ES2360976T3 - Peptidos tensioactivos pulmonares sintéticos. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que tiene la secuencia representada por la fórmula general (I) en la que XΔLCRALIKR-SEC-PQLVCRLVLRΦ Σn X es un resto aminoacídico independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, A, G, K, R, D y E; Δ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en W, L, nL e I; SEC es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en FNRYLT e YNGK; Φ es un resto aminoacídico independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, A, G, K, R, D y E; Σ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en S, G y A; n es un número entero que tiene un valor de 0 ó 1.
Description
La presente invención se refiere a análogos peptídicos de la proteína tensioactiva nativa SP-B y a su uso en la preparación de formulaciones para la profilaxis y/o tratamiento del síndrome de distrés respiratorio (SDR) y otros trastornos respiratorios.
El pulmón humano está compuesto por una gran cantidad de pequeños sacos aéreos, llamados alvéolos, en los que los gases se intercambian entre la sangre y los espacios de aire de los pulmones. En individuos sanos, este intercambio está mediado por la presencia de un complejo tensioactivo que contiene proteína que evita que los pulmones se colapsen al final de la espiración.
El complejo tensioactivo pulmonar está compuesto principalmente por lípidos y contiene cantidades minoritarias de diversas proteínas. Una ausencia de niveles adecuados de este complejo provoca un malfuncionamiento del pulmón. Este síndrome se llama Síndrome de Distrés Respiratorio (SDR) y afecta habitualmente a bebés prematuros.
Dicho síndrome se trata de forma eficaz con preparaciones tensioactivas naturales modificadas extraídas de pulmones animales.
Los constituyentes principales de estas preparaciones tensioactivas son fosfolípidos, tales como 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfocolina habitualmente conocida como dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilglicerol (PG) y las proteínas hidrófobas tensioactivas B y C (SP-B y SP-C) que se sabe que tienen la capacidad de realizar la actividad tipo tensioactivo de dichas preparaciones.
Debido a los inconvenientes de las preparaciones tensioactivas de tejidos animales, tales como la complicación de los procedimientos de producción y esterilización y la posible inducción de reacciones inmunes, se han desarrollado tensioactivos sintéticos que imitan la composición de los tensioactivos naturales modificados.
Dichos tensioactivos sintéticos son conocidos como tensioactivos reconstituidos.
Sin embargo, el desarrollo de tensioactivos reconstituidos clínicamente activos resultó ser complicado ya que el aislamiento de cantidades significativas de las proteínas hidrófobas SP-B y SP-C de fuentes naturales es tanto caro como laborioso.
Asimismo, la producción de estas proteínas por técnicas de ADN recombinante requiere un esfuerzo sustancial en términos de diseño y realización de sistemas de expresión huésped/vector óptimos. Además, se requiere un esfuerzo considerable para desarrollar estrategias de aislamiento eficaces para separar y purificar la proteína expresada de interés de material no deseado.
En particular, la proteína SP-B se caracteriza por su elevado peso molecular, su extrema hidrofobicidad y una gran cantidad de restos de cisteína que complica enormemente su producción comercial mediante el aislamiento de materiales naturales o su expresión mediante estrategias de ADN.
Por lo tanto, la comunidad médica tiene la necesidad de análogos sintéticos, simples, y fáciles de preparar de la proteína SP-B capaces de imitar todas las propiedades de la proteína nativa.
Más particularmente existe la necesidad de análogos sintéticos de la proteína SP-B que, cuando se mezclen con análogos sintéticos de la proteína nativa SP-C y con un vehículo lipídico, den lugar a preparaciones tensioactivas reconstituidas capaces de mantener de forma eficaz la patencia alveolar al final de la espiración.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido de secuencia representada por la fórmula general (I).
XΔLCRALIKR-SEC-PQLVCRLVLRΦIΣn (I)
en la que
X es un resto aminoacídico independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, A, G, K, R, D y E;
Δ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en W, L, nL e I;
SEC es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en FNRYLT e YNGK; Σ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en S, G y A
n es 0 ó1.
La invención también incluye las sales farmacéuticamente aceptables de dichos polipéptidos y su derivados N-y/o C-terminales bloqueados, por ejemplo, mediante acetilación y amidación.
