DE60032769T2

DE60032769T2 - Surfactant PROTEIN C ESTER

Info

Publication number: DE60032769T2
Application number: DE60032769T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Ise; Walther Gernandt; Dietrich Häfner; Wolf-Rüdiger Ulrich; Ernst Sturm
Original assignee: Nycomed GmbH
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2020-06-03
Also published as: CA2375214A1; ES2278609T3; JP4762466B2; EP1192184A1; JP2003502441A; SI1192184T1; US20060148701A1; US7022671B1; AU5074400A; WO2000078810A1; PT1192184E; US7173009B2; DE60032769D1; ATE350399T1; CA2375214C; DK1192184T3; EP1192184B1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf lungensurfactant-aktive Polypeptide (Surfactant-Proteine), Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Stand der Technik
Die Lunge aller Wirbeltiere enthält ein Substanzgemisch, das als "lungensurfactant" bezeichnet wird. Es zeigt oberflächenaktive Eigenschaften und setzt die Oberflächenspannung im Alveolarbereich der Lungen so weit herab, daß ein Kollaps der finalen Atemwegsbereiche bei der Ausatmung vermieden wird. Dieses Substanzgemisch reguliert die Oberflächenspannung in einer dynamischen Art und Weise, so daß der nach dem Laplaceschen Gesetz zu erwartende Kollaps der kleinen Alveolen zugunsten der größeren durch entsprechende Anpassung der Oberflächenspannung vermieden wird. Als Ergebnis entsteht so eine wohl ausbalancierte, histologisch und physiologisch stabile Struktur der Lunge.
Lungensurfactant wird von den alveolären Pneumozyten vom Typ II in Form lamellarer Körperchen (lamellar bodies) sezerniert. Dieses sind kompakte Einheiten aus Phospholipid-Doppelschichten (bilayers) mit einem hohen Anteil an Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Phosphatidylglycerin (PG). Als weitere essentielle Komponenten sind im lungensurfactant Proteine enthalten, die mit SP-A, SP-B, SP-C und SP-D bezeichnet werden (Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-Associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-998). SP-A ist ein hochmolekulares Glycoprotein, das bei der Regulation der Sekretion eine entscheidende Rolle spielt.
Die Proteine SP-C und, in geringerem Maße, SP-B übernehmen bei der Ausbildung des monomolekularen Oberflächenfilms (dem Surfactant im engeren Sinne) die Rolle "thermodynamischer Katalysatoren". Durch die Anwesenheit dieser Proteine wird die Spreitungskinetik enorm beschleunigt. Erst dadurch ist die verzögerungsfreie Anpassung des Surfactant an die jeweiligen Oberflächenspannungserfordernisse möglich. Diese Eigenschaften spiegeln sich in dem extrem hydrophoben Charakter der Proteine, insbesondere des SP-C, wider.
Durch Extraktion von Lungengewebe oder Spülung von Tierlungen konnten Surfactant-Präparate gewonnen werden, die sowohl in physikochemischen Meßapparaturen, in Tiermodellen als auch bei klinischer Anwendung die Fähigkeit zeigen, einen Surfactant-Mangel auszugleichen und damit z.B. zur Therapie des kindlichen Atemnotsyndroms (IRDS) geeignet sind. Diesen Tierpräparaten sind jedoch gravierende Schwächen zu eigen:
Die Zusammensetzung der Phospholipide ist stark von Tierart, Gesundheit und Ernährungszustand des Tieres abhängig und kann nur begrenzt durch Zumischung definierter Komponenten ausgeglichen werden. Der Gehalt an Surfactant-Proteinen sowie das Verhältnis SP-B/SP-C ist den gleichen Unsicherheiten unterworfen. Hinzu kommt, daß eventuell proteolytische Abbauprodukte der Proteine oder modifizierte Abkömmlinge (z.B. durch Oxidation am Methionin) ebenfalls in der therapeutisch eingesetzten Mischung enthalten sind. Bei einer längerfristigen Anwendung oder der Applikation großer Mengen an Surfactant, wie sie z.B. beim adulten Atemnotsyndrom (Schocklunge, ARDS) oder bei anderen Anwendungsfeldern, wie z.B. der Benutzung von Surfactant als "Schlepper" für andere Substanzen bei einer pulmonalen Applikation, nötig werden könnte, ist die Frage des Substanznachschubes offen.
Es bietet sich daher an, diese Probleme durch Herstellung der Proteine auf gentechnischem Wege zu lösen. Da rekombinante Proteine, insbesondere unter Verwendung bakterieller Expressionssysteme, in praktisch unbegrenzten Mengen herstellbar sind, und die Anwendung moderner Analysemethoden und Qualitätskontrollen möglich ist, kann unter Verwendung synthetischer Phospholipide ein Surfactant mit genau definierter Zusammensetzung hergestellt werden. Dieser kann an die therapeutischen Erfordernisse optimal angepaßt werden.
