EA015802B1

EA015802B1 - Реконструированные сурфактанты, обладающие улучшенными свойствами

Info

Publication number: EA015802B1
Application number: EA200900373A
Authority: EA
Inventors: Ян Йоханссон; Торе Курстедт; Бенгт Робертсон
Original assignee: КЬЕЗИ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.п.А.
Priority date: 2006-10-13
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2011-12-30
Also published as: US20100004173A1; JP2010505937A; UA94477C2; KR101328851B1; AU2007306075A1; US20130079275A1; JP2013241449A; MEP12109A; KR20090083892A; US8183210B2; NZ576189A; CL2007002931A1; MY148127A; CN103169947B; CO6400235A2; CY1114716T1; HK1134497A1; GEP20125531B; ES2438727T3; BRPI0715317B1

Abstract

Настоящее изобретение относится к восстановленному сурфактанту, содержащему липидный носитель, полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-C и полипептидный аналог нативного сурфактантного белка SP-B. Изобретение также относится к его фармацевтическим композициям и его применению для лечения или профилактики RDS (респираторного дистресс-синдрома) и других респираторных расстройств.

Description

Настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему липидный носитель и комбинацию конкретного полипептидного аналога нативного сурфактантного белка 8Р-С с конкретным полипептидным аналогом нативного сурфактантного белка 8Р-В.

Изобретение также относится к его фармацевтическим композициям и его применению для лечения или профилактики КЭ8 (респираторного дистресс-синдрома) и других респираторных расстройств.

Предшествующий уровень техники

Легкое человека составлено из большого количества маленьких воздушных мешочков, называемых альвеолами, в которых происходит газообмен между кровью и воздушными пространствами лёгких. У здоровых субъектов этот обмен опосредован наличием комплекса протеинсодержащего сурфактанта, который предохраняет лёгкие от коллапса в конце выдоха.

Комплекс лёгочного сурфактанта состоит, прежде всего, из липида и содержит незначительные количества различных белков. Отсутствие достаточных уровней этого комплекса приводит к нарушению функции лёгкого. Этот синдром называют респираторным дистресс-синдромом (КИ8), и он обычно поражает недоношенных детей.

Указанный синдром эффективно лечат модифицированными природными сурфактантными препаратами, извлекаемыми из лёгких животных.

Имеющиеся в продаже модифицированные сурфактантные препараты представляют собой, например, СитокитЕ, получаемый из лёгкого свиньи, 1пЕакигЕ, извлекаемый после лаважа лёгкого телёнка, и 8итуап1а. химически модифицированный природный экстракт бычьего лёгкого.

Основными составляющими этих сурфактантных препаратов являются фосфолипиды, такие как 1,2-дипальмитоил-кп-глицеро-3-фосфохолин, обычно известный как дипальмитоилфосфатидилхолин (ЭРРС), фосфатидилглицерин (РО) и сурфактантные гидрофобные белки В и С (8Р-В и 8Р-С).

Вследствие недостатков сурфактантных препаратов, получаемых из тканей животных, таких как сложность процессов производства и стерилизации и возможная индукция иммунных реакций, были созданы синтетические сурфактанты, имитирующие композицию модифицированных природных сурфактантов. Указанные синтетические сурфактанты известны как реконструированные сурфактанты.

Однако оказалось, что разработка клинически активных, реконструированных сурфактантов является сложной задачей, так как нативные гидрофобные белки являются слишком большими для синтеза, сложными по структуре и нестабильными в чистом виде.

Известно, что для замены указанных нативных гидрофобных белков были предложены некоторые синтетические полипептиды, частично отвечающие последовательностям нативных белков, и их аналоги, и они раскрыты, например, в νθ 89/06657, νθ 92/22315, νθ 98/49191, νθ 95/32992, И8 6660833, ЕР 413957 и νθ 91/18015.

В \νϋ 00/47623 раскрыты синтетические полипептиды, являющиеся аналогами нативного белка 8РС, в которых: 1) цистеиновые остатки в положениях 5 и 6 заменены остатками 8ет; 2) остатки Уа1 в центральной области 8Р-С замещены другими нейтральными и гидрофобными остатками, выбранными из группы, состоящей из Ьеи, 11е и норлейцина (пЬ); 3) некоторые нейтральные аминокислоты, присутствующие в центральной области 8Р-С, заменены объёмными или полярными остатками, выбранными из группы, состоящей из Ьук, Тгу, РЕе, Туг и орнитина.

Указанные искусственные полипептиды характеризуются тем, что они способны сгибаться, подобно нативному белку 8Р-С, и поэтому должным образом взаимодействовать с липидами сурфактанта, и не инициируют автоолигомеризацию.

В νθ 00/76535 описаны в общем виде препараты лёгочного сурфактанта, содержащие по меньшей мере одну модификацию 8Р-В в комбинации по меньшей мере с одной модификацией белка 8Р-С.

ναππβ АЛ. е! а1. (реферат представлен на ежегодном собрании Педиатрического академического абщества в Сан-Франциско 29 апреля - 2 мая 2006 г.) сообщают, что было предпринято исследование с целью изучения активности синтетического сурфактанта, составленного из 8Р-С-мимического 8Р-СЕЕ, представляющего собой синтетический 8Р-С с 34 остатками с фенилаланином вместо цистеина в положениях 4 и 5, и 8Р-В-мимического Μίηί-В.