En otra realización, la presente invención proporciona un tensioactivo pulmonar reconstituido que comprende un vehículo lipídico mezclado con un polipéptido de fórmula general (I) y formulaciones farmacéuticas del mismo.
Finalmente, la invención se refiere al uso de los polipéptidos de fórmula general (I) para la preparación de un tensioactivo reconstituido para la profilaxis y/o tratamiento del síndrome de distrés respiratorio y otros trastornos respiratorios.
La figure muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína humana SP-B.
La función respiratoria después de un tratamiento in vivo con las preparaciones tensioactivas exógenas se determina midiendo dos parámetros: i) el volumen tidal que es un índice de la adaptabilidad pulmonar y ii) el volumen de gas pulmonar que es un índice de la expansión del aire alveolar o patencia al final de la espiración, y por tanto de la capacidad de formar una película fosfolipídica estable en los alvéolos al final de la espiración.
La proteína SP-B, que también se ha definido como "SP18", es una proteína dimérica de 17 kDa en la que la cadena monomérica es un polipéptido de 79 restos y tiene tres enlaces disulfuro intracatenarios, que enlazan la Cys8 con la Cys77, la Cys11 con la Cys71, y la Cys35 con la Cys46. En su forma nativa, la subunidad humana SP-B existe en forma de un homodímero con enlace disulfuro que tiene un enlace disulfuro intercatenario en la Cys 48. La secuencia de la cadena monomérica de la SP-B humana se presenta en la figura.
La expresión "tensioactivo reconstituido", como se usa en este documento, significa un vehículo lipídico al que se han añadido análogos polipeptídicos de las proteínas tensioactivas, producido a través de tecnología recombinante o procedimientos sintéticos.
La expresión "vehículo lipídico" significa una mezcla de fosfolípidos y opcionalmente componentes lipídicos adicionales, por ejemplo, lípidos neutros tales como triacilgliceroles, ácidos grasos libres y/o colesterol.
Los términos "polipéptido" y "péptido" se usan de forma intercambiable en este documento para indicar una serie lineal de no más de aproximadamente 60 restos aminoacídicos conectados uno a otro por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de los restos adyacentes.
La expresión "análogos polipeptídicos de la proteína tensioactiva nativa SP-B", incluye péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos en la que, en comparación con las proteínas nativas, uno o más aminoácidos han desaparecido o se han remplazado por otros aminoácidos siempre que los polipéptidos, en una mezcla con un vehículo lipídico, muestren actividad tensioactiva pulmonar.
La expresión "análogos polipeptídicos de la proteína tensioactiva nativa SP-C", incluye polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos en la que, en comparación con las proteínas nativas, uno o más aminoácidos han desaparecido o se han remplazado por otros aminoácidos, siempre que los polipéptidos, en una mezcla con un vehículo lipídico, muestren actividad tensioactiva pulmonar.
Los polipéptidos que presentan sustituciones conservativas son aquellos en los que un resto aminoacídico está remplazado por otro resto biológicamente similar. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro tal como entre arginina y lisina, o entre ácido glutámico y ácido aspártico.
La expresión "sustitución conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en el lugar de un aminoácido precursor no sustituido con la condición de que el polipéptido resultante también muestre la actividad tensioactiva necesaria.
Además, la expresión "sustitución conservativa" incluye sustituciones diferentes de las anteriores, con la condición de que el polipéptido resultante mantenga la estructura secundaria así como la actividad tensioactiva necesaria del polipéptido precursor.
Las secuencias de aminoácidos se muestran de acuerdo con el código de una letra con el aminoácido que lleva el grupo amino libre en el extremo izquierdo (extremo amino) y el aminoácido que lleva el grupo carboxilo libre en el Todos los restos aminoacídicos identificados en este documento están en la configuración L natural y las secuencias identificadas en este documento se presentan de acuerdo con las abreviaturas convencionales para los resto aminoacídicos como se muestra en la siguiente tabla de correspondencia.
