JP2003502441A - サーファクタントタンパク質ｃエステル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 乳児呼吸困難症候群および成人呼吸困難症候群の治療のための医薬品組成物に適した新規サーファクタントタンパク質Ｃエステルが記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の属する分野 本発明は、肺界面活性ポリペプチド（サーファクタントタンパク質）、該化合
物の製造方法および該化合物を含有する医薬品組成物に関する。

【０００２】 従来技術 すべての脊椎動物の肺は、“肺性界面活剤（pulmonary surfactant）”と呼称
される物質混合物を含有する。これは、表面活性の性質を有し、かつ、肺の肺胞
領域中で、呼気の間の気道の末端領域の虚脱（collapse）が回避される程度に表
面張力を減少させる。この物質混合物は、著しく表面活性を調整するものであり
、したがって、ラプラスの法則にしたがって予期されうる小肺胞の虚脱が、表面
張力の適切な調整によって、より良好に、回避される。これは、バランスのよい
、組織学的および生理学的に安定な肺の構造を生じる。

【０００３】 肺界面活性剤は、層板状体の形のＩＩ型の肺胞性肺細胞によって分泌される。
これらは、高い割合のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）および
ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を有するリン脂質二重層の緻密なユニット
である。他の本質的な成分として、肺界面活性剤は、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ
−ＣおよびＳＰ−Ｄと表されるタンパク質を含有する（Possmayer, F. : A Prop
osed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-Associated Proteins. Am. Rev.
Respir. Dis. 1988, 138, 990-998）。ＳＰ−Ａは、分泌調節において重要な役
割を担う高分子量グリコプロテインである。

【０００４】 単分子表面層（せまい意味での界面活性剤）の形成中で、タンパク質ＳＰ−Ｃ
およびより少ない程度ではあるがＳＰ−Ｂは、“熱力学的触媒”の役割を担う。
これらタンパク質の存在は、拡散速度論（spreading kinetics）を著しく促進す
る。この理由のみによって、優れた表面張力の要求に対する界面活性剤の調整は
、遅れることなく可能である。これらの性質は、タンパク質、特にＳＰ−Ｃの極
めて疎水性の性質中で反映される。

【０００５】 肺組織の抽出または動物肺の洗浄によって、物理化学的測定装置および動物モ
デルの双方において、同様に医学的使用において、界面活性剤の不足分を補う能
力を有する界面活性製剤を得ることが可能であり、したがって、例えば、乳児呼
吸困難症候群（ＩＲＤＳ）の治療に適している。しかしながら、これらの動物起
源の製剤は、重大な欠点を有する： リン脂質組成物は、動物種、ならびに動物の健康状態および栄養状態に強く依
存し、かつ、定められた成分の混合物による補助が、限られた範囲でのみ可能で
ある。サーファクタントタンパク質含量およびＳＰ−Ｂ／ＳＰ−Ｃの割合は、同
様の変動にさらされる。さらに、タンパク質または改質された誘導体のタンパク
質分解生成物（たとえば、メチオニンでの酸化による）は、治療に使用される混
合物中に含まれていてもよい。界面活性剤の長期間の使用または大量の投与が必
要とされる場合、たとえば、成人呼吸困難症候群（ショック肺、ＡＲＤＳ）また
は他の領域での使用、たとえば、肺への投与において“薬剤”である他の物質へ
の界面活性剤の使用の場合には、物質の供給の問題が依然として残ったままであ
る。

【０００６】 したがって、遺伝子工学によるタンパク質の製造によって、前記問題を解決す
ることが適切である。しかしながら、組み換えタンパク質、特に細菌発現系が使
用される場合には、実際には制限されない量で製造することができ、かつ、近代
的分析方法の使用および質の調整が可能であり、その際、まさに定められた組成
物を有する界面活性剤は、合成リン脂質の使用によって製造することができる。
この界面活性剤は、治療的要求に最適に適応させることができる。

【０００７】 拡散速度論に関して特に重要なヒトタンパク質ＳＰ−Ｃ（配列番号１；以下の
式Ｉ参照、式中、Ａは欠失しているかまたはＰｈｅ、ＢはＣｙｓであり、かつ、
ＣはＭｅｔである）は、脂肪族を除き、高疎水性のアミノ酸、たとえばバリン、
ロイシンおよびイソロイシンから成る。この中心部分の長さ（式Ｉ中のアミノ酸
１２〜３４）は、単分子性リン脂質膜中へのペプチドのインテグレ−ションを可
能にする。配列番号２のＰｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏの配列（式Ｉの３〜６
の位置）中の２個のＣｙｓ基は、パルミチン酸によってＳＨ基でチオエステル化
される。パルミチン酸は、さらに、完全なタンパク質の疎水性の性質を増加させ
、かつ同時にシステインの２個のＳＨ基をブロックし、その後に、酸化およびジ
スルフィット架橋形成に対してこれらを保護する。中心領域（式Ｉのアミノ酸１
３〜３４）は、膜内外ヘリックスを形成する。この領域のＮ末端は、正電荷のア
ミノ酸を含有する極性配列を側鎖に有する（式ＩのLys, 10: Arg, 11）。

