UA72751C2 - Surfactants peptides sp-c analogues and use thereof in the production of synthetic surfactants - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується нових штучних поверхнево-активних пептидів. Зокрема, винахід стосується 2 аналогів 5Р-С які у комбінації з відповідними ліпідами є надзвичайно ефективними у зменшені поверхневого натягу на межі розподілу повітря-рідина.

Таким чином, пептиди згідно з винаходом можна використовувати у комбінації з ліпідами, і як варіант, у комбінації з 5Р-В або його активним аналогом чи замінником 5ЗР-В, для виробництва штучних поверхнево-активних речовин (в подальшому ПАР), корисних у лікуванні респіраторного дистрес-синдрому 70 (РДС), інших нестач або дисфункцій ПАР, пов'язаних з ними легеневих хвороб, наприклад, пневмонії, бронхіту, астми, синдрому аспірації меконію, а також інших хвороб, наприклад, серозних виділень при отиті (липке вухо).

Легеневі ПАР зменшують поверхневий натяг на межі розподілу повітря-рідина альвеолярної вистілки, перешкоджаючи спаданню легенів на кінцевій експірації. Нестача ПАР є загальним розладом у недоношених дітей і викликає респіраторний дистрес-синдром (РДС), якій можна ефективно лікувати натуральними ПАР, 12 вилученими з легенів тварин (Рцімага, Т. апа Кобрегізоп В. (1992) Іп: Корегізоп, В., мап Соїде, І.М... та

Ваїеприго, В. (ед5) Ритопагу Зипасіапі Егот Моїесшаг Віоіоду юю Сіїпіса! Ргасіїсе Атвіегдат, Еівеміег, р.р. 561-592). Основними складовими цих поверхнево-активних препаратів є фосфоліпіди, наприклад, 1,2-дипальмітоїл-5Л-гліцеро-3-фосфохолін (ОРРС), фосфатидилгліцерин (РО) та гідрофобні поверхнево-активні білки В та С (5Р-В та ЗР-С). Гідрофільні поверхнево-активні білки ЗР-А та 5Р-О, які належать до С-типу (Са?"-залежні) коллагенових лектинів і, які вважають первинно діючими у системі захисту хазяїна, звичайно не включені до поверхнево-активних препаратів, що обумовлено застосуванням способів з використанням екстракції органічними розчинниками.

ЗР-В та БР-С складають лише 1-295 від маси ПАР, але все ж таки здатні ефективно покращувати поверхневу активність, у порівнянні з чистими ліпідними препаратами (Сигвівейі, Т. е( а! (1987) Еиг. 9. Віоспет. 168, с 29 255-262; Такапавзпі, А., Метою, Т. апа Еціймага, Т. (1994) Асіа Раедіайї. дар. 36, 613-618). Первинна і (9 вторинна структури ЗР-В та 5Р-С і третинна структура 5Р-С визначені у розчинах (див.4). БР-В складається з двох однакових поліпептидних ланцюгів 79 амінокислот, з'єднаних міжланцюговим дисульфатним містком (Сигеіеді, Т. ей а). (1990) Ргос. Май. Асай. Зсі. ИО.5.А. 87, 2985-2989; Оопапвевоп, .., Сигеіеді, Т. та щдогмаїї, Н. (1991) Віоспетівігу 30, 6917-6921). Кожний мономерний ланцюг має три внутрішньоланцюгові - дисульфідні містки і щонайменше чотири амфіпатичні спіралі, які виявляють одну полярну та одну неполярну юю поверхні, на яких 5Р-В може взаємодіяти з двома ліпідними бішарами та призводити до їх тісного зближення (Апдегезоп, М. еї а). (1995) РЕВБ5 Іей. 362, 328-332). 5Р-С - ліпопротеіїн, який складається з 35 - амінокислотних залишків з А-спіральним доменом між залишками 9-34 (допапззоп, -., еї аІ(1994) Віоспет. 33, см 6015-6023). Спіраль складається головним чином з валіл-залишків і вбудована у ліпідний бішар та орієнтована паралельно ліпідним ацильним ланцюгам (Мапдеприззспе, еї аіЇ. (1992) Еуг. У. Віоспет. 203, 201-209). Дві - пальмітоїльні групи ковалентно зв'язані з цистеїновими залишками у положеннях 5 та 6 на М-кінцевій частині пептиду (Сигвіейді, Т. еї а). (1990) Ргос. Май. Асай. сі. О.5.А. 87, 2985-2989). Два залишки, які зберегли позитивний заряд, аргінін та лізин, у положеннях 11 та 12, можливо взаємодіють з негативно зарядженими « дю групами лицевої сторони ліпідної мембрани, збільшуючи таким чином її ригідність. Ригідність ліпідо-пептидної -о взаємодії може бути зменшена по відношенню до С-кінцевої частини, оскільки вона містить лише маленькі або с гідрофобні залишки, що робить цю частину потенційно мобільнішою у фосфоліпідному бішарі. Вважають, що :з» ЗР-С впливає на товщину і текучість оточуючих ліпідів через надзвичайно стабільну полі-валільну спіраль (Чопапззоп, ). та Сигвіеді, Т. (1997) Еиг. У. Віоспет. 244, 675-693). Оскільки поверхнево-активні препарати, отримані з тканини тварин, мають деякі недоліки, наприклад, їх наявність в обмеженій кількості, можливості -1 395 містити інфекційні агенти та індукувати імунологічні реакції, спробували створити штучні ПАР (допапззоп, .. та Сигвівді Т. (1997) Еицг. 9. Віоспет 244, 675-693; Оопапевоп, .). еї. аїЇ. (1996) Асіа Раедіаїг. 85,

Іо) 675-646), звичайно з синтетичних ліпідів і гідрофобних білків.