Das humane Protein SP-C (SEQ ID NO: 1, siehe nachfolgende Formel I, wobei A = abwesend ist oder Phe bedeutet, B = Cys und C = Met darstellen), das für die Spreitungskinetik besonders wichtig ist, besteht in seinem zentralen Teil ausschließlich aus aliphatischen, sehr hydrophoben Aminosäuren, wie Valin, Leucin und Isoleucin. Die Länge dieses zentralen Teils (Aminosäuren 12-34 in Formel I) erlaubt die Integration des Peptids in den monomolekularen Phospholipidfilm. In der Sequenz SEQ ID NO: 2 Pro-Cys-Cys-Pro (Position 3-6 in Formel I) sind die beiden Cys-Reste durch Palmitinsäure an den SH-Gruppen thioverestert. Die Palmitinsäure erhöht den hydrophoben Charakter des Gesamtproteins sogar noch weiter und verschließt gleichzeitig die beiden SH-Gruppen der Cysteine und schützt sie vor Oxidation und Disulfidbrückenbildung. Die zentrale Region (Aminosäuren 13-34 in Formel I) bildet eine Transmembran-Helix aus. Diese Region wird am N-Terminus flankiert durch eine polare Sequenz, die positiv geladene Aminosäuren (Lys, 10; Arg, 11 in Formel I) enthält.
In der WO89/04326 und der WO91/18015 wird die Herstellung von rekombinantem SP-C und von Mutanten des SP-C beschrieben. Es wird dort u.a. vorgeschlagen, die beiden Cysteine in Position 4 und 5 durch zwei Serine zu ersetzen. Dies hat bei der Herstellung den Vorteil, daß nach der Isolierung des sehr hydrophoben Proteins die technisch aufwendige Palmitoylierung der beiden Cysteine entfällt.
In der WO95/32992 werden SP-C-Mutanten beschrieben, die sich von humanem SP-C durch Ersatz der beiden Cysteine in den Positionen 4 und 5 durch Phenylalanin oder Tryptophan und Ersatz des Methionins in Position 32 durch Isoleucin, Leucin oder Serin unterscheiden.
US 5,876,970 beschreibt unter anderem die Analyse von Surfactant-Protein C, das aus unterschiedlichen natürlichen Quellen isoliert wurde, durch Massenspektrometrie. Es wird erwähnt, daß sich bei der Aufarbeitung von SP-C-Proben für die Massenspektrometrie ein Methyl- bzw. Isopropylester gebildet haben könnte.
EP-A-0 458 167 offenbart ein Verfahren zum chemischen Modifizieren eines Lungensurfactant Proteins oder von Lungensurfactant Polypeptiden mit verschiedenen Fettsäuren.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung weiterer Surfactant-Proteine, die sich zur Herstellung von pharmazeutischen Lungensurfactant-Zubereitungen eignen. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß SP-C-Polypeptide, die am Carboxyterminus mit Alkoholen mit 1-4 Kohlenstoffatomen verestert sind, einerseits vorteilhafte Eigenschaften im Hinblick auf ihre Lungensurfactant-Aktivität aufweisen und andererseits vorteilhafte Eigenschaften im Hinblick auf ihre Stabilität zeigen. Die erfindungsgemäßen SP-C Ester haben insbesondere eine geringe Aggregationsneigung und damit verbesserte Stabilität in Lösung.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung daher SP-C Polypeptide, bei denen die Aminosäure am Carboxyterminus des Polypeptids mit einem Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen verestert ist und Salze davon.
Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter der Bezeichnung SP-C, in Analogie zu der von Possmayer (Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-998) vorgeschlagenen Nomenklatur, die in natürlichem Lungensurfactant oder Amnionflüssigkeit von Säugetieren vorkommende und als SP-C bezeichnete "Familie" von Surfactant-Proteinen verstanden. Bevorzugt wird unter SP-C das in humanem Lungensurfactant oder in humaner Amnionflüssigkeit vorkommende Surfactant-Protein SP-C verstanden.
Weiterhin umfaßt de Bezeichnung SP-C auch chemisch synthetisch oder rekombinant hergestelltes SP-C sowie Modifikationen von SP-C, beispielsweise solche Modifikationen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen oder durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Chemisch synthetisch oder rekombinant hergestelltes SP-C sowie Modifikationen von SP-C sind beispielsweise beschrieben in WO89/04326, WO91/00871, WO91/18015, WO93/21225 oder auch in WO95/32992.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird unter SP-C ein aus der WO95/32992 bekanntes Surfactant-Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 der Formel I verstanden
worin A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe oder Trp und C für Ile, Leu oder Ser stehen.