【０００８】 ＷＯ８９／０４３２６およびＷＯ９１／１８０１５では、ＳＰ−Ｃ組み換え体
およびＳＰ−Ｃ変異体の製造方法が記載されている。前記明細書中において、特
に、２個のシステインを４位および５位で、２個のセリン基によって置換するこ
とが示されている。製造方法において、これは、高疎水性タンパク質の単離の後
に２個のシステインの技術的に複雑なパルミトレーション（palmitolation）が
不要になるいった利点を有する。

【０００９】 ＷＯ９５／３２９９２では、ヒトＳＰ−Ｃとは異なって、２個のシステインが
４位および５位でフェニルアラニンまたはトリプトファンによって置換されてお
り、かつメチオニンが３２位でイソロイシン、ロイシンまたはセリンによって置
換されている、ＳＰ−Ｃ変異体が記載されている。

【００１０】 ＵＳ５８７６９７０では、特に、種々の天然起源から単離されたサーファクタ
ントタンパク質Ｃの質量スペクトル分析が記載されている。ここでは、質量スペ
クトロメトリのためのＳＰ−Ｃ試料の後処理の間に、メチルエステルまたはイソ
プロピルエステルが形成されてもよいことが挙げられている。

【００１１】 本発明の開示 本発明の目的は、薬理学的な肺界面活性製剤の製造に適した他のサーファクタ
ントタンパク質を提供することである。驚くべきことに、カルボキシ末端で、炭
素原子１〜４個を有するアルコールによってエステル化されているＳＰ−Ｃポリ
ペプチドが、第１に、その肺界面活性剤の作用に関して有利な性質を有し、かつ
、第２に、その安定性に関して有利な性質を有することが見出された。特に、本
発明によるＳＰ−Ｃエステルは、凝集に関する低い傾向を有し、したがって、溶
液中での改善された安定性を有する。

【００１２】 したがって、本発明の一つの態様は、アミノ酸が、ポリペプチドのカルボキシ
末端で、炭素原子１〜４個を有するアルコールによってエステル化されているＳ
Ｐ−Ｃポリペプチドおよびその塩に関する。

【００１３】 本発明に関して、“ＳＰ−Ｃ”の用語は、ポスメイヤー（Possmayer）によっ
て提案された命名法（Possmayer, F.: A Proposed Npmenclature for Pulmonary
Surfactant associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-99
8）に沿って、哺乳類の天然の肺界面活性剤中または羊水中に存在し、かつ、Ｓ
Ｐ−Ｃと呼称される、サーファクタントタンパク質の“ファミリー”として理解
される。ＳＰ−Ｃは好ましくは、ヒト肺界面活性剤中かまたはヒト羊水中に存在
するサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの意味として理解される。

【００１４】 したがって、“ＳＰ−Ｃ”の用語は、化学的に合成されたかまたは組み換えに
よって製造されたＳＰ−Ｃ、ならびにＳＰ−Ｃ改変体、たとえば、一つまたはそ
れ以上のアミノ酸が欠失しているかまたは他のアミノ酸によって置換されている
前記改変体を含む。化学的に合成されたかまたは組み換えによって製造されたＳ
Ｐ−Ｃ、ならびにＳＰ−Ｃ改変体は、たとえば、ＷＯ８９／０４３２６、ＷＯ９
１／００８７１、ＷＯ９１／１８０１５、ＷＯ９３／２１２２５、さらにはＷＯ
９５／３２９９２で記載されている。

【００１５】 本発明の好ましい実施態様において、ＳＰ−Ｃは、式Ｉ

【００１６】

【外２】

【００１７】 ［式中、Ａは欠失しているかまたはＰｈｅであり、ＢはＰｈｅまたはＴｒｐであ
り、かつ、ＣはＩｌｅ、ＬｅｕまたはＳｅｒである］の配列番号３のアミノ酸配
列を含むＷＯ９５／３２９９２から公知のサーファクタントタンパク質の意味で
あるとして理解される。

【００１８】 好ましくは、Ａが欠失しているかまたはＰｈｅであり、ＢがＰｈｅであり、か
つ、ＣがＩｌｅである、式Ｉの前記サーファクタントタンパク質である。特に好
ましくは、Ａが欠失しており、ＢがＰｈｅであり、かつＣがＩｌｅである、式Ｉ
のサーファクタントタンパク質である［以下、ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）またはｒＳ
Ｐ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）と呼称される］。

【００１９】 アミノ酸配列は、命名法にしたがって、通常の略記（３語のコード）で示され
、その際、アミノ酸は、左端で遊離アミノ酸基を有し（アミノ末端；式Ｉの０番
または１番のアミノ酸）かつ、アミノ酸は、右端で遊離カルボキシル基を有する
（カルボキシ末端；式Ｉの３４番のアミノ酸）。

