KR101516451B1

KR101516451B1 - 인공 폐 계면활성제 펩티드

Info

Publication number: KR101516451B1
Application number: KR1020107002968A
Authority: KR
Inventors: 잔 조한쏜; 토레 쿠르스테드트; 벤그트 로베르트손; 마우리지오 델카나레
Original assignee: 키에시 파르마슈티시 엣스. 피. 에이.
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2015-04-30
Also published as: EA201000161A1; WO2009018908A1; JP2010535721A; MX2010001543A; EP2022798A1; EP2185588A1; ES2360976T3; EP2185588B1; ATE503768T1; CA2695805C; CA2695805A1; CN108676088A; US20090075892A1; BRPI0813619B1; EA023499B1; KR20100053551A; BRPI0813619A2; EP2185588B9; JP5441904B2; AU2008286026A1

Abstract

본 발명은 천연 계면활성 프로틴 SP-B(native surfactant protein SP-B)의 펩티드 유사체 및 호흡장애증후군(respiratory distress syndrome) 및 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제의 제조에서의 이들의 이용에 관한 것이다.

Description

인공 폐 계면활성제 펩티드{SYNTHETIC PULMONARY SURFACTANT PEPTIDES}

인간의 폐는 다수의 작은 공기주머니(폐포라 불림)로 구성되어 있으며, 여기서는 폐의 기공과 혈액 사이에서 가스가 교환된다. 건강한 개인들에서는 이러한 교환은 호기(expiration)의 끝에 폐가 붕괴되는 것을 방지하는 프로틴-함유 계면활성 복합체(protein-containing surfactant complex)의 존재하여 이루어진다.

폐 계면활성 복합체는 주로 지질로 구성되어 있으며, 다양한 종류의 단백질을 소량 포함하고 있다. 이 복합체가 적당한 수준으로 존재하지 않으면, 폐의 기능의 저하를 초래한다. 이러한 증상을 호흡장애증후군(Respiratory Distress Syndrome, RDS)라고 하고, 주로 신생아에게 영향을 미친다.

상기 증상은 동물의 폐로부터 추출한 변형된 천연 계면활성제 제제로서 효과적으로 치료될 수 있다.

이러한 계면활성제의 주요 구성요소는 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG), 디팔미토일-포스라티딜콜린(dipalmitoyl-phosphatidylcholine, DPPC)으로 주로 알려진 1,2-디팔미토일-슨-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)과 같은 인지질(phospholipid)과 상기 물질의 계면활성제 같은 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려진 계면활성제 하이드로포빅 프로틴 B와 C(SP-B와 SP-C)이다. 생산과 멸균 공정의 복잡성과 혹시나 있을지 모를 면역반응의 유발과 같은 동물 조직으로부터의 계면활성제 준비시의 단점 때문에, 변형된 천연 계면활성제 조성을 모방한 인공 계면활성제가 개발되었다.

상기 인공 계면활성제는 재구성된 계면활성제(reconstituted surfactants)로서 알려졌다. 그러나, 천연 소스(source)로부터 하이드로포빅 SP-B 및 SP-C 프로틴의 유효한 양의 분리가 비용이 많이 들고 노동력을 많이 필요로 하므로, 임상적으로 활성적인 재구성된 계면활성제(clinically active reconstituted surfactant)의 개발은 복잡한 것으로 알려졌다.

마찬가지로, 재조합 DNA 기술에 의해 이들 프로틴의 생산은 최적의 호스트/벡터 발현 시스템(host/vector expression systems)을 설계하고 달성하는데 많은 노력을 필요로 한다. 게다가, 원치 않는 물질로부터 관심있는 발현된 프로틴을 분리하고 정제하는데에는 효과적인 분리 기술을 개발하는데 상당한 노력이 필요하다.

특히, SP-B 프로틴은 높은 분자량, 극단적인 소수성과 상당한 량의 시스테인 레지듀(cysteine residues)에 의해 특징지어질 수 있는데, 이는 천연물질로부터 분리에 의한 상업적인 제품 또는 재조합 DNA 기술에 의한 발현을 매우 복잡하게 만든다.

그러므로, 의약계는 간단하고, 제조하기 편리한 천연 프로틴의 모든 성질을 모방한 프로틴 SP-B의 합성 유사체를 필요로 하게 되었다.