Bevorzugt sind solche Surfactant-Proteine der Formel I, worin A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe und C für Ile stehen. Besonders bevorzugt ist ein Surfactant-Protein der Formel I, worin A abwesend ist, B für Phe und C für Ile stehen [nachfolgend auch als SP-C (FF/I) oder rSP-C (FF/I) bezeichnet].
Die Aminosäuresequenzen sind in der üblichen nomenklaturgerechten Kurzschreibweise (dreibuchstabig) mit der Aminosäure, die die freie Aminogruppe trägt, am linken Ende (Aminoterminus; Aminosäure mit der Nummer 0 bzw. 1 in der Formel I) und der Aminosäure, die die freie Carboxylgruppe trägt, am rechten Ende (Carboxyterminus; Aminosäure mit der Nummer 34 in der Formel I) dargestellt.
Die erfindungsgemäßen SP-C Ester zeigen im Gemisch mit Phospholipiden Lungensurfactant-Aktivität. Die Bestimmung von Lungensurfactant-Aktivität kann in einer dem Fachmann bekannten Weise erfolgen. Natürlicher Lungensurfactant hat oberflächenaktive Eigenschaften; er reduziert beispielsweise die Oberflächenspannung in den Lungenbläschen. Einen einfachen und schnellen in vitro Test, mit dem sich die Oberflächenaktivität von Lungensurfactant-Zubereitungen bestimmen läßt, stellt z.B. die sogenannte Wilhelmy Waage dar [Goerke, J. Biochim. Biophys. Acta, 344: 241-261 (1974), King R. J. and Clements J.A., Am. J. Physicol. 223: 715-726 (1972)]. Diese Methode gibt Hinweise auf die Lungensurfactant-Qualität, gemessen als Tätigkeit eines Lungensurfactants, eine Oberflächenspannung von nahe Null mN/m zu erreichen. Eine andere Meßvorrichtung, um die Oberflächenaktivität von Lungensurfactant zu bestimmen, ist der "Pulsating Bubble Surfactometer" [Possmayer F., Yu S. und Weber M., Prog. Resp. Res., Ed. v. Wichert, Vol. 18: 112-120 (1984)]. Die Aktivität einer Lungensurfactant-Zusammensetzung kann auch mittels in vivo Tests festgestellt werden. Durch die Messung von z.B. der Lungencompliance, des Blutgasaustausches bzw. der benötigten Beatmungsdrücke in Tiermodellen von ARDS und IRDS kann man Hinweise auf die Aktivität eines Lungensurfactants erhalten. Ein solches Modell wird beispielsweise von Häfner et al. beschrieben (D. Häfner et al.: Effects of rSP-C surfactant on oxygenation und histology in a rat lung lavage model of acute lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158: 270-278).
Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen insbesondere aliphatischer Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen verstanden. Genannt seien hier Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol (Isopropanol), 1-Butanol und 2-Butanol, wobei Methanol und 2-Propanol bevorzugt sind.
Als Salze kommen für die erfindungsgemäßen SP-C Ester insbesondere Säureadditionssalze mit Säuren in Betracht. Besonders erwähnt seien die pharmakologisch verträglichen Salze der in der Galenik üblicherweise verwendeten starken Säuren. Als solche eignen sich zweckmäßigerweise Säureadditionssalze mit Säuren wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure, wobei die Säuren bei der Salzherstellung – je nachdem, ob es sich um eine ein- oder mehrbasige Säure handelt und je nachdem, welches Salz gewünscht wird – im äquimolaren oder einem davon abweichenden Mengenverhältnis eingesetzt werden.
Die Herstellung des SP-C Esters kann ausgehend von dem entsprechenden Surfactant-Protein C mit der freien Carboxylgruppe am Carboxyterminus durch Umsetzung mit dem entsprechenden Alkohol unter geeigneten Veresterungsbedingungen erfolgen. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen SP-C Ester durch Umsetzung des entsprechenden Surfactant-Protein C mit der freien Carboxylgruppe am Carboxyterminus mit einem gewünschten Alkohol unter geeigneten Veresterungsbedingungen. Bevorzugt wird der Alkohol in großem Überschuß als Lösungsmittel eingesetzt und die Veresterung mit Hilfe einer Säure durchgeführt. Im Hinblick auf den hydrophoben Charakter der Surfactant-Proteine ist es vorteilhaft, den Alkohol im Gemisch mit anderen organischen Lösungsmitteln einzusetzen. Bevorzugt handelt es sich bei diesen anderen organischen Lösungsmitteln um halogenierte Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Chloroform und Dichlormethan. Geeignete Säuren sind insbesondere starke Säuren wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Bromwasserstoffsäure. Zur Vermeidung der Bildung von Zersetzungsprodukten wird die Veresterung bevorzugt bei Temperaturen im Bereich bis zur Raumtemperatur durchgeführt. Nach erfolgter Veresterung werden die erhaltenen Ester auf übliche Weise isoliert und gegebenenfalls noch einer Reinigung unterzogen, beispielsweise durch Säulenchromatographie mit einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. wie in WO95/32992 oder der WO92/00993 beschrieben). Die Isolierung oder Herstellung beispielhafter Surfactant-Proteine C, die als Ausgangsprodukte für die Veresterung eingesetzt werden können, ist beispielsweise beschrieben in WO89/04326, WO91/00871, WO91/18015, WO93/21225 oder auch in WO95/32992. Die Herstellung von rSP-C (FF/I) ist in der WO95/32992 beschrieben. Beispielsweise können die dort nach der chromatographischen Reinigung des Proteins erhaltenen rSP-C (FF/I) Lösungen (s. WO95/32992, Seite 10, zweiter Absatz) direkt zu den entsprechenden rSP-C (FF/I) Estern weiterverarbeitet werden.
