KR101328851B1 - 개선된 특성을 가지는 재구성된 계면활성제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지질 운반체를 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이고, 천연 계면활성 단백질 SP-C의 유사체인 특정한 폴리펩티드와 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체인 특정한 폴리펩티드의 조합에 관한 것이다.
특히 본 발명은 다음을 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이다:
a) 지질 운반체;
b) 일반식(I)에 의해 나타난 순서를 갖는 최소 20개의 아미노산 잔기와 40개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩티드
FeGeIfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLQpGpLp (I)
여기에서:
X는 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
B는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신 그리고 오르니틴으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
S 는 12-22개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 에스테르 결합을 통하여 곁사슬에 연결된 16번 탄소 원자를 포함하는 아실 그룹에 의해 선택적으로 치환되며;
Ω는 메티오닌 또는 황 원자가 산화된 메티오닌, 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산이고;
a는 1에서 8의 값을 갖는 정수이고;
b 는 1에서 19의 값을 갖는 정수이고;
c 는 3에서 8로부터 독립적으로 선택된 값을 갖는 정수이고;
e, f, g 그리고 p는 0 또는 1의 값을 갖는 정수이고;
n 는 0에서 3의 값을 포함하는 값을 갖는 정수;
그리고
상기 XaBXb(BXc)n는 최대 22개의 아미노산을 갖는 연쇄(sequence)라는 조건을 가지고
c) 일반식(II)에 의해 나타난 폴리펩티드:
CfΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPQLVCRLVLΦCSf (II)
여기에서:
Δ 는 트립토판 그리고 류신으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
Ω는 메티오닌, 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
Φ는 아르기닌 그리고 트레오닌, 바람직하게는 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이며; 그리고
f 는 0 또는 1의 값을 갖는 정수이다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용된 상기 폴리펩티드의 염 및 N 및/또는 C 말단이 보호된 유도체(예를 들어 아세틸화 그리고 아미드화)를 포함한다.
본 발명은 또한 호흡곤란증후군 및 다른 호흡기 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 성분 그리고 용도에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 날숨의 끝에서 폐포의 개존을 개선하기 위해 재구성된 계면활성제의 조제를 위한 일반식(II)의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 호흡곤란증후군 및 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 그러한 치료가 필요한 환자에 치료적으로 효능이 있는 양의 재구성된 계면활성제(이것은 지질 운반체, 일반식(I)의 폴리펩티드, 일반식(II)의 폴리펩티드로 이루어진 것이다)를 투여하는 것이다.
계면활성제(SURFACTANT), 폴리펩티드, 호흡곤란증후군(RDS)

Description

개선된 특성을 가지는 재구성된 계면활성제{RECONSTITUTED SURFACTANTS HAVING IMPROVED PROPERTIES}
본 발명은 지질 운반체를 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이고, 천연 계면활성 단백질 SP-C의 유사체인 특정한 폴리펩티드와 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체인 특정한 폴리펩티드의 조합에 관한 것이다.
본 발명은 또한 호흡곤란증후군 및 다른 호흡기 질환의 치료 또는 예방을 위해 재구성된 계면활성제의 약제학적 성분 그리고 그 용도에 관한 것이다.
인간의 허파는 폐포라고 불리는 많은 수의 작은 공기 주머니로 이루어져 있으며, 그곳에서 기체들은 혈액과 허파의 공기 공간 사이에서 교환된다. 건강한 사람에서, 이러한 교환은 날숨(또는 호기)의 끝에서 허파의 허탈을 방지하는 단백질 포함 계면활성 복합체의 존재에 의하여 중재 된다.
폐 계면활성 복합체는 주로 지질로 이루어져 있고 소량의 다양한 단백질을 포함한다. 이러한 복합체의 적당한 수준의 부존재는 허파의 기능 부전을 초래한다. 이러한 증후군은 호흡 곤란 증후군(RDS)이라고 불리고 통상적으로 조산아에 영향을 끼친다.
상기 증후군은 동물의 허파로부터 추출된 천연의 개조된 계면활성 조제에 의 하여 효과적으로 치료된다.
상업적으로 얻을 수 있는 개조된 계면활성 조제들은, 예를 들면, 돼지 허파로부터 얻은 큐로서프(Curosurf), 송아지 허파 세척으로부터 추출된 인파서프(Infasurf) 그리고 화학적으로 개조된 소과의 허파 천연 추출인 서반타(Survanta)이다.
이러한 계면활성 조제의 주된 구성물은 통상적으로 디팔미토일-포스패티딜콜린(DPPC)으로 알려진 1,2-디팔미토일-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phosphocholine), 포스패티딜글리세롤(PG) 그리고 계면활성의 소수성 단백질 B 및 C(SP-B and SP-C)와 같은 인지질들이다.
생산과 멸균 공정의 복잡함과 같은 동물 조직으로부터 얻은 계면활성 조제의 단점 그리고 면역 반응의 유도 가능성 때문에, 개조된 천연의 계면활성제의 조성을 모방하는 합성 계면활성제가 개발되어 왔다. 상기 합성 계면활성제들은 재구성된 계면활성제로 알려진 것이다.