특히, 천연 프로틴 SP-C의 합성 유도체 및 지질 캐리어와 혼합되었을 때, 호기의 끝부분에 폐포의 개방(alveolar patency at the end of expiration)을 효과적으로 유지할 수 있는 재구성된 계면활성제를 만들 수 있는 프로틴 SP-B의 합성 유사체를 필요로 하게 되었다.

본 발명은 천연 계면활성 프로틴 SP-B(native surfactant protein SP-B)의 펩티드 유사체 및 호흡장애증후군(respiratory distress syndrome) 및 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제의 제조에서의 이용방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명은 일반식 (I)으로 표시된 폴피펩티드 시퀸스(polypeptide of sequence)와 관계된다.

여기서,

X는 C, A, G, K, R, D와 E로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노 산 레지듀;

Δ는 W, L, nL과 I로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노 산 레지듀;

SEQ는 FNRYLT와 YNGK로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 시퀸스;

Φ는 C, A, G, K, R, D와 E로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노 산 레지듀;

Σ는 S, G와 A로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 레지듀;

n은 0 또는 1.

본 발명은 상기 폴리펩티드의 약학적으로 수용가능한 염과 예를들어 아세틸레이션과 아미데이션(acetylation and amidation)을 통한 이들의 폐쇄된 N 및/또는 C-말단 유도체(N- and/or C-terminus derivatives)를 포함한다.

본 발명은 일반식 (I)의 폴리펩티드와 혼합된 지질 캐리어를 포함하는 재구성된 폐 계면활성제(reconstituted pulmonary surfactant) 및 이들의 약학적 제제를 제공한다. 마지막으로 본 발명은 호흡장애증후군 및 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 재구성된 계면활성제의 제조를 위한 일반식 (I)의 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 의해 천연 계면활성 프로틴 SP-B(native surfactant protein SP-B)의 펩티드 유사체 및 호흡장애증후군(respiratory distress syndrome) 및 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제의 제조에서의 이용방법이 제공된다.

도 1은 인간 프로틴 SP-B의 아미노산 시퀸스이다.

정의

외생 계면활성제(exogenous surfactant preparations)로 생체내 처치후의 호흡기능은 2가지 파라미터; i) 폐유순도(lung compliance)의 지표인 1회 호흡량(tidal volume) 및 ii) 호기의 끝부분의 폐포의 공기 팽창 또는 개방 그리고 호기의 끝부분에 폐포에 안정적인 인지질 필름을 형성하는 능력의 지표인 폐 가스 부피를 측정함으로서 결정된다.

"SP18"로 정의되는 프로틴 SP-B는 17k Da 디메릭 프로틴(17k Da dimeric protein)인데, 이는 모노머 체인이 79 레지듀 폴리펩티드(79 residue polypeptide)이고, 3개의 인트라체인 디설파이드 링키지(intrachain disulfide linkages), Cys8 - Cys77, Cys11 - Cys 71 및 Cys 35 - Cys46 링키지,을 가지고 있다. 천연 형태로서, 인간 SP-B 서브유니트는 Cys 48에 인트라체인 디설파이드 링키지를 가지는 디설파이드-링크된 호모디머(disulfide-linked homodimer)로서 존재한다. 인간 SP-B의 모노메릭 체인의 시퀸스(sequence of the monomeric chain of human SP-B)는 도 1에 기재되어 있다.

이하에서 “재구성된 계면활성제”는 재조합 기술 또는 합성 방법을 통하여 만들어지는 계활활성 프로틴의 폴리펩티드 유사체에 지질 캐리어가 추가된 것을 의미한다. “지질 캐리어”는 인지질 및 선택적으로 추가적인 지질 성분, 예를들어 트리아실글리세롤(riacylglycerols)과 같은 중성지질, 자유지방산(free fatty acid) 및/또는 콜레스테롤의 혼합물을 의미한다.

“폴리펩티드”와 “펩티드”는 알파-아미노와 인접한 레지듀의 카르복시 그룹 사이에 펩티드 결합에 의해 서로 서로 연결된 약 60 이상의 아마노 산 레지듀의 선형 시리즈(linear series)를 지시하는 것으로 서로 교체 사용될 수 있다.

“천연 계면활성 프로틴 SP-B의 폴리펩티드 유사체”는 지질 캐리어와 혼합된 폴리펩티드가 폐 계면활성제 작용을 보여주는 한, 천연 프로틴과 비교하여, 하나 또는 그 이상의 아미노 산이 없거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노 산 시퀸스를 가지는 펩티드를 포함한다.