Однако согласно доступной литературной информации в опытах на животных лечение реконструированными сурфактантами приводит к недостаточным объёмам газа в лёгких и недостаточному раскрытию альвеол в конце выдоха, и для достижения активности ίη νίνο, сравнимой с активностью, достигаемой с модифицированными природными сурфактантами, требуется вентиляция с положительным давлением в конце выдоха (РЕЕР) (ЕоЕапккоп 1. е! а1., 1. Арр1. РЕукю1. 2003, 95, 2055-2063; Όανίκ АЛ. е! а1., Ат 1 Ксери СгЕ Саге Меб 1998; 157, 553-559). Доступные препараты реконструированного сурфактанта действительно не способны к образованию стабильной фосфолипидной плёнки в альвеолах в конце выдоха.

Во всех документах, упомянутых выше, отсутствует информация о проблеме раскрытого состояния альвеол в конце выдоха и об эффекте препаратов, раскрытых в них.

Поэтому до сих пор существует неудовлетворённая потребность в реконструированном сурфактанте с улучшенными свойствами, исходя из растяжимости лёгких.

В частности, существует потребность в препарате реконструированного сурфактанта, способном гарантировать альвеолярную стабильность и, следовательно, поддерживать раскрытое состояние альвеол

- 1 015802 в конце выдоха без необходимости применения вентиляции с РЕЕР.

К настоящему времени установлено, и это является целью настоящего изобретения, что конкретные аналоги нативного белка 8Р-С и предпочтительно полипептиды из XVО 00/47623 могут быть успешно объединены с конкретными аналогами нативного белка 8Р-В для обеспечения препарата реконструированного сурфактанта с улучшенными свойствами, исходя из растяжимости лёгких и, в частности, способности эффективного поддержания раскрытого состояния альвеол в конце выдоха без необходимости применения вентиляции с РЕЕР.

В частности, на модели ΒΌ8, когда недоношенных новорожденных лечили препаратами экзогенного сурфактанта без приложения РЕЕР, было обнаружено, что комбинация конкретных аналогов белков 8Р-С и 8Р-В влияет на объёмы газа в лёгких, являющиеся показателем раскрытого состояния альвеол в конце выдоха.

Краткое изложение сущности изобретения

В частности, изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему:

а) липидный носитель;

б) полипептид, содержащий по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и не более чем 40 аминокислотных остатков, имеющий последовательность, представленную общей формулой (I)

Е_вО_е1АЗ_д8РУНЬККХ_аВХ_ь(ВХ_с)_пСАЩОр(Зр1р (I), где X представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из I, Ь и иЬ;

В представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из К, В, Η, V, Е, Υ и От;

возможно замещен ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, предпочтительно 16 атомов углерода, связанных с боковой цепью посредством сложноэфирной связи;

Ω представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из М или М, окисленного по атому серы, I, Ь и пЬ;

а является целым числом, имеющим значение от 1 до 8;

Ь является целым числом, имеющим значение от 1 до 19;

с является целым числом, имеющим значение, независимо выбранное из 3-8;

е, £, д и р являются целыми числами, имеющими значение 0 или 1;

п является целым числом, имеющим значение от 0 до 3; и при условии, что Х_аВХ_Ь(ВХ_с)_п представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты;

в) полипептид, представленный общей формулой (II)

С(Л1СВДЫКНЮА01РК6С1^:Ю1_Р01_\/СР1_\/1ФС5£ (II), где Δ представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и Ь;

Ω представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из М, I, Ь и пЬ;

Φ представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из В и Т; предпочтительно В; и £ является целым числом, имеющим значение 0 или 1.

Изобретение также включает фармацевтически приемлемые соли указанных полипептидов и их блокированные по Ν- и/или С-концу производные, например, путём ацетилирования и амидирования.

Изобретение также относится к его фармацевтическим композициям и их применению для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (ΒΌ8) и других респираторных расстройств.

Кроме того, изобретение относится к применению полипептидов общей формулы (II) для приготовления реконструированного сурфактанта для улучшения раскрытого состояния альвеол в конце выдоха.

Наконец, согласно изобретению предложен способ профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (ΒΌ8) и других респираторных расстройств, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества реконструированного сурфактанта, содержащего липидный носитель, полипептид общей формулы (I) и полипептид общей формулы (II).

Перечень чертежей

На фиг. 1 показана последовательность белка человека 8Р-С. В нативном 8Р-С Сук-остатки пальмитоилированы;

на фиг. 2 - последовательность белка человека 8Р-В;

на фиг. 3 - результаты, выраженные в виде объёмов газа в лёгких (мл/кг);

на фиг. 4 - результаты, выраженные в виде дыхательных объёмов (мл/кг) как функции от времени/давления.