그러나 천연의 소수성 단백질은 너무 커서 합성할 수 없으며, 구조적으로 복잡하고 순수한 형태에서 불안정하기 때문에 임상적으로 활성 있는 재구성된 계면활성제의 개발은 난해한 것으로 드러났다.
상기 천연의 소수성 단백질을 대체하기 위해, 그것의 순서와 부분적으로 유사한 합성 폴리펩티드 및 그것의 유사체들이 선행기술에 보고되고 있고, 예를 들어 WO 89/06657, WO 92/22315, WO 98/49191, WO 95/32992, US 6,660,833, EP 413,957 그리고 WO 91/18015에서 개시되고 있다.
WO 00/47623는 천연 단백질 SP-C의 유사체인 합성 폴리펩티드를 개시했으며, 여기에서: i) 5와 6 위치의 시스테인 잔기들은 세린 잔기로 대체되고, ⅱ) SP-C의 ‘가운데 부위’의 발린 잔기는 류신, 이소류신 그리고 노-류신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 다른 중성 및 소수성 잔기로 치환되고, ⅲ) SP-C의 ‘가운데 부위’에 존재하는 몇 개의 중성 아미노산은 리신, 티로신, 페닐알라닌, 티로신 그리고 오르니틴으로 구성된 그룹으로부터 선택된 크거나 극성의 잔기로 대체되었다.
상기 인공 폴리펩티드들은 그것들이 천연 단백질 SP-C처럼 접힘(folding)을 할 수 있으며, 그래서 계면활성 지질과 적절히 상호작용하고 자가 중합(self-oligomerisation)을 유발시키지 않는다는 특징이 있다.
WO 00/76535는 일반적으로 적어도 하나의 SP-C의 개조와 조합하여 적어도 하나의 SP-B의 개조를 포함하는 허파의 계면활성 조제에 관련된다.
워링 에이제이(2006년 4월 29 ~ 5월 2일, 샌프란시스코에서 열린 소아과 학회 연례 회의에서 제공된 초록)에 의하면, SP-C를 모방한 SP-Cff(이것은 4 및 5 위치에서 시스테인 대신에 페닐알라닌을 갖는 합성 34-잔기 SP-C이다) 그리고 SP-B를 모방한 Mini-B로 구성된 합성 계면활성제의 활성을 시험하기 위해 연구가 착수되었다.
그러나, 입수할 수 있는 문헌에 따르면, 동물 연구에서 재구성된 계면활성제 치료는 낮은 폐 가스 용적 및 날숨의 끝에서 폐포 개존(開存)의 등급을 유발시키고, 개조된 천연 계면활성제를 가지고 얻어지는 것에 비견할 만한 생체 내 활성을 달성하기 위해 호기말양압(PEEP)을 가지고 환기가 요구된다(조한슨 제이 등 저널 어플라이드 피지올로지 2003, 95, 2055-2063; 데이비스 에이제이 등 암 제이 레스피 크릿 캐어 메드 1998; 157, 553-559). 가용한 재구성된 계면활성 조제는 날숨의 끝에서 폐포의 안정된 인지질 막을 실제로 형성할 수 없다.
상술한 모든 문헌은 날숨의 끝에서 폐포 개존의 문제와 개시된 그 약제의 효과에 관하여 침묵하고 있다.
그러므로 폐 탄성도의 관점에서 개선된 특성을 갖는 재구성된 계면활성제를 위한 충족되지 않은 요구가 아직 존재한다.
특히, 폐포 안정성을 보장할 수 있고, 그리하여 PEEP로 환기하는 것을 요하지 않는 날숨의 끝에서 폐포 개존을 유지할 수 있는 재구성된 계면활성 조제에 대한 요구가 있다.
천연의 SP-C 단백질의 특별한 유사체가, 더욱 선호하게는 WO 00/47623의 폴리펩티드, 폐 탄성도의 관점에서 개선된 특성을 갖는 재구성된 계면활성 조제를 제공하기 위해, 그리고 특히 PEEP로 환기하는 것을 요하지 않는 날숨의 끝에서 효과적으로 폐포 개존을 유지할 수 있는 능력을 제공하기 위해 천연의 SP-B 단백질의 특별한 유사체와 유리하게 결합될 수 있다는 것은 이제 알려졌고, 본 발명의 목적이다.
미숙한 조산아가 PEEP를 가하지 않는 외인성 계면활성 조제로 치료된 RDS의 모델에서 상기 단백질 SP-C 및 SP-B의 특별한 유사체의 조합이 날숨의 끝에서 폐포 개존의 지표인 폐 가스 용적에 영향을 미친다는 사실은 특히 알려졌다.
<용어의 정의>
외인성의 계면활성 조제에 의한 생체 내 치료에서 호흡 기능은 다음 두 가지 요소를 측정함으로써 수행되었다:
i) 폐 탄성도의 지표인 1회호흡량 그리고
ii) 날숨의 끝에서 폐포의 공기 팽창 또는 개존의 지표로서 날숨의 끝에서 폐포의 안정된 인지질 막을 형성할 능력이 있는 폐 가스 용적.