【００２０】 リン脂質との混合物中において、本発明によるＳＰ−Ｃエステルは、肺界面活
性剤の活性を有する。肺界面活性剤の活性は、当業者に公知の方法で測定するこ
とができる。天然の肺界面活性剤は、表面活性の性質を有し；この場合、これは
、たとえば、肺胞中の表面張力を減少させるものである。肺界面活性製剤の表面
活性を測定するための、簡単かつ迅速なインヴィトロ（in vitro）試験は、たと
えば、ウェルヘルミーバランス（Wilhelmy balance）と呼称されるものである
［Goerke, J. Biochem. Biophys. Acta, 344: 241-261 (1974), King R.J. and
Clements J.A., Am. J. Physicol. 223; 715-726 (1972)］。この方法は、約０
ｍＮ／ｍの表面張力に達するための肺界面活性剤の能力として測定された、肺界
面活性剤の質の指標を示すものである。肺界面活性剤の表面活性を測定するため
の他の測定装置は、“パルセーティングバブルサーファクタントメーター（puls
ating bubble surfactometer）”である［Possmayer F., Yu S. and Weber M.,
Prog. Resp. Res., Ed. V. Wichert, Vol. 18: 112-120 (1984)］。また、肺界
面活性剤組成物の活性は、生体内（in vivo）試験によって測定することもでき
る。たとえば、ＡＲＤＳおよびＩＲＤＳの動物モデル中で必要とされる、肺性コ
ンプライアンス、血液ガス交換または呼吸圧を測定することによって、肺界面活
性剤の活性の指標を得ることが可能である。このようなモデルは、たとえば、ヘ
フナーら（Haefner et al.）によって記載されている（D. Haefer et al.: Effe
cts of rSP-C surfactant on oxygenation and histology in rat lung lavage
model of acute lung injury Am. J. respir. Crit. Care Med. 1998, 158: 270
-278）。

【００２１】 本発明に関連して、炭素原子１〜４個を有するアルコールは、特に、炭素原子
１〜４個を有する脂肪族アルコールの意味であると認識される。メタノール、エ
タノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、１−ブ
タノールおよび２−ブタノールは、本発明において挙げられてもよく、この場合
、メタノールおよび２−プロパノールが好ましい。

【００２２】 本発明によるＳＰ−Ｃエステルのための適した塩は、特に、酸との酸付加塩で
ある。製薬学中で通常使用される強酸の薬理学的に許容可能な塩が特に好ましい
。有利には、酸、たとえば、塩酸、塩化臭素酸および硫酸との酸付加塩が適して
おり、その際、塩の製造において、酸は、一塩基酸かまたは多塩基酸かによって
、およびどちらの塩が好ましいかによって、等モル比または異なる比で使用され
る。

【００２３】 ＳＰ−Ｃエステルは、カルボキシ末端で遊離カルボキシル基を有する、相当す
るサーファクタントタンパク質Ｃから出発し、適したエステル条件下で、適した
アルコールとの反応によって製造されてもよい。したがって、本発明は、カルボ
キシ末端で遊離カルボキシル基を有する、相当するサーファクタントタンパク質
Ｃを、好ましいアルコールと、適したエステル条件下で反応させることによる、
本発明によるＳＰ−Ｃエステルの製造方法を提供する。好ましくは、溶剤として
過剰量のアルコールを使用し、かつ、酸を用いてのエステル化を実施することで
ある。サーファクタントタンパク質の疎水性の性質に関して、他の有機溶剤との
混合物中でアルコールを使用することは有利である。これらの他の有機溶剤は、
好ましくは水素化された炭化水素、たとえば、クロロホルムおよびジクロロメタ
ンである。適した酸は、特に、強酸、たとえば、塩酸、硫酸または臭化水素酸で
ある。分解生成物の形成を回避するために、エステル化は好ましくは室温を下廻
る温度で実施される。エステル化の後に、生じるエステルは、通常の方法で単離
され、適切である場合には、たとえば、適した溶剤を用いてのカラムクロマトグ
ラフィーによって精製される（たとえば、ＷＯ９５／３２９９２またはＷＯ９２
／００９９３）。エステル化のための出発材料として使用されてもよい典型的な
サーファクタントタンパク質Ｃの単離または製造は、たとえば、ＷＯ８９／０４
３２６、ＷＯ９１／００８７１、ＷＯ９１／１８０１５、ＷＯ９３／２１２２５
または他にはＷＯ９５／３２９９２に記載されている。ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）
の製造は、ＷＯ９５／３２９９２に記載されている。これは、たとえば、タンパ
ク質のクロマトグラフィー（ＷＯ９５／３２９９２、第１０頁、第２パラグラフ
）の後に得られるｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）溶液を直接的に相当するｒＳＰ−Ｃ（
ＦＦ／Ｉ）エステルに製造することが可能である。

