ES2278609T3 - Esteres tensioactivos de la proteina c. - Google Patents
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Abstract
Una proteína C tensioactiva en la cual el aminoácido en el término carboxi de la proteína tensioactiva está esterificado con un alcohol que tiene 1-4 átomos de carbono, o sales farmacológicamente aceptables de la misma.
Description
Ésteres tensioactivos de la proteína C.
La invención se refiere a polipéptidos activos
como agentes tensioactivos pulmonares (proteínas tensioactivas), a
procesos para su preparación y a composiciones farmacéuticas que los
contienen.
Los pulmones de todos los vertebrados contienen
una mezcla de sustancias denominada "agente tensioactivo
pulmonar". El mismo tiene propiedades tensioactivas y reduce la
tensión superficial en la región alveolar de los pulmones en tal
grado que se evita el colapso de las regiones finales del tracto
respiratorio durante la espiración. Esta mezcla de sustancias
regula dinámicamente la tensión superficial, de tal modo que el
colapso de los pequeños alvéolos, que puede esperarse de acuerdo
con la ley de Laplace, se evita a favor de los mayores, por ajuste
apropiado de la tensión superficial. Esto proporciona como resultado
una estructura bien equilibrada, histológica y fisiológicamente
estable del pulmón.
El agente tensioactivo pulmonar es secretado por
los neumocitos alveolares de tipo II en forma de cuerpos laminares.
Éstos son unidades compactas de bicapas fosfolipídicas que tienen
una proporción elevada de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y
fosfatidilglicerol. Como componentes esenciales adicionales, el
agente tensioactivo pulmonar contiene proteínas designadas
SP-A, SP-B, SP-C y
SP-D (Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for
Pulmonary Surfactant-Associated Proteins. Am. Rev.
Respir. Dis. 1988, 138, 990-998). SPA es una
glicoproteína de peso molecular elevado que juega un papel decisivo
en la regulación de la secreción.
Durante la formación de la película
monomolecular superficial (el agente tensioactivo en sentido
estricto), las proteínas SP-C y, en menor grado,
SP-B, juegan el papel de "catalizadores
termodinámicos": La presencia de estas proteínas acelera
enormemente la cinética de la propagación. Sólo debido a esto, el
ajuste del agente tensioactivo a los requisitos de tensión
superficial prevalecientes es posible sin retardo. Estas propiedades
se reflejan en el carácter extremadamente hidrófobo de las
proteínas, en particular de SP-C.
Por extracción de tejido pulmonar o lavado de
pulmones animales, ha sido posible obtener preparaciones del agente
tensioactivo que son capaces de compensar un déficit de agente
tensioactivo tanto en aparatos de medida
físico-químicos como en modelos animales y asimismo
en uso clínico, y son por tanto adecuadas, por ejemplo, para la
terapia del síndrome de dificultad respiratoria infantil (IRDS). Sin
embargo, estas preparaciones animales presentan serios
inconvenientes:
La composición fosfolipídica depende fuertemente
de la especie animal y del estado de salud y nutrición del animal,
y la compensación por mezcla de componentes definidos es únicamente
posible en grado limitado. El contenido de proteína tensioactiva y
la relación SP-B/SP-C se ven
sometidos a las mismas variaciones. Adicionalmente, los productos
de degradación proteolítica de las proteínas o derivados modificados
(por ejemplo por oxidación en la metionina) pueden estar presentes
también en la mezcla que se utiliza terapéuticamente. En casos de
utilización a largo plazo o de la administración de grandes
cantidades de agente tensioactivo, que podrían ser requeridas, por
ejemplo, en casos del síndrome de dificultad respiratoria de los
adultos (pulmón de choque, ARDS) o en otras áreas de utilización,
por ejemplo el uso de agente tensioactivo para "arrastrar"
otras sustancias en administración pulmonar, sigue sin resolver la
cuestión del suministro de la sustancia.
Por consiguiente, sería apropiado resolver estos
problemas por preparación de las proteínas por ingeniería genética.
Dado que las proteínas recombinantes, en particular cuando se
utilizan sistemas de expresión bacterianos, pueden prepararse
virtualmente en cantidades ilimitadas, y que es posible el uso de
métodos modernos de análisis y controles de calidad, puede
prepararse un agente tensioactivo que tenga una composición
exactamente definida utilizando fosfolípidos sintéticos. Este
agente tensioactivo puede adaptarse óptimamente a los requerimientos
terapéuticos.
La parte central de la proteína humana
SP-C, (SEQ ID NO:1, véase la fórmula I más adelante,
donde A = ausente o Phe, B = Cys y C = Met), que es particularmente
importante para la cinética de la propagación, está constituida
exclusivamente por aminoácidos alifáticos, altamente hidrófobos,
tales como valina, leucina e isoleucina. La longitud de esta parte
central (aminoácidos 12-34 en la fórmula I) permite
la integración del péptido en la película monomolecular del
fosfolípido. Los dos radicales Cys en la secuencia SEQ ID NO:2
Pro-Cys-Cys-Pro
(posición 3-6 en la fórmula I) están
tioesterificados en los grupos SH por ácido palmítico. El ácido
palmítico aumenta aún más el carácter hidrófobo de la proteína
entera y al mismo tiempo bloquea los dos grupos SH de las
cisteínas, protegiendo las mismas contra la oxidación y la formación
de puentes disulfuro. La región central (aminoácidos
13-34 en la fórmula I) forma una hélice
transmembranal. El término N de esta región está flanqueado por una
secuencia polar que contiene aminoácidos cargados positivamente
(Lys, 10; Arg 11 en la fórmula I).