본 출원에서, “재구성된 계면활성제”라는 용어는 재조합 기술 또는 합성 방법에 의해 만들어진 계면활성 단백질의 폴리펩티드 유사체가 가해진 지질 운반체를 의미한다.
“지질 운반체”라는 용어는 인지질의 혼합물을 의미하고 나아가 선택적으로 예를 들어 트리아실글리세롤과 같은 중성 지질, 자유 지방산 및/또는 콜레스테롤과 같은 지질 구성물질을 의미한다.
“천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩티드 유사체”라는 용어는 지질 운반체와의 혼합물에서 허파의 계면활성 효과를 보여주며 폴리펩티드만큼 기다란 것으로서 천연 단백질과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산이 누락되거나 다른 아미노산으로 교체된 아미노산 순서를 갖고 있는 펩티드를 포함한다.
“천연 계면활성 단백질 SP-B 의 폴리펩티드 유사체”라는 용어는 지질 운반체와의 혼합물에서 허파의 계면활성 효과를 보여주며 폴리펩티드만큼 기다란 것으로서 천연 단백질과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산이 누락된 아미노산 순서를 갖고 있는 펩티드를 포함한다.
"Mini-B"라는 용어는 캘리포니아 나노시스템즈 인스터튜트 웹사이트로부터 얻은 발표에서 처음 일반적으로 개시된 구조의 천연 SP-B단백질의 N말단 잔기8-25와 C말단 잔기63-78에 기초하는 34-잔기 폴리펩티드를 의미한다. 그 후 그것의 완전한 순서는 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 개시되어 왔다.
워링 에이제이의 펩티드 리서치 저널 2005, 66, 364-374에서 그것의 구조에 대한 더 많은 정보와 활성이 보고되고 있다.
“변형”라는 용어는 펩티드만큼 기다란 것으로서 지질 운반체와의 혼합물에서 Mini-B의 활성을 유지하며 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산에 의하여 대체된 아미노산 순서를 갖는 Mini-B 펩티드의 폴리펩티드 유사체를 의미한다.
아미노산 순서는 자유 아미노 그룹을 좌측 말단(아미노 말단)에 갖고 자유 카복실 그룹을 우측 말단(카복실 말단)에 갖는 세 글자 암호(three-letter code)에 따라 나타난다.
“상승적”이라는 용어는 두 개의 폴리펩티드의 효과가 주어진 분석평가에서 각각의 효과의 총합에 의하여 기대되는 것보다 더 많은 것을 의미한다.
여기에서 확인되는 모든 아미노산 잔기는 천연적인 L형태로 존재하고 여기에서 확인된 순서는 다음 대응 테이블에서 보여주는 것과 같은 아미노산 잔기의 표준 약어에 따라 보고된다.
대응 테이블
아미노산
 기호
한 글자 세 글자
글리신 G Gly
L-프롤린 P Pro
L-이소류신 I Ile
L-류신 L Leu
L-티로신 Y Tyr
L-시스테인 C Cys
L-트립토판 W Trp
L-알라닌 A Ala
L-리신 K Lys
L-아르기닌 R Arg
L-글루타민 Q Glu
L-메티오닌 M Met
L-세린 S Ser
L-발린 V Val
L-아스파라긴 N Asn
L-아스파르트산 D Asp
L-글루탐산 E Gln
L-히스티딘 H His
L-트레오닌 T Thr
L-페닐알라닌 F Phe
L-노-류신 - nLeu
L-오르니틴 - Orn
본 발명은 지질 운반체를 포함하는 재구성된 계면활성제에 관한 것이고, 천연 계면활성 단백질 SP-C의 유사체인 특정한 폴리펩티드와 Mini-B 펩티드 및 그것의 변형을 포함하는 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체인 특정한 폴리펩티드의 조합에 관한 것이다.
우리는 실제로 미숙한 조산아가 PEEP를 가하지 않는 상태에서 외인성 계면활성 조제로 치료된 RDS의 모델에서 일반식(I)의 폴리펩티드와 일반식(II)의 폴리펩티드의 조합이 폐 탄성도에 긍정적으로 작용한다는 사실을 발견했다.
특히, 두 개의 폴리펩티드의 조합은 날숨의 끝에서 폐포 개존의 지표인 폐 가스 용적에 상승적인 방식으로 작용하는 것이 발견되었다.
상기 결과는 본 발명의 재구성된 계면활성제가 단백질 SP-C 또는 단백질 SP- B의 유사체만으로 이루어져서 재구성된 것보다 더 나은 방식으로 인지질 막을 안정화할 수 있다는 것을 설명하고 있다.
게다가, 청구된 재구성 계면활성 조제는 개조된 천연 계면활성제의 투여에 의해 얻어지는 것에 상당하거나 또는 약간 더 양호한 정도로 1회호흡량에 의해 표현되는 호흡기 기능을 개선하는 것으로 나타났다.
유리하게도, 천연 단백질 SP-C의 유사체는 일반식(I)에 의해 나타난 순서를 갖는 적어도 20개의 아미노산 잔기와 40개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩티드이다.