Попередні роботи показали, що синтетичні 5Р-С не можуть укладатися, як природний пептид, у форму

А-спіралі, необхідної для оптимальної поверхневої активності (допапезоп, у). еїаІ(1995) Віоспет. .). 307, 1 50 535-541), і тому не взаємодіють належним чином з поверхнево-активними ліпідами. щ Таким чином, синтетичні аналоги 5Р-С не скручуються як природний пептид та не взаємодіють належним чином з поверхнево-активними ліпідами. Для позбавлення від цієї проблеми було зроблено декілька спроб модифікувати послідовність, наприклад заміною всіх спіральних залишків Маі у природному ЗР-С на Геи, що чітко відповідає формі а-спіралі. Відповідний трансмембранний аналог, ЗР-С(І ей) у комбінації з ОРРС:РО:РА 59 (68:22:9) (за масою) показав гарне розподілення на поверхні повітря-рідина. Однак, максимальне значення

ГФ) поверхневого натягу під час циклічного поверхневого стиснення (У тах) було значно вище ніж у природних ПАР. 7 Крім того, неможливо приготувати ліпідо-пептидні суміші з концентрацією вище приблизно 20 мг/мл, що можливо обумовлено утворенням пептидних олігомерів (Міїззоп, (3. еї аіЇ. (1998) Еиг. У. Віоспет. 255, 116-124). Інші синтезували біоактивні полілейцинові аналоги ЗР-С різної довжини (Такеї, Т. еї аїЇ. (1996) Віої. Рпагт. Виї. 60 19, 1550-1555). В останніх дослідженнях не описано ні самоолігомеризацію, ні проблеми, пов'язані з приготуванням зразків з високою концентрацією ліпідів.

У різноманітних публікаціях вирішувалася проблема забезпечення пептидних аналогів природних поверхнево-активних пептидів, пропонуючи різні вирішення. В таких публікаціях, як, наприклад, УУО 93 21225, ЕР 733 645, М/О96 17872, від імені ТокуоТапаре, описано пептидні аналоги природного 5Р-С, які загалом бо відрізняються від природного пептиду, відносно послідовності М-кінцевої частини.

Заявки на винахід МУО89 06657 та М/092 22315 Скрипського дослідницького інституту описують аналоги

ЗР-В, які мають змінені гідрофобні та гідрофільні амінокислотні залишки. Серед іншого заявлено змінені лейцинові та лізинові залишки (КІ у) пептиду.

Сіегсх А. Еї аїЇ., Еицг.9. Віоспет 229, 465-72, 1995 описали пептиди різної довжини, що відповідають

М-закінченню свинячого ЗР-С, та гібридні пептиди, вилучені з свинячого 5Р-С та бактеріородопсину.

У9опапвзвоп 3.еї аї., Віоспет.).307, 535:41, 1995 описали синтетичні пептиди, які відрізняються від природного свинячого 5Р-С заміщенням деяких амінокислот.

У М/О89/04326 від імені Саїйогпіа ВіоФесппоїоду - Вук Сцідеп та у УМУО91/18015 від імені Саїйогпіа 7/0 Віоїесппоїюду - Зсіов Мома описані аналоги ЗР-С, які містять початкову М-кінцеву послідовність, в якій два

Сув природного 5Р-С заміщені двома зЗег.

Зараз виявили, що пептиди аналогу 5Р-С, які сполучають наступні ознаки: і) заміну залишків МаІ іншими нейтральними та гідрофобними залишками; ії) заміну залишків Суз залишками зег; ії) заміну деяких нейтральних амінокислотних залишків великими або полярними залишками, виявляють особливо сприятливі властивості для /5 Зменшення поверхневого натягу. Зокрема стало відомо, що остання ознака, завдяки позитивним зарядам, наданим полярними залишками, або стеричній перешкоді, обумовленій великими замісниками, дозволяє уникнути самовільної олігомеризації.

Таким чином, згідно з першим аспектом, винахід стосується аналогів ЗР-С, які мають таку загальну формулу (І), використовуючи однолітерний амінокислотний код: 720 ГеспР77РУНІ КАХ аВ)п(ХвВ)п(ХоВ)тхасАц Мої. (1) в якій:

Х - амінокислота, вибрана з групи, яка складається з М, І, І, Міе (норлейцин);

В - амінокислота, вибрана з групи, яка складається з орнітину, К, І, МУ, Е, М, 0, М; с 29 7 - амінокислота, вибрана з групи, яка складається з 5, С, Е, де залишки Зег або Суз зв'язані, як Го) варіант, естерними або тіоестерними зв'язками з ацильними групами, які містять 12-22 атомів карбону. а - ціле число від 1 до 19

Ь - ціле число від 1 до 19 . . «- зо с - ціле число від 1 до 21 4 - ціле число від 0 до 20 ів) е-0 або 1

І- 0 або 1 ї- п - О або 1 с т - 0 або 1 35 за умови, що: ї- -Ні т», - їхе; - (ХАВ)А(ХЬВ І (ХоВ) п ха - послідовність, яка має максимум 22 амінокислоти, найкраще від 10 до 22. «

Найкраще, коли пептиди формули (І) мають такі послідовності: -о (іа) ЕСІРЗЗРУНІ КАХ.ВХ.ВХ.ВХОАГ І МОЇ. с (ІБ) ЕСІРЗЗРУНІ КАХ5ВХ5ВХ;ОАГІ МОЇ. :з» (Іс) ЕСІРЗЗРУНІ КАХАВХ11ОАГ І МОЇ. (Ід) ЕСІРЗЗРУНІ КАХЗ8ВХ,ОБАГ І МОЇ. (іє) ЕСІРЗЗРУНІ КАХ418Х:2ОБАГІ МОЇ. -1 Серед послідовностей (Іа) - (І) найкращими є ті, що мають В - І уз або Рпе, а Х - І еиц, Ме або Міеє.

