFA(100μl)并加入酰基氯(与肽相比10-20当量)。10分钟之后用80％含水乙醇(1.9ml)将反应骤冷。酰基肽的纯化是：首先使用层析法在二氯化乙烯/甲醇1∶4(v/v)中经过Lipidex 5000，然后使用达到60％(含水)甲醇/0.1％TFA或75％(含水)乙醇/0.1％TFA的2-丙醇/0.1％TFA的线性梯度通过反相HPLC经过C18柱。
实施例2
生物化学表征
通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(Phast-system，Pharmacia，Sweden)并使用C18柱和60％含水甲醇/0.1％TFA和异丙醇/0.1％TFA的线性梯度通过反相高效液相色谱(HPLC)(Gustafsson，M.等人(1997)《生物化学杂志》326，799-806)检查肽的纯度。
通过用血管紧张肽(Mr 3326.8)校准的基质辅助的激光解吸离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱测定法(Lasermat 2000，Finnigan MAT)测定分子量。
使用圆二色性(CD)光谱学(Jasco-720 Jasco，日本)研究肽的二级结构。用三氟乙醇(TFE)溶解之后，以20nm/min的扫描速度和2个数据点/nm的分辨率记录260-184nm的光谱。计算剩余摩尔椭圆率并以kdeg xcm2/dmol表示。利用208和222nm下的摩尔椭圆率估计螺旋结构的含量(Barrow，C.J.等人(1992)《分子生物学杂志》225，1075-1093)。
使用CD光谱学的SP-C(LKS)的二级结构的研究显示了α-螺旋肽典型的光谱，并由208nm和222nm最小值估计约75％的α螺旋含量。用水逐步稀释直到12％TFE，其二级结构仍然保持稳定，条件是该肽溶于纯TFE。
SP-C(LKS)的SDS-PAGE显示了一与天然SP-C相似的单条带，尽管在其螺旋部分中缺少Lys的SP-C(Leu)形成低聚体。与我们对SP-C(Leu)/脂质混合物的体会相反，该混合物难以高于20mg/ml的浓度溶解(Nilsson，G.等人(1998)《欧洲生物化学杂志》255，116-124.)，可以制成脂质浓度为80mg/ml并且多肽/脂质比为0.03的SP-C(LKS)/脂质混合物。
实施例3
肽/脂质混合物的制备
DPPC、PG和PA都购自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)。将溶于氯仿/甲醇98∶2(v/v)的这些脂质以比例DPPC∶PG∶PA 68∶22∶9(w/w/w)或DPPC/PG 7∶3(w/w)混合。通过将SP-C(LKS)单独或SP-C(LKS)和SP-B以总的多肽/脂质重量比为0-0.05加入到每个脂质混合物中制备表面活性物质制剂。将这些混合物在氮气下蒸发，并以脂质浓度为10-80mg/ml将其再悬浮于150mmol/l NaCl或10mmol/l含有140mmol/l NaCl和2.0mmol/l CaCl2的10mmol/l Hepes缓冲液(pH6.9)中。反复冷冻和声处理(50W，48kHz)，直到获得均匀悬浮液。有时候，将这些最终悬浮液在45℃下培养1小时。
悬浮于150mmol/l NaCl的表面活性物质制剂的pH为3.5-5.5。在含有SP-B的制剂中观察到该较低的pH-值3.5-4.5。由于天然SP-B使用酸化有机溶剂提纯(Curstedt，T.等人(1987)《欧洲生物化学杂志》168，255-262)，因此在制剂中可能留有少量酸。通过将该表面活性物质制剂悬浮于含有140mmol/l NaCl和2mmol/l CaCl2的Hepes缓冲液(pH6.9)中，获得接近生理的pH(表1)。与在非缓冲盐水中的相应制剂相比，当使用DPPC/PG 7∶3(w/w)作为脂质混合物时γmax或γmin没有变化。然而当PA包含在该脂质混合物中时，在较高pH下γmax和γmin都增加(表1和2)。
表1：人造表面活性物质制剂在生理盐水溶液中的表面性质
在样品制备之后或在45℃下培养1小时之后直接进行测定。在NaCl150mmol/l中的磷脂浓度为10mg/ml。在37℃、50％表面压缩和40周/分钟的速率下用脉动气泡表面活性计获得了不同时期的记录。这些值为3-5次测定的平均值(标准偏差)。在本文中定义了缩写。
| 表面活性物质制剂 | 表面张力(mN/m) | ||||||||
| SP-C(LKS)(％w/w) | SP-B(％w/w) | 磷脂 | 培养温度 | 7.5秒 | 1分钟 | 5分钟 | |||
| γmin | γmax | γmin | γmax | γmin | γmax | ||||
| 3333333333 | --22--2210.5 | DPPC/PG/PADPPC/PG/PADPPC/PG/PADPPC/PG/PADPPC/PGDPPC/PGDPPC/PGDPPC/PGDPPC/PGDPPC/PG | -45℃-45℃-45℃-45℃-45℃ | ＜1＜1＜1＜1128(3)2(1)3(3)＜14(2) | 41(1)41(1)33(2)34(1)39(5)35(5)31(1)29(3)24(4)29(1) | ＜1＜1＜1＜114(4)9(3)2(1)1(1)1(2)4(3) | 41(1)41(1)33(2)34(2)42(4)39(5)31(3)33(2)26(4)29(2) | ＜1＜1＜1＜19(5)6(4)2(1)1(0)＜13(1) | 41(0)41(1)33(2)25(2)42(2)42(3)33(1)36(1)31(1)34(2) |
