BRPI0813619B1

BRPI0813619B1 - Peptídeos surfactantes pulmonares sintéticos

Info

Publication number: BRPI0813619B1
Application number: BRPI0813619-0A
Authority: BR
Inventors: Maurizio Delcanale; Tore Curstendt; Jan Johansson; Bengt Robertson
Original assignee: Chiesi Farmaceutici S.P.A
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2021-06-22
Also published as: AU2008286026B2; ES2360976T3; EA201000161A1; CN108676088A; EA023499B1; JP2010535721A; ATE503768T1; CN101827861A; KR20100053551A; EP2185588A1; CA2695805A1; JP5441904B2; DE602008005901D1; CA2695805C; BRPI0813619A2; US20090075892A1; EP2022798A1; MX2010001543A; EP2185588B9; US8148492B2

Abstract

peptídeos surfactantes pulmonares sintéticos. a presente invenção é direcionada a análogos polipeptídicos da proteína surfactante nativa sp-b e seus usos na preparação de formulações para o tratamento ou profilaxia da síndrome do desconforto respiratório (sdr) e de outros distúrbios respiratórios.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001]. A presente invenção é direcionada a análogos peptídicos da proteína surfactante nativa SP-B e seus usos na preparação de formulações para a profilaxia e/ou tratamento da síndrome do desconforto respiratório (SDR) e de outros distúrbios respiratórios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002]. O pulmão humano é composto de uma grande quantidade de minúsculos sacos de ar, chamados alvéolos, nos quais os gases são trocados entre o sangue e os espaços de ar dos pulmões. Em indivíduos saudáveis, essa troca é mediada pela presença de uma proteína contendo um complexo surfactante que impede o colapso dos pulmões ao final da expiração.

[003]. O complexo surfactante pulmonar é composto principalmente de lipídio e contém pequenas quantidades de diversas proteínas. Uma ausência de níveis adequados desse complexo resulta em funcionamento incorreto do pulmão. Esta síndrome é chamada de Síndrome do Desconforto Respiratório (SDR) e afeta normalmente bebês prematuros.

[004]. Tal síndrome é tratada efetivamente com preparados de surfactante natural modificado, extraído de pulmões de animais.

[005]. Os principais componentes desses preparados de surfactante são fosfolipídios, como 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina conhecidosnormalmente como dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilglicerol (PG) e proteínas hidrofóbicas surfactantes B e C (SP-B e SP-C) que são reconhecidas por terem a capacidade de afetar a atividade de natureza surfactante de tais preparados.

[006]. Devido às desvantagens dos preparados de surfactantes a partir de tecidos animais, como a complexidade da produção e dos processos de esterilização e possível indução de reações imunológicas, foram desenvolvidos surfactantes sintéticos que reproduzem a composição dos surfactantes naturais modificados.

[007] . Tais surfactantes sintéticos são conhecidos como surfactantes reconstituídos.

[008]. Entretanto, o desenvolvimento de surfactantes reconstituídos clinicamente ativos revelou-se complexo, pois o isolamento de quantidades significativas de proteínas SP-B e SP-C hidrofóbicas a partir de fontes naturais é caro e utiliza muita mão-de-obra.

[009]. Da mesma forma, a produção dessas proteínas por técnicas recombinantes de DNA requer esforço substancial em termos de projeto e de obtenção de sistemas ideais hospedeiro-vetor de expressão de DNA. Além disso, é necessário esforço considerável para desenvolver estratégias de isolamento efetivas para separar e purificar a proteína expressa de interesse do material indesejado.

[0010]. Especificamente, a proteína SP-B é caracterizada por elevadopeso molecular, extrema hidrofobicidade e uma grande quantidade de resíduos de cisteína que dificulta de forma significativa sua produção comercial a partir do isolamento de materiais naturais ou de sua expressão utilizando estratégias recombinantes de DNA.

[0011]. Portanto, a comunidade médica tem uma necessidade deanálogos sintéticos simples e fáceis de preparar da proteína SP-B capaz de reproduzir todas as propriedades da proteína nativa.

[0012]. Mais especificamente, há uma necessidade de análogossintéticos da proteína SP-B nativa que, quando misturados a análogos sintéticos da proteína nativa SP-C e com um carreador de lipídio, produzam preparados de surfactantes reconstituídos capazes de manter eficientemente a permeabilidade alveolar ao final da expiração.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0013]. A presente invenção é direcionada a um polipeptídio desequência representada pela fórmula geral (I). XΔLCRALIKR-SEQ-PQLVCRLVLRΦΣn (I) onde,X é um resíduo de aminoácido selecionado independentemente dogrupo consistindo em C, A, G, K, R, D e E;Δ é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo emW, L, nL e I;SEQ é uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em FNRYLT e YNGK;Φ é um resíduo de aminoácido selecionado independentemente do grupo consistindo em C, A, G, K, R, D e E;∑ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupoconsistindo em S, G e An é igual a 0 ou 1.