【００２４】 本発明によるＳＰ−Ｃエステルは、それ自体かまたは相互の組み合わせ物で、
気道の治療での要求に適合する医薬品組成物中で提供されてもよい。本発明によ
るＳＰ−Ｃエステルと、群ＳＰ−Ａ、エステル化されていないＳＰ−ＣおよびＳ
Ｐ−Ｂからの他の肺性界面活性剤の少なくとも一つとの医薬品組成物中での組み
合わせ物が挙げられてもよい。医薬品組成物中でのエステル化されていないＳＰ
−Ｃとの組み合わせ物は、本明細書中で特に挙げられてもよい。好ましくは、５
０質量％までのＳＰ−Ｃ（エステル化されていないもの）（組成物中でのサーフ
ァクタントタンパク質の総量に基づく）を含有し、残りは本発明による一つまた
はそれ以上のＳＰ−Ｃエステルである組み合わせ物であるか、あるいは５０質量
％までの本発明によるＳＰ−Ｃエステル一つまたはそれ以上を含有し、その際、
残りはＳＰ−Ｃ（エステル化されていないもの）を含有する組み合わせ物である
。特に好ましくは、ＳＰ−Ｃ（エステル化されていないもの）５〜１５質量％を
含有し、その際、残りは一つまたはそれ以上の本発明によるＳＰ−Ｃエステルで
ある組み合わせ物であるか、あるいは、本発明による一つまたはそれ以上のＳＰ
−Ｃエステル ０．５〜１０質量％を含有し、その際、残りはＳＰ−Ｃ（エステ
ル化されていないもの）である組み合わせ物であり、特に好ましくは、ＳＰ−Ｃ
エステル２〜５質量％を含有し、その際、残りはＳＰ−Ｃ（エステル化されてい
ないもの）である組み合わせ物である。本発明で好ましいのは、ｒＳＰ−Ｃ（Ｆ
Ｆ／Ｉ）エステルとエステル化されていない形でのｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）の組
み合わせ物である。典型的な組み合わせ物は、ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルエ
ステル１〜６質量％を含有し、その際、残りはエステル化されていない形でのｒ
ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）である組み合わせ物である。このような組み合わせ物は、
たとえば、完全な変換が達成される前にエステル化反応が中断される場合には、
ＳＰ−Ｃのエステル化反応から直接的にか、あるいは組み合わせ物の適切に純粋
な成分を混合することによって得られてもよい。

【００２５】 サーファクタントタンパク質に加えて、組成物は、リン脂質、好ましくは天然
の肺界面活性組成物中に含まれるリン脂質、たとえば、好ましくは、ジパルミト
イルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレイルホスファチジル
グリセロール（ＰＯＰＧ）および／またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）
を含有する。本発明による組成物の他の考えられうる成分は、脂肪酸、たとえば
、パルミチン酸である。好ましい粘性に調整するために、組成物は、電解質、た
とえば、カルシウム塩、マグネシウム塩および／またはナトリウム塩を含有して
いてもよい（たとえば、塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよび／または重炭酸
ナトリウム）。組成物の別個の成分の型および量を決定する場合に、従来技術は
使用され、一方では天然の肺界面活性剤が使用され、他方では従来技術の多くの
提案、たとえば、ＥＰ−Ａ０１１９０５６およびＥＰ−Ａ０４０６７３２が、そ
の方向づけに関して用いられる。

【００２６】 本発明による製剤は、好都合には、リン脂質８０〜９５質量％、サーファクタ
ントタンパク質０．２〜５質量％、脂肪酸２〜１５質量％および電解質０〜５質
量％を含有する（乾燥質量に基づく）。

【００２７】 好ましくは、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
およびパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）を、特に、７：３
〜３：７の割合で（質量比）である。

【００２８】 本発明による好ましい製剤は、リン脂質８０〜９５質量％、サーファクタント
タンパク質０．５〜３．０質量％、脂肪酸、好ましくはパルミチン酸３〜１５質
量％、および塩化カルシウム０〜３質量％を含有する（乾燥質量に基づく）。

【００２９】 本発明による好ましい組成物は、リン脂質８０〜９５質量％、サーファクタン
トタンパク質０．５〜３．０質量％、脂肪酸、好ましくはパルミチン酸４〜７質
量％、および塩化カルシウム１〜３質量％を含有する。

【００３０】 本発明による製剤は、従来技術から公知の方法で、たとえば、ＷＯ９５／３２
９９２で記載されたように、リン脂質マトリックス中にサーファクタントタンパ
ク質を混合させることによって製造される。本発明によれば、肺界面活性製剤は
、好ましくは、凍結乾燥された形、特に好ましくは噴霧乾燥された形で提供され
る。凍結乾燥された形は、たとえば、ＷＯ９７／３５８８２、ＷＯ９５／３２９
９２、ＷＯ９１／１００８７１およびＤＥ３２２９１７９から公知である。ＷＯ
９７／２６８６３は、噴霧乾燥による肺界面活性製剤の製造方法を記載している
。本発明によれば、この方法で製造された製剤が好ましい。