“천연 계면활성 프로틴 SP-C의 폴리펩티드 유사체”는 지질 캐리어와 혼합된 폴리펩티드가 폐 계면활성제 작용을 보여주는 한, 천연 프로틴과 비교하여, 하나 또는 그 이상의 아미노 산이 없거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노 산 시퀸스를 가지는 폴리펩티드를 포함한다.

보존적 치환(conservative substitutions)을 보이는 폴리펩티드는 하나의 아미노산 레지듀가 생물적으로 유사한 다른 레지듀에 의해 치환된 것이다. 보존적 치환의 예시로서는 이소류신(isoleucine), 바린(valine), 류신(leucine), 또는 메티오닌(methionine)과 같은 하나의 하이드로포빅 레지듀의 다른 것으로의 치환 또는 아르기닌(arginine)과 리신(lysine) 또는 글루타민산과 아스파르트산(glutamic and aspartic acid)과 같이 하나의 극성 레지듀를 다른 것으로 치환하는 것을 들 수 있다. “보존적 치환”은 또한 얻은 폴리펩티드가 또한 필요로 하는 계면활성 작용을 나타내는 한, 비치환된 모 아미노 산(unsubstituted parent amino acid)의 위치에 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다.

게다가, “보존적 치환”은 또한 얻은 폴리펩티드가 모 폴리펩티드(parent polypeptide)의 필요한 계면활성 작용 뿐 아니라 2차 구조(secondary structure)까지 유지하는 한, 이전의 것과는 다른 것으로의 치환도 포함한다.

아미노산 시퀸스는 3-레터 코드(three-letter code)에 의하면, 좌측 말단(아미노 말단)에 자유 아미노 그룹을 가지고 그리고 우측 말단(카르복시 말단)에 자유 카르복실 그룹을 가지는 아미노 산이 있는 것으로 표시된다.

본 발명에서의 모든 아미노산 레지듀는 천연 L-배치(natural L-configuration)이고, 본 발명에서의 시퀸스는 아래에 대응표에 기재된 바와 같이 아미노산 레지듀에 대한 표준 약자에 의해 기재된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 일반식 (I)에 의해 표시되는 시퀸스를 가지는 폴리펩티드와 관련된다.

여기서,

X는 C, A, G, K, R, D와 E로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노 산 레지듀(residue);

n은 0 또는 1.

본 발명에 의한 폴리펩티드는 FNRYLT 및 YNGK로 구성된 그룹으로부터 선택된 턴 모티프(turn motif)를 형성할 수 있는 아미노 산 시퀀스를 통해 연결된 SP-B 프로틴의 N-터미날 시퀸스(N-terminal sequence) 8-17과 C-터미날 시퀸스(C-terminal sequence) 67-78을 포함한다.

상기 폴리펩티드는 일반식 (I)에 의해 포함되는 변형체를 포함하는데, 이는 천연 SP-B 단백질의 시퀸스의 아미노 산 레지듀의 일부가 교체 및/또는 제거된 것을 특징으로 한다.

그 외에 이들은 아미노- 또는 카르복시-터미널 엔드(amino- or carboxy-terminal end)에 추가적인 아미노 산 레지듀를 포함할 수 있다. 상기 변형은 폴리펩티드의 발현을 향상시키거나 “링커(linker)” 시퀸스로서 작용할 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생체작용을 감소시키거나 방해하지는 않는다.

본 발명은 상기 폴리펩티드의 약학적으로 수용가능한 염과 예를들어 아세틸레이션과 아미데이션을 통한 이들의 폐쇄된 N 및/또는 C-말단 유도체(N- and/or C-terminus derivatives,)를 포함한다.

약학적으로 수용가능한 염은 예를들어, 하이드로클로릭 에시드, 아세틱 에시드 및 트리플루오로아세틱 에시드의 염을 포함한다.

일반식 (I)의 폴리펩티드는 디설파이드 링크된 분자(disulfide linked molecule)의 형태일 수 있으며, 이는 분자내 디설파이드 링키지(intramolecular disulfide linkage)가 Cys 레지듀 포지션 4(Cys residue at position 4)와 C-터미날 파트(C-terminal part)에서의 것 사이에 있다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 첫번째 그룹은

X와 Φ는 둘다 C;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 FNRYLT;

n는 0.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 디설파이드 링크된 분자의 형태이며, 이는 분자내 디설파이드 링키지가 2 Cys 레지듀 포지션 1과 27 및/또는 2 Cys 레지듀 포지션 4과 21사이에 존재한다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 두번째 그룹은

X와 Φ는 둘다 C;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 YNGK;

n는 0 또는 1.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 디설파이드 링크된 분자의 형태이며, 이는 분자내 디설파이드 링키지가 2 Cys 레지듀 포지션 1과 25 및/또는 2 Cys 레지듀 포지션 4과 19사이에 존재한다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 세번째 그룹은

X는 A 또는 G;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 FNRYLT;

n는 0 또는 1.