[0014]. A invenção também inclui sais farmaceuticamente aceitáveisde tais polipeptídios e seus derivados bloqueados N-terminal e/ou C-terminal, por exemplo: via acetilação e amidação.

[0015]. Em outra modalidade, a presente invenção trata de umsurfactante pulmonar reconstituído composto de um carreador de lipídio misturado a um polipeptídio de fórmula geral (I) e as formulações farmacêuticas deste.

[0016]. Concluindo, a invenção é direcionada para o uso dospolipeptídios de fórmula geral (I) para a preparação de um surfactante reconstituído para a profilaxia e/ou tratamento da síndrome do desconforto respiratório e de outros distúrbios respiratórios.

DESCRIÇÃO DA FIGURA

[0017]. A Figura apresenta a sequência de aminoácidos da proteínaSP-B humana.

DEFINIÇÕES

[0018]. A função respiratória após tratamento in vivo com ospreparados de surfactante exógeno é determinada pela mensuração de dois parâmetros: i) O volume tidal ou corrente, igual a quantidade de ar inspirada ou expirada, que é um indicador da complacência pulmonar, e

[0019]. ii) o volume gasoso pulmonar que é um indicador daexpansão aérea alveolar ou da permeabilidade alveolar ao final da expiração e, portanto, da capacidade de formar uma película fosfolipídica estável nos alvéolos ao final da expiração.

[0020]. A proteína SP-B, que também tem sido definida como “SP18”,é uma proteína dimérica com 17 KDa (kilodaltons) na qual a cadeia monomérica é um polipeptídio com 79 resíduos e tem três ligações dissulfídicas intra-cadeia, ligando Cys8 a Cys77, Cys11 a Cys71 e Cys35 a Cys46. Em sua forma nativa, a sub-unidade SP-B humana existe como um homodímero de ligação dissulfídica tendo uma ligação dissulfídica intercadeia em Cys 48. A sequência da cadeia monomérica do SP-B humano está indicada na Figura.

[0021]. O termo “surfactante reconstituído”, conforme usado nestedocumento, significa um carreador de lipídio no qual foram adicionados análogos polipeptídicos das proteínas surfactantes, criados por meio de tecnologia recombinante ou por métodos sintéticos.

[0022]. O termo “carreador de lipídio” significa uma mistura defosfolipídios e, opcionalmente, componentes lipídicos adicionais, por exemplo: lipídios neutros como triacilgliceróis, ácidos graxos livres e/ou colesterol.

[0023]. Os termos “polipeptídio” e “peptídio” são utilizados de formaintercambiável neste documento para designar uma serie linear de não mais de 60 resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros por pontes peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxi de resíduos adjacentes.

[0024]. O termo “análogos polipeptídicos da proteína surfactante SP-B nativa”, inclui peptídeos que tenham uma sequência de aminoácido nos quais, comparados às proteínas nativas, um ou mais aminoácidos estão faltando ou foram substituídos por outros aminoácidos, desde que os polipeptídios, em uma mistura com um portador de lipídio, apresentem atividade surfactante pulmonar.

[0025]. O termo “análogos polipeptídicos da proteína surfactante SP-C nativa”, inclui polipeptídios com uma sequência de aminoácidos nos quais, comparado com as proteínas nativas, um ou mais aminoácidos estão faltado ou foram substituídos por outros aminoácidos, desde que os polipeptídios, em uma mistura com um portador de lipídio, apresentem atividade surfactante pulmonar.

[0026]. Polipeptídios que apresentam substituições conservadorassão aqueles nos quais o resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo biologicamente similar. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro como entre arginina e lisina, ou entre ácido glutâmico e ácido aspártico (aspartato).

[0027]. O termo "substituição conservadora" também inclui o uso deum aminoácido substituído no lugar de um aminoácido genitor não substituído, desde que o polipeptídio resultante também apresente a atividade surfactante necessária.

[0028]. Além disso, o termo “substituição conservadora” incluisubstituições diferentes das anteriores, desde que o polipeptídio resultante mantenha a estrutura secundária assim como a atividade surfactante necessária do polipeptídio genitor.

[0029]. As sequências de aminoácidos são apresentadas de acordocom um código de três letras com o aminoácido que transporta o grupo amino livre na extremidade esquerda (aminoterminal) e o aminoácido que transporta o grupo carboxila na extremidade direita (carboxiterminal).