- 2 015802

Определения

Наблюдение за респираторной функцией после лечения ίη νίνο экзогенными препаратами сурфактанта осуществляют путём измерения двух параметров:

1) дыхательного объёма, являющегося показателем растяжимости лёгких, и

2) объёма газа в лёгких, являющегося показателем увеличения альвеолярного воздуха или раскрытого состояния в конце выдоха и, следовательно, возможности образования стабильной фосфолипидной плёнки в альвеолах в конце выдоха.

В настоящей заявке термин реконструированный сурфактант означает липидный носитель, к которому добавлены полипептидные аналоги белков сурфактанта, приготовленные по рекомбинантной технологии или синтетическими способами.

Термин липидный носитель означает смесь фосфолипидов и, возможно, дополнительные липидные компоненты, например нейтральные липиды, такие как триацилглицерины, свободные жирные кислоты и/или холестерин.

Термин полипептидные аналоги нативного сурфактантного белка 8Р-С включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, в которой по сравнению с нативными белками одна или более аминокислот отсутствуют или заменены другими аминокислотами, при условии, что полипептиды в смеси с липидным носителем проявляют активность лёгочного сурфактанта.

Термин полипептидные аналоги нативного сурфактантного белка 8Р-В включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, в которой по сравнению с нативными белками одна или более аминокислот отсутствуют, при условии, что полипептиды в смеси с липидным носителем проявляют активность лёгочного сурфактанта.

Термин щ1ш-В означает полипептид с 34 остатками на основе 8-25 Ν-концевых остатков и 63-78 С-концевых остатков нативного белка 8Р-В, чья структура впервые в общих чертах была раскрыта в презентации на веб-сайте СаШОгша Nаηο8уκΐетκ ИъШШе. Впоследствии его полная последовательность была раскрыта в К.С8В Рго(еш Эа(а Вапк.

Дополнительная информация о его структуре и активности представлена в ХУаппд ЛЭ. е( а1. ί. РерДбе Век 2005, 66, 364-374.

Термин варианты означает полипептидные аналоги пептида Μίηί-В, имеющие аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот заменены другими аминокислотами, при условии, что пептиды в смеси с липидным носителем сохраняют активность Μίηί-В.

Аминокислотные последовательности изображены с использованием трёхбуквенного кода, причём аминокислота со свободной аминогруппой расположена в левом конце (аминный конец), а аминокислота со свободной карбоксильной группой расположена в правом конце (карбоксильный конец).

Термин синергический означает, что эффективность двух полипептидов превышает ту, которую можно было бы ожидать в данном исследовании путем суммирования их соответствующих индивидуальных эффективностей.

Все аминокислотные остатки, идентифицированные в данном описании изобретения, находятся в природной Ь-конфигурации, а последовательности, идентифицированные в данном описании изобретения, представлены в соответствии со стандартными сокращениями аминокислотных остатков, как показано в следующей ниже таблице соответствия.

Таблица соответствия

Аминокислота СИМВОЛ

	Однобуквенный	Трёхбуквенный
Глицин	О	<31у
(.-пролин	Р	Рго
ί-изолейцин	1	Не
(.-лейцин	ί	Ьеи
1.-тирозин	Υ	Туг
1-цистеин	С	Суэ
ί-триптофан	νν	Тгр
ί-аланин	А	А1а
ί-лизин	К	1уз

- 3 015802

Б-аргинин	Н	Агд
Б-глутамин	а	О1ц
Б-метионин	м	Ме!
Б-серин	3	5ег
Б-валин	V	Уа1
Б-аспарагин	N	Αδη
Б-аспарагиновая кислота	ϋ	Аер
Б-глутаминовая кислота	Е	С1п
Б-гистидин	Н	ΗΪ3
Б-треонин	т	ТНг
Б-фенилаланин	Е	РНе
Б-норлейцин	-	пБеи
Б-орнитин	-	Огп

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к реконструированному сурфактанту, содержащему липидный носитель и комбинацию конкретных полипептидных аналогов нативного сурфактантного белка 8Р-С с конкретными полипептидными аналогами нативного сурфактантного белка 8Р-В, включая пептид т1ш-В и его варианты.

На модели КН8, когда недоношенных новорожденных лечили препаратами экзогенного сурфактанта без приложения РЕЕР, авторами изобретения действительно было обнаружено, что комбинация полипептида общей формулы (I) с полипептидом общей формулы (II) положительно влияет на растяжимость лёгких.

В частности, было обнаружено, что комбинация двух полипептидов синергически влияет на объёмы газа в лёгких, являющиеся показателем раскрытого состояния альвеол в конце выдоха.

Указанный результат свидетельствует о том, что реконструированный сурфактант по изобретению способен стабилизировать в альвеолах фосфолипидную плёнку в конце выдоха лучше, чем реконструированный сурфактант, содержащий только аналог белка 8Р-С или аналог белка 8Р-В.

Более того, оказалось, что препарат заявленного реконструированного сурфактанта улучшает респираторную функцию, выраженную посредством дыхательных объёмов, в степени, сопоставимой или даже немного лучшей, чем улучшение, достигаемое после введения модифицированного природного сурфактанта.