TABLA DE CORRESPONDENCIA AMINOÁCIDO SÍMBOLO
Glicina G Gly L-prolina P Pro L-isoleucina I Ile L-leucina L Leu L-tirosina Y Tyr L-cisteína C Cys L-triptófano W Trp L-alanina A Ala L-lisina K Lys L-arginina R Arg L-glutamina Q Glu L-metionina M Met L-serina S Ser L-valina V Val L-asparagina N Asn L-ácido aspártico D Asp L-ácido glutámico E Gln L-histidina H His L-treonina T Thr L-fenilalanina F Phe L-nor-leucina -nLeu L-ornitina -Orn
La presente invención se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia representada por la fórmula general (I). XΔLCRALIKR-SEC-PQLVCRLVLRΦΣn (I)
10 enlaque X es un resto aminoacídico independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, A, G, K, R, D y E; Δ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en W, L, nL e I; SEC es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en FNRYLT e YNGK;
Σ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en S, G y A;
n es 0 ó1.
Los polipéptidos de la invención incluyen la secuencia N-terminal 8-17 y la secuencia C-terminal 67-78 de la proteína
SP-B unida a través de una secuencia de aminoácidos capaz de formar un motivo de giro seleccionada entre el
grupo que consiste en FNRYLT e YNGK.
Dichos polipéptidos también incluyen modificaciones tales como las abarcadas por la fórmula general (I) en la que
algunos de los restos aminoacídicos de las secuencias de la proteína SP-B nativa se han remplazado y/o han
desaparecido.
Por lo demás, también pueden incluir restos aminoacídicos adicionales en el extremo amino-o carboxi-terminal.
Dichas modificaciones pueden servir para potenciar la expresión del polipéptido o pueden servir como secuencia
"enlazadora", pero preferiblemente no disminuyen o interfieren de otro modo con la actividad biológica de un
polipéptido de la presente invención.
La invención también incluye las sales farmacéuticamente aceptables de dichos polipéptidos y sus derivados N-y/o
C-terminales bloqueados, por ejemplo, mediante acetilación y amidación.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, ácido acético, y ácido
trifluoroacético.
En una realización, los polipéptidos de fórmula general (I) pueden estar en forma de molécula con enlace disulfuro
en la que el enlace disulfuro intramolecular está entre el resto de Cys en la posición 4 y el de la parte C-terminal.
Un primer grupo de polipéptidos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que
Xy Φ son ambos C;
Δ es como se ha definido anteriormente;
SEC es FNRYLT;
n es 0.
De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula con enlace disulfuro en la que el enlace
disulfuro intramolecular está entre los dos restos de Cys en la posición 1 y 27 y/o entre los dos restos de Cys en la
posición 4 y 21.
Un segundo grupo de polipéptidos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que
Xy Φ son ambos C;
Δ es como se ha definido anteriormente;
SEC es YNGK;
N es 0ó 1.
De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula con enlace disulfuro en la que el enlace
disulfuro intramolecular está entre los dos restos de Cys en la posición 1 y 25 y/o entre los dos restos de Cys en la posición 4 y 19. Un tercer grupo de polipéptidos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que es A oG; Δ es como se ha definido anteriormente; SEC es FNRYLT; N es 0ó 1,
Φ es A oG. De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula cíclica en la que el enlace intramolecular está entre los restos de Ala o Gly en las posiciones 1 y 27. Más ventajosamente también está
Un cuarto grupo de compuestos polipeptídicos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que
X esA oG;
Δ es como se ha definido anteriormente;
SEC es YNGK;
N es 0ó 1,
Φ es A oG.
De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula cíclica en la que el enlace
intramolecular está entre los restos de Ala o Gly en las posiciones 1 y 25. Más ventajosamente, también está
presente un enlace disulfuro entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y 19.
Un quinto grupo de polipéptidos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que
X esK oR;
Δ es como se ha definido anteriormente;
SEC es FNRYLT;
N es 0ó 1;
Φ es D o E.
De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula cíclica en la que el enlace está entre el resto K o R en la posición 1 y el resto D o E en la posición 27. El enlace puede estar en forma de enlace covalente amida entre el grupo amina libre del resto K o R y el grupo carboxílico libre del resto D o E, de lo contrario el enlace puede estar en forma de puente salino.
Más ventajosamente, también está presente un enlace disulfuro entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y
21.
Un sexto grupo de compuestos polipeptídicos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que
X K oR;
Δ es como se ha definido anteriormente;
SEC es YNGK;
N es 0ó 1;
Φ es D o E.