[0030]. Todos os resíduos aminoácidos identificados nestedocumento estão na configuração-L natural e as sequências identificadas neste documento são relatadas de acordo com abreviações padrões de resíduos aminoácidos, conforme apresentado na Tabela de Correspondência a seguir.TABELA DE CORRESPONDÊNCIA

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031]. A presente invenção é direcionada a um polipeptídio com asequência representada pela fórmula geral (I). XΔLCRALIKR-SEQ-PQLVCRLVLRΦΣn (I) onde,X é um resíduo de aminoácido selecionado independentemente dogrupo consistindo em C, A, G, K, R, D e E;Δ é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo emW, L, nL e I; SEQ é uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em FNRYLT e YNGK;Φ é um resíduo de aminoácido selecionado independentemente do grupo consistindo em C, A, G, K, R, D e E;∑ é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupoconsistindo em S, G e An é igual a 0 ou 1.

[0032]. Os polipeptídios da invenção incluem a sequência N-terminal8-17 e a sequência C-terminal 67-78 da proteína SP-B ligada por meio de uma sequência de aminoácido capaz de tornar-se em um composto selecionado do grupo consistindo em FNRYLT e YNGK.

[0033]. Tais polipeptídios também incluem modificações comoaquelas englobadas pela fórmula geral (I) na qual alguns dos resíduos aminoácidos das sequências da proteína SP-B nativa foram substituídas e/ou estão faltando.

[0034]. Por outro lado, elas podem incluir ainda resíduos aminoácidosadicionais na extremidade aminoterminal ou carboxiterminal. Tais modificações podem servir para ampliar a expressão do polipeptídio ou podem servir como uma sequência "ligadora", mas preferencialmente não reduzem ou interferem de qualquer outro modo com a atividade biológica de um polipeptídio da presente invenção.

[0035]. A invenção também inclui sais farmaceuticamente aceitáveisde tais polipeptídios e seus derivados bloqueados N-terminal e/ou C-terminal, por exemplo: via acetilação e amidação.

[0036]. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, saisde ácido hidroclórico, ácido acético e de ácido trifluoroacético.

[0037]. Em uma modalidade, os polipeptídios de fórmula geral (I) podem estar na forma de molécula com ligação dissulfídica na qual a ligação dissulfídica intramolecular ocorre entre o resíduo Cys na posição 4 e com aquele no C-terminal.

[0038]. Um primeiro grupo de polipeptídios preferenciais de fórmulageral (I) é aquele no qual:X e Φ são ambos C;Δ é conforme definido acima;SEQ é FNRYLT;n é igual a 0.

[0039]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula com ligação dissulfídica, na qual a ligação dissulfídica intramolecular ocorre entre os dois resíduos Cys na posição 1 e 27 e/ou entre os dois resíduos Cys na posição 4 e 21.

[0040]. Um segundo grupo de polipeptídios preferenciais de fórmulageral (I) é aquele no qual:X e Φ são ambos C;Δ é conforme definido acima;SEQ é YNGK;n é igual a 0 ou 1.

[0041]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula com ligação dissulfídica, na qual a ligação dissulfídica intramolecular ocorre entre os dois resíduos Cys na posição 1 e 25 e/ou entre os dois resíduos Cys na posição 4 e 19.

[0042]. Um terceiro grupo de polipeptídios preferenciais de fórmulageral (I) é aquele no qual: X é igual a A ou G;Δ é conforme definido acima;SEQ é FNRYLT;n é igual a 0 ou 1.Φ é igual a A ou G

[0043]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula cíclica, na qual a ligação intramolecular ocorre entre os resíduos Ala ou Gly nas posições 1 e 27. Uma ligação dissulfídica também pode estar presente, de forma mais vantajosa, entre os resíduos Cys nas posições 4 e 21.

[0044]. Um quarto grupo de compostos polipeptídios preferenciais defórmula geral (I) é aquele no qual:X é igual a A ou G;Δ é conforme definido acima;SEQ é YNGK;n é igual a 0 ou 1.Φ é igual a A ou G.

[0045]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula cíclica, na qual a ligação intramolecular ocorre entre os resíduos Ala ou Gly nas posições 1 e 25. Uma ligação dissulfídica também está presente, de forma mais vantajosa, entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 19.

[0046]. Um quinto grupo de polipeptídios preferenciais de fórmulageral (I) é aquele no qual:X é K ou R;Δ é conforme definido acima; SEQ é FNRYLT;n é igual a 0 ou 1;Φ é D ou E.

[0047]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula cíclica, na qual a ligação ocorre entre o resíduo K ou R na posição 1 e o resíduo D ou E na posição 27. A junção pode ser na forma de ligação covalente de amido entre o grupo amino livre do resíduo K ou R e o grupo carboxílico livre do resíduo D ou E, por outro lado a ligação pode ser sob a forma de uma ponte de sal.