表2：人造表面活性物质制剂在缓冲盐溶液中的表面性质
对依次含有NaCl 140mmol/l和CaCl2 2.0mmol/l的Hepes缓冲液(pH6.9)中含有浓度为10mg/ml的磷脂的样品进行测定。在37℃、50％表面压缩和40周/分钟的速率下用脉动气泡表面活性计获得了不同时期的记录。这些值为3-5次测定的平均值(标准偏差)。在本文中定义了缩写。
| 表面活性物质制剂 | 表面张力(mN/m) | ||||
| SP-C(LKS)(％w/w) | SP-B(％w/w) | 磷脂 | 7.5秒 | 1分钟 | 5分钟 |
| γmin γmax | γmin γmax | γmin γmax | |||
| 3333 | -2-2 | DPPC/PG/PADPPC/PG/PADPPC/PGDPPC/PG | 4(1) 44(2)3(3) 38(3)15(3) 39(4)2(2) 26(3) | 5(2) 47(2)4(4) 40(2)16(2) 42(3)1(1) 29(3) | 7(2) 50(1)3(3) 44(2)13(3) 44(3)＜1 35(1) |
实施例4
SP-C(LKS)和多粘菌素B的磷脂混合物的制备
DPPC和PG购自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)。将溶于氯仿/甲醇98∶2(v/v)的这些磷脂以比例DPPC/PG 7∶3(w/w)混合。通过将SP-C(LKS)以总的多肽/磷脂重量比为0.03加入到该磷脂混合物中。将这些混合物在氮气下蒸发，并在室温下再悬浮于含有140mmol/l NaCl和2.0mmol/l CaCl2的10mmol/l Hepes缓冲液(pH6.9)或者含有0.01％多粘菌素B(PxB)(Sigma Chemical Co，St Louis，MO)的相同缓冲液中。反复冷冻和声处理(50W，48kHz)，直到获得均匀悬浮液。两种制剂的最终磷脂浓度都为10mg/ml。PxB的加入使γmax和γmin都降低，并获得最佳表面活性(表3)。
表3：有或没有多粘菌素B时人造表面活性物质的表面性质
在37℃、50％表面压缩和40周/分钟的速率下用脉动气泡表面活性计获得不同时期的记录。这些值为5-11次测定的平均值(SD)。在本文中定义了缩写。
| 表面活性物质制剂 | 表面张力(mN/m) | ||||
| SP-C(LKS)(％w/w) | PxB(％w/w) | 磷脂 | 7.5秒 | 1分钟 | 5分钟 |
| γmin γmax | γmin γmax | γmin γmax | |||
| 33 | -l | DPPC/PGDPPC/PG | 15(3) 39(4)3(2) 29(3) | 16(2) 42(3)2(2) 31(4) | 13(3) 44(3)1(1) 34(2) |
实施例5
生物物理表征
在约34-37℃下用威廉米表面天平(Biegler，Vienna，Austria)测定表面扩展动力学。使用一与应力计相连并插入到在塔夫纶槽中的20ml150mmol/1 Nacl的低相1mm深的铂板监测表面张力10分钟。在距离铂板4cm处将总共1mg脂质的悬浮液以小滴添加到低相上。
使用威廉米天平对3wt％于DPPC/PG，7∶3(w/w)中的SP-C(LKS)的动力学测定显示，3秒钟之后以28mN/m的表面张力快速扩展(图2)。使用相同脂质混合物中的1wt％SP-C(LKS)其扩展稍微慢一点。加入2wt％SP-B之后扩展速度或平衡表面张力没有明显的改变(图2)。该混合物在45℃下培养1个小时之后观察不到提高(数据未显示)。使用DPPC∶PG∶PA，68∶22∶9(w/w/w)作为脂质混合物获得了相似结果(数据未显示)。
在37℃下在气泡表面50％反复压缩期间和以40周/分钟的频率使用脉动气泡表面活性计(surfactometer International，Toronto，canada)记录动力学表面张力。在10mg/ml的脂质浓度下将所有测定持续5分钟。以特定时间间隔测定穿过气泡壁的压力梯度并将其用于计算最小(γmin)和最大(γmax)气泡尺寸下的表面张力。
在脉动气泡表面活性计中，3wt％于DPPC∶PG∶PA，68∶22∶9(w/w/w)中的SP-C(LKS)在最小气泡半径(γmin)时产生低于1mN/m的表面张力，而使用3wt％于DPPC∶PG，7∶3(w/w)中的SP-C(LKS)观察到γmin为9-14mN/m(表1)。在两种情况下在最大气泡半径(γmax)时的表面张力为约40mN/m。加入2wt％SP-B赋予两种脂质制剂的γmax-值为31-33mN/m且γmin为0-2mN/m。这些值与从天然源分离的表面活性物质制剂获得的那些值非常相似(Robertson，B.等人(1990)Prog.Respir，Res.25，237-246)。这些制剂在45℃下培养1小时对表面活性没有显著影响(表1)。在3wt％于DPPC∶PG 7∶3(w/w)中的SP-C(LKS)中将SP-B的量减少到0.5wt％趋于增加γmin，尽管结果没有达到统计学上的显著性(表1)。与SP-B相反，将2wt％KL4(Cochrane，C.G.和Revak，S.D.(1991)Science 254，566-568)加入到3wt％于DPPC∶PG∶PA 68∶22∶9(w/w)的SP-C(LKS)中不降低γmax，它仍保持相对较高，为41-42mN/m。