De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula cíclica en la que el enlace está entre el
resto K o R en la posición 1 y el resto D o E en la posición 25. El enlace puede estar en forma de enlace covalente amida entre el grupo amina libre del resto K o R y el grupo carboxílico libre del resto D o E, de lo contrario el enlace puede estar en forma de puente salino.
Más ventajosamente, también está presente un enlace disulfuro entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y
19.
Un séptimo grupo de polipéptidos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que
X esDoE;
Δ es como se ha definido anteriormente;
SEC es FNRYLT;
N es 0ó 1;
Φ es K oR.
De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula cíclica en la que el enlace está entre el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
resto D o E en la posición 1 y el resto K o R en la posición 27. El enlace puede estar en forma de enlace covalente amida entre el grupo amina libre del resto K o R y el grupo carboxílico libre del resto D o E, de lo contrario el enlace puede estar en forma de puente salino.
Más ventajosamente, también está presente un enlace disulfuro entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y
21. Un octavo grupo de compuestos polipeptídicos preferidos de fórmula general (I) es ese en el que X
es D o E; Δ es como se ha definido anteriormente; SEC es YNGK; N es 0ó 1; Φ es K oR. De forma ventajosa, dichos polipéptidos pueden estar en forma de molécula cíclica en la que el enlace está entre el
resto D o E en la posición 1 y el resto K o R en la posición 25. El enlace puede estar en forma de enlace covalente amida entre el grupo amina libre del resto K o R y el grupo carboxílico libre del resto D o E, de lo contrario el enlace puede estar en forma de puente salino.
Más ventajosamente, también está presente un enlace disulfuro entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y
19.
Los polipéptidos preferidos abarcados por la fórmula general (I) se presentan a continuación
CLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (Ia)
CLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC (Ib)
CWLCRALIKRFNRYLTPOLVCRLVLRC (Ic)
CWLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC (Id)
ALLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRAA (Ie)
ALLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRAA (If)
GLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRGG (Ig)
GLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRGG (Ih)
Los polipéptidos (Ic) y (Id) en forma de moléculas con enlace disulfuro en las que los enlaces disulfuro
intramoleculares están entre los restos de Cys se indican a partir de ahora como polipéptidos ox-(Ic) y ox-(Id).
Los polipéptidos de la invención, cuando se mezclan con un vehículo lipídico que comprende fosfolípidos, forman un tensioactivo reconstituido capaz de reducir la tensión superficial a valores cercanos a cero. Se ha descubierto que, en un modelo de SDR en el que se trataron recién nacidos inmaduros sin aplicar una presión
de espiración final positiva (PEEP), los polipéptidos de fórmula general (I), cuando se mezclaban con análogos sintéticos particulares de la proteína SP-C y con un vehículo lipídico adecuado, mejoraban la función respiratoria expresaba por los volúmenes tidales a un grado comparable con el conseguido después de la administración de un tensioactivo natural modificado.
Además, resultó que dicha preparación de tensioactivo reconstituido mejoraba el volumen de gas pulmonar que es
un índice de la patencia alveolar al final de la espiración.
Los polipéptidos de fórmula general (I) pueden sintetizarse por cualquier técnica que sea conocida para los
especialistas en la técnica de polipéptidos.
Muchas de las técnicas disponibles pueden encontrarse en J.M. Steward y J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, y J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides", Vol.2, pág. 46, Academic Press (Nueva York), 1983 para síntesis peptídica en fase sólida, y E. Schroder y K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (Nueva York), 1965 para síntesis clásica en solución. Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse usando la técnica sintética en fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, en J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Pueden encontrarse otras técnicas de síntesis de polipéptidos, por ejemplo, en M. Bodanszky y col., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2ª Ed., (1976) así como en otros trabajos Los grupos protectores apropiados para su uso en dichas síntesis se encontrarán en los textos anteriores así como en J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nueva York, NY (1973).
En general, estos procedimientos comprenden la adición secuencial de uno o más restos aminoacídicos o restos aminoacídicos adecuadamente protegidos a una cadena peptídico creciente.