Преимущественно аналог нативного белка 8Р-С представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и не более чем 40 аминокислотных остатков, имеющий последовательность, представленную общей формулой (I)

Е_ее_в1гРг8дЗРУНЬККХ_аВХ_ь(ВХ_с)_пСАИО_рС_р1_р (I), где X представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из I, Ь и иЬ;

В представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из К, В, Η, №, Е, Υ и Огп;

п является целым числом, имеющим значение от 0 до 3; и при условии, что Х_аВХ_Ь(ВХ_с)_п представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты, предпочтительно содержащую от 10 до 22 аминокислот.

Предпочтительно полипептид общей формулы (I) состоит по меньшей мере из 30 и не более чем 35 аминокислот, более предпочтительно из не более чем 33 аминокислот.

В конкретных воплощениях полипептиды общей формулы (I) состоят из 30, или 33, или 35 аминокислот.

Предпочтительно полипептидный аналог белка 8Р-С представлен общей формулой Па), в которой е и п равны 0, а д равен 1

ЬРгВЗРУНкККХаВХьОАНОрОркр (1а),

- 4 015802 где X, В и Ω являются такими, как определено выше;

а находится в диапазоне от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно равен 1; Ь находится в диапазоне от 1 до 19, предпочтительно от 5 до 15; более предпочтительно равен 14;

£ и р равны 0 или 1.

Более предпочтительно полипептидный аналог белка 8Р-С представлен общей формулой (1Ь), в которой £ равен 1

1Р38Р\/Н1ККХаВХь6АЫ0рСр1_р (1Ь), где X, В, Ω, а и Ь являются такими, как определено выше; р равен 0 или 1.

Еще более предпочтительно полипептидный аналог белка 8Р-С представлен общей формулой (1с)

1Р88РУНкКРкКкккккккк]ккк)кСАккО_рСркр (1с), где Ω является таким, как определено выше; р равен 0 или 1.

Ниже приведены примеры полипептидов формулы (1с)

I Р88РУНкКРкКкккккккк1ккк1 кОАШУКЭк

1Р38РУН£ККБКШШШ1-ШиЗАШ<31

1РЗЗРУНкКВкКкккккккк1ккк1к6АкккОк

1Р38РУНкКЕкКкккккккк1ккк1кСАккпк6к

1РЗЗРУНкККкКкккккккк1ккк1к(ЗАкк (16) (8ΕΩ Ю:1), (1е) (3ΕΩ Ю:2), (Ιί) (8ΕΩ Ю:3), (1д) (ЗЕО Ю:4), (1Й) (ЗЕО Ю:5).

В документах предшествующего уровня техники полипептид (16) также назван как 8Р-С33.

Более предпочтительно аналог 8Р-С представляет собой полипептид, выбранный из группы полипептидов, имеющих формулы (1е), (1£), (1д) и (II).

В предпочтительном воплощении изобретения полипептид общей формулы (I) представляет собой полипептид (Ι£), ниже называемый как 8Р-С33(Ьеи)³¹.

Аналог нативного белка 8Р-В преимущественно состоит из двух частей, соответствующих 8-25 Νконцевым остаткам и 63-78 С-концевым остаткам нативного белка 8Р-В (называемый как пептид ιηίπί-В) или его варианта.

Более предпочтительно аналог нативного белка 8Р-В является полипептидом, представленным следующей ниже общей формулой (II):

ΟτΔίΟΡΑΙΙΚΡίαΑΩΙΡΚΟΟΡΩΙΡαΐνΟΡίνίΦΟδί (II), где Δ представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V и Ь;

Ω представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из М, I, Ь и иЬ;

Φ представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из В и Т, предпочтительно В; и £ является целым числом, имеющим значение 0 или 1.

В конкретном воплощении изобретения аналог 8Р-В является полипептидом, представленным формулой (Па)

СУУкСЕАк1КЕ1ОАМ1РКСЗСНМкРС1кУСНкУкНС8 (На) (8ΕΩЮ:6).

В других воплощениях изобретения аналог 8Р-В выбран из аналогов, имеющих следующие формулы:

СккСЕАк1КЕ1ОАМ1РКО6НМкРакУСЕкУкВС8 (ПЬ) (8ΕΩЮ:7),

С\Л/кСВАк1КЕЮАк1РК66ЕккРакУСЕкУкЕС8 (Пс) (8ΕΩЮ:8),

СИСНАИКНЮАЫРКеСЕЫРОкУСРЬУкНСЗ (ΙΙά) (5ΕΩЮ:9).

В предпочтительном воплощении полипептиды (Па), (ПЬ), (Пс) и (Пб) могут находиться в форме дисульфидсвязанной молекулы, в которой внутримолекулярная дисульфидная связь образована между двумя остатками Сук в положениях 1 и 33 и/или между двумя остатками Сук в положениях 4 и 27.

В документах уровня техники дисульфидсвязанный полипептид (Па) назван как окисленный Μίηί-В (ох Μίηί-В).

Полипептид (Пс) ниже назван как М1ш-В(Ееи), а его дисульфидсвязанная форма как ох М1ш-В(Ееи).

Полипептиды общей формулы (I) и (II) могут быть приготовлены синтетическими способами или по рекомбинантным технологиям, которые хорошо известны специалистам в данной области техники.