Φ는 A 또는 G

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 사이클릭 분자(cyclic molecule)의 형태일 수 있는데, 이는 분자내 링키지가 Ala 또는 GIy 레지듀 포지션 1과 27 사이에 존재한다. 더욱 바람직하게는 디설파이드 레지듀가 또한 2개의 Cys 레지듀 포지션 4와 21 사이에 존재한다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드 화합물의 네번째 그룹은

X는 A 또는 G;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 YNGK;

n는 0 또는 1.

Φ는 A 또는 G

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 사이클릭 분자(cyclic molecule)의 형태일 수 있는데, 이는 분자내 링키지가 Ala 또는 GIy 레지듀 포지션 1과 25 사이에 존재한다. 더욱 바람직하게는 디설파이드 레지듀가 또한 2개의 Cys 레지듀 포지션 4와 19 사이에 존재한다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 다섯번째 그룹은

X는 K 또는 R;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 FNRYLT;

n는 0 또는 1.

Φ는 D 또는 E

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 사이클릭 분자(cyclic molecule)의 형태일 수 있는데, 이는 링키지가 K 또는 R 레지듀 포지션 1과 D 또는 E 레지듀 포지션 27 사이에 존재한다. 링키지는 자유 아미노 그룹 K 또는 R 레지듀와 자유 카르복실릭 그룹 D 또는 E 레지듀 사이에 아미드 공유결합의 형태일 수 있고, 그렇지 않으면 링키지는 염다리(salt bridge)의 형태일 수 있다.

더욱 바람직하게는 디설파이드 레지듀가 또한 2개의 Cys 레지듀 포지션 4와 21 사이에 존재한다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 여섯번째 그룹은

X는 K 또는 R;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 YNGK;

n는 0 또는 1.

Φ는 D 또는 E

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 사이클릭 분자(cyclic molecule)의 형태일 수 있는데, 이는 링키지가 K 또는 R 레지듀 포지션 1과 D 또는 E 레지듀 포지션 25 사이에 존재한다. 링키지는 자유 아미노 그룹 K 또는 R 레지듀와 자유 카르복실릭 그룹 D 또는 E 레지듀 사이에 아미드 공유결합의 형태일 수 있고, 그렇지 않으면 링키지는 염다리(salt bridge)의 형태일 수 있다.

더욱 바람직하게는 디설파이드 레지듀가 또한 2개의 Cys 레지듀 포지션 4와 19 사이에 존재한다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 일곱번째 그룹은

X는 D 또는 E;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 FNRYLT;

n는 0 또는 1.

Φ는 K 또는 R.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 사이클릭 분자(cyclic molecule)의 형태일 수 있는데, 이는 링키지가 D 또는 E 레지듀 포지션 1과 K 또는 R 레지듀 포지션 27 사이에 존재한다. 링키지는 자유 아미노 그룹 K 또는 R 레지듀와 자유 카르복실릭 그룹 D 또는 E 레지듀 사이에 아미드 공유결합의 형태일 수 있고, 그렇지 않으면 링키지는 염다리(salt bridge)의 형태일 수 있다.

일반식 (I)의 바람직한 폴리펩티드의 여덟번째 그룹은

X는 D 또는 E;

Δ는 상기에 정의된 바와 같고;

SEQ는 YNGK;

n는 0 또는 1;

Φ는 K 또는 R.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 사이클릭 분자(cyclic molecule)의 형태일 수 있는데, 이는 링키지가 D 또는 E 레지듀 포지션 1과 K 또는 R 레지듀 포지션 25 사이에 존재한다. 링키지는 자유 아미노 그룹 K 또는 R 레지듀와 자유 카르복실릭 그룹 D 또는 E 레지듀 사이에 아미드 공유결합의 형태일 수 있고, 그렇지 않으면 링키지는 염다리(salt bridge)의 형태일 수 있다.

일반식(I)에 의해 포함되는 바람직한 폴리펩티드는 아래와 같다.