Die erfindungsgemäßen SP-C Ester können einzeln oder in Kombination miteinander in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, die an die Erfordernisse der Atemwegsbehandlung angepaßt sind. Erwähnenswert ist die Kombination der erfindungsgemäßen SP-C Ester mit mindestens einem weiteren lungensurfactant-aktiven Polypeptid aus der Gruppe SP-A, unverestertes SP-C und SP-B in pharmazeutischen Zusammensetzungen. Besonders erwähnenswert ist hier die Kombination mit unverestertem SP-C in den pharmazeutischen Zusammensetzungen. Bevorzugt sind dabei Kombinationen die (bezogen auf die Gesamtmenge an Surfactant-Protein in den Zusammensetzungen) bis zu 50 Gew.-% SP-C (unverestert) und als Rest einen oder mehrere erfindungsgemäße SP-C Ester enthalten oder Kombinationen die bis zu 50 Gew.-% eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen SP-C Ester und als Rest SP-C (unverestert) enthalten. Besonders bevorzugt sind Kombinationen die 5 bis 15 Gew.-% SP-C (unverestert) und als Rest einen oder mehrere der erfindungsgemäßen SP-C Ester enthalten oder Kombinationen die 0,5 bis 10 Gew.-% eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen SP-C Ester und als Rest SP-C (unverestert) enthalten, insbesondere solche die 2 bis 5 Gew.-% SP-C Ester und als Rest SP-C (unverestert) enthalten. Bevorzugt ist hier die Kombination aus rSP-C (FF/I) Estern und rSP-C (FF/I) in unveresterter Form. Beispielhafte Kombinationen enthalten 1-6 Gew.-% rSP-C (FF/I) Methylester und als Rest rSP-C (FF/I) in unveresterter Form. Solche Kombinationen können beispielsweise direkt aus der Veresterungsreaktion des SP-C erhalten werden, wenn die Veresterungsreaktion vor einem vollständigen Umsatz abgebrochen wird oder durch Mischen der entsprechenden reinen Kombinationsbestandteile.
Die Zusammensetzungen enthalten neben dem Surfactant-Protein Phospholipide, vorzugsweise solche Phospholipide, die in natürlichen Lungensurfactant-Zusammensetzungen enthalten sind, wie vorzugsweise Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (POPG) und/oder Phosphatidylglycerol (PG). Als weitere Bestandteile, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten sein können, seien Fettsäuren wie beispielsweise Palmitinsäure genannt. Zur Einstellung einer günstigen Viskosität können die Zusammensetzungen Elektrolyte wie Calcium-, Magnesium- und/oder Natriumsalze enthalten (beispielsweise Calciumchlorid, Natriumchlorid und/oder Natriumhydrogencarbonat). Der Fachmann orientiert sich bei der Bemessung der Art und Menge der einzelnen Bestandteile der Zusammensetzungen zum einen an der bekannten Zusammensetzung natürlicher Lungensurfactants und zum anderen an den zahlreichen Vorschlägen nach dem Stand der Technik, wie z.B. EP-A 0119056 und EP-A 0406732.
Erfindungsgemäße Zubereitungen enthalten zweckmäßigerweise 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,2 bis 5 Gew.-% Surfactant-Protein, 2 bis 15 Gew.-% Fettsäuren und 0 bis 5 Gew.-% Elektrolyte (bezogen auf das Trockengewicht).
Vorzugsweise handelt es sich bei den Phospholipiden um Gemische aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (POPG), insbesondere im Verhältnis (Gewichtsverhältnis) von 7 zu 3 bis 3 zu 7.