Згідно з найкращими втіленнями, пептиди формули (Іа) -«(ІХ) мають наступні послідовності, відповідно: іме) ЕСІРЗЗРМНІКАКГ ПІ КС КІС КІОАС МОГ |5Р-С (І КБ) -1 ЕСІРЗЗБРМНІККТ ПС КСССЛІКС СП ЗАС МОГ. (5Р-С (ІК),

ЕСІРЗЗБРМНІККЦ ПІКС ССС ЗАССМОГ. (5Р-С (І КБ)2І 1 ЕСІРЗЗБРМНІКАКГ ОГС КОС С ЗАС МОГ |ЗР-С (І КБ)ЗІ ще ЕСІРЗБРМНІККТ ПС СССЛІКССП ЗАССМОГ. (5Р-С (І КБ)

ЕСІРЗЗ5РМНІККГ ПЕС СРС РІГ ЗАСМОГ. ІЗР-С (І Е5))

У найкращому втіленні винаходу, залишки Зег ковалентно пов'язані з адцильними групами, які містять 12-22 5 атомів карбону.

Пептиди формули (І) можна отримати синтетичними способами або за допомогою способів рекомбінації.

ГФ) Загальноприйняті синтетичні способи описано, наприклад, у ЗсПпгоедег еї аїЇ., "Те реріідев", мої. 1, г Асадетіс Ргевзв, 1965; Водапз2Ку еї аї., "Реріїде зупіпевзів", Іпіегесіепсе Рибіїзпег, 1996; Вагату 4 Мегтійеїа, "Тпе реріїдев; Апаїузіз, Зупіпезіз, Віоіоду", моіЇ. 2, спаріег 1, Асадетіс Ргезз, 1980. Вищезазначені способи бр Вулючають синтез пептидів у твердій фазі, у розчинах, способи органічного хімічного синтезу, або будь-які їх комбінації. 5- або О- ациловані пептиди найкраще синтезувати обробкою неацилованих пептидів ацилхлоридом у чистій трифлуороцтовій кислоті, як описано Уоизеїі-Заїакдей еї аІ. Віоспйет У 1999, 343, 557-562. Після синтезу та очищення, синтетичні пептиди охарактеризували біохімічно та біофізично, як описано у наступному розділі ве "Приклади".

Активність пептидів згідно з винаходом стосовно зниження поверхневого натягу оцінювали у комбінації з ліпідами та фосфоліпідами, 5Р-В, аналогами 5Р-В або замінниками ЗР-В. Зокрема, пептиди поєднали з ОРРС (1,2-дипальмітоїл-5П-гліцеро-3-фосфохолінуРЄ (фосфатидилгліцерин)у/РА (пальмітинова кислота) з ЗР-В або без нього, з його активним аналогом та поліміксинами.

Результати досліджень поверхневої активності з пульсуючою бульбашкою, чітко показують, що синтетичні пептиди згідно з даним винаходом значно зменшують мінімальний і максимальний поверхневий натяг під час циклічного поверхневого стискання (уггі і Улах) ДО значень, порівнюваних з тими, що отримали, використовуючи

ПАР з натуральних джерел.

Додавання 5Р-В або його активного аналогу до суміші пептид/ліпіди-фосфоліпіди дає досить сприятливі 70 результати. Крім того, несподівано виявили, що поліміксини, зокрема поліміксин В, діють як замінники ЗР-В і їх додавання дає результати, порівнювані з тими, що були досягнуті з ЗР-В.

Згідно з другим аспектом, винахід стосується синтетичних ПАР, що містять один або більше пептидів формули (І), у суміші з ліпідами і/або фосфоліпідами, і як варіант, з 5Р-В, їх активними похідними або поліміксинами. Відповідні ліпіди/поліміксини можуть бути вибрані з групи, що містить фосфатидилхоліни (краще 75 ОРРС) РО, РА, триацилгліцерини, сфінгомієлін.

Навіть у кращому втіленні винаходу мають бути використані суміші ПАР, що містять пептид, в якому пальмітоїльні ланцюги ковалентно пов'язані з Зег залишками через О. Виявили, що суміші ПАР, які містять дипальмітоїльну форму згаданого пептиду (5Р-С(Іец), виявляють більшу стабільність поверхневої плівки і збільшений розмір поверхнево-асоційованого резервуару ліпідів, порівняно з сумішами, що містять відповідний Непалмітоїловий пептид, що виміряно системою з утриманням бульбашок. У зразках, що містять 590 дипалмітоїлового пептиду, упіпя була нижче 1,5 мН/м, а плівки досить стабільними, оскільки поверхневий натяг збільшувався менш ніж 0,5 мН/м протягом 10 хв. при сталому об'ємі бульбашки. На противагу, удір для непальмітоїлового пептиду була приблизно 5 мН/м, а плівки менш стабільними, як спостерігалося частим проскакуванням бульбашок внаслідок низького поверхневого натягу. Крім того, після субфазового виснаження Ге! для зразків, що містять непальмітоїловий пептид, можливість досягти стабільного поверхневого натягу нижче 0 о було втрачено після кількох етапів адсорбції, в той час як з дипальмітоїловим пептидом якість плівки не погіршувалася навіть після 10-ти етапів розширення і введення резервного матеріалу, еквівалентного більш ніж двом моношарам. Удосконалену поверхневу активність дипальмітоїлових пептидів також виявляли сурфактометром. Крім того, виявили, що наявність ацильних груп додатково зменшує тенденцію до утворення - олігомерів. Такий висновок є дуже важливим, оскільки під час приготування штучних ПАР олігомеризація пептидів виявилася такою, що заважає приготуванню сумішей з вищими ніж 20 мг/мл концентраціями (Міїввоп ей о а/, Еиг У Віоспет 1998,255, 116-124). -

Синтетичні ПАР можна приготувати змішуванням розчинів або суспензій пептидів і ліпідів і наступним сушінням суміші. см

Як виявилося, висушену суміш можна суспендувати, диспергувати або вводити як таку суб'єктам, які - потребують лікування від нестачі ПАР.