Cys 레지듀 사이에 분자내 디설파이드 링키지가 존재하는 디설파이드 링크된 분자 형태의 폴리펩티드 (Ic) 및 (Id)을 이하에서는 ox-(lc) 및 ox-(ld) 폴리펩티드로 표시한다.

인지질을 포함하는 지질 캐리어와 혼합시에 본 발명의 폴리펩티드는 표면 장력을 거의 0까지 줄일 수 있는 재구성된 계면활성제를 형성한다. 호기말 양압(positive end expiratory pressure)을 적용함이 없이 미숙아를 처치한 RDS 경우에서, 프로틴 SP-C의 특정 합성 유사체 및 적당한 지질 캐리어와 혼합된 일반식 (I)의 폴리펩티드는 변형된 천연 계면활성제의 투여후와 비교하여 호흡량으로 표시되는 호흡기능이 어느 정도 향상시킴을 알게 되었다.

나아가, 상기 재구성된 계활활성제는 호기의 말단에서 폐포 개방의 지표인 폐 가스 부피를 향상시키는 것으로 판명되었다. 일반식 (I)의 폴리펩티드는 폴리펩티드 분야의 당업자에게 알려진 어떠한 기술로도 분석될 수 있다.

고체상 폴리펩티드의 분석에 대한 제이, 엠. 스테워드 및 제이.디.영, “고체상 펩티드 분석(Solid Phase Peptide Synthesis)”, 더블유.에이치.프리맨. 시오., 샌프란시스코, 1969 및 제이. 메이엔호퍼, “호르모날 프로테인 및 펩티드(Hormonal Proteins and Peptides)", 2판, p46, 아카데믹 프레스(뉴욕), 1983 및 클래시컬 용액 분석(classical solution synthesis)에 대한 이. 슈로더 및 케이.큐브케, ”펩티드(The Peptides)“, 1판 아카데믹 프레스(뉴욕), 1965에서 많은 기술적인 특징이 기재되어 있다. 본 발명에 의한 폴리펩티드는 메리필드, 제이.암.켐 소크.(Merrifield, in J. Am. Chem. Soc.) 85: 2149-2154 (1963)에 최초로 기재된 고체-상 분석 기술(solid-phase synthetic technique)을 사용하여 준비될 수 있다. 다른 폴리펩티드 분석 기술이 알려져 있는데, 예를들어, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다른 문서 뿐만 아니라, 엠. 보단스키 외, 펩티드 분석, 존 위레이 & 손스, 2판(1976)에도 기재되어 있다. 이러한 분석에 사용될 수 있는 적당한 보호 그룹은 상기된 문서 뿐 아니라 제이.에프.더블유.맥오미에, 유기화학에서의 보호그룹,프레눔 프레스, 유욕(1973)에 기재되어 있다.

일반적으로 이들 방법들은 펩티드 체인의 성장을 위하여 하나 또는 그 이상의 아미노 산 레지듀 또는 적당히 보호된 아미노산 레지듀의 연속적인 투여를 포함한다.

예시로서 고상합성(solid phase synthesis)을 사용하면, 보호 또는 유도 아미노산(protected or derivatized amino acid)이 미보호된 카르복실 또는 아미노 그룹을 통해 불활성 고체 지지대(inert solid support)에 부착된다. 카르복실 또는 아미노 그룹의 보호 그룹은 선택적으로 제거되고, 적당히 보호된 보완 (아미노 또는 카르복실) 그룹을 가지는 시퀸스에서의 다음 아미노산이 혼합되어 고체 지지대에 이미 부착된 레지듀와 아미드 링키지를 형성하기에 적합한 환경하에서 반응한다. 아미노 또는 카르복실 그룹의 보호 그룹은 새로 추가된 아미노산 레지듀로부터 제거되고, 다음 아미노산(적당히 보호된)이 추가되고, 등등의 절차를 거친다.

모든 원하는 아미노산이 적당한 시퀸스로 연결된 후에, 사이드 그룹의 남은 터미널과 보호그룹 (및 고체 지지대)가 연속적으로 또는 동시에 제기되어, 최종 폴리펩티드를 얻게 된다. 미정제 폴리펩티드는 일반적으로 HLPC에 의해 정제되고, 냉동건조(lyophilisation)에 의해 분리된다.