Bevorzugte erfindungsgemäße Zubereitungen enthalten 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,5 bis 3,0 Gew.-% Surfactant-Protein, 3 bis 15 Gew.-% Fettsäure, vorzugsweise Palmitinsäure, und 0 bis 3 Gew.-% Calciumchlorid (bezogen auf das Trockengewicht).
Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,5 bis 3,0 Gew.-% Surfactant-Protein, 4 bis 7 Gew.-% Fettsäure, vorzugsweise Palmitinsäure, und 1 bis 3 Gew.-% Calciumchlorid.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitungen erfolgt auf eine dem Fachmann vertraute Weise beispielsweise durch Einbau des Surfactant-Proteins in eine Phospholipidmatrix wie in der WO95/32992 beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Lungensurfactant-Zubereitungen in lyophilisierter und insbesondere in sprühgetrockneter Form bereitgestellt. Lyophilisierte Zubereitungen sind beispielsweise bekannt aus WO97/35882, WO95/32992, WO91/100871 und DE 3229179 . Die WO97/26863 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von pulverförmigen Lungensurfactant-Zubereitungen durch Sprühtrocknung. Erfindungsgemäß sind auf diese Weise hergestellte Zubereitungen bevorzugt.
Beispiele
1. rSPC(FF/I)-Ester
rSPC(FF/I)-methylester
5 Fraktionen (1 l) der gemäß WO95/32992 nach HPLC-Chromatographie erhaltenen reinen rSPC(FF/I)-Lösungen werden in einem Scheidetrichter mit 500 ml Chloroform und 300 ml 1 N Salzsäurelösung versetzt, gut durchmischt und dann nach Phasentrennung die wäßrige Phase abgetrennt. Die organische Phase wird mit Methanol auf 1 l verdünnt und nochmals mit 300 ml 1 N Salzsäurelösung gewaschen. Nach Phasentrennung wird die organische Phase wiederum mit Methanol auf 1 l verdünnt und der pH der Lösung mit konz. Salzsäurelösung auf ca. pH 1 eingestellt. Man läßt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen und destilliert dann am Rotationsverdampfer ca. 300 ml Lösungsmittelgemisch ab. Nach weiteren 3 Tagen bei Raumtemperatur läßt sich mittels HPTLC (HPTLC-Fertigplatten Diol (Merck); Laufmittel; Chloroform: Methanol:Ammoniak (25%): H₂O = 13:6:0,4:0,8; Anfärbung: Comassie-Blue) kein unverestertes rSPC(FF/I) mehr nachweisen. Die Lösung wird zweimal mit je 300 ml 0,1 N Salzsäurelösung ausgeschüttelt, wobei nach Phasentrennung die organische Phase jeweils mit 2-Propanol auf ca. 700 ml verdünnt wird. Der pH der Lösung wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung auf pH 3,5-4 eingestellt. Die Lösung wird insgesamt 4 × am Rotationsverdampfer bei 20-25°C auf 250 ml eingeengt und jeweils wieder mit 2-Propanol auf 500 ml aufgefüllt. Nach Filtration erhält man schließlich eine Lösung von ca. 200 mg rSPC(FF/I)-methylester in 2-Propanol, die bei –20°C gelagert wird. Das Massenspektrum (MALDI-TOF) zeigt den Molekülpeak MH⁺ bei 3634 Da.
rSPC(FF/I)-2-propylester
6 Fraktionen (1,2 1) der gemäß WO95/32992 nach HPLC-Chromatographie erhaltenen reinen rSPC(FF/I)-Lösungen werden in einem Scheidetrichter mit 600 ml Chloroform und 400 ml 1 N Salzsäurelösung versetzt, gut durchmischt und dann nach Phasentrennung die wäßrige Phase abgetrennt. Die organische Phase wird mit 2-Propanol auf 1,2 l verdünnt und dann mit konz. Salzsäurelösung ein pH von 0,5-1 eingestellt. Nach 1 Tag Stehen bei Raumtemperatur werden am Rotationsverdampfer bei 20-25°C ca. 300 ml Lösungsmittelgemisch abdestilliert und durch 300 ml 2-Propanol ersetzt. Diese Prozedur wird nach 3, 6, 9 und 12 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wiederholt. Dann kann mittels HPTLC (siehe Beispiel 1) praktisch kein unverestertes rSPC(FF/I) mehr nachgewiesen werden. Der pH der Lösung wird mit ges. NaHCO₃-Lösung auf 3,5-4 eingestellt und dann die Lösung am Rotationsverdampfer auf 500 ml eingeengt. Nach Filtration erhält man eine Lösung von ca. 250 mg rSPC(FF/I)-2-propylester in 2-Propanol, die bei –20°C gelagert wird. Das Massenspektrum (MALDI-TOF) zeigt den Molekülpeak MH⁺ bei 3662 Da.