【００３１】 例 １．ｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）エステル ｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）メチルエステル 分液漏斗中において、ＷＯ９５／３２９９２によって、ＨＰＬＣクロマトグラ
フィーによって得られた純粋なｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）の５画分（１ｌ）を、クロ
ロホルム５００ｍｌおよび１Ｎ塩酸３００ｍｌと混合させ、かつ、完全に混合さ
せ、かつ、その後に、相分離の後に水相を除去した。有機相をメタノールで希釈
して１ｌにし、かつ、１Ｎ塩酸３００ｍｌでもう一度洗浄した。相分離の後に、
有機相を再度メタノールで希釈し１ｌにし、かつ溶液のｐＨを、濃塩酸を用いて
、約ｐＨ１に調整した。混合物を室温に２日間に亘って置き、かつ、約３００ｍ
ｌの溶剤混合物をその後にロータリーエバポレーターを用いて留去した。室温で
さらに３日間の後に、ＨＰＬＣ（すぐに使用可能なＨＰＬＣプレートＤｉｏｌ（
Merck）:移動相；クロロホルム：メタノール：アンモニア（２５％）：Ｈ_２Ｏ＝
１３：６：０．４：０．８；染色：クマシーブルー）によって、未エステル化ｒ
ＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）が検出されることはなかった。溶液をそれぞれ０．１Ｎ塩酸
３００ｍｌで２回に亘って抽出し、かつ、有機相を、相分離の後に、２−プロパ
ノールでそれぞれ希釈し７００ｍｌにした。溶液のｐＨを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液
でｐＨ３．５〜４に調整した。全体で４ｘの溶液を、２０〜２５℃で、ロータリ
ーエバポレーターを用いて２５０ｍｌに濃縮し、かつ、それぞれの場合において
２−プロパノールを用いて５００ｍｌにした。濾過は、最終的には、２−プロパ
ノール中で約２００ｍｇのｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）の溶液にし、この場合、これは
−２０℃で保存された。質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、３６３４Ｄ
ａで、分子ピークＭＨ^＋を示した。

【００３２】 ｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）−２−プロピルエステル 分液漏斗中において、ＷＯ９５／３２９９２にしたがい、ＨＰＬＣクロマトグ
ラフィーによって得られた純粋なｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）溶液６画分（１．２ｌ）
をクロロホルム６００ｍｌおよび１Ｎ塩酸４００ｍｌと混合し、かつ、完全に混
合させ、かつ、相分離の後に、水相を除去した。有機相を２−プロパノールで希
釈し１．２ｌにし、かつ、ｐＨをその後に濃塩酸を用いて０．５〜１に調整した
。混合物を室温で１日間に亘って置き、かつ、約３００ｍｌの溶剤混合物を、そ
の後に、２０〜２５℃でロータリーエバポレーターを用いて留去し、かつ、２−
プロパノール３００ｍｌによって置き換えた。この工程を、室温で３、６、９お
よび１２日間置いた後に繰り返した。ＨＰＴＬＣ（例１参照）によって、その後
に、任意の未エステル化ｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）を検出することは不可能であった
。溶液のｐＨを飽和ＮａＨＣＯ_３溶液を用いて３．５〜４に調整し、かつ、その
後に、溶液をロータリーエバポレーターを用いて５００ｍｌに濃縮する。濾過に
よって、２−プロパノール中のｒＳＰＣ（ＦＦ／Ｉ）２−プロピルエステル約２
５０ｍｇの溶液が生じ、この場合、これは−２０℃に保存される。質量スペクト
ル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、３６６２Ｄａで分子ピークＭＨ^＋を示す。

【００３３】 ２．ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）エステルのリン脂質マトリックスへの混合 イソプロパノールの溶液中のｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）または２−プロピルエス
テルを、リン脂質マトリックスの成分と混合し、室温で、塩化ナトリウム希釈溶
液（０．０６５％ ｗ／ｗ ＮａＣｌ）中に噴霧することによって、リン脂質マ
トリックス成分を含有する不均質な混合物として沈殿させた。肺界面活性剤懸濁
液から、肺界面活性剤（ＬＳＦ）をバケット遠心分離器を用いて分離除去し、か
つ、電解質溶液（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２）中に再懸濁し、かつ、ｐＨを０．１Ｎ
ＮａＯＨを用いてｐＨ６．５に調整した。この水性懸濁液を、２０ｍｌバイア
ル中に装填し、かつ凍結乾燥させた。以下の製造例中で示された質量および量は
、肺界面活性製剤１０ｇの製造に基づく。

【００３４】 ４０℃において、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＣＣ）７．００
ｇ、パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロールアンモニウム塩（ＰＯＰ
Ｇ×ＮＨ_４）３．０８ｇ、およびパルミチン酸０．２５ｇを、９０％イソプロパ
ノール ２００ｍｌ中に溶解させ、かつ、その後に混合物を室温に冷却する。生
じるリン脂質溶液を、ＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルまたは２−プロピルエステル
２００ｍｇを含有する溶液１ｌと組み合わせる。生じる“噴霧溶液”を重炭酸
溶液で撹拌することによって、ｐＨ４．５に調整した（５％ＮａＨＣＯ_３溶液
約５ｍｌ）。