FeGeIfPfSgSPVHLKRXaBXb(BXc)nGALLQpGpLp (I)
여기에서:
X는 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
B는 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신 그리고 오르니틴으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
S 는 12-22개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 에스테르 결합을 통하여 곁사슬에 연결된 16번 탄소 원자를 포함하는 아실 그룹에 의해 선택적으로 치환되며;
Ω는 메티오닌 또는 황 원자가 산화된 메티오닌, 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산이고;
a는 1에서 8의 값을 갖는 정수이고;
b 는 1에서 19의 값을 갖는 정수이고;
c 는 3에서 8로부터 독립적으로 선택된 값을 갖는 정수이고;
e, f, g 그리고 p는 0 또는 1의 값을 갖는 정수이고;
n 는 0에서 3의 값을 포함하는 값을 갖는 정수이며;
그리고
상기 XaBXb(BXc)n는 최대 22개, 바람직하게는 10 내지 22개의 아미노산으로 구성되는 연쇄(sequence)라는 조건을 가진다.
바람직하게도, 일반식(I)의 폴리펩티드는 적어도 30이고 35보다 많지 않은 아미노산으로 이루어지고, 더욱 바람직하게는 35보다 많지 않은 아미노산으로 이루어진다.
특별한 일실시예에서 일반식(I)의 폴리펩티드는 30 또는 33 또는 35개의 아미노산으로 이루어진다.
바람직하게도, SP-C 단백질의 폴리펩티드 유사체는 일반식(Ia)에 의해 표시되며, 여기에서 e와 n은 0이고 g는 1이다.
IfPfSSPVHLKRXaBXbGALLQpGpLp (Ia)
여기에서
X, B 그리고 Ω는 위에서 정의된 것과 같으며;
a는 1에서 8까지, 바람직하게는 1에서 3까지; 더욱 바람직하게는 1이고;
b는 1에서 19까지, 바람직하게는 5에서 15까지; 더욱 바람직하게는 14이고;
f 그리고 p는 0 또는 1이다.
더욱 바람직하게도, SP-C 단백질의 폴리펩티드 유사체는 일반식(Ib)에 의해 표시되며, 여기에서 f는 1이다.
IPSSPVHLKRXaBXbGALLQpGpLp (Ib)
여기에서:
X, B 그리고 Ω는 위에서 정의된 것과 같으며;
p는 0 또는 1이다.
훨씬 더 바람직하게도, SP-C 단백질의 폴리펩티드 유사체는 일반식(Ic)에 의해 표시된다.
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLΩpGpLp (Ic)
여기에서:
Ω는 위에서 정의된 것과 같으며
p는 0 또는 1이다.
일반식(Ic)의 폴리펩티드의 예는 아래에 보고된다:
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (Id) (서열 번호:1)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLIGL (Ie) (서열 번호:2)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (If) (서열 번호:3)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLnLGL (Ig) (서열 번호:4)
IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL (Ih) (서열 번호:5)
상기 폴리펩티드(Id)는 또한 선행 기술에서 SP-C33라고 불려지고 있다.
가장 바람직하게도, SP-C 유사체는 화학식 (Ie), (If), (Ig) 그리고 (Ih)를 갖는 폴리펩티드 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드이다.
본 발명의 바람직한 일실시 예에서, 일반식(I)의 폴리펩티드는 이하 SP-C33(Leu)31로 참조 되는 폴리펩티드(If)이다.
유리하게도, 천연 단백질 SP-B의 유사체는 N말단 잔기 8-25 및 천연 SP-B 단백질의 63-78 C말단 부분(Mini-B로 불려지는)에 상응하는 두 가지 부분 또는 그것의 변형으로 구성되어 있다.
더욱 유리하게도, 천연 단백질 SP-B의 유사체는 다음 일반식(II)에 의하여 표시되는 폴리펩티드이다.
CfΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPQLVCRLVLΦCSf (II)
여기에서:
Δ 는 트립토판 그리고 류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Ω는 메티오닌, 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고;
Φ는 아르기닌 그리고 트레오닌, 바람직하게는 아르기닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며; 그리고
f 는 0 또는 1의 값을 갖는 정수이다.
본 발명의 특별한 일실시 예에서, SP-B 유사체는 화학식(IIa)에 의하여 표시되는 폴리펩티드이다.
CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (IIa) (서열 번호:6)
본 발명의 다른 일실시 예에서 SP-B 유사체는 다음의 화학식을 가지고 있는 것들로부터 선택된다.
CLLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (IIb) (서열 번호:7)
CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (IIc) (서열 번호:8)
CLLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (IId) (서열 번호:9)
바람직한 일실시예에서, 폴리펩티드 (IIa), (IIb), (IIc) 그리고 (IId)는 분자내 이황화 결합이 1번과 33번 위치의 두 개의 시스테인 잔기 사이 및/또는 4번과 27번 위치의 두 개의 시스테인 잔기 사이에 있는 이황화 결합된 분자의 형태로 존재할 수 있다.
이황화 결합된 폴리펩티드(IIa)는 관련 분야에서 산화된 Mini-B (ox Mini-B)로 불려지고 있다.
폴리펩티드(IIc)는 이하에서 Mini-B(Lleu)라고 불려지고 이황화 결합된 형태는 ox Mini-B(Leu)라고 불려진다.