2. Einbau von rSP-C (FF/I) Estern in eine Phospholipid-Matrix
rSP-C (FF/I) Methyl- oder 2-Propylester wird in i-Propanollösung mit den Komponenten der Phospholipidmatrix versetzt und durch Einsprühen in eine verdünnte Kochsalzlösung (0,065 w/w NaCl) bei Raumtemperatur in homogener Mischung mit den Komponenten der Phospholipidmatrix ausgefällt. Aus der Lungensurfactant-Suspension wird der Lungensurfactant (LSF) mit einer Becherzentrifuge abgetrennt, in Elektrolytlösung (NaCl, CaCl₂) resuspendiert und der pH-Wert mit 0,1 N NaOH auf pH 6,5 eingestellt. Diese wäßrige Suspension wird auf 20 ml Vials abgefüllt und lyophilisiert. Die im folgenden Herstellungsbeispiel gemachten Gewichts- und Volumenangaben beziehen sich auf die Herstellung von 10 g Lungensurfactant-Zubereitung:
7,00 g Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPCC), 3,08 g Palmitoyloleylphosphatidyl-glycerol-Ammoniumsalz (POPG × NH₄) und 0,25 g Palmitinsäure werden bei 40°C in 200 ml 90% i-Propanol gelöst und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die erhaltene Phospholipidlösung J wird mit 1 l einer Lösung enthaltend 200 mg SP-C(FF/I) Methyl- oder 2-Propylester vereinigt. Die erhaltene "Sprühlösung" wird unter Rühren mit Bikarbonatlösung (ca. 5 ml 5% NaHCO₃-Lösung) auf pH 4,5 eingestellt.
Die "Sprühlösung" wird bei Raumtemperatur mit einer Einsprühgeschwindigkeit von 25 ml/min über eine Einstoffdüse in 9,6 l verdünnte NaCl-Lösung (0,065 w/w) unter intensivem Rühren eingebracht. Es bildet sich eine opaleszierende Lösung, aus der nach zweistündiger Lagerung bei 4°-8°C die Lungensurfactant-Zubereitung durch Einsprühen einer Elektrolytlösung (3,0 g CaCl₂ × 2H₂O und 61,3 g NaCl in 300 ml H₂O) ausgefällt wird. Die Lungensurfactant-Suspension (Gesamtvolumen 10,8-11,0 l) wird über Nacht bei 4°C gelagert und dann mit einer Sorvall-Becherzentrifuge (RC2-B) bei 16000 g in jeweils 30 Minuten abzentrifugiert. Der Zentrifugationskuchen wird jeweils zur Entfernung anhaftenden restlichen i-Propanols im halben Volumen 0,65%iger Kochsalzlösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Diese Prozedur wird insgesamt 3-4 mal wiederholt. Der Kuchen der letzten Zentrifugation wird in 400 ml 0,65%iger NaCl-Lösung aufgenommen, mit 0,1 N NaOH auf pH 6, 5 eingestellt und in Portionen zu 6,2 g auf 20 ml Vials aufgeteilt. Der Inhalt der Vials wird wie folgt lyophilisiert: Einfrieren über 6 Stunden bei –45°C und Normaldruck, Gefriertrocknen für 54 Stunden bei 0,16 mbar und –20°C, danach zur weiteren Intensivtrocknung noch 5 Stunden bei –20°C und 0,02 mbar.
Man erhält 65-66 Vials, die jeweils 0,150 g Lungensurfactant (ber. ohne NaCl) enthalten.
Die trockenen Lungensurfactant-Proben werden im Kühlschrank bei 4°C gelagert und müssen vor dem Einsatz mit Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert werden (Suspensionskonzentration 25 mg/ml).

Pro Vial sind enthalten:

95,6 mg	Dipalmitoylphosphatidylcholin
42,1 mg	Palmitoyloleylphosphatidylglycerol
	(Ammoniumsalz)
2,7 mg	rSP-C(FF/I) Methyl- oder 2-Propylester
6,8 mg	Palmitinsäure
2,9 mg	Calciumchlorid (wasserfrei)

3. Herstellung pulverförmiger Lungensurfactant-Zubereitungen
Die Herstellung pulverförmiger Lungensurfactant-Zubereitungen erfolgt nach dem in der WO97/26863 beschriebenen Verfahren.
Beispiel A
10,95 g of 1,2-Dipalmitoyl-3-sn-phosphatidylcholin, 4,6 g 1-Palmitoyl-2-oleoyl-3-sn-phosphatidylglycerolammonium, 418 mg Calciumchloriddihydrat und 750 mg Palmitinsäure werden in 330 ml 2-Propanol/Wasser (85:15) bei 50°C gelöst und nach dem Abkühlen auf 30°C mit 620 ml einer Lösung von rSP-C (FF/I) 2-Propylester in Isopropanol/Wasser (95:5, c = 484 mg/l) gemischt. Die resultierende Lösung wird in einem Laborsprühtrockner Büchi B 191 sprühgetrocknet. Sprühbedingungen: Trocknungsgas Stickstoff, Eintritts temperatur 100°C, Austrittstemperatur 58-60°C. Man erhält ein farbloses Pulver.