Los documentos WO 89/04326 y WO 91/18015
describen la preparación de SP-C recombinante y de
mutantes de SP-C. En estas publicaciones, se
propone, entre otras cosas, reemplazar las dos cisteínas en las
posiciones 4 y 5 por dos radicales serina. En la preparación, esto
tiene la ventaja de que puede prescindirse de la palmitoilación
técnicamente complicada de las dos cisteínas después del aislamiento
de la proteína altamente hidrófoba.
El documento WO 95/32992 describe mutantes de
SP-C que difieren de la SP-C humana
en que las dos cisteínas en las posiciones 4 y 5 están reemplazadas
por fenilalanina o triptófano y la metionina en la posición 32 está
reemplazada por isoleucina, leucina o serina.
El documento US 5.876.970 describe, inter
alia, el análisis por espectrometría de masas de la proteína C
del agente tensioactivo aislada de diversas fuentes naturales. Se
menciona que, durante el tratamiento de las muestras de
SP-C para la espectrometría de masas, puede haberse
formado un éster metílico o isopropílico.
El documento
EP-A-0 458 167 describe un método
para modificar químicamente una proteína o polipéptidos
tensioactivos pulmonares con diversos ácidos grasos.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar proteínas tensioactivas adicionales adecuadas para la
producción de preparaciones farmacéuticas de agente tensioactivo
pulmonar. Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que
polipéptidos SP-C que están esterificados en el
término carboxi con alcoholes que tienen 1-4 átomos
de carbono tienen, en primer lugar, propiedades ventajosas con
respecto a su actividad tensioactiva pulmonar y, en segundo lugar,
propiedades ventajosas con respecto a su estabilidad. En particular,
los ésteres de SP-C de acuerdo con la invención
tienen una tendencia baja a agregarse y, de acuerdo con ello, una
estabilidad mejorada en solución.
Un aspecto de la invención se refiere por tanto
a polipéptidos SP-C en los cuales el aminoácido en
el término carboxi del polipéptido está esterificado con un alcohol
que tiene 1-+4 átomos de carbono, y sales de los mismos.
En el contexto de la invención, el término
"SP-C" debe entenderse, por analogía a la
nomenclatura propuesta por Possmayer (Possmayer, F.: A Proposed
Nomenclature for Pulmonary Surfactant-Associated
Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138,
990-998), como la "familia" de proteínas
tensioactivas que está presente en el agente tensioactivo pulmonar
natural o en el fluido amniótico de los mamíferos y designada
SP-C. SP-C debe entenderse
preferiblemente con el significado de la proteína tensioactiva
SP-C que está presente en el agente tensioactivo
pulmonar humano o en el fluido amniótico humano.
Adicionalmente, el término
"SP-C" incluye también SP-C y
modificaciones de SP-C sintetizado(as)
químicamente o preparado(as) por métodos recombinantes, por
ejemplo aquellas modificaciones en las cuales están ausentes uno o
más aminoácidos o han sido reemplazados por otros aminoácidos.
SP-C y modificaciones de SP-C
sintetizado(as) químicamente o preparado(as) por
medios recombinantes se describen, por ejemplo, en los documentos WO
89/04326, WO 91/00871, WO 91/18015, WO 93/21225 y también en WO
95/32992.
En una realización preferida de la invención,
SP-C debe entenderse con el significado de una
proteína tensioactiva conocida por el documento WO 95/32992 con la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 de la fórmula I
en la cual A está ausente o es Phe,
B es Phe o Trp y C es Ile, Leu o
Ser.
Se da preferencia a aquellas proteínas
tensioactivas de la fórmula I en las cuales A está ausente o es Phe,
B es Phe y C es Ile. Se da una preferencia particular a una
proteína tensioactiva de la fórmula I en la cual A está ausente, B
es Phe y C es Ile [a la que se hace referencia también en lo
sucesivo como SP-C (FF/I) o rSP-C
(FF/I)].
Las secuencias de aminoácidos se muestran en la
notación abreviada habitual (código de tres letras) de acuerdo con
la nomenclatura, con el aminoácido que lleva el grupo amino libre en
el extremo izquierdo (término amino; aminoácido del número 0 ó 1 en
la fórmula I) y el aminoácido que lleva el grupo carboxilo libre en
el extremo derecho (término carboxi; aminoácido del número 34 en la
fórmula I).