[0048]. Uma ligação dissulfídica também está presente, de formamais vantajosa, entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 21.

[0049]. Um sexto grupo de compostos polipeptídios preferenciais defórmula geral (I) é aquele no qual:X é K ou R;Δ é conforme definido acima;SEQ é YNGK;n é igual a 0 ou 1;Φ é D ou E.

[0050]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula cíclica, na qual a ligação ocorre entre o resíduo K ou R na posição 1 e o resíduo D ou E na posição 25. A junção pode ser na forma de ligação covalente de amido entre o grupo amino livre do resíduo K ou R e o grupo carboxílico livre do resíduo D ou E, por outro lado a ligação pode ser sob a forma de ponte de sal.

[0051]. Uma ligação dissulfídica também está presente, de forma mais vantajosa, entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 19.

[0052]. Um sétimo grupo de polipeptídios preferenciais de fórmulageral (I) é aquele no qual:é D ou E;é conforme definido acima;é igual a 0 ou 1;é K ou R.

[0053]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na formade molécula cíclica, na qual a ligação ocorre entre o resíduo D ou E na posição 1 e o resíduo K ou R na posição 27. A junção pode ser na forma de ligação covalente de amido entre o grupo amino livre do resíduo K ou R e o grupo carboxílico livre do resíduo D ou E, por outro lado a ligação pode ser sob a forma de uma ponte de sal.

[0054]. Uma ligação dissulfídica também está presente, de formamais vantajosa, entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 21.

[0055]. Um oitavo grupo de compostos polipeptídios preferenciais defórmula geral (I) é aquele no qual:X é D ou E;Δ é conforme definido acima;SEQ é YNGK;n é igual a 0 ou 1;Φ é K ou R.

[0056]. Tais polipeptídios podem estar, de forma vantajosa, na forma de molécula cíclica, na qual a ligação ocorre entre o resíduo D ou E na posição 1 e o resíduo K ou R na posição 25. A junção pode ser na forma de ligação covalente de amido entre o grupo amino livre do resíduo K ou R e o grupo carboxílico livre do resíduo D ou E, por outro lado a ligação pode ser sob a forma de uma ponte de sal.

[0057]. Uma ligação dissulfídica também está presente, de formamais vantajosa, entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 19.Os polipeptídios preferenciais englobados pela fórmula geral (I) estão relacionados abaixoCLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (Ia)CLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC (Ib)CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (Ic)CWLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC (Id)ALLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRAA (Ie)ALLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRAA (If)GLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRGG (Ig)GLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRGG (Ih)

[0058]. Os polipeptídios (Ic) e (Id) na forma de moléculas comligações dissulfídicas nas quais as ligações dissulfídicas intramoleculares estão entre os resíduos Cys, são indicados neste documento como polipeptídios ox-(Ic) e ox-(Id).

[0059]. Os polipeptídios da invenção, quando misturados a umcarreador de lipídio consistindo em fosfolipídios, formam um surfactante reconstituído capaz de reduzir a tensão superficial a valores próximos de zero.

[0060]. Descobrimos também que, em um modelo de SDR no qual o recém-nascido imaturo foi tratado sem aplicar uma pressão positiva expiratória final (PEEP), os polipeptídios de fórmula geral (I), quando misturados a análogos sintéticos específicos da proteína SP-C e, com um carreador de lipídio adequado, melhoraram a função respiratória conforme indicado pelos volumes correntes (tidal) a um grau comparável com o alcançado depois da administração de um surfactante natural modificado.

[0061]. Além disso, tal preparado surfactante reconstituído acaboupor melhorar o volume gasoso pulmonar que é um indicador da permeabilidade alveolar ao final da expiração.

[0062]. Os polipeptídios de fórmula geral (I) podem ser sintetizadospor quaisquer técnicas conhecidas por um técnico no assunto de polipeptídios.

[0063]. Muitas das técnicas disponíveis podem ser encontradas nolivro de J.M. Steward e J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", da W.H. Freeman Co., São Francisco, 1969, e J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides" (Proteínas e peptídeos hormonais", Vol.2, página 46, Academic Press (New York), 1983, sobre síntese de peptídio em fase sólida, e de E. Schroder e K. Kubke, "The Peptides" (Os peptídeos), vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para síntese de solução clássica. Os polipeptídios da invenção também podem ser preparados utilizando-se a técnica sintética em fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, no J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Outras técnicas de síntese de polipeptídios podem ser encontradas, por exemplo, em M. Bodanszky e outros, Peptide Synthesis (Síntese de peptídeos), John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976) assim como em outros trabalhos de referência conhecidos dos técnicos no assunto.

[0064]. Grupos protetores apropriados para uso em tais sínteses sãoencontrados nos textos mencionados acima, assim como em J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry (Grupos protetores em química orgânica), Plenum Press, New York, NY (1973).