Превосходное краткое изложение многих доступных технологий можно найти в ЕМ. 81е\\'агб апб ΕΌ. Уоипд. 8о11б Р1аке РерНбе 8упШек1к, ν.Η. Ргеетап Со., 8ап Егапсйсо, 1969, и Б. МеБепЪоГег, Ногтопа1 Рго1етк апб Рер11бек, Уо1. 2, р. 46, Асабетю Ргекк (Νον Уогк), 1983 (для твердофазного пептидного синтеза) и в Е. 8скгобег апб К. КиЬке, Т1е Рер11бек, Уо1. 1, Лсабетю Ргекк (№\ν Уогк), 1965 (для классического синтеза в растворе). Полипептиды по изобретению также могут быть приготовлены с использованием технологии твердофазного синтеза, первоначально описанной Метйе1б в Б. Ат. С1ет. 8ос. 85: 2149-2154 (1963). Другие технологии полипептидного синтеза можно найти, например, в М. Вобапкхку е! а1., Рер11бе 8упИек1к, БоЬп νίΒν & 8опк, 2б Еб., (1976), а также в других справочниках, извест

- 5 015802 ных специалистам в данной области техники.

В указанных выше текстах, а также в 1Ε\ν. МсОш1е, РгсИссОус Сгоирк ίη Отдашс Сйеш18йу, Р1епит Ргекк, Νο\ν Уотк, ΝΥ (1973) будут найдены подходящие защитные группы для применения в таких синтезах.

Например, полипептиды общей формулы (I) могут быть приготовлены способом, раскрытым в \УО 00/47623, тогда как полипептиды общей формулы (II) могут быть приготовлены способом, который указан ХУагшр ЛЭ. е! а1. в 1. Рерйбе Век 2005, 66, 364-374.

Изобретение также включает фармацевтически приемлемые соли полипептидов общих формул (I) и (II) и их блокированные по Ν- и/или С-концу производные, например, путём ацетилирования и амидирования.

Фармацевтически приемлемые соли включают, например, соли хлористо-водородной кислоты, уксусной кислоты и трифторуксусной кислоты.

Реконструированный сурфактант по изобретению может быть получен путём смешивания раствора или суспензии полипептидов общей формулы (I) и (II) и липидов с последующей сушкой смеси; иначе они могут быть получены путём лиофилизации или распылительной сушки.

Предпочтительно полипептиды общей формулы (I) и полипептиды общей формулы (II) присутствуют в реконструированных сурфактантах по изобретению в фиксированном количестве и количественном отношении в виде фиксированной комбинации.

Доля полипептидов общих формул (I) и (II) по отношению к реконструированному сурфактанту может варьироваться. Преимущественно каждый полипептид может присутствовать в количестве, находящемся между 0,5 и 10%, исходя из массы сурфактанта (мас./мас.), предпочтительно между 1 и 5%, наиболее предпочтительно между 1 и 3%.

В предпочтительном воплощении реконструированный сурфактант содержит от 1 до 3 мас.% полипептида (II), от 1 до 3 мас.% полипептида (Па) предпочтительно в окисленной форме.

В другом предпочтительном воплощении реконструированный сурфактант содержит от 1 до 3 мас.% полипептида (II), от 1 до 3 мас.% полипептида (Пс) предпочтительно в окисленной форме.

Липидный носитель преимущественно содержит фосфолипиды, которые имеются в природных лёгочных сурфактантных препаратах, например фосфатидилхолины (РС), такие как дипальмитоилфосфатидилхолин (ИРРС) и пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), и фосфатидилглицерины (РС), такие как пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (РОРС) и дипальмитоилфосфатидилглицерин (ИРРС).

Другие фосфолипиды, которые можно преимущественно применять, представляют собой фосфатидилинозиты (И), фосфатидилэтаноламины (РЕ), фосфатидилсерины и сфингомиелины (8М).

В конкретном воплощении липидный носитель может содержать дополнительные компоненты, например нейтральные липиды, такие как триацилглицерины, свободные жирные кислоты и/или холестерин.

Реконструированный сурфактант по изобретению преимущественно содержит 90-99 мас.% липидного носителя, предпочтительно 92-98%, более предпочтительно 94-96%, и оба пептида в суммарном количестве 1-10 мас.%, предпочтительно 2-8%, более предпочтительно 4-6%.

В одном из воплощений изобретения реконструированный сурфактант содержит 96 мас.% липидного носителя, 2 мас.% полипептида общей формулы (I) и 2 мас.% полипептида общей формулы (II).

В конкретном воплощении липидный носитель состоит только из фосфолипидов, более предпочтительно из смеси ИРРС и пальмитоилолеилфосфолипида, выбранного из РОРС или его смеси с РОРС при массовых соотношениях в диапазоне от 95:5 до 50:50, предпочтительно от 80:20 до 60:40.

Массовое соотношение между ИРРС и РОРС предпочтительно колеблется в диапазоне от 75:25 до 65:35 и более предпочтительно составляет 68:31. В случае смесей ИРРС:РОРС:РОРС фосфолипиды предпочтительно применяют при массовых соотношениях 60:20:20 или 68:15:16.

В другом воплощении липидный носитель может состоять из ИРРС, ИРРС и холестерина.