En una mezcla con fosfolípidos, los ésteres de
SP-C de acuerdo con la invención tienen actividad de
agente tensioactivo pulmonar. La actividad de agente tensioactivo
pulmonar puede determinarse de una manera conocida por las personas
expertas en la técnica. El agente tensioactivo pulmonar natural
tiene propiedades tensioactivas; el mismo reduce, por ejemplo, la
tensión superficial en los alvéolos pulmonares. Un ensayo simple y
rápido in vitro para la determinación de la actividad
superficial de las preparaciones de agente tensioactivo pulmonar
es, por ejemplo, el denominado equilibrio de Wilhelmy
[Go-erke, J. Biochim. Biophys. Acta, 344:
241-261 (1974), King R.J. y Clements J.A., Am. J.
Physiol. 223: 715-726 (1972)]. Este método
proporciona una indicación de la calidad del agente tensioactivo
pulmonar, medida como la capacidad de un agente tensioactivo
pulmonar para alcanzar una tensión superficial de aproximadamente
cero mN/m. Otro dispositivo de medida para determinar la actividad
superficial del agente tensioactivo pulmonar es el "surfactómetro
de burbuja pulsante" [Possmayer F., Yu S. y Weber M., Prog.
Resp. Res., Ed. v. Wichert, vol. 18: 112-120
(1984)]. La actividad de una composición de agente tensioactivo
pulmonar puede determinarse también por medio de ensayos in
vivo. Por medida de, por ejemplo, la elasticidad pulmonar, el
intercambio de gases de la sangre o las presiones respiratorias
necesarias en modelos animales de ARDS e IRDS, es posible obtener
una indicación de la actividad de un agente tensioactivo pulmonar.
Un modelo de este tipo se describe, por ejemplo, por Häfner et
al. (D. Häfner et al.: Effects of rSP-C
surfactant on oxygenation and histology in a rat lung lavage model
of acute lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158:
270-278).
En el contexto de la invención, un alcohol que
tiene 1-4 átomos de carbono debe entenderse con el
significado, en particular de un alcohol alifático que tiene
1-4 átomos de carbono. Metanol, etanol,
1-propanol, 2-propanol
(isopropanol), 1-butanol y 2-butanol
pueden ser mencionados aquí, siendo preferidos metanol y 2
propanol.
Sales adecuadas para los ésteres de
SP-C de acuerdo con la invención son, en particular,
sales de adición de ácido con ácidos. Puede hacerse mención
particular de las sales farmacológicamente aceptables de los ácidos
fuertes utilizados habitualmente en farmacia. Son adecuadas,
ventajosamente, sales de adición de ácido con ácidos tales como,
por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y ácido sulfúrico,
donde, en la preparación de la sal, los ácidos se emplean en una
relación equimolar o una relación que difiere de ésta - dependiendo
de si se trata de un ácido mono- o polibásico y de la sal que se
desee.
El éster de SP-C puede
prepararse a partir de la proteína C tensioactiva correspondiente
que tiene el grupo carboxilo libre en el término carboxi, por
reacción con el alcohol apropiado en condiciones de esterificación
adecuadas. La invención, de acuerdo con ello, proporciona también un
proceso para preparar los ésteres de SP-C de
acuerdo con la invención por reacción de la proteína tensioactiva C
correspondiente que tiene el grupo carboxilo libre en el término
carboxi con un alcohol deseado en condiciones adecuadas de
esterificación. Se da preferencia a emplear un gran exceso de
alcohol como disolvente y a realizar la esterificación con la ayuda
de un ácido. Con respecto al carácter hidrófobo de las proteínas
tensioactivas, es ventajoso emplear el alcohol en una mezcla con
otros disolventes orgánicos. Estos otros disolventes orgánicos son
preferiblemente hidrocarburos halogenados, tales como, por ejemplo,
cloroformo y diclorometano. Ácidos adecuados son, en particular,
ácidos fuertes tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido
sulfúrico o ácido bromhídrico. Para evitar la formación de
productos de descomposición, la esterificación se lleva a cabo
preferiblemente a las temperaturas del ambiente o temperaturas
inferiores. Después de la esterificación, los ésteres resultantes se
aíslan de manera habitual y, en caso apropiado, se purifican, por
ejemplo por cromatografía en columna son un disolvente adecuado (por
ejemplo como se describe en los documentos WO 95/32992 o WO
92/00993). El aislamiento o la preparación de proteínas C
tensioactivas ilustrativas que pueden utilizarse como materiales de
partida para la esterificación se describe, por ejemplo, en los
documentos WO 89/04326, WO 91/00871, WO 91/18015, WO 93/21225 o
incluso en WO 95/32292. La preparación de rSP-C
(FF/I) se describe en el documento WO 95/32992. Es posible, por
ejemplo, procesar las soluciones de rSP-C (FF/I)
obtenidas en dicho lugar después de purificación cromatográfica de
la proteína (véase el documento WO 95/32992, página 10, segundo
párrafo) para dar directamente los ésteres de rSP-C
(FF/I) correspondientes.