Beispiel B
3,74 g (5,1 mmol) 1,2-Dipalmitoyl-3-sn-phosphatidylcholin, 2,81 g (3,7 mmol) 1-Palmitoyl-2-oleoyl-3-snphosphatidylcholin, 2,90 g (3,9 mmol) 1,2-Dipalmitoylphosphatidyl-3-sn-phosphatidylglycerol-natrium, 234 mg Palmitinsäure und 279 mg (1,9 mmol) Calciumchloriddihydrat werden in 160 ml 2-Propanol/Wasser (85:15) bei 50°C gelöst und nach dem Abkühlen auf 30°C mit 566 ml einer Lösung von rSP-C (FF/I) Methylester in Isopropanol/Wasser (92:8, c = 330 mg/l) bei 30°C gemischt. Die resultierende Lösung wird in einem Laborsprühtrockner Büchi B 191 sprühgetrocknet. Sprühbedingungen: Trocknungsgas Stickstoff, Eintrittstemperatur 90°C, Austrittstemperatur 58-60°C. Man erhält ein farbloses Pulver.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) ist ein beschreibender Ausdruck, der auf eine große Anzahl akuter, diffus infiltrativer Lungenläsionen unterschiedlicher Ätiologie angewendet wird, sofern sie mit einer schweren Gasaustauschstörung (insbesondere arterieller Hypoxämie) verbunden sind. Der Ausdruck ARDS wird wegen der zahlreichen klinischen und pathologischen Gemeinsamkeiten zum Infant Respiratory Distress Syndrome (IRDS) verwendet. Steht beim IRDS der durch die frühzeitige Geburt bedingte Lungensurfactant-Mangel im Vordergrund, so ist beim ARDS eine Lungensurfactant-Fehlfunktion durch die auf unterschiedlichen Ätiologien basierende Erkrankung der Lunge hervorgerufen. Auslösende Ursachen für ein ALI (Acute Lung Injury) einschließlich ARDS können beispielsweise sein (zit. nach Harrison's Principles of Internal Medicine 10th Ed 1983 McGraw-Hill Int. Book Comp.) diffuse pulmonale Infektionen (z.B. durch Viren, Bakterien, Pilze), Aspiration von z.B. Magensaft oder bei Beinahe-Ertrinken, Inhalation von Toxinen oder Irritantien (z.B. Chlorgas, Stickoxide, Brandrauch), direktes oder indirektes Trauma (z.B. multiple Frakturen bzw. Lungenkontusion), systemische Reaktionen auf Entzündungen außerhalb der Lunge (z.B. hämorrhagische Pankreatitis, gram-negative Septikämie), Transfusionen hoher Blutvolumen oder auch nach kardiopulmonalem Bypass.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich nicht nur zur Behandlung oder Prophylaxe von IRDS bei Frühgeborenen und zur Behandlung und Prophylaxe von ALI einschließlich ARDS bei Erwachsenen sondern auch zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD (chronic obstructive pulmonary disease), Asthma und cystischer Fibrose. Außerdem eignen sich die erfindungsgemäßen Surfactant-Proteine und die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Schlepper für die Verabreichung anderer Arzneistoffe.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erfolgt auf dem Fachmann bekannte Weise, vorzugsweise durch intratracheale Instillation (Infusion oder Bolus) oder in Form einer Vernebelung. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für die Verabreichung in einem geeigneten Lösungsmittel oder Resuspendiermedium gelöst bzw. suspendiert, insbesondere wenn die Zusammensetzungen in lyophilisierter oder sprühgetrockneter Form vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem geeigneten Resuspendiermedium um physiologische Kochsalzlösung. Es erweist sich als vorteilhaft, Suspensionen bzw. Lösungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu verabreichen, die 12,5 bis 100 mg Phospholipide pro ml Suspension enthalten. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen pro Applikation in einer solchen Menge verabreicht, daß die Menge an Phospholipiden zwischen 12,5 und 200 mg pro Kilogramm Körpergewicht beträgt. Die Verabreichung erfolgt in der Regel ein- bis dreimal täglich über einen Zeitraum von 1 bis 7 Tagen. Gewünschtenfalls kann vor der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine bronchoalveoläre Lavage, vorzugsweise mit verdünnter Lungensurfactant-Zusammensetzung durchgeführt werden. Eine solche Vorgehensweise ist beispielsweise beschrieben in Gommers et al. [Bronchoalveolar lavage with a diluted surfactant suspension prior to surfactant instillation improves the effectiveness of a surfactant therapy in experimental acute respiratory distress syndrome (ARDS), Intensive Care Med. 1998, 24:494-500] und in der WO98/49191.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystischer Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) in Säugern, insbesondere Menschen, durch Verabreichung einer geeigneten Menge einer erfindungsgemäßen Lungensurfactant-Zusammensetzung.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Surfactant-Proteine zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen (Arzneimitteln) zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystischer Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) in Säugern, insbesondere Menschen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Handelsprodukt, bestehend aus einem üblichen Sekundär packmittel, einem die pharmazeutische Zusammensetzung enthaltenden Primärpackmittel (beispielsweise eine Ampulle) und gewünschtenfalls einem Beipackzettel, wobei die pharmazeutischen Zubereitung geeignet ist zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystischer Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) und wobei auf dem Sekundärpackmittel oder auf dem Beipackzettel des Handelsprodukts auf die Eignung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung der genannten Krankheiten hingewiesen wird, und wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens einen erfindungsgemäßen SP-C Ester zusammen mit geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoffen umfaßt. Das Sekundärpackmittel, das die pharmazeutische Zusammensetzung enthaltende Primärpackmittel und der Beipackzettel entsprechen ansonsten dem, was der Fachmann als Standard für pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Art ansehen würde.