Usando una síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se adhiere a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino no protegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo después se elimina selectivamente y se mezcla y hace reaccionar el siguiente aminoácido en la secuencia que tenga el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido en condiciones adecuadas para formar el enlace amida con el resto ya adherido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo después se elimina de este aminoacídico recién añadido, y entonces se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), etc.
Después de haber unido todos los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, se elimina cualquier grupo protector restante de grupos terminales y laterales (y el soporte sólido) secuencialmente o de forma concurrente, para dar lugar al polipéptido final.
El polipéptido sin procesar generalmente se purifica por HPLC y se aísla por liofilización.
El polipéptido puede obtenerse en forma de sal farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la sal obtenida puede convertirse en otro tipo de sal usando una columna compactada con una resina de intercambio iónico adecuada de acuerdo con un procedimiento bien conocido para los especialistas en la técnica.
Los polipéptidos de la invención también pueden prepararse usando metodologías de ácido nucleico recombinantes bien conocidas en la técnica.
Por lo tanto, las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de la invención, los vectores de expresión recombinante capaces de expresarlos y los procedimientos de los mismos se incluyen en la presente invención.
Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de esta invención puede sintetizarse por técnicas químicas bien conocidas para los especialistas en la técnica. El segmento de ADN después puede ligarse en un vector de expresión, y puede usarse un huésped transformado con el mismo para producir el polipéptido.
Por síntesis química de la secuencia codificante, puede hacerse cualquier modificación deseada sustituyendo las bases apropiadas en el lugar de aquellas que codifican la secuencia de restos aminoacídicos nativos.
Los vectores de expresión recombinante capaces de expresar el presente polipéptido y sus procedimientos de uso para producir los polipéptidos de fórmula general (I) se incluyen en la presente invención.
También se incluyen en la presente invención equivalentes de ácido ribonucleico (ARN) de los segmentos de ADN descritos anteriormente.
Una característica importante y bien conocida del código genético es su redundancia. Es decir, para la mayoría de los aminoácidos usados para producir proteínas, más de un triplete de nucleótidos codificante (codón) puede codificar o designar un resto aminoacídico particular. Por lo tanto, varias secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar una secuencia de restos aminoacídicos particular. Dichas secuencias de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes ya que pueden provocar la producción de la misma secuencia de restos aminoacídicos en todos los organismos.
Los polipéptidos de fórmula general (I) pueden mezclarse con un vehículo lipídico farmacéuticamente aceptable para formar un tensioactivo reconstituido.
Las proporciones ponderales entre el polipéptido y el vehículo lipídico están ventajosamente en el intervalo de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:5000, preferiblemente de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:2000, y más preferiblemente de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1000. En una realización más preferida, la proporción ponderal de polipéptido:vehículo lipídico está en el intervalo de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:1000, preferiblemente de aproximadamente 1:7 a aproximadamente 1:500, y más preferiblemente de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 100.
De forma ventajosa, el vehículo lipídico comprende los fosfolípidos que están contenidos en preparaciones tensioactivas pulmonares naturales, por ejemplo, fosfatidilcolinas (PC) tales como dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), y fosfatidilgliceroles (PG), tales como palmitoiloleoilfosfatidilglicerol (POPG) y dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG).
Otros fosfolípidos que pueden usarse ventajosamente son los fosfatidilinositoles (PI), fosfatidiletanolaminas (PE), fosfatidilserinas y esfingomielinas (SM).
El tensioactivo reconstituido puede comprender uno o más polipéptidos de fórmula general (I) o puede comprender adicionalmente un análogo peptídico sintético de la proteína tensioactiva nativa SP-C tal como los descritos en los documentos WO 95/32992, WO 00/47623, y WO 03/097695.
Los tensioactivos reconstituidos que comprenden un polipéptido de la invención pueden prepararse mezclando una solución o una suspensión de dicho polipéptido, opcionalmente una solución o una suspensión de otro péptido y el vehículo lipídico, después secando posteriormente la mezcla.
De lo contrario, pueden prepararse por liofilización o secado por pulverización de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
La administración de dicha preparación de tensioactivo reconstituido puede realizarse de un modo conocido para los especialistas en la técnica, preferiblemente por un sistema intra-traqueal (infusión o bolo). De lo contrario, la administración puede realizarse by aerosolización o por nebulización.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen el tensioactivo reconstituido que comprende los polipéptidos de la invención.