В предпочтительном воплощении изобретения реконструированный сурфактант содержит от 1 до 5 мас.% одного из полипептидов общей формулы Да), от 1 до 5 мас.% одного из полипептидов общей формулы (II) и смесь ИРРС и РОРС при массовом соотношении 68:31.

Введение реконструированного сурфактанта по изобретению осуществляют способом, известным специалисту в данной области техники, предпочтительно путем интратрахеального вливания (инфузия или болюс) или путем распыления.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим реконструированный сурфактант по изобретению. Указанные композиции преимущественно вводят в виде раствора, дисперсии, суспензии или сухого порошка. Указанные композиции предпочтительно содержат реконструированный сурфактант, растворённый или суспендированный в подходящем растворителе или в среде для ресуспендирования.

Указанные фармацевтические композиции предпочтительно поставляют в виде суспензии в водном забуференном физиологическом растворе в одноразовых стеклянных пузырьках. Концентрация реконструированного сурфактанта (выраженная в виде содержания фосфолипида) преимущественно находится в диапазоне от примерно 2 до примерно 160 мг сурфактанта на 1 мл, предпочтительно между 10 и 100

- 6 015802 мг/мл, более предпочтительно между 20 и 80 мг/мл.

Кроме того, указанные композиции могут содержать электролиты, такие как кальциевые, магниевые и/или натриевые соли, предпочтительно хлорид кальция.

Фармацевтические композиции по изобретению являются пригодными для профилактики и/или лечения респираторного дистресс-синдрома (ΚΌ8) у недоношенных детей или других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, включая ΚΌ8 у взрослых (ΆΚΌ8), синдром аспирации мекония (МА8) и бронхолёгочную дисплазию (ΒΡΌ).

Также они могут быть полезны для профилактики и/или лечения других респираторных расстройств, таких как пневмония, бронхит, СОРЭ (хроническая обструктивная болезнь лёгких), астма и муковисцидоз, а также для лечения среднего серозного отита (экссудативного отита).

Следующие ниже примеры иллюстрируют изобретение более подробно.

Примеры

Пример 1. Синтез и очистка полипептидов 8Р-С33(Ьеи)³¹ и 8Р-С33.

Полипептид 8Р-С33(Ьеи)³¹ получали по стандартным методикам 8РР8 (твердофазный пептидный синтез), основанным на Етос-химии и последующих расщеплениях с использованием ТЕА.

Всего было получено 186,0 г сырого 8Р-С33(Ъеи)³¹.

Полипептид очищали, подвергая материал противоточному распределению (ССЭ) с использованием Н₂О/н-ВиОН/АсОЕ1/АсОН (4:1:4:1) в качестве двухфазной системы растворителей.

В результате этой очистки получали 78,9 г 8Р-С33(Ьеи)³¹ с чистотой более 60%.

Окончательную очистку осуществляли препаративной НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография) с использованием РЬКР-8 в качестве неподвижной фазы в стальной колонке 50x300 мм и линейного градиента от 25 до 100% В за 75 мин. Подвижная фаза состояла из буфера А: 0,1% ТЕА в АСЫ/Н₂О 1:4 и буфера В: 0,1% ТЕА в 1РА.

Очищенный полипептид растворяли в 90% АсОН и пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой Эоиех (ацетатная форма), что после лиофилизации привело к получению 5,8 г (5,4%) конечного продукта в виде ацетата.

Полипептид 8Р-С33 получали аналогичным образом.

Условные обозначения

АСЫ - ацетонитрил,

АсОЕ1 - этилацетат,

АсОН - уксусная кислота,

Вос - трет-бутилоксикарбонил, п-ВиОН - н-бутанол,

Етос - 9-флуоренилметилоксикарбонил,

1РА - изопропиловый спирт,

ТЕА - трифторуксусная кислота.

Пример 2. Синтез и очистка полипептидов ох М1ш-В(Ееи) и ох-Μίηί-Ε.

Полипептид ох-М1ш-В(Ееи) получали по стандартным методикам 8РР8 (твердофазный пептидный синтез), основанным на Етос-химии и последующих расщеплениях с использованием ТЕА.

Сырой полипептид очищали препаративной НРЬС с использованием ТЕА-системы и выделяли путём лиофилизации.

Окисление очищенного пептида воздухом привело к моноциклической последовательности с дисульфидной связью между Сук¹ и Сук³³. Моноциклический пептид очищали препаративной НРЬС с использованием ТЕА-системы и выделяли путём лиофилизации.

Второй дисульфидный мостик между Сук⁴ и Сук²⁷ формировали с использованием йода.

После окисления продукт очищали препаративной НРЬС с использованием ТЕА-системы и выделяли путём лиофилизации. Было выделено 1,12 г (1,7%) конечного соединения с чистотой более 89%.

Полипептид ох Μίηί-Β получали аналогичным образом.

Пример 3. Эксперименты ίη у1уо с реконструированным сурфактантом на основе ох Μίηί-Β и 8РС33.

Сурфактантные препараты испытывали на недоношенных новорожденных кроликах, полученных путём гистерэктомии при сроке беременности 27 суток. Эксперименты проводили без использования положительного давления в конце выдоха (РЕЕР).