[0065]. Em geral, esses métodos consistem na adição sequencial deum ou mais resíduos de aminoácido ou resíduos de aminoácido adequadamente protegidos para uma cadeia peptídica crescente.

[0066]. Usando uma síntese em fase sólida como ilustração, oaminoácido protegido ou derivado é conectado a um suporte sólido inerte por meio de seu grupo carboxila ou amino desprotegido. O grupo de proteção do grupo amino ou carboxila é removido seletivamente em seguida e o próximo aminoácido na sequência tendo o grupo complementar (amino ou carboxila) adequadamente protegido é misturado e reagido sob condições adequadas para formar a ligação amida com o resíduo já conectado ao suporte sólido. O grupo protetor do grupo amino ou carboxila é removido em seguida deste recém- adicionado resíduo de aminoácido, e o próximo aminoácido (adequadamente protegido) é adicionado em seguida, etc.

[0067]. Depois que todos os aminoácidos desejados foramconectados na sequência correta, qualquer terminal remanescente e grupos protetores de grupo lateral (e o suporte sólido) são removidos sequencialmente ou paralelamente, para produzir o polipeptídio final.

[0068]. O polipeptídio bruto é purificado, em geral, por técnica deHPLC e é isolado por liofilização.

[0069]. O polipeptídio pode ser obtido na forma de sal aceitávelfarmaceuticamente. Opcionalmente o sal obtido pode ser convertido em outro tipo de sal utilizando-se uma coluna carregada com uma resina de troca iônica adequada, de acordo com um procedimento bem conhecido de uma pessoa capacitada da área.

[0070]. Os polipeptídios da invenção também podem ser preparadosutilizando-se metodologias de ácido nucléico recombinante bem conhecidas no estado da técnica.

[0071]. Portanto, as sequências de DNA que codificam os polipeptídios da invenção, os vetores de expressão recombinante capazes de os expressarem e os métodos utilizados estão incluídos na presente invenção.

[0072]. Uma codificação de sequência de DNA para um polipeptídiodesta invenção pode ser sintetizada por técnicas químicas bem conhecidas de técnicos no assunto. O segmento de DNA pode ser ligado em seguida a um vetor de expressão, e uma célula hospedeira transformada com este segmento pode ser utilizada para produzir o polipeptídio.

[0073]. Ao sintetizar quimicamente a sequência de codificação,quaisquer modificações desejadas podem ser feitas simplesmente substituindo as bases apropriadas por aquelas que codificam a sequência de resíduo de aminoácido nativo.

[0074]. Os vetores de expressão recombinante capazes de expressarum polipeptídio de interesse e os métodos de seu uso para produzir os polipeptídios de fórmula geral (I) estão incluídos na presente invenção.

[0075]. Estão incluídos também na presente invenção osequivalentes de ácido ribonucleico (RNA) dos segmentos de DNA acima descritos.

[0076]. Uma característica importante e bem conhecida do códigogenético é sua redundância. Ou seja, para a maioria dos aminoácidos utilizados para produzir proteínas, mais de uma trinca de nucleotídeo (códon) de codificação pode codificar ou designar um resíduo de aminoácido específico. Portanto, uma quantidade de sequências de nucleotídeos diferentes pode codificar uma sequência de resíduo de aminoácido específico. Tais sequências de nucleotídeos são consideradas funcionalmente equivalentes, pois podem resultar na produção da mesma sequência de resíduo de aminoácido em todos os organismos.

[0077]. Os polipeptídios de fórmula geral (I) podem ser misturadoscom um carreador de lipídio farmaceuticamente aceitável para formar um surfactante reconstituído.

[0078]. As razões de peso entre o polipeptídio e o carreador de lipídioestá, de forma vantajosa, na faixa de aproximadamente de 1:5 a aproximadamente 1:5000, de preferência aproximadamente de 1:10 a aproximadamente 1:2000, e mais preferencialmente aproximadamente de 1:50 a aproximadamente 1:1000. Em uma modalidade mais preferencial, a razão de peso entre um polipeptídio e um carreador de lipídio está na faixa de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:1000, de preferência aproximadamente de 1:7 a aproximadamente 1:500, e mais preferencialmente aproximadamente de 1:10 a aproximadamente 1:100.

[0079]. O carreador de lipídio consiste, de forma vantajosa, nosfosfolipídios que estão contidos em preparados de surfactante pulmonar natural, por exemplo fosfatidilcolinas (PC) como dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) e palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), e fosfatidilgliceróis (PG), como palmitoil- oleoil fosfatidilglicerol (POPG) e dipalmitoil-fosfatidilglicerol (DPPG).