일반식(I) 그리고 (II)의 폴리펩티드는 관련 분야에서 숙련된 자에게 잘 알려진 합성 방법 또는 재조합 기술에 따라서 제조될 수 있다.
이용 가능한 많은 기술의 우수한 개요는 고체상태 펩티드 합성에 관하여는 제이. 엠. 스튜어드 및 제이. 디. 영, “솔리드 페이즈 펩타이드 씬쎄시스”, 더블유. 에이치. 프리만 컴퍼니, 샌프란시스코, 1969, 그리고 제이. 마이엔호퍼, “호르모날 프로테인 앤드 펩타이즈”, 볼륨2, 46페이지, 아카데믹 프레스(뉴욕), 1983에서 발견될 수 있고, 고전적 용액 합성에 관하여는 이. 슈로더 및 케이. 커브케, “더 펩타이즈”, 볼륨 1, 아카데믹 프레스(뉴욕), 1965에서 발견될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 미국 화학 학회지 2149-2154 (1963)에서 메리필드에 의하여 최초로 기술된 고체 상태 합성 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 다른 폴리펩티드 합성 기술은, 예를 들어, 엠. 본댄즈키 그 외, 펩타이드 씬쎄시스, 존 윌리 앤 썬스, 2판(1976) 뿐만 아니라 관련 분야에서 숙련된 자에게 알려진 다른 참고 자료에서 발견될 수 있다.
이러한 합성에서 사용되는 적당한 보호기(protective group)는 상술한 문헌들뿐만이 아니라 제이. 에프. 더블류. 맥오미, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 케미스트리, 플레넘 프레스, 뉴욕, 엔와이(1973)에서도 발견될 것이다.
예를 들어, 일반식(I)의 폴리펩티드는 WO 00/47623에서 개시된 방법에 의하여 제조될 수 있고, 반면에 일반식(II)의 폴리펩티드는 워링 에이제이가 펩티드 리서치 저널 2005, 66, 364-374에서 보고된 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 발명은 약제학적으로 허용된 일반식(I) 과 (II)의 폴리펩티드의 염 그리고 N 및/또는 C말단이, 예를 들어 아세틸화 그리고 아미드화에 의하여, 보호된 유도체를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들어 염산, 아세트산 그리고 삼불화아세트산의 염을 포함한다.
본 발명의 재구성된 계면활성제는 용액 또는 일반식(I)과 (II)의 폴리펩티드 그리고 지질의 현탁액을 혼합하고 순차적으로 상기 혼합물을 건조함으로써 제조될 수 있으며, 다른 방법으로는 감압동결건조(lyophilisation) 또는 분사-건조(spray-drying)에 의하여 제조될 수 있다.
바람직하게도, 일반식(I)의 폴리펩티드 및 일반식(II)의 폴리펩티드는 본 발명의 재구성된 계면활성제에서 고정된 조합으로서 일정한 양과 정량적인 비로 존재한다.
재구성된 계면활성제에 대한 일반식(I)과 (II)의 폴리펩티드의 상대적 비율은 여러 가지이다. 유리하게도 각각의 폴리펩티드는 0.5와 10% 사이에서, 바람직하게는 1과 5% 사이에서, 더욱 바람직하게는 1과 3% 사이에서 계면활성제의 무게에 기초하여(w/w) 이루어진 양으로 존재할 수 있다.
바람직한 일실시 예에서, 재구성된 계면활성제는 바람직하게는 산화된 형태에서 폴리펩티드(If)의 무게로 1에서 3%까지, 폴리펩티드(IIa)의 무게로 1에서 3%까지 포함한다.
또 다른 바람직한 일실시 예에서, 재구성된 계면활성제는 바람직하게는 산화된 형태에서 폴리펩티드(If)의 무게로 1에서 3%까지, 폴리펩티드(IIc)의 무게로 1에서 3%까지 포함한다.
유리하게도, 지질 운반체는 천연의 허파의 계면활성 조제, 예를 들어 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC)과 같은 포스파티딜콜린(PC) 그리고 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG) 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG)과 같은 포스파티딜글리세롤(PG)에 포함되는 인지질로 구성된다.
유리하게 사용될 수 있는 다른 인지질은 포스패티딜이노시톨(Pl), 포스패티딜에탄올아민(PE), 포스패티딜세린 그리고 스핑고미엘린(SM)이다.
특별한 일실시예에서, 지질 운반체는 추가 구성요소, 예를 들어 트리아실글리세롤, 자유 지방산과 같은 중성지질 및/또는 콜레스테롤을 포함한다.
유리하게도 본 발명에 따른 재구성된 계면활성제는 지질 운반체의 무게로 90에서 99%까지, 바람직하게는 92에서 98%까지, 더욱 바람직하게는 94에서 96%까지를 포함하고, 두 개의 펩티드의 총합의 무게로 1에서 10%까지, 바람직하게는 2에서 8%까지, 더욱 바람직하게는 4에서 6%까지를 포함한다.
본 발명의 일실시 예들 중의 하나에서 재구성된 계면활성제는 지질 운반체의 무게로 96%, 일반식(I)의 폴리펩티드의 무게로 2% 그리고 일반식(II)의 폴리펩티드의 무게로 2%를 포함한다.