폴리펩티드는 약학적으로 수용가능한 염의 형태로 얻어질 수 있다. 선택적으로 얻어진 염은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 적당한 이온 교환 수지로 채워진 칼럼을 사용하여 다른 형태의 염으로서 전환시킬 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 재조합 핵산 기술(recombinant nucleic acid methodologies)을 사용하여 준비될 수도 있다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드의 코딩된 DNA 시퀸스, 이들을 발현시키는 재조합 발현 벡터(recombinant expression vectors) 및 그 방법도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드에 대한 DNA 시퀸스 코딩은 당업자에게 잘 알려진 화학 기술에 의해 합성될 수 있다. 다음으로 DNA 세그먼트는 발현 벡터(expression vector)로 묶이고, 그와 함께 변형된 호스트(host)는 폴리펩티드를 생성하기 위하여 사용될 수 있다.

코딩 시퀸스의 화학적 합성에 의해, 적당한 성분(bases)을 천연 아미노산 레지듀 시퀸스의 인코딩 한 것으로 치환함으로서 간단히 원하는 변형을 만들 수 있다. 목표 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터(recombinant expression vectors) 및 일반식 (I)의 폴리펩티드의 생산을 위한 이들의 용도도 본 발명에 포함된다.

본 발명에는 상기에 기술된 DNA 세그먼트에 상응하는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)을 포함한다. 유전 코드(genetic code)의 중요하고 잘 알려진 특징은 과잉(redundancy)이다. 이는 프로틴을 만드는데 사용되어지는 대부분의 아미노 산에 있어서, 하나 이상의 코딩 뉴클레오티드 트리플렛(코돈)(coding nucleotide triplet (codon))이 특정 아미노산 레지듀를 위하여 코드되거나 지정(designate)될 수 있다.

그러므로, 다수의 서로 다른 뉴클레오티드 시퀸스(nucleotide sequences)가 특정 아미노산 레지듀 시퀸스를 위하여 코드화될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 시퀸스는 기능적으로 동일한 것으로 간주된다. 왜냐하면 이들은 모든 유기체에서 동일한 아미노산 레지듀 시퀸스를 생산하기 때문이다. 일반식 (I)의 폴리펩티드는 약학적으로 수용가능한 지질 캐리어와 혼합되어져서 재구성된 계면활성제를 형성한다. 폴리펩티드와 지질 캐리어의 중량비는 약1 :5 - 약 1 :5000, 바람직하게는 약 1 :10 - 약 1 :2000, 더욱 바람직하게는 1 :50 - 1 :1000이다. 보다 바람직한 실시예에서는 폴리펩티드:지질 캐리어의 중량비는 약 1 :5 - 약 1 :1000, 바람직하게는 약 1 :7 - 약 1 :500, 그리고 더욱 바람직하게는 약 1 :10 - 약 100이다.

바람직하게, 지질 캐리어는 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)과 팔미토일오레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC)과 같은 천연 폐 계면활성제에 포함되는 인지질과 팔미토일오레오일포스파티딜클리세롤(palmitoyloleoylphosphatidylglycerol, POPG)과 디팔미토일포스파티딜클리세롤(dipalmitoylposphatidylglycerol, DPPG)과 같은 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerols, PG)을 포함한다.

바람직하게 사용될 수있는 다른 인지질에는 포스파티딜리노시톨(phosphatidylinositols, Pl), 포스파티딜에타놀아민(phosphatidylethanolamines, PE), 포스파티딜세린스(phosphatidylserines) 및 스핀고미에린(sphingomyelins, SM)을 들 수 있다.

특정 실시예에서, 지질 캐리어는 트리아실글리세롤(triacylglycerol), 자유 지방산(free fatty acids) 및/또는 콜레스테롤과 같은 천연 지질을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 재구성된 계면활성제는 하나 또는 그 이상의 일반식 (I)의 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 추가로 WO95/32992, WO 00/47623, 및 WO 03/097695에 기재된 바와 같이 천연 계면활성 프로틴 SP-C의 합성 펩티드 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 폴리펩티드를 포함하는 재구성된 계면활성제는 상기 폴피펩티드의 서스펜젼 또는 용액, 선택적으로 다른 펩티드의 용액 또는 서스펜젼과 지질 캐리어를 혼합하고, 혼합물을 건조시킴으로서 준비될 수 있다. 그렇지 않으면, 본 분야에 알려진 방법에 의해 냉동건조(lyophilisation) 또는 스프레이-건조(spray-drying)에 의해 준비될 수 있다.

상기 재구성된 표면활성제의 투여는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 실시될 수 있다. 바람직하게는 기관내투여(주입 또는 환약)(intratracheal installation (infusion or bolus))이다. 그렇지 않으면 투여는 에어로졸라이제이션(aerosolization) 또는 네불리제이션(nebulisation)에 의해 행해질 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 재구성된 계면활성제를 포함하는 약학 조성물과도 관련된다.