Los ésteres de SP-C de acuerdo
con la invención pueden, solos o en combinación entre ellos,
proporcionarse en composiciones farmacéuticas que están adaptadas a
los requerimientos del tratamiento del tracto respiratorio. Puede
mencionarse la combinación de los ésteres de SP-C de
acuerdo con la invención con al menos otro polipéptido activo como
agente tensioactivo pulmonar del grupo SP-A,
SP-C no esterificado y SP-B en
composiciones farmacéuticas. En particular, puede mencionarse aquí
la combinación con SP-C no esterificado en
composiciones farmacéuticas. Se da preferencia a combinaciones que
(basado en la cantidad total de proteína tensioactiva en las
composiciones) comprenden hasta 50% en peso de SP-C
(no esterificado), siendo el resto uno o más ésteres de
SP-C de acuerdo con la invención, o combinaciones
que comprenden hasta 50% en peso de uno o más de los ésteres de
SP-C de acuerdo con la invención, siendo el resto
SP-C (no esterificado). Se da preferencia particular
a combinaciones que comprenden 5 a 15% en peso de
SP-C (no esterificado), siendo el resto uno o más de
los ésteres de SP-C de acuerdo con la invención, o
combinaciones que comprenden 0,5 a 10% en peso de uno o más de los
ésteres de SP-C de acuerdo con la invención, siendo
el resto SP-C (no esterificado), en particular
aquéllas que comprenden 2 a 5% en peso de ésteres de
SP-C, siendo el resto SP-C (no
esterificado). Se da preferencia en este contexto a la combinación
de ésteres de rSP-C (FF/I) y rSP-C
(FF/I) en forma no esterificada. Combinaciones ilustrativas
comprenden 1-6% en peso de éster metílico de
rSP-C (FF/I), siendo el resto rSP-C
(FF/I) en forma no esterificada. Tales combinaciones pueden
obtenerse, por ejemplo, directamente por la reacción de
esterificación de SP-C si la reacción de
esterificación se interrumpe antes que se alcance la conversión
completa, o por mezcla de los componentes puros de la combinación
apropiados.
Además de la proteína tensioactiva, las
composiciones comprenden fosfolípidos, preferiblemente fosfolípidos
que están contenidos en composiciones naturales de agente
tensioactivo pulmonar, tales como, preferiblemente,
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), palmitoiloleilfosfatidilglicerol
(POPG) y/o fosfatidilglicerol (PG). Componentes posibles
adicionales de las composiciones de acuerdo con la invención son
ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmítico. Para
ajustar la viscosidad favorable, las composiciones pueden comprender
electrólitos, tales como sales de calcio, magnesio y/o sodio (por
ejemplo cloruro de calcio, cloruro de sodio, y/o bicarbonato de
sodio). Cuando se determinan el tipo y las cantidades de los
componentes individuales de las composiciones, la persona experta
en la técnica utiliza, por una parte, la composición conocida de los
agentes tensioactivos pulmonares naturales y, por otra parte, las
numerosas propuestas realizadas en la técnica anterior, tales como,
por ejemplo, los documentos EP-A 0119056 y
EP-A 0406732, para orientación.
Las preparaciones de acuerdo con la invención
comprenden convenientemente 80 a 95% en peso de fosfolípidos, 0,2 a
5% en peso de proteína tensioactiva, 2 a 15% en peso de ácidos
grasos y 0 a 5% en peso de electrólitos (basado en el peso
seco).
Los fosfolípidos son preferiblemente mezclas de
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y
palmitoiloleilfosfatidilglicerol (POPG), particularmente en una
relación (relación en peso) de 7 a 3 a 3 a 7.
Preparaciones preferidas de acuerdo con la
invención comprenden 80 a 95% en peso de fosfolípidos, 0,5 a 3,0%
en peso de proteína tensioactiva, 3 a 15% en peso de ácido graso,
preferiblemente ácido palmítico, y 0 a 3% en peso de cloruro de
calcio (basado en el peso seco).
Composiciones preferidas de acuerdo con la
invención comprenden 80 a 95% en peso de fosfolípidos, 0,5 a 3,0%
en peso de proteína tensioactiva, 4 a 7% en peso de ácido graso,
preferible ácido palmítico, y 1 a 3% en peso de cloruro de
calcio.
Las preparaciones de acuerdo con la invención se
producen de una manera conocida por las personas expertas en la
técnica, por ejemplo por incorporación de la proteína tensioactiva
en una matriz de fosfolípido como se describe en el documento WO
95/32992. De acuerdo con la invención, las preparaciones de agente
tensioactivo pulmonar se proporcionan preferiblemente en forma
liofilizada y en particular en forma secada por pulverización. Las
preparaciones liofilizadas son conocidas, por ejemplo, por los
documentos WO 97/35882, WO 95/32992, WO 91/100871 y DE 3229179. El
documento WO 97/26863 describe un proceso para producir
preparaciones pulverulentas de agente tensioactivo pulmonar
mediante secado por pulverización. De acuerdo con la invención, se
da preferencia a preparaciones producidas de esta manera.
En un embudo separador, se mezclan 5 fracciones
(de 1 l) de las soluciones rSPC(FF/I) puras obtenidas de
acuerdo con el documento WO 95/32992 por cromatografía HPLC, con
500 ml de cloroformo y 300 ml de ácido clorhídrico 1 N y se mezcla
concienzudamente, y la fase acuosa se retira, después de la
separación de las fases. Se diluye la fase orgánica con metanol
hasta 1 l y se lava una vez más con 300 ml de ácido clorhídrico 1 N.