Синтетичні ПАР краще вводити ендотрахеально або аерозолем. Остання форма введення потребуватиме комбінації маленьких частинок ПАР з відповідним інертним пропелентом. Інші форми введення, наприклад, « розпорошення або розпилювання стабільних розчинів/суспензій ПАР також включені в рамки даного винаходу.

Згідно з іншим аспектом, винахід стосується використання зазначених пептидів для приготування - с поверхнево-активного засобу, що має використовуватися в усіх випадках нестачі або дисфункції ПАР у дорослих ц або новонароджених, що пов'язані з легеневими хворобами, наприклад, пневмонією, бронхітом, астмою, "» синдромом аспірації меконію, а також іншими хворобами, наприклад, серозними виділеннями при отиті (липке вухо).

Звичайно використовуватимуть поверхнево-активний засіб, краще при ендотрахеальному введенні, у -і лікуванні респіраторного дистрес-синдрому, який часто вражає недоношених дітей. юю Наступні приклади детальніше ілюструють винахід.

Приклад 1 -І Синтез та очищення пептидів сл 50 Аналог 5Р-С, 5Р-С(ІК5) (Фіг.1) синтезували, використовуючи поетапну технологію твердої фази та трет-бутилоксикарбонільної хімії (Кепі, 5.В.Н. (1988) Аппи. Кем.Віоспет. 57, 957-989) на приладі Арріїєй - й Віозузіетз 430А. Розщеплення зв'язку смола-пептид та депротектування бічних ланцюгів проводили у безводному гідрогенфлуориді/метоксибензолі/диметилсульфіді, 10:11:11 (за об'ємом) протягом 1,5 годин при температурі ОТ. Захисні групи та відпрацьовані реактиви видалили повторною екстракцією з діетиловим етером, а пептид потім екстрагували зі смоли дихлорметаном/трифлуороцтовою кислотою (ТФОК) 3:1 (за об'ємом) з наступним роторним випарюванням. Неочищений екстракт пептиду знову розчинили при концентрації 100 мг/мл о у хлорофом/метанолі 1:1 (за об'ємом), що містить 595 НО. 10 мг аліквоту нанесли на колонку Зерпадех І Н-60 іме) (40 х 1 см) у тому ж розчиннику (Сигвіеді, Т. ейаіЇ, (1987) Еицг. У. Віоспет. 168, 255-262). Були зібрані фракції по 2,5мл та виміряно оптичне поглинання на 214 та 28Онм. Ідентифікацію та підрахунок зробили 60 амінокислотним аналізом.

Для ацилування, очищений пептид (звичайно приблизно 5 мг) висушили, розчинили у дистильованій ТФОК (100 мкл) і додали ацилхлорид (10-20 еквівалентів порівняно з пептидом). Через 10 хв. реакцію гасили 8090 водним етанолом (1,9 мл).

Очищення ацилпептидів робили, використовуючи хромотограф на І іІрідех 5000 у етилєнхлориді/метанолі 1:4 65 (за об'ємом) супроводжуючи ВЕРХ з оберненою фазою на колонці С 18, використовуючи лінійний градієнт 2-пропанол/0,195 ТФОК, який переходить у 6095 (водний) метанол/0,195 ТФОК або 7595 (водний) етанол/О,195

ТФОК.

Приклад 2

Біохімічна характеристика

Чистоту пептиду перевірили електрофорезом у поліакриламідному гелі (РАСЕ) у присутності додецилсульфату натрію (505) (Рпазі-зувіет, РНаптасіа, Зуледеп) та високоефективною рідинною хроматографією з оберненою фазою (ВЕРХ), використовуючи колонку С 18 та лінійний градієнт 60 95 водний метанол /0,1 96 ТФОК та ізопропанол/0,1 95 ТФОК (Сизіаївзоп, М. еї аї. (1997) Віоспет. У).326, 799-806).

Молекулярні маси визначали мас-спектрометрію з лазерною десорбцією з допоміжної матриці 7/0 Іонізацією-часом-прольоту. (МАСОІ-ТОР) (Газегтаї 2000, Ріппідап МАТ), каліброваною на вазоактивному кишковому пептиді (М, 3326,8). Вторинну структуру пептиду досліджували, використовуючи спектроскопію кругового діхроїзму (СО) (дЧавзсо-720 дазсо, дарап). Після солюбілізації трифлуоретанолом (ТЕЕ) спектри були зареєстровані від 260 до 184 нм з швидкістю сканування 20 нм/хв та розділенням 2 виміри/нм. Залишкову молярну еліптичність обчислили та виразили у кград х см 7/дмоль. Молярні еліптичності при 208 та 222 нм 75 Використовували для оцінки вмісту спіральної структури (Ватом/, С.). еї аї. (1992) 9. Мої. Віої. 225, 1075-1093). Дослідження вторинної структури ЗР-С(І КБ), з використанням спектроскопії СО, показали спектр, типовий для ос-спіральних пептидів, а вміст А-спіралей приблизно 7595 визначили з мінімумів на 208 нм та 222 нм. Вторинна структура залишалася стабільною після поступового розведення Н 20 до тих пір, токи 12 956 ТЕЕ не забезпечило, що пептид солюбілізувався у чистому ТРЕ. ЗХО5-РАСЕ 5Р-С(І КБ) показала одну смугу, подібну до природного ЗР-С, в той час як 5Р-Сі(І еи), якому бракувало Гуз на спіральній частині, утворює олігомери. За контрастом з нашим дослідом з сумішами 5Р-С(І еш)/піпіїї, які важко солюбілізувати при концентрації вище 20 мг/мл (Міїзвоп, С. еї а). (1998) Еицг. 9. ,25 Віоспет. 255, 116-124), стало можливим приготувати суміш

ЗР-С(І КБУ п з концентрацією ліпіду 80 мг/мл і співвідношенням поліпептид/ліпід 0,03.