[0080]. Outros fosfolipídios que podem ser utilizados de formavantajosa são os fosfatidilinositóis (PI), os fosfatidiletanolaminas (PE), as fosfatidilserinas e esfingomielinas (SM).

[0081]. Em uma modalidade específica, o carreador de lipídio podeconsistir em componentes adicionais, por exemplo lipídios neutros como triacilgliceróis, ácidos graxos livres e/ou colesterol.

[0082]. O surfactante reconstituído pode consistir em um ou maispolipeptídios de fórmula geral (I) ou pode consistir adicionalmente em um análogo peptídico sintético da proteína surfactante nativa SP-C como aqueles apresentados nos documentos WO 95/32992, WO 00/47623 e WO 03/097695.

[0083]. Surfactantes reconstituídos consistindo em um polipeptídioda invenção podem ser preparados misturando-se uma solução ou a suspensão de tal polipeptídio, opcionalmente uma solução ou uma suspensão de outro peptídio e do carreador de lipídio e, em seguida, secando a mistura subsequentemente.

[0084]. Por outro lado, podem ser preparados por liofilização ou pelatécnica de secagem por pulverização de acordo com métodos conhecidos na arte.

[0085]. A administração de tal preparado surfactante reconstituídopode ser realizada de uma maneira conhecida a uma pessoa capacitada na ARTE, preferencialmente via instalação intra-traqueal (infusão ou bolo). Por outro lado, a administração pode ser realizada por aerosolização ou por nebulização.

[0086]. A presente invenção também se refere a composiçõesfarmacêuticas incluindo o surfactante reconstituído composto dos polipeptídios da invenção.

[0087]. Tais composições são administradas de forma vantajosa naforma de uma solução, dispersão, suspensão ou de pó seco. Preferencialmente tais composições consistem no surfactante reconstituído dissolvido ou em suspensão em um solvente ou meio de ressuspensão adequado.

[0088]. De preferência tais composições farmacêuticas sãofornecidas como suspensão dissolvida em uma solução aquosa salina fisiológica (soro fisiológico) em frascos de vidro de uso único. A concentração de forma vantajosa do surfactante reconstituído (expressa como concentração ou teor de fosfolipídeo) está na faixa de cerca de 2 a 160 mg de surfactante por ml, de preferência entre 10 a 100 mg/ml, mais preferencialmente entre 20 a 80 mg/ml.

[0089]. Tais composições podem consistir adicionalmente deeletrólitos, como cálcio, magnésio e/ou sais de sódio (por exemplo cloreto de cálcio ou cloreto de sódio).

[0090]. As composições na forma de suspensões aquosas também podem ser administradas por nebulização.

[0091]. Se for utilizada em administração via aerossol, o surfactantereconstituído é fornecido em uma forma finamente dividida, em conjunto com um propelente. Propelentes úteis são tipicamente gases em condições ambiente, condensados sob pressão, como hidrofluoroalcanos.

[0092]. O aerossol é embalado em um recipiente equipado com umaválvula adequada, de modo que os ingredientes possam ser mantidos sob pressão até serem liberados.

[0093]. Composições farmacêuticas obtidas com os polipeptídios dainvenção são adequadas para o tratamento ou profilaxia da síndrome do desconforto respiratório (SDR) em bebês nascidos prematuramente ou no tratamento ou profilaxia de outras doenças relacionadas à uma deficiência ou disfunção de surfactante incluindo SDR em adultos (SDRA), síndrome de aspiração de mecônio (SAM) e displasia broncopulmonar (DBP).

[0094]. Elas também podem ser úteis no tratamento ou profilaxia deoutros distúrbios respiratórios como pneumonia, bronquite, DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica), asma e fibrose cística, assim como para o tratamento de otite média serosa (otite com secreção inflamatória).

[0095]. O exemplo a seguir ilustra a invenção com mais detalhes.EXEMPLOSExemplo 1 - Síntese e purificação do polipeptídio ox-(Ic)