상기 조성물은 용액, 디스편션(dispersion), 서스편션(suspension) 또는 드라이 파우더(dry powder)의 형태로 투여되는 것이 바람직하다. 바람직하게 상기 조성물은 적당한 용매 또는 리서스펜션 미디엄(resuspension medium)에 용해 또는 현탁된 재구성된 표면활성제를 포함한다.

바람직하게 상기 약학 조성물은 1회용 유리 비알(single-use glass vials)에 완충된 생리학적 샐라인 수용액(buffered physiological saline aqueous solution)에서의 서스펜젼(suspension)으로서 공급될 수 있다. 바람직하게는 재구성된 계면활성제의 농도(인지질 농도로 표시)는 약 2-약 160계면활성제 mg/ml, 바람직하게는 10-100mg/ml, 더욱 바람직하게는 20-80mg/ml이다.

상기 조성물은 칼슘, 마그네슘 및/또는 소디움 염(예를들어, 칼슘 클로라이드 또는 소디움 클로라이드)과 같은 전해질을 추가로 포함한다.

수용 서스펜젼의 형태에서의 조성물은 네불리제이션에 의해 투여될 수도 있다.

에어로졸 투여로 사용된다면, 재구성된 계면활성제는 추진체와 함께 미세하게 나누어진 형태로 공급된다. 유용한 추진체는 하이드로플루오로알칸과 같이 대기압하에서 가스의 형태이고 가압하에 응축되어진다. 에어로졸은 적당한 밸브를 가지고 있는 용기에 포장되어서, 내용물은 방출전에는 가압하에 유지될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드에 의해 얻어지는 약학 조성물은 미숙아 호흡장애증후군(RDS)의 치료 또는 예방 또는 성인의 RDS, 태변흡입증후군(meconiumaspiration syndrome), 기관지 폐형성 장애증(bronchopulmonary dysplasia)를 포함하는 계면활성제-결핍 또는 기능장애와 관련된 다른 질병의 치료 또는 예방에 적합하다.

심각한 중이염(otitis media (glue ear))의 치료 뿐 아니라, 폐렴, 기관지염, COPD(만설폐쇄성폐질환), 천식 및 낭포성 섬유종(cystic fibrosis)과 같은 다른 호흡기 질환의 치료 또는 예방에 적합하다.

아래의 실시예는 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

실시예 1 - 폴리펩티드 ox-(lc)의 합성과 정제

폴리펩티드 ox-(lc)는 아래의 개략도 1에 기재된 대로, 프목 화학(Fmoc chemistry)에 근거한 표준 SPPS(고상 펩티드 합성)에 의해 준비된다.

개략도 1

고상합성 후에, 디설파이드 브릿지(disulfide bridges)가 없는 미정제 펩티드는 표준 방법에 의해 레진으로부터 쪼개지고, 그리고 디설파이드 브릿지가 2개의 서로 다른 산화단계에 의해 선택적으로 형성된다.

디설파이드 브릿지를 선택적으로 형성하기 위하여, 4 시스테인의 측면 그룹을 위한 정의된 보호 패턴이 합성중에 선택된다.

개략도 1에 보여지는 방법에서, Cys1과 Cys27은 SPPS동안에 Fmoc-Cys(Trt)-OH로서 도입되고, 반면에 Cys4과 Cys21는 상응하는 Acm-유도체(derivatives)로서 연결된다.

첫 번째 디설파이드 브릿지는 공기산화(air oxidation)에 의해 형성되고, 하나의 브릿지를 가지는 펩티드는 HPLC 시스템에 의해 정제되고, 냉동 건조에 의해 분리된다. 두 번째 디설파이드 브릿지는 요오드 산화에 의해 형성되고, 최종 펩티드는 HPLC 시스템에 의해 정제되고 냉동 건조에 의해 분리된다.

최종 폴리펩티드의 순도는 Ci8칼럼을 사용하는 역상고성능액체크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)에 의해 측정하니, 92.2%로 판명되었다. 분자량은 ESI-MS에 측정되었다.

수율: 1.73 g (2.4%).

실시예 2 - 폴리펩티드 ox-(ld)의 합성 및 정제

폴리펩티드 ox-(ld)는 아래의 개략도 2에 기재된 방법과 유사한 방법으로 제조된다.