Dichas composiciones se administran ventajosamente en forma de una solución, dispersión, suspensión o polvo seco. Preferiblemente dichas composiciones comprenden el tensioactivo reconstituido disuelto o suspendido en un disolvente adecuado o medios de resuspensión.
Preferiblemente, dichas composiciones farmacéuticas se suministran en forma de suspensión en una solución acuosa salina fisiológica tamponada en viales de vidrio de un único uso. De forma ventajosa, la concentración de tensioactivo reconstituido (expresaba como contenido de fosfolípidos) está en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 160 mg de tensioactivo por ml, preferiblemente entre 10 y 100 mg/ml, más preferiblemente entre 20 y 80 mg/ml.
Dichas composiciones pueden comprender adicionalmente electrolitos, tales como sales de calcio, magnesio y/o sodio (por ejemplo, cloruro cálcico o cloruro sódico).
Las composiciones en forma de suspensión acuosa también pueden administrarse por nebulización.
Si tiene que usarse en administración por aerosol, el tensioactivo reconstituido se suministra en forma finamente dividida junto con un propulsor. Los propulsores útiles son típicamente gases en condiciones ambientales que se condensan bajo presión tales como los hidrofluoroalcanos.
El aerosol se envasa en un recipiente equipado con una válvula adecuada de modo que los ingredientes puedan mantenerse bajo presión hasta que se liberen.
Las composiciones farmacéuticas obtenidas con los polipéptidos de la invención son adecuadas para el tratamiento
o profilaxis del síndrome de distrés respiratorio (SDR) en bebés prematuros o en el tratamiento o profilaxis de otras enfermedades relacionadas con una deficiencia o disfunción de tensioactivo incluyendo SDR en el adulto (SDRA), síndrome de aspiración de meconio (SAM), y displasia broncopulmonar (DBP).
También pueden ser útiles para el tratamiento o profilaxis de otros trastornos respiratorios tales como neumonía, bronquitis, EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), asma, y fibrosis quística así como para el tratamiento de otitis media serosa (oído pegajoso).
El siguiente ejemplo ilustra la invención en más detalle.
El polipéptido ox-(Ic) se preparó por procedimientos SPPS (del inglés Solid Phase Peptide Synthesis (síntesis peptídica en fase sólida)) convencionales basados en química de Fmoc, de acuerdo con el Esquema 1 presentado a continuación.
Después de la síntesis en fase sólida, el péptido en bruto sin puentes disulfuro se escindió de la resina por procedimientos convencionales, después los puentes disulfuro se formaron selectivamente por dos etapas de
30 oxidación diferentes.
Para formar selectivamente los puntes disulfuro, se eligió un patrón de protección definido para los grupos laterales de las cuatro cisternas durante la síntesis. En el procedimiento mostrado en el Esquema 1, la Cys1 y la Cys27 se introdujeron como Fmoc-Cys(Trt)-OH durante la SPPS, mientras que la Cys4 y la Cys21 se acoplaron como los derivados Acm correspondientes.
35 El primer puente disulfuro se formó por oxidación en aire y el péptido que tenía un puente se purificó por sistemas de HPLC y se aisló por liofilización. El segundo puente disulfuro se formó por oxidación con yodo, y el péptido final se purificó por sistema de HPLC y se aisló por liofilización.
La pureza del polipéptido final se comprobó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa, usando una columna C18 y resultó que era del 92%. Su masa molecular se determinó por EM-IEN. Rendimiento:
40 1,73 g (2,4%).
El polipéptido ox-(Id) se preparó de un modo similar de acuerdo con el Esquema 2 presentado a continuación.
La introducción de los puentes disulfuro entre la Cys1 y la Cys27 y entre la Cys4 y la Cys21, la purificación y el aislamiento se realizaron como se ha presentado en el Ejemplo 1.
La pureza del polipéptido final se comprobó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa, usando una columna C18 y resultó que era del 86%. Su masa molecular se determinó9 por EM-IEN. Rendimiento: n-BuOH n-Butanol
- 0,81 g (2,4%).