특별한 일실시 예에서 운반된 지질은 인지질 더욱 바람직하게는 DPPC 및 POPG로부터 무게 비율로 95:5에서 50:50까지, 바람직하게는 80:20에서 60:40까지 선택된 팔미토일올레일포스포리피드의 혼합물 또는 POPC의 혼합물로 이루어진다.
DPPC와 POPG의 무게 비율은 75:25에서 65:35까지의 범위이고, 더욱 바람직하게는 68:31이다. DPPC:POPG:POPC의 혼합물의 경우에 인지질은 60:20:20 또는 68:15:16의 무게 비율로 바람직하게 사용된다.
또 다른 일실시 예에서, 지질 운반체는 DPPC, DPPG 그리고 콜레스테롤으로 구성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시 예에서, 재구성된 계면활성제는 일반식(Ia)의 폴리펩티드 중의 하나의 무게로 1에서 5%, 일반식(II)의 폴리펩티드 중의 하나의 무게로 1에서 5% 그리고 68:31의 무게 비율로 혼합된 DPPC 및 POPG의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 재구성된 계면활성제의 투여는 관련 분야에서 숙련된 자에게 알려진 방식으로, 바람직하게는 경기관지투여(주입 또는 볼루스)에 의하여 또는 분무에 의하여 수행되었다.
본 발명은 본 발명의 재구성된 계면활성제를 포함하는 약제학적 성분에도 관련된다. 상기 성분은 용액, 분산, 현탁액 또는 건조 가루의 형태로 유리하게 투여될 수 있다. 바람직하게도 상기 성분은 재구성된 적당한 용매 또는 재현탁 매체에서 용해되거나 현탁되는 계면활성제를 포함한다.
바람직하게도 상기 약제학적인 성분은 단용(單用)의 유리병 속의 완충된 생리적 식염수에서 현탁액으로 제공될 수 있다. 유리하게도 재구성된 계면활성제 농도(인지질 함량으로 표현)는 대략 밀리리터당 2에서 160밀리그램의 계면활성제의 범위에 있고, 바람직하게는 10에서 100 mg/ml 사이, 더욱 바람직하게는 20에서 80 mg/ml 사이의 범위에 있다.
상기 성분은 칼슘, 마그네슘 및/또는 나트륨 염, 바람직하게는 염화 캄슘과 같은 전해질을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 성분은 미숙아의 호흡곤란증후군(RDS) 또는 계면활성제-결핍증 또는 성년의 RDS(ARDS)를 포함하는 기능장애, 태변흡인증후군(MAS), 그리고 기관지폐형성장애(BPD)의 예방 및/또는 치료를 위하여 적당하다.
그것들은 또한 폐렴, 기관지염, COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 천식, 그리고 낭포성 섬유증과 같은 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료뿐만이 아니라 장액성 중이염(아교 귀)의 치료를 위하여 유용하다.
다음의 예들은 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
도 1은 인간의 단백질 SP-C의 순서를 보여준다. 천연의 SP-C에서 시스테인 잔기는 팔미토일화된다.
도 2는 인간의 단백질 SP-B의 순서를 보여준다.
도 3는 폐 가스 용적(ml/kg)에 관한 결과를 보여준다.
도 4는 시간/압력의 함수로서 1회호흡량(ml/kg)에 관한 결과를 보여준다.
실시예 1 - 폴리펩티드 SP - C33 ( Leu )31와 SP - C33 의 합성 및 정제
폴리펩티드 SP-C33(Leu)31는 Fmoc 화학 및 연속적인 TFA-분할에 기초한 표준 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 방법에 의하여 제조되었다.
총 186.0 g의 정제되지 않은 SP-C33(Leu)31가 얻어졌다.
이중상 용매 시스템(biphasic solvent system)으로서 H2O/n-BuOH/AcOEt/AcOH 4:1:4:1를 사용하는 역류 분포(CCD)에 상기 물질을 거치게 함으로써 폴리펩티드는 정제되었다.
이러한 정제는 순도 60%이상으로 78.9 g의 SP-C33(Leu)31을 수득하였다.
최종 정제는 75분 동안에 25% B에서 100% B로 선형 구배(linear gradient)를 걸어주면서 50 x 300 mm의 강철 원기둥에서 PLRP-S를 고정상으로 사용하는 예비의 HPLC에 의하여 수행되었다. 이동상은 완충A = ACN/H2O 1:4 용매의 0.1% TFA 및 완충B = IPA 용매의 0.1% TFA로 이루어졌다.
정제된 폴리펩티드는 90% AcOH에 용해되었고, 감압동결건조 후, 초산염으로서 5.8 g (= 5.4%)의 최종 생성물을 제공하기 위하여 Dowex 이온 교환 수지(초산염 형)가 채워진 칼럼을 통과하였다.
폴리펩티드 SP-C33는 유사한 방법으로 제조되었다.