Приклад З Га

Приготування сумішей пептид/ліпід

ОРРС, РО та РА усі були куплені у Зідта СПетісаі Со. (З Іоців, МО). Ліпіди, розчинені у і9) хлороформ/метанолі 98:2 (за об'ємом), змішали у пропорціях ОРРС:РО:РА 68:22:9 (за масою) оба ОРРС/РО 7:3 (за масою). Поверхнево-активні препарати приготували додаванням одного 5Р-С(І К5) або ЗР-С(І КБ) та 5Р-В, до кожної ліпідної суміші, при загальному співвідношенні мас поліпептид/ліпід 0-0.05. Суміші випарювали під о/р зо азотом та ресуспендували у 150 ммоль/л Масі або у 10 ммоль/л буфері Гепес з рН 6,9, який містить 140 ммоль/л

Масі та 2,0 ммоль/л СасСі», до концентрації ліпіду 10-80 мг/мл. Повторні заморожування та обробку о ультразвуком (50 Вт, 48 кГц) здійснювали до тих пір, поки не досягли однорідних суспензій. В деяких випадках рч- кінцеву суспензію інкубували при 452 протягом 1 години.

Поверхнево-активні препарати, суспендовані в 150 ммол/л масі, мають рН 3,5-5,5. Нижчі значення рН 3,5-4,5 с спостерігали у препаратах, які містять 5Р-В. Оскільки природний ЗР-В очищений з використанням підкислених їч- органічних розчинників (Сигеіейї, Т. ей а). (1987) Еиг. 9. 20 Віоспет. 168, 255-262), незначна кількість кислоти може залишитись у препаратах. Близький до фізіологічного рН отримали суспендуванням поверхнево-активного препарату у буфері Гепес з рН 6.9, який містить 140 ммоль/л Масі та 2 ммоль/л Сасі 2 « (Таблиця 1), Порівняно з відповідними препаратами у небуферованому соляному розчині ніяких змін Уах 860 удіп не відбувалось, коли як ліпідну суміш використовували ОРРС/РО 7:3 (за масою). Однак, коли РА був включений - с до ліпідної суміші обидва Угах і упіп Збільшувалися при вищому рН (Таблиці 1 та 2). "з Приклад 4 " Приготування суміші фосфоліпідів з БР-С(І КБ) та поліміксином В.

ОРРС та РО були куплені у Зідта Спетіса! Со. (5 І оців, МО). Ліпіди, розчинені у хлороформ/метанолі 98:2 (за об'ємом), змішали у пропорціях ОРРС/РО 7:3 (за масою). 5Р-С(І К5) додавали до сумішей фосфоліпідів при - загальному співвідношенні мас поліпептид/фосфоліпід 0,03. Суміші випарювали під азотом та ресуспендували

ГФ при кімнатній температурі у 10 ммоль/л буфері Гепес з рН 6,9, який містить 140 ммоль/л Масі та 2,0 ммоль/л

Сасі» або у такому ж буфері, який місить 0,0195 поліміксину В (РХВ) (Зідта СПпетіса! Со, ЗІ І оців, МО). -і Повторні заморожування та обробку ультразвуком (50 Вт, 48 кГц) здійснювали до тих пір, поки не досягли сл 50 однорідних суспензій. Кінцева концентрація фосфоліпідів для обох препаратів була 10 мг/мл. Додавання РХхВ зменшує як утіп так і Утаух та досягається оптимальна поверхнева активність (Таблиця 3). - Приклад 5

Біофізична характеристика

Кінетику поверхневого розширення вимірювали при температурі приблизно 34-37 «С поверхневим балансом за УМіІНеіІту (Вієдієг, Міеппа, А!йзігіа). Поверхневий натяг відслідковували протягом 10 хв., використовуючи

ГФ! платинову пластинку, пов'язану з вимірювачем деформацій і вставлену на 1мм у гіпофазу, об'ємом 20 мл, що містить 150 ммоль/л Масі, і яка знаходиться у тефлоновій діжці. Суспензії додавали у вигляді крапельок о загалом 1 мг ліпідів, у гіпофазу, що розміщена на відстані 4 см від платинової пластинки.

Кінетичні вимірювання З масових часток 5Р-С(ІК5) у ОРРС/РО, 7:3 (за масою), використовуючи баланс бо УМійеіту, показали швидке розширення з поверхневим натягом 28 мН/м, через З с (Фіг. 2). Розширення виявилося деякою мірою повільним, при використанні 1 масової частки ЗР-С(І КБ) у тій самі суміші ліпідів (дані не показані) Добавка 2 масових часток ЗР-В значною мірою не змінила швидкість розширення або урівноваженого поверхневого натягу (Фіг.2). Жодних покращень не спостерігали після інкубування суміші протягом 1 години при температурі 452 (дані не показані). Подібні результати отримали з ОРРС:РО:РА, 68:22:9 бо (за масою), як сумішшю ліпідів (дані не показані).

Динамічний поверхневий натяг зареєстрували, використовуючи сурфактометр з пульсуючою бульбашкою (З,ипасіотегег Іпіегпайопаї!, Тогопіо, Сапада) при температурі 372С під час 50 95 циклічного стискання поверхні бульбашок і з частотою 40 циклів на хв. Усі виміри здійснювали протягом 5 хв. і при концентрації ліпідів 10 Мг/мл. Градієнти натягу вздовж стінки бульбашки були визначені в певні періоди часу і використані для обчислення поверхневого натягу при мінімальному або максимальному розмірі бульбашок.