Después de la separación de fases, la fase orgánica se diluye de
nuevo con metanol hasta 1 l, y se ajusta el pH de la solución a
aproximadamente pH 1 utilizando ácido clorhídrico conc. Se deja la
mezcla en reposo a la temperatura ambiente durante 2 días, y se
eliminan luego aproximadamente 300 ml de mezcla disolvente por
destilación utilizando un evaporador rotativo. Después de 3 días
más a la temperatura ambiente, ya no es posible detectar
rSPC(FF/I) no esterificado por HPTLC (placas de HPTLC Diol
listas para ser utilizadas (Merck); fase móvil,
cloroformo:metanol:amoniaco (25%):H_{2}O = 13:6:0,4:0,8; tinción:
Azul Coomassie). La solución se extrae dos veces, en cada caso con
300 ml de ácido clorhídrico 0,1 N, y la fase orgánica, después de la
separación de fases, se diluye en cada caso con
2-propanol hasta aproximadamente 700 ml. El pH de la
solución se ajusta con NaHCO_{3} saturado a pH
3,5-4. Se concentra la solución un total de 4 veces
a 20-25ºC hasta 250 ml utilizando un evaporador
rotativo y, en cada caso, se lleva hasta 500 ml utilizando
2-propanol. La filtración da por último una solución
de aproximadamente 200 mg de éster metílico de rSPC(FF/I) en
2-propanol que se guarda a -20ºC. El espectro de
masas (MALDI-TOF) muestra el pico molecular MH^{+}
a 3634 Da.
En un embudo separador, se mezclan 6 fracciones
(1,2 l) de las soluciones rSPC(FF/I) puras obtenidas de
acuerdo con el documento WO 95/32992 por cromatografía HPLC con 600
ml de cloroformo y 400 ml de ácido clorhídrico 1 N y se mezcla
concienzudamente, y la fase acuosa se retira después de la
separación de fases. La fase orgánica se diluye con
2-propanol hasta 1,2 l, y el pH se ajusta luego a
0,5-1 utilizando ácido clorhídrico conc. La mezcla
se deja en reposo a la temperatura ambiente durante 1 día, y se
eliminan luego por destilación aproximadamente 300 ml de la mezcla
disolvente a 20-25ºC utilizando un evaporador
rotativa, y se reemplazan por 300 ml de 2-propanol.
Este procedimiento se repite después de 3, 6, 9 y 12 días de reposo
a la temperatura ambiente. Por HPTLC (véase el Ejemplo 1), es luego
virtualmente imposible detectar cualquier cantidad de
rSPC(FF/I) no esterificado. El pH de la solución se ajusta a
3,5-4 utilizando solución saturada de NaHCO_{3},
y la solución se concentra luego a 500 ml utilizando un evaporador
rotativo. La filtración da una solución de aproximadamente 250 mg
de éster 2-propílico de rSPC(FF/I) en
2-propanol que se guarda a -20ºC. El espectro de
masas (MALDI-TOF) muestra el pico molecular
MH^{+} a 3662 Da.
Se mezcla éster metílico o
2-propílico de rSP-C(FF/I) en
una solución de isopropanol con los componentes de la matriz de
fosfolípido y, por pulverización en una solución diluida de cloruro
de sodio (0,065% p/p de NaCl) a la temperatura ambiente se
precipita como una mezcla homogénea con los componentes de la matriz
de fosfolípido. A partir de la suspensión de agente tensioactivo
pulmonar, se separa el agente tensioactivo pulmonar (LSF)
utilizando una centrífuga de cubetas y se resuspende en solución
electrolítica (NaCl, CaCl_{2}), después de lo cual se ajusta el
pH a pH 6,5 utilizando NaOH 0,1 N. Esta suspensión acuosa se
introduce en viales de 20 ml y se liofiliza. Los pesos y volúmenes
indicados en el ejemplo de preparación siguiente están basados en
la preparación de 10 g de preparación de agente tensioactivo
pulmonar:
Se disuelven a 40ºC 7,00 g de
dipalmitolilfosfatidilcolina (OPCC), 3,08 g de sal amónica de
palmitoiloleilfosfatidil-glicerol (POPG x NH_{4})
y 0,25 g de ácido palmítico en 200 ml de isopropanol al 90%, y la
mezcla se enfría luego a la temperatura ambiente. La solución de
fosfolípido resultante se combina con 1 l de una solución que
comprende 200 mg de éster metílico o 2-propílico de
SP-C(FF/I). La "solución de
pulverización" resultante se ajusta a pH 4,5 por agitación con
solución de bicarbonato (aproximadamente 5 ml de solución de
NaHCO_{3} al 5%).