В качестве аналога 8Р-С применяли полипептид, именуемый 8Р-С33, который был получен в соответствии с примером 1.

В качестве аналога белка 8Р-В применяли окисленный Μίηί-Β (ох Μίηί-Β), который был получен в соответствии с примером 2.

Животных в момент рождения подвергали воздействию препаратов реконструированного сурфактанта, содержащих в качестве липидного носителя фосфолипидную смесь ЭРРС:ОРС при соотношении 68:31 мас./мас. Фосфолипиды смешивали с 2 или 4% мас./мас. 8РС-33, 2% мас./мас. ох Μίηί-Β или 2% мас./мас. 8РС-33 + 2% мас./мас. ох Μίηί-Β.

- 7 015802

Животных, получающих такую же дозу СигокшТ®, использовали в качестве положительных контролей, а необработанных однопомётных животных использовали в качестве отрицательных контролей.

Все препараты сурфактанта вводили в концентрации 80 мг/мл и при стандартной дозе 2,5 мл/кг.

Недоношенных новорожденных кроликов подвергали вентилированию параллельно со стандартизованной последовательностью пиковых инсуффляционных давлений. Сначала для раскрытия лёгких устанавливали давление 35 см водяного столба (около 3,43 кПа) на 1 мин. После этого рекрутментманевра давление понижали до 25 см водяного столба (около 2,45 кПа) в течение 15 мин и далее до 20 и см водяного столба (около 1,96 и 1,47 кПа). В конце давление опять повышали до 25 см водяного столба в течение 5 мин, после чего лёгкие вентилировали азотом в течение дополнительных 5 мин и затем иссекали для измерений объёма газа.

Измеряли объёмы газа в лёгких и дыхательные объёмы, выраженные в мл/кг; результаты, представленные в виде средних значений, показаны на фиг. 3 и 4 соответственно.

Из фиг. 3 можно понять, что животные, обработанные препаратом реконструированного сурфактанта, содержащим 2% мас./мас. οχ Μίηί-Β, имели более низкие объёмы газа в лёгких по сравнению с животными, получавшими 2% мас./мас. 8Р-С33 (примерно 2 мл/кг против примерно 4 мл/кг).

Добавление 2% мас./мас. οχ Μίηί-Β к сурфактанту 8Р-С33 вызвало значительно большее увеличение объёмов газа в лёгких по сравнению с любым одиночным пептидом (8 мл/кг против примерно 6 мл/кг).

Как показано на фиг. 4, аналогичную тенденцию наблюдали для дыхательных объёмов, и после введения пептидов в комбинации наблюдали улучшение, сопоставимое или даже немного лучшее, чем улучшение, достигаемое после введения СигокшТ®.

Также было обнаружено, что увеличение содержания 8Р-С33 от 2 до 4% мас./мас. не привело к увеличению объёмов газа в лёгких, показывая тем самым, что стабилизирующий эффект фосфолипидной плёнки в альвеолах в конце выдоха обусловлен добавлением οχ Μίηί-Β.

Claims

1. Реконструированный сурфактант, содержащий смесь фосфолипидов и комбинацию полипептидного аналога нативного сурфактантного белка 8Р-С с полипептидным аналогом нативного сурфактантного белка 8Р-В, где указанный полипептидный аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С представляет собой полипептид, содержащий по меньшей мере 20 аминокислотных остатков и не более чем 40 аминокислотных остатков, имеющий последовательность, представленную общей формулой (I)

Е_еСД_гР£_дЗРУН1_ККХ_аВХь(ВХ_с)пОА1_1-О_рС_р1__р (I), где X представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из I, Ь и пЬ;

В представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из К, А, Е, Υ и От;

8 возможно замещен ацильными группами, содержащими 12-22 атома углерода, предпочтительно

16 атомов углерода, связанных с боковой цепью посредством сложноэфирной связи;

Ω представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из М или М, окисленного по атому серы, I, Ь и пЬ;

е, Т, д и р являются целыми числами, имеющими значение 0 или 1;

η является целым числом, имеющим значение от 0 до 3;

при условии, что Х₃ВХ_ь(ВХ_с)_п представляет собой последовательность, имеющую максимум 22 аминокислоты; и где указанный полипептидный аналог нативного сурфактантного белка 8Р-В представляет собой полипептид общей формулы (II)

СгД1скАикк1ОАО1Ркескп1Рав/сн1-У1_Фсз_т (И), где Δ представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из А и Ь;

Ω представляет собой аминокислотный остаток, независимо выбранный из группы, состоящей из М, I, Ь и пБ;

- 8 015802

Φ представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Я и Т; и ί является целым числом, имеющим значение 0 или 1.

2. Реконструированный сурфактант по п.1, где Φ представляет собой Я.

3. Реконструированный сурфактант по п.1 или 2, где аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С и аналог нативного сурфактантного белка 8Р-В присутствуют в фиксированной комбинации.

4. Реконструированный сурфактант по любому из пп.1-3, где полипептид(П) находится в форме дисульфидсвязанной молекулы с внутримолекулярной дисульфидной связью между двумя остатками Сук в положениях 1 и 33 и/или между двумя остатками Сук в положениях 4 и 27.