【００３５】 室温において、“噴霧溶液”を激しく撹拌しながら、単一物質（single-subst
ance）ノズルを介して、２５ｍｌ／分の噴霧速度で、ＮａＣｌ希釈溶液 ９．６
ｌ（０.０６５％ ｗ／ｗ）中に装入する。４℃〜８℃で２時間に亘っての保存
の後に乳白色の溶液が形成され、肺界面活性製剤を、電解質溶液（Ｈ_２Ｏ ３０
０ｍｌ中の３．０ｇ ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２ＯおよびＮａＣｌ６１．３ｇ）中に噴
霧することによって沈殿させた。肺界面活性懸濁液（１０．８〜１１．０ｌ）を
４℃で一晩に亘って保存し、その後にそれぞれの場合において３０分に亘って１
６０００ｇで、Ｓｏｒｖａｌｌ バケット遠心分離器（ＲＣ２−Ｂ）を用いて遠
心分離した。それぞれの場合において、遠心分離ケークは、残留するイソプロパ
ノールを付着を取り除くために、０．６５％濃度塩化ナトリウム溶液の半量で再
懸濁し、かつ、再度遠心分離した。この方法は、全部で３〜４回に亘って繰り返
す。最終的な遠心分離のケークを、０．６５％濃度ＮａＣｌ溶液 ４００ｍｌ中
に入れ、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ６．５に調整し、かつ、一部分６．２ｇで
２０ｍｌのバイアルに入れた。バイアルの内容物を以下のように凍結乾燥させた
：大気圧下で−４５℃で６時間に亘って凍結させ、０．１６ｍバール下で−２０
℃で５４時間に亘って凍結乾燥させ、その後に０．０２ｍバールで−２０℃で５
時間に亘ってさらに強力に乾燥させた。

【００３６】 これによって、それぞれ肺界面活性剤０．１５０ｇ（ＮａＣｌを含まずに算定
された）を含有するバイアル６５〜６６個が得られた。

【００３７】 乾燥肺界面活性剤試料を冷蔵庫中で４℃で保存し、かつ、使用前に水または生
理学的食塩水で懸濁しなければならない（懸濁液濃度２５ｍｇ／ｍｌ）。

【００３８】 それぞれのバイアルは以下のものを含む： ジパルミトイルホスファチジルコリン ９５．６ｍｇ パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（アンモニウム塩） ４２．
１ｍｇ ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルまたは２−プロピルエステル ２．７ｍｇ パルミチン酸 ６．８ｍｇ 塩化カルシウム（無水物） ２．９ｍｇ ３．粉末肺界面活性製剤の製造 粉末肺界面活性製剤は、ＷＯ９７／２６８６３で記載された方法によって製造
された。

【００３９】 例Ａ ５０℃で、１，２−ジパルミトイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン １０
．９５ｇ、１−パルミトイル−２−オレイル−３−ｓｎ−ホスファチジルグリセ
ロール−アンモニウム ４．６ｇ、塩化カルシウム二水和物 ４１８ｍｇおよび
パルミチン酸 ７５０ｍｇを、２−プロパノール／水（８５：１５） ３３０ｍ
ｌ中に溶解させ、３０℃に冷却した後に、イソプロパノール／水（９５：５，ｃ
＝４８４ｍｇ／ｌ）中のｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）２−プロピルエステルの溶液６
２０ｍｌと混合させた。生じる溶液を、ＢｕｅｃｈｉＢ１９１実験室用噴霧乾燥
器中で噴霧乾燥させた。噴霧条件：乾燥のためのガス：窒素、入口温度：１００
℃、出口温度：５８〜６０℃。これによって無色の粉末が得られた。

【００４０】 例Ｂ ５０℃で、１，２−ジパルミトイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン ３．
７４ｇ（５．１ｍｍｏｌ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−３−ｓｎ−ホ
スファチジルコリン ２．８１ｇ（３．７ｍｍｏｌ）、１，２−ジパルミトイル
ホスファチジル−３−ｓｎ−ホスファチジルグリセロールナトリウム ２．９０
ｇ（３．９ｍｍｏｌ）、パルミチン酸２３４ｍｇおよび塩化カルシウム二水和物
２７９ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）を、２−プロパノール／水（８５：１５）１６０
ｍｌ中に溶解し、かつ、３０℃に冷却した後に、イソプロパノール／水（９２：
８，ｃ＝３３０ｍｇ／ｌ）中のｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルエステルの溶液５
６６ｍｌで、３０℃で混合した。生じる溶液を、ＢｕｅｃｈｉＢ１９１実験室用
乾燥器中で噴霧乾燥した。噴霧条件：乾燥のためのガス：窒素、入口温度：９０
℃、出口温度５８〜６０℃。これによって、無色の粉末が得られた。