Pharmakologische Untersuchungen
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung enthaltend rSP-C (FF/I) Methylester (nachfolgend als Charge LLÜ139 bezeichnet) und eine erfindungsgemäße Zusammensetzung enthaltend eine Kombination aus rSP-C (FF/I) Methylester und rSP-C (FF/I) (unverestert) im Gewichtsverhältnis (bezogen auf die Gesamtmenge an Surfactant-Protein in der Zusammensetzung) von 5 zu 95 (nachfolgend als Charge ERa8 bezeichnet) wurden in einem von Häfner et al. beschriebenen Modell [D. Häfner, P.-G. Germann and D. Hauschke: Effects of rSP-C surfactant on oxygenation and histology in a rat-lunglavage model of acute Jung injury. Am. J. Resp. Crit Care Med. 158, 270-278 (1998)] untersucht. Die beiden Chargen wurden im RLL-Modell nach Spätbehandlung (Gabe 1 h nach der letzten Lavage) in den Dosierungen 12,5, 25, 50 und 100 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht eingesetzt. Beide Chargen zeigen eine deutliche Verbesserung der Oxygenierung gegenüber Kontrollen, die nicht behandelt wurden. Die Effekte sind dosisabhängig. Die Werte liegen speziell bei Dosierungen von 50 und 100 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht im Bereich der Ausgangswerte nicht-lavagierter Ratten.
Figurenbeschreibung
1 zeigt graphisch den Einfluß einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltend rSP-C (FF/I) Methylester (LLÜ139) und einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltend eine Kombination aus rSP-C (FF/I) Methylester und rSP-C (FF/I) (unverestert) im Gewichtsverhältnis von 5 zu 95 (Era8) für Dosierungen mit 12,5, 25, 50 und 100 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht auf die Oxygenierung in einem von Häfner et al. beschriebenen Modell [D. Häfner, P.-G. Germann and D. Hauschke: Effects of rSP-C surfactant on oxygenation and histology in a rat-lung-lavage model of acute lung injury. Am. J. Resp. Crit Care Med. 158, 270-278 (1998)]. Die Dosis 0 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht gibt die Oxygenierung unbehandelter Kontrollen wieder.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Surfactant-Protein C, wobei die Aminosäure am Carboxyterminus des Surfactant-Proteins mit einem Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen verestert ist und pharmakologisch verträgliche Salze davon.
Surfactant-Protein C nach Anspruch 1, wobei es sich um ein Surfactant-Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3 der Formel 1 handelt,
worin A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe oder Trp und C für Ile, Leu oder Ser stehen.
Surfactant-Protein C nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe und C für Ile stehen.
Surfactant-Protein C nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß A abwesend ist, B für Phe und C für Ile stehen.
Surfactant-Protein C nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Alkohol um Methanol oder 2-Propanol handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystischer Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) in Säugern, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem Surfactant-Protein C Ester nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein weiteres Surfactant-Protein aus der Gruppe SP-A, unverestertes SP-C und SP-B enthalten ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß rSP-C (FF/I) enthalten ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Phospholipide, Fettsäuren und Elektrolyte enthalten sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß bezogen auf das Trockengewicht der Zusammensetzung 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,2 bis 5 Gew.-% Surfactant-Protein, 2 bis 15 Gew.-% Fettsäuren und 0 bis 5 Gew.-% Elektrolyte enthalten sind.