实施例6
含二棕榈酰化和非棕榈酰化参照肽的混合物之间的比较
向由DPPC/PG/PA 68∶22∶9 w/w/w制备的每个脂质混合物中加入3％w/wSP-C(Leu)或二棕榈酰化SP-C(Leu)制备表面活性物质制剂。将这些混合物在氮气下蒸发并以10mg/ml的脂质浓度再悬浮于150mmol/l NaCl中。在也使用SP-B代用品的样品中，加入1％w/w的多粘菌素B。
含有二棕榈酰化SP-C(Leu)的混合物，无论是否有多粘菌素B，都呈现出显著的提高，特别是在降低5分钟时的γmax和早期时间间隔的γmin方面。
表4：表面性质
使用脉动气泡表面活性计获得了混合物的表面张力。平衡2分钟之后，在37℃、50％表面压缩和40周/分钟的速率下获得了不同时期的记录。
| 表面活性物质制剂 | 表面张力(mN/m) | ||||
| SP-C(Leu)(wt％) | 二棕榈酰化SP-C(Leu)(wt％) | PxB(wt％) | 7.5秒 | 1分钟 | 5分钟 |
| γmin γmax | γmin γmax | γmin γmax | |||
| 11 | 11 | 1-1 | 11 393 371 340 29 | 6.2 393 381 350 34 | 2 420 401 360 35 |
实施例7
体内测定
在9个27天孕龄的早产新生兔中评价了表面活性物质对发育不全肺的机械性能的治疗效果。出生时将这些动物的气管切开，其中5个经气管套管接受2次2.5ml/kg含DPPC、PG和SP-C(LKS)，且有或没有多粘菌素B的人造表面活性物质(比例如上)。外源表面活性物质的总磷脂浓度为40mg/ml。用作阴性对照的2只动物未经气管接受物质，用作阳性对照的另外2只动物用稀释到40mg/ml的相同剂量的改性天然表面活性物质(Curosurf，Chiesi Farmaceutici Spa，Parma，Italy)治疗。1只动物用盐水中的DPPC和PG(浓度与上面的相同)的混合物以剂量2.5ml/kg治疗。将所有动物保持在温度为37℃的身体体积描记器盒中，并用频率设定为40分钟且50％吸气时间的Servo Ventilator 900B(Siemens-Elema，Solna，Sweden)平行通入100％氧气持续60分钟。使用与每个体积描记器盒相连的呼吸速率计测定潮气量。这些动物用8-10ml/kg标准化潮气量且没有终末呼气正压(PEEP)下通气。肺-胸顺应性定义为潮气量与吸气峰压之比，以ml/cm水kg表示。
与未经治疗的对照动物相比，用人造表面活性物质治疗的动物，特别是接受含多粘菌素B的表面活性物质的动物中的顺应性明显提高。显然，这种提高看来优于用相似剂量的改性天然表面活性物质治疗之后所看到的(图3)。
附图简述
图1、SP-C及其类似物的氨基酸序列和螺旋轮形展示
人SP-C的序列取自Johansson，J.等人(1988)FEBS Lett.232，61-64并且SP-C(Leu)的序列取自Nilsson，G.等人(1998)Eur.J.Biochem.255，116-124)。SP-C(LKS)以SP-C的一级结构为基础，但是除位置17之外的位置16-28上的所有Val残基都用Leu残基替换，Lys残基已被引入位置17、22和27，并且位置5和6上的棕榈酰化Cys用Ser替换。
图2、合成表面活性物质制剂的表面扩展
3wt％SP-C(LKS)(充满的正方形，实线)和3wt％SP-C(LKS)+2wt％SP-B(开放的三角形，虚线)的扩展动力学。所有制剂均以10mg/ml于150mmol/l NaCl中的DPPC/PG，7∶3(w/w)的浓度测定。记录是用威廉米天平获得的，每个数据点为3个不同记录的平均值。
图3体内结果
5个早产新生兔(孕龄为27天)在8-10ml/kg标准化潮气量且没有终末呼气正压(PEEP)下通气的肺-胸顺应性。在治疗的动物中顺应性明显提高。看来加入多粘菌素B(PxB)增加人造表面活性物质的效果。在所有表面活性物质制剂中的磷脂浓度都相同，即为40mg/ml。
序列表
<110>Chiesi Farmaceutici spa
<120>具有表面活性的人造肽及其在制备人造表面活性物质中的用途
<130>chiesi
<140>
<141>
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<151>1999-02-12
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成肽
<400>1
Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Lys Leu Leu Leu Leu Lys Ile Leu Leu Leu Lys Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
<210>2
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成肽
<400>2
Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Leu Lys Leu Leu Leu Leu Ile Lys Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