[0096]. O polipeptídio ox-(Ic) foi preparado por métodos padrão deSPPS (Síntese de peptídio em fase sólida) baseado em química de Fmoc, de acordo com o Esquema 1 apresentado abaixo.Esquema 1Fmoc-Cys(Trt) Resina Wang Clivagem de Fmoc: 20% de piperidina em DMF (dimetil formamida)Acoplamento: Fmoc-AA-OH/TBTU/DIPEA = 3/2,7/4,5 em DMF (dimetil ▼formamida)Boc-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-Leu-Ile-Lys(Boc)-Arg(Pbf)- Phe-Asn(Mtt-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Pro-Gln(Trt)-Leu-Val-Cys(Acm)- Arg(Pbf)-Leu-Val-Leu-Arg-(Pbf)-Cys(Trt)-Wang-ResinTFA/EDT/TIPS/H2O = 80/10/5/5 vH-Cys-Trp-Leu-Cys(Acm)-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Phe-Asn-Arg-Tyr-Leu-Thr-Pro- Gln-Leu-Val-Cys(Acm)-Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Cys-OH (reduzido)1. H2O/dioxana = 1/1, pH 7,5, ar2. Preparação HPLC, RP-C18, gradiente de ACN em 0,1 % TFAw3. LyoH-Cys-Trp-Leu-Cys(Acm)-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Phe-Asn-Arg-Tyr-Leu-Thr-Pro- Gln-Leu-Val-Cys(Acm)-Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Cys-OH(Ligação dissulfídica entre Cys1 e Cys27)1. H2O/ACOH, L2 em MeOH2. Preparação HPLC, RP-C18, gradiente de ACN em 0,1 % TFAv 3. LyoH-Cys-Trp-Leu-Cys-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Phe-Asn-Arg-Tyr-Leu-Thr-Pro-Gln- Leu-Val-Cys-Arg-Leu-Val-Leu-Leu-Arg-Cys-OH sal de trifluoroacetato(Ligação dissulfídica entre Cys1 e Cys27/Cys4 e Cys21)

[0097]. Após a síntese em fase sólida, o peptídio bruto sem pontesdissulfídicas foi clicado a partir da resina por métodos padrão e, em seguida, pontes dissulfídicas foram formadas seletivamente por duas etapas de oxidação diferentes.

[0098]. Para formar seletivamente as pontes dissulfídicas foiselecionado durante a síntese um padrão de proteção definido para os grupos laterais de quatro cisteínas. No processo mostrado no Esquema 1, Cys1 e Cys27 foram introduzidos como Fmoc-Cys(Trt)-OH durante a SPPS, ao passo que Cys4 e Cys21 foram acoplados como os derivados Acm correspondentes.

[0099]. A primeira ponte dissulfídica foi formada por oxidação com are o peptídio com uma ponte foi purificado por sistemas HPLC e isolado por liofilização. A segunda ponte dissulfídica foi formada por oxidação com iodo, e o peptídio final foi purificado por sistema HPLC e isolado por liofilização.

[00100]. A pureza do polipeptídio final foi verificada por cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho, (HPLC), usando uma coluna C18 e foi igual a 92%.

[00101]. Sua massa molecular foi determinada pela técnica ESI-MS.

[00102]. Rendimento: 1,73 g (2,4%).Exemplo 2 - Síntese e purificação do polipeptídio ox-(Id)

[00103]. O polipeptídio ox-(Id) foi preparado de uma maneira similar, de acordo com o Esquema 2 apresentado abaixo.Esquema 2Fmoc-Cys(Trt) Resina WangClivagem de Fmoc: 20% de piperidina em DMF (dimetil formamida)Acoplamento: Fmoc-AA-OH/TBTU/DIPEA = 3/2,7/4,5 em DMF (dimetil v formamida)Boc-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-Leu-Ile-Lys(Boc)-Arg(Pbf)- Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Pro-Gln-(Trt)-Leu-Val-Cys-(Acm)- Arg(Pbf)- Leu-Val-Leu-Arg(Pfb)-Cys(Trt)-Wang-ResinTFA/EDT/TIPS/H2O = 80/10/5/5 ▼H-Cys-Trp-Leu-Cys(Acm)-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Tyr-Asn-Bly-Lys-Pro-Gln-Leu-Val-Cys(Acm)-Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Cys-OH (reduzido)1. H2O/dioxana = 1/1, pH 7,5, ar2. Preparação HPLC, RP-C18, gradiente de ACN em 0,1 % TFA„3. LyoH-Cys-Trp-Leu-Cys(Acm)-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Tyr-Asn-Gly-Lys-Pro-Gln-Leu-Val-Cys(Acm)-Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Cys-OH(Ligação dissulfídica entre Cys1 e Cys25)H2O/ACOH, L2 em MeOH1. Preparação HPLC, RP-C18, gradiente de ACN em H2Ocontendo NaClO42. Preparação HPLC, RP-C18, gradiente de ACN em 0,1 % TFA3. Lyo▼H-Cys-Trp-Leu-Cys-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Tyr-Asn-Gly-Lys-Pro-Gln-Leu-Val-Cys-Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Cys-OH sal de trifluoroacetato(Ligação dissulfídica entre Cys1 e Cys25/Cys4 e Cys19)

[00104]. A introdução das pontes dissulfídicas entre Cys1 e Cys27 e entre Cys4 e Cys21, a purificação e o isolamento foram realizados conforme relatado no Exemplo 1.

[00105]. A pureza do polipeptídio final foi verificada por cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho, (HPLC), usando uma coluna C18 e foi igual a 86%.