범례
ACN 아세토니트릴
AcOEt 에틸 아세테이트
AcOH 아세트산
Boc 티-부틸옥시카보닐
n-BuOH 엔-부탄올
Fmoc 9-플루오레닐메틸옥시카보닐
IPA 이소프로필 알코올
TFA 삼불화아세트산
실시예 2 - 폴리펩티드 ox Mini - B( Leu )와 ox - Mini -B의 합성 및 정제
폴리펩티드 ox-Mini-B(Leu)는 Fmoc 화학 및 연속적인 TFA-분할에 기초한 표준 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 방법에 의하여 제조되었다.
정제되지 않은 폴리펩티드는 TFA 시스템을 사용하는 예비의 HPLC에 의해 정제되었고 감압동결건조에 의하여 분리되었다.
정제된 펩티드의 공기 산화는 시스테인1 그리고 시스테인33 사이의 이황화 결합을 갖는 모노시클릭 연쇄를 생산했다. 상기 모노시클릭 펩티드는 TFA 시스템을 사용하는 예비의 HPLC에 의해 정제되었고 감압동결건조에 의하여 분리되었다.
Cys4 그리고 Cys27 사이의 두 번째의 이황화 결합은 요오드를 사용하여 형성되었다.
산화 후에, 상기 생성물은 TFA 시스템을 사용하는 예비의 HPLC에 의해 정제되었고 감압동결건조에 의하여 분리되었다. 1.12 g (= 1.7%)의 최종 생성물은 순도 89%이상으로 분리되었다.
폴리펩티드 ox Mini-B는 유사한 방법으로 제조되었다.
실시예 3 - ox Mini -B 및 SP - C33 에 기초한 재구성된 계면활성제의 생체 내 실험
계면활성 조제는 자궁적출에 의하여 얻은 잉태 기간이 27일인 미숙한 신생 토끼(premature newborn rabbit)에서 시험되었다. 실험은 호기말양압(PEEP)을 가하 지 않은 상태에서 수행되었다.
SP-C 유사체에서와 같이, 실시예 1에 따라 제조된 SP-C33로 칭해지는 폴리펩티드는 사용되었다.
단백질 SP-B의 유사체에서와 같이, 실시예 2에 따라 제조된 산화된 Mini-B (ox Mini-B)는 사용되었다.
상기 동물은 출생 시에, 지질 운반체로서, 중량비 68:31로 혼합된 DPPC:POPG 인지질 혼합물을 포함하는 재구성된 계면활성 조제로 처리되었다. 인지질은 중량 비로 2 또는 4% SPC-33, 2% ox Mini-B와 혼합되거나 2% SPC-33, 플러스2% ox Mini-B와 혼합되었다.
큐로서프®(Curosurf®)의 동일한 양을 수용한 동물은 양성 대조 표준으로서 제공되었고 처리되지 않은 한배 새끼(littermate)는 음성 대조 표준으로 제공되었다.
모든 계면활성 조제는 80 mg/ml의 농도 및 2.5 ml/kg의 표준 복용량으로 투여되었다.
미숙한 신생 토끼는 최고 흡입 압력의 표준화된 순서와 병행하여 환기되었다. 허파를 개방시키기 위해, 압력은 최초로 1분 동안 35 cm H2O로 설정되었다. 이러한 보충 조작 후에, 압력은 15분 동안 25 cm H2O로 낮춰지고 계속해서 20 그리고 15 cm H2O로 낮춰졌다. 최종적으로, 압력은 다시 25 cm H2O로 5분 동안 올려졌고, 이후에 허파는 추가 5분 동안 질소로 환기되고 나서 기체 용적 측정을 위하여 절제 되었다.
ml/kg로 표현되는 폐 가스 용적 및 1회호흡량은 양쪽 모두 측정되었고 중간값으로 주어진 결과는 도 3 및 도 4에 각각 보고되고 있다.
도 3으로부터 중량비 2%의 ox Mini-B를 포함하는 재구성된 계면활성 조제로 처리된 동물이 중량비 2%의 SP-C33(약 2 ml/kg 대 4 ml/kg)가 수용된 동물보다 더 낮은 폐 가스 용적을 갖는다는 것은 이해될 수 있다.
중량비 2%의 ox Mini-B를 SP-C33 계면활성제로의 첨가는 각 펩티드가 혼자인 것(8 ml/kg 대비 약 6 ml/kg)보다 폐 가스 용적에 있어서 현저한 증가를 발생시켰다.
도 4에서 도시된 바와 같이, 1회호흡량에 대해서도 유사한 경향은 관찰되었고, 조합된 펩티드의 투여 후에 Curosurf®의 투여 후에 얻어지는 것에 상당하거나 또는 약간 더 양호한 개선이 발견되었다.
중량 비로 2에서 4%로의 SP-C33함량의 증가가 폐 가스 용적을 증가시키지 않는다는 것은 또한 발견되었으며, 이는 날숨의 끝에서 폐포의 인지질 막의 안정화 효과는 ox Mini-B의 첨가에 기인한다는 것을 나타내고 있다.
상술한 결과는 본 발명의 재구성된 계면활성제는 단백질 SP-C의 유사체만으로 이루어지거나 단백질 SP-B의 유사체만으로 이루어진 것보다 더 우수한 방식으로 날숨의 끝에서 폐포의 인지질 막을 안정화시킬 수 있다는 사실을 설명한다.