- Leyenda
- AA-OH
- Aminoácido
- ACN
- Acetonitrilo
- AcOEt
- Acetato de etilo
- AcOH
- Ácido acético
- Acm
- Acetamidometilo
tBu t-Butilo
DIPEA N,N-Diisopropiletilamina
5 DMF N,N-Dimetilformamida
EDT 1,2-Etanoditiol
EM-IEN Espectrometría de masas con ionización por electronebulización
Fmoc 9-Fluorenilmetiloxicarbonilo
HPLC Cromatografía líquida de alta resolución 10 Lio Liofilización
Mtt Metiltritilo
PBF 2,2,4,6,7-Pentametil-2,3-dihidro-benzofuran-5-sulfonilo
SPPS Síntesis peptídica en fase sólida
TBTU Tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio 15 TFA Ácido trifluoroacético
TIPS Triisopropilsililo
Trt Tritilo
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Chiesi Farmaceutici Spa 20 <120> PÉPTIDOS TENSIOACTIVOS PULMONARES SINTÉTICOS
<130> 1849eur
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<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1 25 <211> 27
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25 <220>
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<400> 8
Claims (10)
1.-Un polipéptido que tiene la secuencia representada por la fórmula general (I)
XΔLCRALIKR-SEC-PQLVCRLVLRΦΣn (I) en la que X es un resto aminoacídico independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, A, G, K, R, D y E; Δ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en W, L, nL e I; SEC es una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en FNRYLT e YNGK; Φ es un resto aminoacídico independientemente seleccionado entre el grupo que consiste en C, A, G, K, R, D y E; Σ es un resto aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en S, G y A; n es un número entero que tiene un valor de 0 ó 1. 2.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X y Φ son ambos C, SEC es FNRYLT, y n es 0. 3.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, en forma de molécula con enlace disulfuro en la que el enlace
disulfuro intramolecular está entre los dos restos de Cys en las posiciones 1 y 27 y/o entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y 21.
4.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X y Φ son ambos C, SEC es YNGK, y n es 0. 5.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, en forma de molécula con enlace disulfuro en la que el enlace disulfuro intramolecular está entre los dos restos de Cys en las posiciones 1 y 25 y/o entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y 19.
6.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X y Φ sonambos Ao G, y SEC es FNRYLT. 7.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X y Φ sonambos Ao G, y SEC es YNGK. 8.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es K o R, SEC es FNRYLT, y Φ es D o E. 9.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es K o R, SEC es YNGK, y Φ es D o E. 10.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es D o E, SEC es FNRYLT, y Φ es K o R. 11.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es D o E, SEC es YNGK, y Φ es K o R. 12.-El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre el grupo que consiste en
- CLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC
- (Ia)
- CLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC
- (Ib)
- CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC
- (Ic)
- CWLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC
- (Id)
- ALLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRAA
- (Ie)
- ALLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRAA
- (If)
- GLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRGG
- (Ig)
- GLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRGG
- (Ih)
13.-El polipéptido de la reivindicación 12, que es el polipéptido que tiene la secuencia (Ic) CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC
14.-El polipéptido de la reivindicación 13, en forma de molécula con enlace disulfuro en la que el enlace disulfuro intramolecular está entre los dos restos de Cys en las posiciones 1 y 27 y/o entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y 21.
15.-El polipéptido de la reivindicación 12, que es el polipéptido que tiene la secuencia (Id) 16-El polipéptido de la reivindicación 13, en forma de molécula con enlace disulfuro en la que el enlace disulfuro intramolecular está entre los dos restos de Cys en las posiciones 1 y 25 y/o entre los dos restos de Cys en las posiciones 4 y 19.
5 17.-Un tensioactivo reconstituido que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en mezcla con un vehículo lipídico.
18.-Un tensioactivo reconstituido de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende adicionalmente un análogo peptídico sintético de la proteína tensioactiva nativa SP-C.
19.-Un tensioactivo reconstituido de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que el vehículo lipídico comprende 10 una mezcla de fosfolípidos.
20.-Uso de un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento del síndrome de distrés respiratorio (SDR) en bebés prematuros.
21.-Uso de un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad relacionada con una deficiencia o disfunción de tensioactivo seleccionada entre 15 el grupo que consiste en SDR en el adulto (SDRA), síndrome de aspiración de meconio (SAM), y displasia broncopulmonar (DBP).
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