【００４１】 商業的価値 商業的価値 成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）は、重大なガス交換障害を伴う、異なる病因
からの、多くの急性の拡散浸潤性の肺病変に相当する（特に、動脈性低酸素症）
記述的表現である。ＡＲＤＳの表現は、乳児呼吸困難症候群（ＩＲＤＳ）と同様
の数多くの臨床的特徴および病理学的特徴を有することから用いられる。ＩＲＤ
Ｓの場合には、早産によって引き起こされる肺界面活性剤の不足が主な原因であ
り、ＡＲＤＳの場合には、異なる病因に基づく肺疾患によって、肺界面活性剤機
能不全が引き起こされる。ＡＲＤＳを含むＡＬＩを引き起こす引き金となるのは
、たとえば、（Harrison's Principles of Internal medicine 10th Ed. 1983,
McGraw-Hill Int. Book Compによって記載されている）びまん性肺感染症（たと
えば、ウイルス、バクテリア、ファージによるもの）、たとえば胃液の吸引、ま
たは溺れた場合の吸引、毒物または刺激物の吸入（たとえば、塩素ガス、窒素酸
化物、ばい煙）、直接的または間接的外傷（たとえば、多発性骨折または肺挫傷
）、肺外面の炎症に対する全身反応（たとえば、出血性膵炎、グラム陰性菌敗血
症）、大量の輸血であるかまたは心肺バイパス後の輸血であってもよい。

【００４２】 本発明による製剤は、早産の乳児でのＩＲＤＳの治療または予防であるか、あ
るいはＡＲＤＳを含む成人におけるＡＬＩの治療または予防に適しているばかり
ではなく、さらには、肺炎、気管支炎、胎便吸入症候群、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性
肺疾患）、喘息および嚢胞性繊維症の治療または予防に適している。さらに、本
発明によるサーファクタントタンパク質および本発明による組成物は、他の薬剤
の投与に関するキャリアーとしての使用に適している。

【００４３】 本発明による製剤の投与は、従来技術から公知の方法で、好ましくは気管内滴
下（輸液またはボーラス剤）であるか、あるいは噴霧の形で実施される。投与に
関して、本発明による製剤は、好ましくは、適した溶剤または再懸濁媒体中で溶
解させるかまたは懸濁させ、特に、製剤は、凍結乾燥された形かまたは噴霧乾燥
された形で存在する。適した溶剤は、好ましくは生理学的食塩水である。１ｍｌ
の懸濁液に対して、１２．５〜１００ｍｇのリン脂質を含有する本発明による製
剤の懸濁液または溶剤の投与が有利であることが見出された。適用に関して、本
発明による製剤は、好ましくは体重１ｋｇ当たりリン脂質１２．５〜２００ｍｇ
の量で投与される。一般には、投与は１日１回〜３回、１〜７日間に亘って実施
される。必要である場合には、好ましくは肺界面活性剤組成物希釈液での気管支
肺胞洗浄液を、本発明による製剤の投与前に実施することができる。このような
方法は、たとえば、ゴマーら（Gommer et al.）［Brochoalveolar lavage with
a diluted surfactant suspension prior to surfactant instillation improve
s the effectiveness of surfactant therapy in experimental acute respirat
ory distress syndrome (ARDS), Intensive Care Med. 1998, 24: 494-500］お
よびＷＯ９８／４９１９１で記載されている。

【００４４】 したがって、本発明は、さらに、哺乳類、特にヒトにおいて、肺炎、気管支炎
、胎便吸入症候群、ＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性繊維症、ＩＲＤＳおよび／またはＡ
ＬＩ（ＡＲＤＳを含む）を、本発明による肺界面活性製剤の適した量を投与する
ことによって、治療または予防する方法を提供する。

【００４５】 また、本発明は、哺乳類、特にヒトにおいて、肺炎、気管支炎、胎便吸入症候
群、ＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性繊維症、ＩＲＤＳおよび／またはＡＬＩ（ＡＲＤＳ
を含む）の治療または予防のための医薬品製剤（医薬品）を製造するための、サ
ーファクタントタンパク質の使用を提供する。

【００４６】 さらに、本発明は、市販の２次包装、薬剤を含有する１次包装（たとえばアン
プル）および必要である場合には添付のリーフレットから成る商業的製品を提供
し、この場合、この医薬品製剤は、肺炎、気管支炎、胎便吸入症候群、ＣＯＰＤ
、喘息、嚢胞性繊維症、ＩＲＤＳおよび／またはＡＬＩ（ＡＲＤＳを含む）の治
療または予防に適しており、挙げられた障害の治療または予防のための医薬品組
成物の適性は、商業的製品の２次包装または添付のリーフレットに記載されてお
り、かつ、医薬品製剤は、少なくとも一つの本発明によるＳＰ−Ｃエステルなら
びに適した薬理学的助剤を含む。２次包装、製剤を含む１次包装および添付のリ
ーフレットは、他には、この型の医薬品製剤に関して、当業者が標準的であると
みなすものに相当する。