У сурфактометрі з пульсуючою бульбашкою З масові частки ЗР-С(І К5) у ОРРС:РО:РА, 68:22:9 (за масою) показали поверхневий натяг менше 1мН/м при мінімальному радіусі бульбашок (уУтіп), В той час як Угіп 9-14 мН/м спостерігали з З масовими частками ЗР-С(І КБ) у ОРРС:РО, 7:3 (за масою) (Таблиця 1). Поверхневий натяг при 7/0 максимальному радіусі бульбашок (уау) був приблизно 40 мнН/м в обох випадках. Додавання 2 масових часток

ЗР-В дало значення угдах 31-33 мН/м і удіп 0-2 мН/м тдля обох ліпідних препаратів. Ці значення дуже близькі до тих, що отримали з поверхнево-активними препаратам, вилученими з натуральних джерел (Корбегізоп, В. еї а). (1990). Ргод. Кезріг. Кев. 25, 237-246). Інкубування препаратів при темп. 452 протягом 1 години значною мірою не вплинуло на поверхневу активність (Табл.1). Зменшення кількості 5Р-В до масової частки 0.5 95 у ЗР-С(І КБ) з 75 масовою часткою З 95 у ОРРС:РО 7:3 (за масою), збільшувало таким чином удір; хоча результати не досягли статистичної значимості (Табл.1). На противагу 5Р-В, додавання КІ , з масовою часткою 2 95 (Соспгапе, С.0. апа

Кемак, 5.0. (1991) Зсіепсе 254, 566-568) до 5Р-С(І КБ) з масовою часткою З 95 у ОРРС:РО:РА 68:22:9 (за масою) не зменшило значення у,ау; яке залишилося відносно високим при 41-42 мН/м.

Приклад 6

Порівняння сумішей, що містять зазначені дипалмітоїлові і непалмітоїлові пептиди.

Поверхнево-активні препарати приготували додаванням 395 за масою 5Р-С(Іеи) або дипалмітоїлового

ЗР-С(ІГ ем) до кожної ліпідної суміші, приготованої з ОРЕС/РО/РА 68:22:9 за масою. Суміші випарювали під дією азоту і повторно суспендували у 150 ммоль/л Масі при концентрації ліпідів 10 мг/мл. У зразки, в яких також використовувався замінник ЗР-В, додали 195 за масою поліміксину В. : Суміші, що містять дипалмітоїловий с р-С(І еи), з поліміксином В або без нього, показують значне покращання, зокрема у зменшенні Угах за 5 хв. і Утіп Ге) у ранішні інтервали часу.

Приклад 7

Визначення іп мімо

Дію терапії ПАР на механічні властивості дитячих легенів визначили у 9 новонароджених кролів віком від -- народження 27 днів. Новонародженим тваринам видаляли трахеї і п'ятьом з них, через трахеальну канюлю, ю вводили двічі по 2,5 мл/кг штучних ПАР, що містять ОРРС, РО і 5Р-С (І КБ), з поліміксином В або без нього, у вищезазначених пропорціях. Загальна концентрація фософоліпідів у екзогенному поверхнево-активному в. матеріалі становила 40 мг/мл. сч

Двоє тварин, які слугували негативною контрольною групою, не отримали жодного матеріалу через трахеальну трубу, а інших двоє, що слугували як позитивною контрольною групою, обробили однаковою дозою (Ге модифікованої натуральної ПАР (Сигозип, СПпіезі Рагптасеціїсі ра, Рагта, Нау), розведеної в співвідношенні мг/мл. Одну тварину обробили сумішшю ОРРС та РО у соляному розчині (та ж сама концентрація) дозою 2.5 мл/кг. Усіх тварин тримали у плетизмографічних боксах при темп. 372С і вентилювали паралельно протягом 60 « хв. 10095 киснем, використовуючи пристрій Зегмо Мепійаюг 9008 (Зіетепе-Еіета, ЗоіІпа, Зу"едеп) з частотою 40 40 хв. і 50965 часом інспірації. Подаваний об'єм визначали пневмографом, що зв'язаний з кожним плетизмографічним З с боксом. Тварин вентилювали стандартизованим подаваним об'ємом 8-Ю мл/кг і без позитивного тиску наприкінці "з видиху. Співвідношення легені-грудна клітка визначили як співвідношення між подаваним об'ємом і піковим " інспіраторним тиском і позначили як мл/см НО кг.

Порівняно з тваринами необробленої контрольної групи, співвідношення значно покращилось у тварин, оброблених штучними ПАР, зокрема у тварин, що отримували ПАР, що містить поліміксин В. Значною мірою, - поліпшення виявилося кращим порівняно з тим, яке спостерігали після обробки подібною дозою модифікованих ко натуральних ПАР (Фіг.3).

Стислий опис фігур. ш- Фіг. 1. Амінокислотні послідовності та представлення спіральних кілець ЗР-С і його аналогів. «сл 20 Послідовність ЗР-С людини взято від допапезоп, 4). еї аІ-(1988) РГЕВ5 І ей. 232, 61-64, а послідовність

ЗР-С(Гец) від Міїззоп, О., еї аіЇ. (1998) Еиг. 9У. Віоспет. 255, 116-124). БР-С(1К5) базується на первинній "З структурі 5Р-С, але усі залишки Маї в позиціях 16-28, за винятком позиції 17, замінені залишками Геи, залишки

Ї уз введені в позиції 17, 22 і 27, а палмітоїловані Суз в позиціях 5 і 6 замінені на зЗег.

Фіг. 2. Розширення на поверхні синтетичних поверхнево-активних препаратів. 52 Кінетику розширення ЗР-С(1К5), з масовою часткою 395, (заповнені квадратики, безперервна лінія) і

Ф! ЗР-С( КБ), з масовою часткою 390, з додаванням ЗР-В, з масовою часткою 2595 (відкриті трикутнички, пунктирна лінія). Усі препарати досліджували при концентрації ОРРС/РО 10 мг/мл, 7:3 (за масою) в 150 ммоль/л Масі. ді Записи отримали на балансі М/іІпеїгпу і кожний результат обробки - це три різні записи.

Фіг. 3. Результати іп мімо 60 Співвідношення легені-грудна клітка у 5 недоношених новонароджених кролів (віком від народження 27 днів) вентилювали стандартизованим подаваним об'ємом 8-Ю мл/кг і без позитивного тиску наприкінці видиху.