<210>3
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成肽
<400>3
Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Lys Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
<210>4
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成肽
<400>4
Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Lys Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
<210>5
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：合成肽
<400>5
Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Lys Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
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<212>PRT
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<223>人工序列的说明：合成肽
<400>6
Phe Gly Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Leu
20 25 30
Met Gly Leu
35
Claims (18)
1.按照一字母氨基酸代码的通式(I)的SP-C类似物：
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLMGL (I)
其中：
X为选自以下的一种氨基酸：I、L、正亮氨酸；
B为选自以下的一种氨基酸：K、W、F、Y；
Z为S并且任选地通过酯键与含有12-22个碳原子的酰基相连；
a为1-19的整数
b为1-19的整数
c为1-21的整数
d为0-20的整数
e为0或1
f为0或1
n为0或1
m为0或1
条件是：
-n+m＞0；
-f≥e；
-(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd为最多具有22个氨基酸的序列。
2.根据权利要求1的SP-C类似物，其中(XaB)n(XbB)n(XcB)mXd为10-22个氨基酸的序列。
3.根据权利要求1的SP-C类似物，具有式(Ia)：
(Ia)FGIPSSPVHLKRX4BX4BX4BXGALLMGL。
4.根据权利要求1的SP-C类似物，具有式(Ib)：
(Ib)FGIPSSPVHLKRX5BX5BX4GALLMGL。
5.根据权利要求1的SP-C类似物，具有式(Ic)：
(Ic)FGIPSSPVHLKRX4BX11GALLMGL。
6.根据权利要求1的SP-C类似物，具有式(Id)：
(Id)FGIPSSPVHLKRX8BX7GALLMGL。
7.根据权利要求1的SP-C类似物，具有式(Ie)：
(Ie)FGIPSSPVHLKRX11BX4GALLMGL。
8.根据权利要求1-7任一项的SP-C类似物，其中Ser残基用棕榈酰基酰化。
9.根据权利要求1-7任一项的SP-C类似物，其中B为Lys或Phe且X为Leu、Ile或Nle。
10.根据权利要求9的SP-C类似物，选自：
SP-C(LKS)FGIPSSPVHLKRLLIL
KLLLLKILLLKLGALLMGL
SP-C(LKS)1FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL
SP-C(LKS)2FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL
SP-C(LKS)3FGIPSSPVHLKRLLILLLLLKLILLLILGALLMGL
SP-C(LKS)4FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL
SP-C(LFS)FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL。
11.一种合成表面活性物质，含有至少一种式(I)的SP-C类似物，并混合有脂质和磷脂。
12.根据权利要求11的合成表面活性物质，其中混合物脂质/磷脂包括DPPC、PG、PA。
13.根据权利要求11-12任一项的合成表面活性物质，还含有SP-B或其类似物或多粘菌素。
14.根据权利要求11-12任一项的合成表面活性物质，为溶液、分散液、悬浮液、干粉形式。
15.权利要求11-12任一项的合成表面活性物质，进一步含有多粘菌素。
16.权利要求15的合成表面活性物质，其中所述多粘菌素为多粘菌素B。
17.权利要求1-8中任一项的SP-C类似物用于制备合成表面活性物质的用途，其中所述合成表面活性物质用于治疗肺表面活性物质缺乏或功能异常的所有病症或浆液性中耳炎。
18.根据权利要求17的用途，其中肺表面活性物质缺乏为呼吸窘迫综合征。
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