A la temperatura ambiente, se introduce la
"solución de pulverización" con agitación enérgica por medio de
una tobera de una sola sustancia a una velocidad de pulverización
de 25 ml/min en 9,6 l de solución diluida de NaCl (0,065% p/p). Se
forma una solución opalescente a partir de la cual, después de 2
horas de almacenamiento a 4ºC - 8ºC, se precipita la preparación
del agente tensioactivo pulmonar por pulverización en una solución
electrolítica
(3,0 g CaCl_{2} x 2H_{2}O y 61,3 g de NaCl en 300 ml de H_{2}O). La suspensión de agente tensioactivo pulmonar (volumen total 10,8-11,0 l) se guarda a 4ºC durante una noche y se centrifuga luego durante30 minutos en cada caso, utilizando una centrífuga de cubetas Sorvall (RC2-B) a 16.000 g. En cada caso, la torta de centrifugación se resuspende, a fin de eliminar el isopropanol adherente residual, en la mitad de su volumen de solución de cloruro de sodio de concentración 0,65% y se centrifuga de nuevo. Este procedimiento se repite un total de 3-4 veces. La torta de la última centrifugación se recoge en 400 ml de una solución de NaCl de concentración 0,65%, se ajusta a pH 6,5 utilizando NaOH 0,1 N y se divide, en porciones de 6,2 g, en viales de 20 ml. El contenido de los viales se liofiliza como sigue: congelación a -45ºC y a la presión atmosférica durante 6 horas, liofilización a 0,16 mbar y -20ºC durante 54 horas y posteriormente, para secado intensivo adicional, otras 5 horas a -20ºC y 0,02 mbar.
(3,0 g CaCl_{2} x 2H_{2}O y 61,3 g de NaCl en 300 ml de H_{2}O). La suspensión de agente tensioactivo pulmonar (volumen total 10,8-11,0 l) se guarda a 4ºC durante una noche y se centrifuga luego durante30 minutos en cada caso, utilizando una centrífuga de cubetas Sorvall (RC2-B) a 16.000 g. En cada caso, la torta de centrifugación se resuspende, a fin de eliminar el isopropanol adherente residual, en la mitad de su volumen de solución de cloruro de sodio de concentración 0,65% y se centrifuga de nuevo. Este procedimiento se repite un total de 3-4 veces. La torta de la última centrifugación se recoge en 400 ml de una solución de NaCl de concentración 0,65%, se ajusta a pH 6,5 utilizando NaOH 0,1 N y se divide, en porciones de 6,2 g, en viales de 20 ml. El contenido de los viales se liofiliza como sigue: congelación a -45ºC y a la presión atmosférica durante 6 horas, liofilización a 0,16 mbar y -20ºC durante 54 horas y posteriormente, para secado intensivo adicional, otras 5 horas a -20ºC y 0,02 mbar.
Esto proporciona 65-66 viales,
cada uno de los cuales contiene 0,150 g de agente tensioactivo
pulmonar (calculado sin NaCl).
Las muestras de agente tensioactivo pulmonar
seco se guardan en un frigorífico a 4ºC y deben resuspenderse con
agua o solución salina fisiológica antes de su utilización
(concentración de la suspensión, 25 mg/ml).
Cada vial contiene:
- 95,6 mg
- de dipalmitoilfosfatidilcolina
- 42,1 mg
- de palmitoiloleilfosfatidilglicerol (sal de amonio)
- 2,7 mg
- de éster metílico o 2-propílico de rSP-C(FF/I)
- 6,8 mg
- de ácido palmítico
- 2,9 mg
- de cloruro de calcio (anhidro)
\vskip1.000000\baselineskip
Se producen preparaciones pulverulentas de
agente tensioactivo pulmonar por el proceso descrito en el documento
WO 97/26863.
Ejemplo
A
A 50ºC, se disuelven 10,95 g de
1,2-dipalmitoil-3-sn-fosfatidilcolina,
4,6 g de
1-palmitoil-2-oleoil-3-sn-fosfatidilglicerol-amonio,
418 mg de cloruro de calcio dihidratado y 750 mg de ácido palmítico
en 330 ml de 2-propanol/agua (85:15) y, después de
enfriar a 30ºC, se mezclan con 620 ml de una solución de éster
2-propilíco de rSP-C(FF/I) en
isopropanol/agua (95:5, c = 484 mg/l). La solución resultante se
seca por pulverización en un secador de pulverización de laboratorio
Büchi B191. Condiciones de pulverización: gas para secado:
nitrógeno, temperatura de entrada: 100ºC, temperatura de salida:
58-60ºC. Esto proporciona un polvo incoloro.
\newpage
Ejemplo
B
A 50ºC, se disuelven 3,74 g (5,1 mmol) de
1,2-dipalmitoil-3-sn-fosfatidilcolina,
2,81 g (3,7 mmol) de
1-palmitoil-2-oleoil-3-sn-fosfatidilcolina,
2,90 g (3,9 mmol) de
1,2-dipalmitoilfosfatidil-3-sn-fosfatidil-glicerol-sodio,
234 mg de ácido palmítico y 279 mg (1,9 mmol) de cloruro de calcio
dihidratado en 160 ml de 2-propanol/agua (85:15) y,
después de enfriar a 30ºC, se mezcla a 30ºC con 566 ml de una
solución de éster metílico de rSP-C(FF/I) en
isopropanol/agua (92:8, c = 330 mg/l). La solución resultante se
seca por pulverización en un secador de pulverización de laboratorio
Büchi B 191. Condiciones de pulverización: gas para secado:
nitrógeno, temperatura de entrada: 90ºC, temperatura de salida:
58-60ºC. Esto proporciona un polvo incoloro.