Співвідношення значно покращилося у оброблених тварин. Як виявилося, додавання поліміксину В (РХВ) збільшує дію штучних ПАР. Концентрація фосфоліпідів є однаковою в усіх поверхнево-активних препаратах, тобто 40 мг/мл. б5

Поверхневі властивості штучних ПАР препаратів у фізіологічному соляному розчині

ЗР-С(І КБ) (95 за масою) |ЗР-В (95 за масою) |Фософоліпіди |Температура інкубації 81100001 Ротор поко 51111111 брова оливу со юоуляу то 87711118 ОРРОРЯРА 7-11 5103802 с 330) ст за 31111120 вові 11111010 зва ви 51000111 рРрово | 50 вбузвів ов) зорвувнуаоюу 81111118 Повотв 0111 0) 7яоу ноу зво) і 831100 вові 10010100 сор виу ємо

Вимірювання проводили безпосередньо після приготування зразків або після інкубування протягом 1 години при 452 С. Концентрація фосфоліпідів була 10 мг/мл у 150 ммоль/л Масі. Записи отримали у різні проміжки часу на сурфактометрі з пульсуючою бульбашкою при 372С, 5095 поверхневим стисканням та зі швидкістю 40 обертів за хв. Значення є середньою величиною (зі стандартним відхиленням) з 3-5 вимірювань. Значення абревіатури дані у тексті. с

Табл. 2. (8) - зо 0000 дте отак юю так тею так 1110 ово ду маруврумтоу то во ю м 81111111 0 ОРРоРо БУ ву) зоуамоу 050000 бровою ру оору і зво) см рю. 1 ї-

Вимірювання проводили на зразках, які містять фосфоліпіди у концентрації 10 мг/мл у Нерез буфері (рн 6,9), який в свою чергу містить 140 ммоль/л Масі та 2,0 ммоль/л Сасі». Записи отримали у різні проміжки часу сурфактометром з пульсуючою бульбашкою при 372С, 50956 поверхневим стисканням та зі швидкістю 40 обертів « 70 за хв. Значення є середньою величиною (зі стандартним відхиленням) з 3-5 вимірювань. Значення абревіатури 8 с дані у тексті. ; т Таблиця З

Поверхневі властивості штучних ПАР з або без поліміксином В 5 ш- ЗР-С (ІК) (95 за масою) РхВ(95 за масою)| Фосфоліпіди ю - 87711111 ЮРРОРО БІ) 390) 2в(3) 16024203) 1303) дав) За 87717711 оРОРо зб) рою с 50 що Записи отримали у різні проміжки часу сурфактометром з пульсуючою бульбашкою при 372С, 5090 поверхневим стисканням та зі швидкістю 40 обертів за хв. Значення є середньою величиною (503) з 5-11 вимірювань. Значення абревіатури дані у тексті. і

Ге) Поверхневі властивості іх 60 то) рвав звів вою

ПИ ПИТИ ПОН ПЕЛА ЕЕ ПЕТЯ НЕНЕТЯ

11 о ом в б5

Поверхневий натяг сумішей отримали сурфактометром з пульсуючою бульбашкою. Після двох хвилин урівноваження, записи отримали у різні проміжки часу при 372С, 5095 поверхневим стисканням та при швидкості 40 обертів за хв.

Я ші «ш

Які а 7

В За

Н т І зт им

ЖЕ в ши

ПО віх 4 Я

ЕД 5 70 вн ЗА, ДУ не з» М,

У ШШся

Іі "аа

Е ІІ

Я і

Б ' я - щі В врш Яма я 2 ай (З «и в рань - її ча

ЛИ МН еще у чех я й » вий (х) у

Ії - в в 5 9559 яв с

Фіг о 80 | ою бо / - т ї 50 ! с ш

Е | м- х 40

Е ко; зітІлІя « о - 20 - с . :з» 10 0 - | 0 10 20 30 40 50 бо ко Час (хв.) -І с 50 - ФІГ.2 -

Ф) іме) 60 б5 щ 5В-СПЖ5| Іо» хв 0.50 М Сигозисі 40 мг/л 045 дя сло т шк 035 Що І і | і а 025 1 г явищі. с 15" зо

Час (хв.)

Список послідовностей «110» К'єзі Фармачеутічі С.п.А. «120» Штучні поверхнево-активні пептиди та їх використання у виробництві штучних поверхнево-активних речовин «130» К'єзі «140» «141» «1502МІЗ9АО000275 «151» 1999-02-12 «160256 «170» Патентна Версія 2.1 с «2105 1 «2115 35 о «2122РКТ «213» Штучна послідовність «220» ч- «223» Описання штучної послідовності: синтетичні пептиди «400» 1 о

Ре слу Те Рго бег Заг Рго Ма! Нів Геи ув Аку ви Мем Це Сей че 1 5 10 15 "узі ви Гени Ге Ге ув Ме Ге еу їси Гуз і еи Су Аа Геш Ге сч 20 25 зо -

Меї ЯМУ Ге

ЗБ

«21022 «211» 35 « «2122РКТ «213» Штучна послідовність о) с «220» "» «223» Описання штучної послідовності: синтетичні пептиди " «40022

РНе Су їе Рго Зег Зег Рго Уаї Ніз І.еи І ув Аго І. ем | ви в Ге -1 15 1 З 10 15 че увівніеціє ей Не уз Ге Ге Пе Ге Сіу Аа Ге Ге о 20 оБ зо -І Меї су І ви сл 50 35 21053 ть «211235 «2122 РКТ «213» Штучна послідовність 59 «220»

ГФ) «223» Описання штучної послідовності: синтетичні пептиди «400» З де Рпе Су Пе Рго Зег Зег Рго Ма! Нів І еи І ув Аг Ге і ви Пе ей 1 Б 10 15 бо Гуз ГеиГеці ви ее йе Гео Гей і ви Пе Гей сту Аза Ген г еи 20 25 30

Меї Спу Ге 35 65 «21054 «211235

«212»РАТ «213» Штучна послідовність «223» Описання штучної послідовності: синтетичні пептиди «400» 4