개략도 2

Cys1과 Cys27 사이와 Cys4와 Cys21 사이의 디설파이드 브릿지의 도입, 정제 및 분리는 실시예 1에 기재된 방법대로 행해진다.

최종 폴리펩티드의 순도는 Ci8칼럼을 사용하는 역상고성능액체크로마토그래피(reversed phase high performance liquid chromatography, HPLC)에 의해 측정하니, 86%로 판명되었다. 분자량은 ESI-MS에 측정되었다.

수율: 0.81 g (2.4%).

SEQUENCE LISTING <110> Chiesi Farmaceutici Spa <120> SYNTHETIC PULMONARY SURFACTANT PEPTIDES <130> 1849eur <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Tyr Asn Gly Lys Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys 20 25 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Tyr Asn Gly Lys Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Cys 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Ala Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Ala Ala 20 25 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthethic peptide <400> 6 Ala Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Tyr Asn Gly Lys Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Ala Ala 20 25 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> artificial peptide <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Gly Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Thr 1 5 10 15 Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Gly Gly 20 25 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Gly Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Tyr Asn Gly Lys Pro Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg Gly Gly 20 25

Claims

일반식 (I)으로 표시되는 시퀸스를 가지는 폴리펩티드.

여기서,
X는 C, A, G, K, R, D와 E로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노 산 레지듀;
Δ는 W, L, nL과 I로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노 산 레지듀;
SEQ는 FNRYLT와 YNGK로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 시퀸스;
Φ는 C, A, G, K, R, D와 E로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노 산 레지듀;
Σ는 S, G와 A로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 레지듀;
n은 0 또는 1.
제1항에 있어서, 상기 X와 Φ는 둘다 C, SEQ는 FNRYLT, 및 n은 0인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 2 Cys 레지듀 포지션 1과 27 사이 및/또는 2개의 Cys 레지듀 포지션 4와 21 사이에 분자내 디설파이드 링키지가 있는 디설파이드 링크된 분자의 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X와 Φ는 둘다 C, SEQ는 YNGK, 및 n은 0인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 2 Cys 레지듀 포지션 1과 25 사이 및/또는 2 Cys 레지듀 포지션 4와 19 사이에 분자내 디설파이드 링키지가 있는 디설파이드 링크된 분자의 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X와 Φ는 둘다 A 또는 G, SEQ는 FNRYLT인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X와 Φ는 둘다 A 또는 G, SEQ는 YNGK인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X는 K 또는 R, SEQ는 FNRYLT, 및 Φ는 D 또는 E인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X는 K 또는 R, SEQ는 YNGK, 및 Φ는 D 또는 E인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X는 D 또는 E, SEQ는 FNRYLT, 및 Φ는 K 또는 R인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 X는 D 또는 E, SEQ는 YNGK, 및 Φ는 K 또는 R인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아래의 그룹에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 시퀸스(Ic)를 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 2 Cys 레지듀 포지션 1과 27 및/또는 2 Cys 레지듀 포지션 2와 21 사이에 분자내 설파이드 링키지가 있는 디설파이드 링크된 분자의 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리페티드.
제12항에 있어서, 시퀸스(Id)을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 2 Cys 레지듀 포지션 1과 25 및/또는 2 Cys 레지듀 포지션 4와 19 사이에 분자내 설파이드 링키지가 있는 디설파이드 링크된 분자의 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리페티드.
제1항에 의한 폴리펩티드와 지질 캐리어가 혼합된 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
제17항에 있어서, 상기 계면활성제는 천연 계면활성 프로핀 SP-C의 합성 펩티드 유사체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
제17항에 있어서, 상기 지질 캐리어는 인지질 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
유효성분으로 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 미숙아의 호흡장애증후군(respiratory distress syndrome; RDS), 성인의 호흡장애증후군(respiratory distress syndrome in adults; ARDS), 태변흡입증후군(meconium aspiration syndrome; MAS), 또는 기관지 폐 형성 장애증(bronchopulmonary dysplasia; BPD)의 예방, 치료 또는 예방과 치료용 약제.
제1항의 폴리펩티드를 포함하는 미숙아의 호흡장애증후군(respiratory distress syndrome; RDS), 성인의 호흡장애증후군 (respiratory distress syndrome in adults; ARDS), 태변흡입증후군(meconium aspiration syndrome; MAS), 또는 기관지 폐 형성 장애증(bronchopulmonary dysplasia; BPD)의 예방, 치료 또는 예방과 치료용 약제 조성물.
제18항에 있어서, 상기 지질 캐리어는 인지질 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.