El síndrome de dificultad respiratoria de los
adultos (ARDS) es una expresión descriptiva que se aplica a un gran
número de lesiones pulmonares agudas, difusamente infiltrantes de
etiología diferente si las mismas están asociadas con un trastorno
severo del intercambio de gases (en particular hipoxemia arterial).
La expresión ARDS se utiliza debido a las numerosas características
clínicas y patológicas comunes con el síndrome de dificultad
respiratoria infantil (IRDS). Si, en el caso del IRDS, es
predominante, la deficiencia de agente tensioactivo pulmonar
causada por un parto prematuro, en el caso del ARDS una disfunción
del agente tensioactivo pulmonar está causada por un trastorno
pulmonar basado en etiologías diferentes. Las causas del
desencadenamiento de una ALI (lesión pulmonar aguda) con inclusión
de ARDS pueden ser, por ejemplo (citado de acuerdo con Harrison's
Principles of Internal Medicine, 10ª edición, 1983
McGraw-Hill Int. Book Comp.) infecciones pulmonares
difusas (debidas por ejemplo a virus, bacterias, hongos),
aspiración de, por ejemplo, jugo gástrico o, en el caso de
cuasi-ahogamiento, inhalación de toxinas o irritantes (por
ejemplo cloro gaseoso, óxidos de nitrógeno, humo), traumatismos
directos o indirectos (por ejemplo fracturas múltiples o contusión
pulmonar), reacciones sistémicas a inflamaciones exteriores al
pulmón (por ejemplo pancreatitis hemorrágica, septicemia
gram-negativa), transfusiones de volúmenes de
sangre elevados o, alternativamente, después de derivación
cardiopulmonar.
Las composiciones de acuerdo con la invención
son adecuadas no sólo para el tratamiento o la profilaxis del IRDS
en los bebés nacidos prematuramente o en el tratamiento o la
profilaxis de ALI con inclusión de ARDS en los adultos, sino
también para el tratamiento o la profilaxis de neumonía, bronquitis,
síndrome de aspiración del meconio, COPD (enfermedad pulmonar
obstructiva crónica), asma y fibrosis quística. Además, las
proteínas tensioactivas de acuerdo con la invención y las
composiciones de acuerdo con la invención son adecuadas para uso
como vehículos para la administración de otros fármacos.
La administración de las composiciones de
acuerdo con la invención se lleva a cabo de una manera conocida por
las personas expertas en la técnica, preferiblemente por instilación
intratraqueal (infusión o bolus) o en la forma de una atomización.
Para la administración, las composiciones de acuerdo con la
invención se disuelven o suspenden preferiblemente en un disolvente
o medio de resuspensión adecuado, en particular cuando las
composiciones están presentes en forma liofilizada o secada por
pulverización. El medio de resuspensión adecuado es preferiblemente
solución salina fisiológica. Se ha encontrado que es ventajoso
administrar suspensiones o soluciones de las composiciones de
acuerdo con la invención que contienen desde 12,5 a 100 mg de
fosfolípidos por ml de suspensión. Para la aplicación, las
composiciones de acuerdo con la invención se administran
preferiblemente en tal cantidad que la cantidad de fosfolípidos
está comprendida entre 12,5 y 200 mg por kilogramo de peso
corporal. La administración se realiza generalmente una sola vez a
tres veces al día a lo largo de un periodo de 1 a 7 días. Si se
desea, puede realizarse un lavado broncoalveolar, preferiblemente
con composición diluida de agente tensioactivo pulmonar, antes de
la administración de las composiciones de acuerdo con la invención.
Un procedimiento de este tipo se describe, por ejemplo, en Gommers
et al. [Bronchoalveolar lavage with a diluted surfactant
suspension prior to surfactant instillation improves the
efecctiveness of a surfactant therapy in experimental acute
respiratory distress syndrome (ARDS), Intensive Care Med. 1998, 24:
494-500] y en el documento WO 98/49191.
De acuerdo con ello, la invención proporciona
también un método para el tratamiento o la profilaxis de neumonía,
bronquitis, síndrome de aspiración del meconio, COPD, asma, fibrosis
quística, IRDS y/o ALI (con inclusión de ARDS) en los mamíferos, en
particular humanos, por administración de una cantidad adecuada de
una composición de agente tensioactivo pulmonar de acuerdo con la
invención.
La invención proporciona adicionalmente el uso
de las proteínas tensioactivas de acuerdo con la invención para
preparar composiciones farmacéuticas (medicamentos) para el
tratamiento o la profilaxis de neumonía, bronquitis, síndrome de
aspiración del meconio, COPD, asma, fibrosis quística, IRDS y/o ALI
(con inclusión de ARDS) en mamíferos, en particular humanos.