【００４７】 薬理学的研究 ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルエステル（以下のバッチＬＬＵＥ１３９）を含
有する本発明の組成物、およびｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルエステルとｒＳＰ
−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）（エステル化されていないもの）との質量比５：９５（組成物
中のサーファクタントパン宅室の総量に基づく）（以下バッチＥＲａ８とする）
の組み合わせ物を含有する本発明による組成物を、ヘフナーら（Haefner et al.
）［D. Haefner, P.-G. Germann and D. Hauschke: Effects of rSP-Csurfactan
t on oxygenation and histology in rat-kung-lavage model of acute lung in
jury. Am. J. Resp. Crit Care Med. 158, 270-278 (1998)］によって記載され
たモデルで試験した。ＲＬＬモデルにおいて、２個のバッチを、体重１ｋｇ当た
りリン脂質１２．５、２５、５０および１００ｍｇの用量で、後処理（late tre
atment）（最後の洗浄後１時間での投与）によって使用した。双方のバッチは、
未処理のコントロール群と比較して酸素化の著しい改善を示した。効果は、投与
量依存的であった。特に、体重１ｋｇ当たり５０ｍｇおよび１００ｍｇのリン脂
質の投与量での値は、洗浄されていないラットの最初の値の範囲内であった。

【００４８】 図の詳細な説明 図１は、ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルエステル（ＬＬＵＥ１３９）を含有す
る本発明の組成物、およびｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）メチルエステルおよびｒＳＰ
−Ｃ（ＦＦ／Ｉ）（エステル化されていないもの）を質量比５：９５で含有する
本発明による組成物（Ｅｒａ８）の効果を、ヘフナーらによって記載されたモデ
ル（Haefner et al.）［D. Haefner, P.-G. Germann and D. Hauschke: Effects
of rSP-Csurfactant on oxygenation and histology in rat-kung-lavage mode
l of acute lung injury. Am. J. Resp. Crit Care Med. 158, 270-278 (1998)
］での酸素化において、体重１ｋｇ当たりリン脂質１２．５、２５、５０および
１００ｍｇの投与量に関するグラフを示す。体重１ｋｇ当たり投与量０ｍｇは、
処理されていないコントロール群の酸化を示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明による組成物の効果を示すグラフ図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 11/06 11/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，Ｋ Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヴァルター ゲルナント ドイツ連邦共和国 アレンスバッハ アム ミュールバッハ ９ (72)発明者 ディートリヒ ヘフナー ドイツ連邦共和国 コンスタンツ ベート ーヴェンシュトラーセ ５ (72)発明者 ヴォルフ−リューディガー ウルリヒ ドイツ連邦共和国 コンスタンツ アルペ ンシュトラーセ ２ (72)発明者 エルンスト シュトゥルム ドイツ連邦共和国 コンスタンツ ボール シュトラーセ ９ Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA07 BA01 BA08 BA19 DC50 MA02 MA13 MA16 MA23 MA55 ZA592 ZB132 4C086 AA01 DA41 MA02 MA13 MA16 MA23 MA55 ZA59 ZB13 4C206 AA01 DA03 MA02 MA33 MA36 MA43 MA75 ZA59 ZB13 4H045 AA10 AA30 BA18 BA50 CA40 EA20 FA30 FA51 GA01

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サーファクタントタンパク質のカルボキシ末端で、アミノ酸
   を炭素原子１〜４個を有するアルコールでエステル化したサーファクタントタン
   パク質Ｃおよびその薬理学的に認容性の塩。
2. 【請求項２】 式Ｉ 【外１】 ［式中、Ａは欠失しているかまたはＰｈｅであり、ＢはＰｈｅまたはＴｒｐであ
   り、かつＣはＩｉｅ、ＬｅｕまたはＳｅｒである］の配列番号３のアミノ酸配列
   を有するサーファクタントタンパク質である、請求項１に記載のサーファクタン
   トタンパク質Ｃ。
3. 【請求項３】 Ａが欠失しているかまたはＰｈｅであり、ＢがＰｈｅであり
   、かつ、ＣがＩｉｅである、請求項２に記載のサーファクタントタンパク質Ｃ。
4. 【請求項４】 Ａが欠失しており、ＢがＰｈｅであり、かつＣがＩｉｅであ
   る、請求項２に記載のサーファクタントタンパク質Ｃ。
5. 【請求項５】 アルコールがメタノールまたは２−プロパノールである、請
   求項１に記載のサーファクタントタンパク質Ｃ。
6. 【請求項６】 請求項１から５までのいずれか１項記載のサーファクタント
   タンパク質Ｃエステルを含有する、哺乳類において、肺炎、気管支炎、胎便吸引
   症候群、ＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性繊維症、ＩＲＤＳおよび／またはＡＬＩ（ＡＲ
   ＤＳを含む）を治療または予防するための医薬品組成物。
7. 【請求項７】 ＳＰ−Ａ、エステル化されていないＳＰ−ＣおよびＳＰ−Ｂ
   の群からの少なくとも一つの他のサーファクタントタンパク質を含有する、請求
   項６に記載の医薬品組成物。
8. 【請求項８】 ｒＳＰ−Ｃ（ＦＦ／ｌ）を含有する、請求項７に記載の医薬
   品組成物。
9. 【請求項９】 リン脂質、脂肪酸および電解質を含有する、請求項６に記載
   の医薬品組成物。
10. 【請求項１０】 組成物の乾燥質量に対して、リン脂質 ８０〜９５質量％
    、サーファクタントタンパク質 ０．２〜５質量％、脂肪酸 ２〜１５質量％お
    よび電解質 ０〜５質量％を含有する、請求項９に記載の医薬品組成物。