게다가, 청구된 재구성된 계면활성 조제는 개조된 천연의 계면활성제의 투여 후에 얻어지는 것에 상당하거나 약간 더 양호한 정도로 1회호흡량으로 표현되는 호흡 기능을 개선하는 것으로 드러났다.
본 발명에 따른 약제학적 성분은 미숙아의 호흡곤란증후군(RDS) 또는 계면활성제-결핍증 또는 성년의 RDS(ARDS)를 포함하는 기능장애, 태변흡인증후군(MAS), 그리고 기관지폐형성장애(BPD)의 예방 및/또는 치료를 위하여 적당하다.
그것들은 또한 폐렴, 기관지염, COPD(만성 폐쇄성 폐질환), 천식, 그리고 낭포성 섬유증과 같은 다른 호흡기 질환의 예방 및/또는 치료뿐만이 아니라 장액성 중이염(아교 귀)의 치료를 위하여 유용하다.
<110> CHIESI FARMACEUTICI S.P.A. <120> RECONSTITUTED SURFACTANTS HAVING IMPROVED PROPERTIES <130> 2012-11 <150> EP 06021521.7 <151> 2006-10-13 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> polypeptide analogue of the SP-C protein <400> 1 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Met Gly 20 25 30 Leu <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> polypeptide analogue of the SP-C protein <400> 2 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Ile Gly 20 25 30 Leu <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> polypeptide analogue of the SP-C protein <400> 3 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Leu Gly 20 25 30 Leu <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> polypeptide analogue of the SP-C protein <400> 4 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Leu Gly 20 25 30 Leu <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> polypeptide analogue of the SP-C protein <400> 5 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> SP-B analogue <400> 6 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> SP-B analogue <400> 7 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Met Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Met Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> SP-B analogue <400> 8 Cys Trp Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> SP-B analogue <400> 9 Cys Leu Leu Cys Arg Ala Leu Ile Lys Arg Ile Gln Ala Leu Ile Pro 1 5 10 15 Lys Gly Gly Arg Leu Leu Pro Gln Leu Val Cys Arg Leu Val Leu Arg 20 25 30 Cys Ser

Claims (21)

  1. i) 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG)의 혼합물;
    ii) 하기 일반식(Ic)로 표현되는 서열을 갖는 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩티드 유사체:
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLΩpGpLp (Ic)
    여기에서,
    Ω는 메티오닌 또는 황이 산화된 메티오닌, 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    p는 0 또는 1의 값을 갖는 정수; 및
    iii) 하기 일반식(II)로 표현되는 서열을 갖는 천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩티드 유사체:
    CΔLCRALIKRIQAΩIPKGGRΩLPQLVCRLVLRCSf (II)
    여기에서,
    Δ 는 트립토판 그리고 류신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    Ω는 메티오닌, 이소류신, 류신 그리고 노-류신으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기이고; 및
    f 는 0 또는 1의 값을 갖는 정수이고,
    상기 식(II)의 폴리펩티드는,
    분자내 이황화 결합이 1번과 33번 위치의 두 개의 시스테인 잔기 사이,
    또는 4번과 27번 위치의 두 개의 시스테인 잔기 사이,
    또는 1번과 33번 위치의 두 개의 시스테인 잔기 사이와 4번과 27번 위치의 두 개의 시스테인 잔기 사이에 있는 이황화 결합된 분자의 형태로 존재하는 것을 포함하는 재구성된 계면활성제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 천연 계면활성 단백질 SP-C의 유사체 및 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체는 고정된 조합으로 존재하는 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 천연 계면활성 단백질 SP-B의 유사체는 하기 화학식(IIa)에 의하여 표현되는 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제
    CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS (IIa).
  4. 제1항에 있어서, 상기 천연 계면활성 단백질 SP-C의 유사체는 하기 화학식으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제:
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (Id)
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLIGL (Ie)
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (If)
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLnLGL (Ig)
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALL (Ih)
  5. 제1항에 있어서, 상기 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩티드 유사체는
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (If) 이고
    상기 천연 계면활성 단백질 SP- B의 폴리펩티드 유사체는
    CWLCRALIKRIQAMIPKGGRMLPQLVCRLVLRCS(IIa)인 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 천연 계면활성 단백질 SP-C의 폴리펩티드 유사체는
    IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (If)이고
    상기 천연 계면활성 단백질 SP-B의 폴리펩티드 유사체는
    CWLCRALIKRIQALIPKGGRLLPQLVCRLVLRCS (IIc)인 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG)는 68:31의 중량비인 것을 특징으로 하는 재구성된 계면활성제.
  8. 제1항에 따른 재구성된 계면활성제를 포함하는, 미숙아 또는 성년의 호흡곤란증후군(RDS), 태변흡인증후군(MAS), 기관지폐형성장애(BPD), 폐렴, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 천식, 낭포성 섬유증 또는 장액성 중이염(아교 귀)의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 용액, 분산, 현탁액 또는 건조 가루의 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 수성 현탁액의 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 2 그리고 160 mg/ml 사이로 이루어진 농도의 상기 재구성된 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 재구성된 계면활성제의 농도는 20 그리고 80 mg/ml 사이로 이루어진 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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