Рпе Су Ме Рго Заг Зег Рго Маї Нів і.еу І уз Аго ви Геу Ме Гео 1 5 10 15

Геи Ге Ген еи Гуз Ге Пе Ге Ме Се) Че Гени СМ Аа Ге Се 70 20 25 зо

Меї Сіу ге 35 «21025 «211235 «212» РКТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Описання штучної послідовності: синтетичні пептиди «400» 5

Ре С1у Ме Рго 5ег Бег Ро Маї Нів І.ви І ув Аго Гец І еи Ме є 1 5 10 15

Ге ец ей ви еи Ге Ме Гуз Геу ви Пе Ге Су Аа І ви Гей 20 25 Зо

Меї Спу ву с 35 о «21026 «211» 35 «2122 РТ «213» Штучна послідовність - «220» ю «223» Описання штучної послідовності: синтетичні пептиди «400» 6 -

Рне Су їе Рго бег бег Рго Ма! Ні Геу Гуз Аді еи І ей Ме ви сч 1 Б 10 15 -

Рпе ги Геиц Ген ви Рпе Пе еціеи Сей Ре Геи Су Ага ви Се 20 25 Зо

Меї СУ Гец « ю 35 З с ч»

Claims (1)

1. Формула винаходу п

   1. Аналоги ЗР-С, які мають згідно з однолітерним амінокислотним кодом загальну формулу (1): - 45 ГевпРАХРУНКА(Х аВ)(ХьВ (ов пав Ай МІ. (1), в якій: ко Х - амінокислота, вибрана з групи, яка складається з І, І, Міе (норлейцин); В - амінокислота, вибрана з групи, яка складається з К, МУ, Е, У, орнітину; і 7 - 5, і може, як варіант, бути з'єднаною естерними зв'язками з ацильною групою, яка містить 12-22 атомів 1 20 карбону; а - ціле число від 1 до 19; - М й й Ь - ціле число від 1 до 19; с - ціле число від 1 до 21; а - ціле число від 0 до 20; е-0 або 1; ГФ) Т- 0 або 1; п - 0 або 1; о т - О або 1; за умови, що: 60 -пнт»0; «Еге; - (ХаВ)4(ХЬВ и (ХоВ) птХа - послідовність, яка має максимум 22 амінокислоти, краще від 10 до 22 амінокислот.

   2. Аналоги ЗР-С за п. 1, які відрізняються тим, що мають формулу (Іа): 65 (Іа) ЕСІРБЗРУНІ КАХ.АВХАВХ.ВХОАЇ І МО.

   З. Аналоги 5Р-С за п. 1, які відрізняються тим, що мають формулу (ІБ):

   (ІБ) ЕСІРЗЗРУНІ КАХ5ВХ5ВХ,ОАГ І МО.

   4. Аналоги ЗР-С за п. 1, які відрізняються тим, що мають формулу (Іс) (Іс) ЕСІРЗЗРУНІ КАХ.ВХ.15А І МО...

   5. Аналоги 5Р-С за п. 1, які відрізняються тим, що мають формулу (Ід) (Ід) ЕСІРЗЗРУНІ КАХВВХУОАЇ І МОЇ.

   6. Аналоги 5Р-С за п. 1, які відрізняються тим, що мають формулу (Іє) (іє) ЕСІРЗЗРУНІ КАХ .1ВХ, ОА МОЇ.

   7. Аналоги 5Р-С за пп. 1-6, які відрізняються тим, що залишками серину (бег) є ацилатні переважно /о пальмітоїлові групи.

   8. Аналоги ЗР-С за пп. 1-7, які відрізняються тим, що В - лізин або фенілаланін, а Х - лейцин, ізолейцин або норлейцин.

   9. Аналоги 5Р-С за п. 8, які відрізняються тим, що вибрані з групи, яка складається з: ЗР-С (ІК5) РСІРЗЗРМНІКА ПІКС КІ КІ ОА СМ, 5Р-С(ІК5)1 ЕБІРЗЗРМНІКАК ПЕ КС ІК ЗАГ МОЇ, ЗР-С (К5)2 ЕСБІРЗЗРМНІКК ПІК СЕС СІСОАГ І МО, ЗР-С (К5)З ЕСІРЗЗРМНІКК ПІ ТІ КОП СА МО, 5Р-С (ІК5)4 ЕСІРЗЗРМНІКК ПІТ ГГ ТІК СТА МО, 5Р-С (1Е5) ЕСІРЗЗРМНІККІ ПЕ РЕ РІГ ЗАГ МОГ.

   10. Аналоги 5Р-С за пп. 1-7, які відрізняються тим, що їх використовують для приготування синтетичної ПАР для використання у всіх випадках нестачі легеневої ПАР.

   11. Аналоги ЗР-С за п. 10, які відрізняються тим, що їх використовують, коли нестачею легеневої ПАР є респіраторний дистрес-синдром.

   12. Синтетична ПАР, яка містіть щонайменше один аналог 5ЗР-С формули (І) у домішку з ліпідами та сч ов фосфоліпідами.

   13. Синтетична ПАР за п. 12, яка відрізняється тим, що суміш ліпідів/фосфоліпідів містить ОРРО, РО, РА. о

   14. Синтетична ПАР за пп. 12-13, яка відрізняється тим, що додатково містить ЗР-В або його активну похідну або поліміксин.

   15. Синтетична ПАР за пп. 12-14, яка відрізняється тим, що представлена у формі розчину, дисперсії, "р зо буспензії, сухого порошку.

   16. Синтетична ПАР за пп. 12-15, яка відрізняється тим, що для її приготування використовують поліміксин, о переважно поліміксин В для лікування всіх випадків нестачі або дисфункцій легеневої ПАР, або серозного отиту М (ексудативного отиту). с Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних ї- мікросхем", 2005, М 4, 15.04.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. ші с ;» -І іме) -І с 50 - Ф) іме) 60 б5