[00106]. Sua massa molecular foi determinada pela técnica ESI-MS.

[00107]. Rendimento: 0,81 g (2,4%).LegendaAA-OH AminoácidoACN AcetonitrilaAcOEt Acetato de etilaAcOH Ácido acéticoAcm AcetamidometilBoc t-ButiloxicarbonilN-BuOH N-butanoltBu t-ButilDIPEA N,N-DiisopropiletilaminaDMF N,N-DimetilformamidaEDT 1,2-EtanoditiolESI-MS Espectometria de massa por ESI (ionização por eletrospray)Fmoc 9-FluorenilmetiloxicarbonilHPLC Cromatografia líquida de altodesempenhoLyo LiofilizaçãoMtt Metiltritil LegendaPBF 2,2,4,6,7-Pentametil-2,3-dihidro-benzofurano-5-sulfonilSPPS Síntese de peptídio em fase sólidaTBTU Tetrafluoroborato de 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronioTFA Ácido trifluoroacéticoTIPS TriisopropilsililTrt Tritil

Claims

1. POLIPEPTÍDIO com a sequência representada pela fórmula geral (I) XΔLCRALIKR-SEQ-PQLVCRLVLRΦΣn (I), caracterizado porX ser um resíduo de aminoácido selecionado independentemente dogrupo consistindo em C, A, G, K, R, D e;Δ ser um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo emW, L, nL e I;SEQ ser uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em FNRYLT e YNGK;Φ ser um resíduo de aminoácido selecionado independentemente dogrupo consistindo em C, A, G, K, R, D e;∑ ser um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupoconsistindo em S, G e An ser um número inteiro com valor igual a 0 ou 1.

2. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X e Φ serem ambos C, a SEQ é FNRYLT, e n é igual a 0.

3. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 2, na forma de molécula com ligação dissulfídica, caracterizado pela ligação dissulfídica intramolecular ocorrer entre os dois resíduos Cys nas posições 1 e 27 e/ou entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 21.

4. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X e Φ serem ambos C, SEQ é YNGK, e n é igual a 0.

5. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 4 na forma de molécula com ligação dissulfídica, caracterizado pela ligação dissulfídica intramolecular ocorrer entre os dois resíduos Cys nas posições 1 e 25 e/ou entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 19.

6. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X e Φ serem ambos A ou G, e SEQ é FNRYLT.

7. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X e Φ serem ambos A ou G, e SEQ é YNGK.

8. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X ser K ou R, SEQ ser FNRYLT, e Φ ser D ou E.

9. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X ser K ou R, a SEQ ser YNGK, e Φ ser D ou E.

10. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X ser D ou E, SEQ ser FNRYLT, e Φ ser K ou R.

11. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X ser D ou E, SEQ ser YNGK, e Φ ser K ou R.

12. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por selecionado do grupo consistindo em:CLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (Ia)CLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC (Ib)CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC (Ic)CWLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRC (Id)ALLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRAA (Ie)ALLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRAA (If)GLLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRGG (Ig)GLLCRALIKRYNGKPQLVCRLVLRGG (Ih)

13. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser o polipeptídio com a sequência (Ic)CWLCRALIKRFNRYLTPQLVCRLVLRC

14. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 13, na forma de molécula com ligação dissulfídica, caracterizado pela ligação dissulfídica intramolecular ocorrer entre os dois resíduos Cys nas posições 1 e 27 e/ou entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 21.

15. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser o polipeptídio com a sequência (Id)CWLCRALIKRYNG KPQLVCRLVLRC

16. POLIPEPTÍDIO de acordo com a reivindicação 13, na forma de molécula com ligação dissulfídica, caracterizado pela ligação dissulfídica intramolecular ocorrer entre os dois resíduos Cys nas posições 1 e 25 e/ou entre os dois resíduos Cys nas posições 4 e 19.

17. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO, caracterizado por consistir em um polipeptídio tal como definido por uma das reivindicações de 1 a 16 em uma mistura com um carreador de lipídio.

18. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por consistir ainda em um análogo peptídico sintético da proteína surfactante SP-C nativa.

19. SURFACTANTE RECONSTITUÍDO de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo carreador de lipídio consistir em uma mistura de fosfolipídios.

20. USO DE UM POLIPEPTÍDIO conforme definido por uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para a profilaxia e/ou tratamento da síndrome do desconforto respiratório (SDR) em bebês nascidos prematuramente ou de outras doenças relacionadas a deficiência ou disfunção de surfactante.

21. USO de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por ser usado para doença relacionada à uma deficiência ou disfunção de surfactante inclui SDR em adultos (SDRA), síndrome de aspiração de mecônio (SAM) e displasia broncopulmonar (DBP).