5. Реконструированный сурфактант по любому из пп.1-3, где аналог нативного сурфактантного белка 8Р-В представлен общей формулой (11а) οννίΟΕΑίίκριΟΑΜίΡκαοκΜίραίνοκίνίκοδ (На).

6. Реконструированный сурфактант по п.5, где аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С представлен общей формулой (1а)

1гРгЗЗРХ/НЬККХ_аВХьСАк1Цр6рЬр (1а), где X, В и Ω являются такими, как определено выше;

а находится в диапазоне от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 3; более предпочтительно равен 1;

Ь находится в диапазоне от 1 до 19, предпочтительно от 5 до 15; более предпочтительно равен 14 и ί и р равны 0 или 1.

7. Реконструированный сурфактант по п.6, где аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С представлен общей формулой (1Ь)

ΙΡδ3ΡνΗΙΚΗΧ_βΒΧ_&ΘΑΙΙΩρΘρΙ_ρ(1Ь), где X, В, Ω, а и Ь являются такими, как определено выше; и р равен 0 или 1.

8. Реконструированный сурфактант по п.7, где аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С представлен общей формулой (1с) ^ЗЗРУНЬКЯСКЬЫНЬШЬШЮАНОрСрЕр(1с), где Ω является таким, как определено выше; и р равен 0 или 1.

9. Реконструированный сурфактант по п.8, где аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С выбран из группы, состоящей из

1Р88РУНЬК1иК1_1_Ш1_Ш1_Ш1-СА1.1.М<31_(16), )Ρ33ΡνΗίΚΡί1_ΚΙ_Ι_1_ίΙ_11_1_Ι1_1_1_ΙΙ_(3ΑίΙ_Ιί3Ι_(1е),

ΙΡ33ΡνΗΙΚΚί_ΚΙ_1_Ι_Ι_Ι_1_1_Ι_ΙΙ_1_Ι_([_<3ΑΙ_!_1?31_(11),

1Р85Р\/Н!-К1Ч1-К1-Ш-1-Ш-1ШЛ_(ЗА1-1п1_С1-(1д), (РЗЗРУНЬКРкКкЬИНЬИкШССАИ(1й).

10. Реконструированный сурфактант по п.1, где полипептидный аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С представляет собой

ΙΡ88ΡνΗίΚΡίΚίίΙΙίίΙΓΙίίίΙί6Αΐυ_ΘΙ(II), и полипептидный аналог нативного сурфактантного белка 8Р-В представляет собой ΟννίΟΡΑίΙΚΡίαΑΜΙΡΚΟΘΚΜΙΡαΐνΟΡίνίΚΟδ (Па).

11. Реконструированный сурфактант по п.1, где полипептидный аналог нативного сурфактантного белка 8Р-С представляет собой !Р88Р\/Н1-КК1-К[-к1_1-1-1-Ш1-Ш1-6АШ-61_ (11), и полипептидный аналог нативного сурфактантного белка 8Р-В представляет собой

ΟννίΟΡΑίΙΚΕίΐαΑΙΙΡΚΘΘΕΪίίΡαίνΟΚίνίΡΟδ (Ос).

12. Реконструированный сурфактант по любому из пп.1-11, где фосфолипидная смесь содержит дипальмитоилфосфатидилхолин (ЭРРС) и пальмитоилолеоилфосфолипид, выбранный из пальмитоилолеоилфосфатидилглицерина (РОРС) или его смеси с пальмитоилолеоилфосфатидилхолином (РОРС) при массовых соотношениях в диапазоне от 95:5 до 50:50.

13. Реконструированный сурфактант по п.12, где фосфолипидная смесь содержит ОРРС и РОРС при массовом соотношении 68:31.

14. Фармацевтическая композиция, содержащая реконструированный сурфактант по любому из пп.1-13 и подходящий носитель или растворитель.

15. Фармацевтическая композиция по п.14 в виде или раствора, или дисперсии, или суспензии, или сухого порошка.

16. Фармацевтическая композиция по п.15 в виде водной суспензии.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, содержащая реконструированный сурфактант в концентрации от 2 до 160 мг/мл.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, где концентрация реконструированного сурфактанта составляет от 20 до 80 мг/мл.

- 9 015802

19. Применение реконструированного сурфактанта по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики респираторного дистресс-синдрома (КЭ8) у недоношенных детей или в лечении или профилактике других заболеваний, связанных с дефицитом или дисфункцией сурфактанта.

20. Применение по п.19, где заболевания, связанные с дефицитом или дисфункцией сурфактанта, включают КЭ8 у взрослых (ΆΚΌ8), синдром аспирации мекония (МА8) и бронхолёгочную дисплазию (ΒΡΌ).

ΝΗ₂ РЬе С1у По Рго Суз Суз Рго УЗ! Н!з 1аи 1_уз 1 5 10 Д<д 1зо Уа1 Уа! Уа1 Уа! Уа! Уа1 15 20 ίβυ Не Уа! Уа! Не Уа! С1у А!а 1аи 25 30 1_еи Ме! О1у 1еи СООН