La invención proporciona adicionalmente un
producto comercial, constituido por un paquete secundario habitual,
un paquete primario que contiene la composición farmacéutica (por
ejemplo una ampolla) y, en caso deseado, un prospecto acompañante,
siendo adecuada la preparación farmacéutica para el tratamiento o la
profilaxis de neumonía, bronquitis, síndrome de aspiración del
meconio, COPD, asma, fibrosis quística, IRDS y/o ALI (con inclusión
de ARDS), viniendo indicada la idoneidad de la composición
farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de los trastornos
mencionados en el paquete secundario o el prospecto acompañante del
producto comercial, y comprendiendo la composición farmacéutica al
menos un éster de SP-C de acuerdo con la invención,
junto con adyuvantes farmacéuticos adecuados. El paquete secundario,
el paquete primario que contiene la composición farmacéutica y el
prospecto acompañante corresponden por lo demás a lo que una persona
experta en la técnica podría considerar como estándar para
composiciones farmacéuticas de este tipo.
Una composición de acuerdo con la invención que
contenía éster metílico de rSP-C(FF/I) (a la
que se hace referencia en lo sucesivo como lote LLÜ139) y una
composición de acuerdo con la invención que contenía una combinación
de éster metílico de rSP-C(FF/I) y
rSP-C(FF/I) (no esterificado) en una relación
en peso (basada en la cantidad total de proteína tensioactiva en la
composición) de 5 a 95 (a la que se hace referencia en lo sucesivo
como lote ERa8) se ensayaron en un modelo descrito por Häfner et
al. [D. Häfner, P.-G. Germann y D. Hauschke: Effects of
rSP-C surfactant on oxygenation and histology in a
rat-lug-lavage model of acute lung
injury. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 158, 270-278
(1998)]. En el modelo RLL se utilizaron los dos lotes por
tratamiento final (administración 1 hora después del último lavado)
en las dosis de 12,5, 25, 50 y 100 mg de fosfolípido por kg de peso
corporal. Ambos lotes demuestran una mejora acusada de la
oxigenación en comparación con los controles sin tratar. Los
efectos son dependientes de la dosis. Específicamente, los valores
para dosificaciones de 50 y 100 mg de fosfolípido por kg de peso
corporal están comprendidos en el intervalo de los valores iniciales
de ratas que no han sido sometidas a lavado.
Fig. 1 muestra una presentación gráfica del
efecto de una composición de acuerdo con la invención que contiene
éster metílico de rSP-C(FF/I) (LLÜ139) y una
composición de acuerdo con la invención que contiene una combinación
de éster metílico de rSP-C(FF/I) y
rSP-C(FF/I) (sin esterificar) en una relación
en peso de 5 a 95 (Era8) para dosis de 12,5, 25, 50 y 100 mg de
fosfolípido por kg de peso corporal sobre la oxigenación en un
modelo descrito por Häfner et al. [D. Häfner, P.-G. Germann
y D. Hauschke: Effects of rSP-C surfactant on
oxygenation and histology in a
rat-lug-lavage model of acute lung
injury. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 158, 270-278
(1998)]. La dosis de 0 mg de fosfolípido por kg de peso corporal
representa la oxigenación de los controles sin tratar.
<110> Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik
GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ésteres Tensioactivos de la Proteína
C
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B639WOORD0196706082
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 99111728.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-06-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Phe o no es un aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Ile Pro Cys Cys Pro Val His Leu Lys
Arg Leu Leu Ile Val}
\sac{Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val
Ile Val Gly Ala Leu Leu}
\sac{Met Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> NON_TER
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> NON TER
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Cys Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Phe o no es un aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Phe o Trp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Phe o Trp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MUTÁGENO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Ile, Leu o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Ile Pro Xaa Xaa Pro Val His Leu Lys
Arg Leu Leu Ile Val}
\sac{Val Val Val Val Val Leu Ile Val Val Val
Ile Val Gly Ala Leu Leu}
\sac{Xaa Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Una proteína C tensioactiva en la cual el
aminoácido en el término carboxi de la proteína tensioactiva está
esterificado con un alcohol que tiene 1-4 átomos de
carbono, o sales farmacológicamente aceptables de la misma.
2. La proteína C tensioactiva de acuerdo con la
reivindicación 1, que es una proteína tensioactiva que tiene la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 de la fórmula I
en la cual A está ausente o es Phe,
B es Phe o Trp y C es Ile, Leu o
Ser.
3. La proteína tensioactiva C de acuerdo con la
reivindicación 2, en donde A está ausente o es Phe, B es Phe y C es
Ile.
4. La proteína C tensioactiva de acuerdo con la
reivindicación 2, en donde A está ausente, B es Phe y C es Ile.
5. La proteína C tensioactiva de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el alcohol es metanol o
2-propanol.
6. Una composición farmacéutica para el
tratamiento o la profilaxis de neumonía, bronquitis, síndrome de
aspiración del meconio, COPD, asma, fibrosis quística, IRDS y/o ALI
(con inclusión de ARDS) en mamíferos, que comprende un éster de la
proteína C tensioactiva de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 6, que comprende al menos una proteína tensioactiva
adicional del grupo SP-A, SP-C no
esterificado y SP-B.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 7, que comprende rSP-C (FF/I).
9. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 6, que comprende fosfolípidos, ácidos grasos y
electrólitos.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9, que comprende, basado en el peso seco de la
composición, de 80 a 95% en peso de fosfolípidos, de 0,2 a 5% en
peso de proteína tensioactiva, de 2 a 15% en peso de ácidos grasos
y de 0 a 5% en peso de electrólitos.
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